用於保護肝臟和保護胃黏膜的解酒飲的製作方法
2023-06-26 06:34:37 3
本發明涉及中藥解酒方劑。更具體地說,本發明涉及用於保護肝臟和保護胃黏膜的解酒飲及其製備方法。
背景技術:
隨著生活水平的提高、飲食結構改變和酒精消費量的日益增長,酒精性肝病發病率在世界範圍內呈現逐年升高的趨勢。有資料表明,成年男性每天攝入乙醇的劑量>40g,女性攝入乙醇的劑量>20-30g,就可導致肝臟損傷。進入體內的乙醇,僅有2-10%通過肺臟和腎臟排出,其餘大部分在肝臟中分解代謝。乙醇代謝過程中引起機體氧化應激,氧化應激可以損傷線粒體,乙醇也可直接導致內質網應激,進而造成線粒體功能紊亂、脂質蓄積、炎症反應以及細胞凋亡。長期飲酒可造成全身多系統的損傷、尤其對胃腸道,肝臟損傷更為明顯,酒精可直接或間接引起慢性胃炎,消化性潰瘍和酒精中毒性肝硬化。近年來,成人酒精中毒的發生率也逐年升高,急性酒精中毒可引起多臟器損害,特別是導致急性胃黏膜糜爛出血。
現有的解酒藥品多具有醒酒解酒的功效,但只局限於能延緩飲酒者的醉酒時間,緩解醉酒者的頭痛、噁心等症狀,減短醉酒者的醉睡時間,而缺乏解酒藥對於醉酒者肝臟和胃黏膜的保護功效;雖然有公開的具有護肝作用的解酒組合物,但其公開例中缺乏對於解酒藥在預防或治療醉酒造成的肝臟和胃黏膜損傷方面的藥理學實驗例證。
技術實現要素:
本發明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷,並提供至少後面將說明的優點。
本發明還有一個目的是提供一種用於保護肝臟和保護胃黏膜的解酒飲及其製備方法。
本發明還有一個目的是通過科學的生化對比試驗及相關生理指徵表徵對比,研究所述解酒飲對小鼠急性肝損傷和急性胃黏膜損傷的預防和治療作用。
為了實現根據本發明的這些目的和其它優點,提供了一種用於保護肝臟和保護胃黏膜的解酒飲,所述解酒飲製備原料組成包括:枳梖子10-20重量份、丹參5-15重量份、葛根10-20重量份、黨參10-20重量份、陳皮10-20重量份、枸杞子10-20重量份、葛花10-20重量份、山楂5-15重量份、甘草5-15重量份、女貞子10-20重量份;
所述各原料配比均以含水率不超過7%的乾重計算,所述解酒飲的製備方法為:將各原料按重量配比混合均勻裝入紗布包中,輻照滅菌,將紗布包浸入相當於藥材總重八倍量的清水浸泡0.5-1h,以大火煮沸後改文火煎煮1h,取出藥包瀝乾後再浸入相當於藥材總重八倍量的清水中,以大火煮沸後改文火煎煮1h,取出藥包瀝乾,將兩次煎煮的藥液合併,在80℃的水浴上進行減壓濃縮,壓力值為-0.08pa,調整濃縮液為含量相當於含生藥1g/ml的流浸膏。
優選的是,其中,枳梖子20重量份、丹參10重量份、葛根15重量份、黨參10重量份、陳皮10重量份、枸杞子10重量份、葛花10重量份、山楂5重量份、甘草10重量份、女貞子10重量份。
優選的是,其中,所述枳梖子、丹參、葛根、黨參、陳皮、山楂、甘草經粗粉機粉碎,粉碎後的粒度為0.27-0.55cm。
優選的是,其中,所述中藥原料裝入紗布包時,所述中藥原料體積佔紗布包容積的1/3-1/2。
優選的是,其中,將紗布包抽線封口後,整理紗布包使藥材平鋪為1-2cm厚,採用紫外線輻照殺菌。
優選的是,其中,每次取出藥包時,用少量清水衝洗藥包後瀝乾,衝洗和瀝出的藥液回收入煎煮藥液中,每次衝洗所用水量不超過1/5的幹藥總重量。
優選的是,其中,所述藥液經過減壓濃縮後,放入60℃烘箱內烘乾24h之後置於容量瓶中用水稀釋定容為含量相當於含生藥1g/ml的流浸膏。
優選的是,其中,所述解酒飲可以將流浸膏於棕色容器中密封保存,所述解酒飲也可以經過噴霧乾燥製成顆粒,以便於包裝並方便服用。
優選的是,其中,所述解酒飲用法及用量為:可於飲酒前服用或飲酒後服用,成人每天服用量按體重計為1.25g/Kg,分三次服用。
優選的是,其中,所述解酒飲可以用於製備具有醒酒、解酒、保肝、護胃等功效的藥品或食品。
本發明至少包括以下有益效果:所述解酒飲中包含的葛根、枸杞子、葛花、山楂、甘草、女貞子皆具有保護肝臟的功能,可預防或治療乙醇對肝臟的損害,同時,甘草還具有解毒功能,可加速乙醇代謝而排洩到體外;而丹參具有促進細胞組織的修復與再生,促進肝臟微循環,防止凝血淤血的作用;陳皮、黨參有抑制胃腸道痙攣和保護胃黏膜的作用,還可減輕醉酒產生的嘔吐;葛根、山楂具有改善微循環,抗氧化作用,這樣可以減輕因醉酒產生的頭痛;此外枳梖子還有利尿作用,可以加速乙醇從體內排除;因此所述解酒飲具有醒酒、保肝和保護胃黏膜的作用;由於製備方法中採用兩次煎煮的工藝,因此能夠充分浸出各中藥原料中的有效成分;由於採用80℃水浴上進行減壓濃縮,因此能夠避免藥液被高溫煎糊,同時加快濃縮速度;由於部分難以浸煮的藥材進行了粗粉碎,因此能夠加快藥物成分的浸出,同時因為粒度控制在0.27-0.55cm,因此減少了藥粉過細時候藥粉本身對有效成分的吸附;由於中藥原料體積佔紗布包容積的1/3-1/2,因此能使藥材與容積之間有充足的接觸空隙,有助於有效成分的浸出;由於整理紗布包使藥材平鋪為1-2cm厚,採用紫外線輻照殺菌,因此能夠徹底殺死藥材上的微生物和蟲卵等;由於每次取出藥包時,用少量清水衝洗藥包後瀝乾,衝洗和瀝出的藥液回收入煎煮藥液中,因此能夠儘可能地回收藥材本身所吸附的有效成分;由於所述藥液經過減壓濃縮後,放入60℃烘箱內烘乾24h之後置於容量瓶中用水稀釋定容為含量相當於含生藥1g/ml的流浸膏,因此能夠保證流浸膏的濃度複合規定;由於所述解酒飲可以將流浸膏於棕色容器中密封保存,也可以經過噴霧乾燥製成顆粒,因此能夠保證藥效、便於包裝或服用;由於所述解酒飲用法及用量為:可於飲酒前服用或飲酒後服用,成人每天服用量按體重計為1.25g/Kg,分三次服用,因此能夠持續有效地發揮其醒酒、保肝和保護胃黏膜的作用;由於所述解酒飲可以用於製備具有醒酒、保肝、護胃等功效的藥品或食品,因此可以有更廣泛地應用空間,以多種形式服務於人類的身體健康。
本發明的其它優點、目標和特徵將部分通過下面的說明體現,部分還將通過對本發明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。
附圖說明
圖1為本發明對肝組織病理組織學的改變的影響(HE,×100);
圖2為本發明一個實施例中對免疫組化檢測肝臟MnSOD的表達情況對比圖(×400);
圖3為本發明一個實施例中對免疫組化檢測肝臟Bcl-2的表達情況對比圖(×400);
圖4為本發明一個實施例中對免疫組化檢測肝臟Caspase-3的表達情況對比圖(×400);
圖5為本發明一個實施例中螢光定量RT-PCR產物的擴增曲線;
圖6為本發明一個實施例中螢光定量RT-PCR產物的溶解曲線;
圖7為本發明一個實施例中對小鼠急性胃黏膜損傷的影響(×10)
圖8為本發明一個實施例中對小鼠胃黏膜病理組織學的影響(HE,×400)
具體實施方式
下面對本發明做進一步的詳細說明,以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。
應當理解,本文所使用的諸如「具有」、「包含」以及「包括」術語並不配出一個或多個其它元件或其組合的存在或添加。
解酒飲的製備
本發明所述用於保護肝臟和保護胃黏膜的解酒飲由以下重量配比的原料組成:枳梖子20重量份、丹參10重量份、葛根15重量份、黨參10重量份、陳皮10重量份、枸杞子10重量份、葛花10重量份、山楂5重量份、甘草10重量份、女貞子10重量份;
其中,所述配比均以含水率不超過7%的乾重計算;
本發明所述的丹參養心袋泡茶的製備方法,包括以下步驟:
將所述枳梖子、丹參、葛根、黨參、陳皮、山楂、甘草經粗粉機粉碎,粉碎後的粒度為0.27-55cm,按相應比例配合枸杞子、葛花混合均勻,將所述中藥原料裝入紗布包,其體積佔紗布包容積的1/3-1/2,將紗布包抽線封口後,整理紗布包使藥材平鋪為1-2cm厚,採用紫外線輻照殺菌,將所述紗布包浸入相當於藥材總重八倍量的清水浸泡0.5-1h,以大火煮沸後改文火煎煮1h,取出藥包,並使用不超過1/5的幹藥總重量的清水對藥包進行衝洗並瀝乾,衝洗和瀝出的藥液回收入煎煮藥液中,將藥包再浸入相當於藥材總重八倍量的清水中,以大火煮沸後改文火煎煮1h,取出藥包使用不超過1/5的幹藥總重量的清水對藥包進行衝洗並瀝乾,衝洗和瀝出的藥液回收入煎煮藥液中,將兩次煎煮的藥液合併,在80℃的水浴上進行減壓濃縮,壓力值為-0.08pa,待藥液變粘稠,轉移容器放入60℃烘箱內烘乾24h之後置於容量瓶中用水稀釋定容為含量相當於含生藥1g/ml的流浸膏,所得流浸膏置於棕色容器中密封保存,或者可以將流浸膏進行噴霧乾燥製成顆粒進行包裝。
解酒飲對小鼠急性肝損傷的保護作用的實驗
1.材料和方法
1.1實驗動物
昆明種健康小鼠60隻:SPF級,雌雄各半,體質量18~22g,由廣西醫科大學動物中心提供,實驗動物使用許可證:SCXK桂2014-0002,飼養環境溫度為(23±2)℃,溼度為40%~60%。
1.2受試藥物
本發明方法所製備的解酒飲
聯苯雙酯滴丸:萬邦德製藥集團股份有限公司,批號:A02141148,規格:1.5mg/丸。
1.3試劑與儀器
CCl4:成都市新都區木蘭鎮工業開發區,批號:2014061301;
考馬斯亮藍檢測試劑盒:南京建成生物工程研究所,批號:20151008;
SOD試劑盒(WST-1法):南京建成生物工程研究所產品,批號:20151212;
AST試劑盒:上海執誠生物科技股份有限公司,批號:ZCMARO020;
ALT試劑盒:上海執誠生物科技股份有限公司,批號:ZCSEPN024;
MDA試劑盒:南京建成生物工程研究所產品,批號:20150715;
GSH試劑盒:南京建成生物工程研究所產品,批號:20150707;
白蛋白測定試劑盒:上海執誠生物科技股份有限公司,批號:ZCJUNN016;
總蛋白測定試劑盒:上海執誠生物科技股份有限公司,批號:ZCJULN010;
MnSOD:武漢博士德生物工程有限公司,批號:BA4566;
Caspase-3:美國bioworlde公司,批號:BS1518;
BCL-2:北京中杉金橋生物有限公司,批號:15680208;
總RNA提取試劑盒(RNAisoPlus),日本TaKaRa公司,批號:D9108A;
反轉錄試劑盒,日本TaKaRa公司,批號:DRR036A;
螢光定量PCR試劑盒,日本TaKaRa公司,批號:DRR081A;
Nrf2序列特異引物,大連寶生物工程有限公司;
SOD序列特異引物,大連寶生物工程有限公司;
β-actin序列特異引物,大連寶生物工程有限公司;
DEPC水,美國Sigma公司;
電子分析天平,型號:EL204,上海梅特勒一立託儀器公司;
紫外可見分光光度計,型號:UVmini-1240,日本島津;
日立全自動生化分析儀,型號:7100,日本日立公司;
酶標儀,型號:MULTISKANMK3,Thermo;
Olympus生物顯微鏡,型號:CX31+DP73,日本奧林巴斯株式會社;
螢光定量PCR儀:美國應用生物系統公司生產,型號:7500;
2方法
2.1藥物的製備
高劑量組用藥:解酒飲流浸膏1g/ml的濃度;
中劑量組用藥:將解酒飲流浸膏用蒸餾水進行2倍稀釋成0.5g/ml的濃度;
低劑量組用藥:將解酒飲流浸膏用蒸餾水進行4倍稀釋成0.25g/ml的濃度;陽性藥物的製備:
聯苯雙酯滴丸40粒(規格1.5mg,共60mg)研磨成粉末,用蒸餾水稀釋至10ml,配製成濃度為0.006g/ml藥物混懸液,用時新鮮配製,搖勻使用。0.3%CCl4溶液:
用微量移液器量取30μlCCl4分析純置於10ml容量瓶中,加橄欖油至容量瓶的刻度線,充分混勻,製成0.3%CCl4橄欖油溶液。
2.2動物分組及給藥
(1)動物分組
健康的昆明種小鼠,60隻,體重18-22g,適應性地餵養一周後,隨機分為模型對照組、正常對照組、解酒飲高劑量組、解酒飲中劑量組、解酒飲低劑量組和聯苯雙酯組,每組10隻,雄雌各半。
(2)給藥
高劑量組小鼠灌服25g/kg劑量的解酒飲,中劑量組灌服12.5g/kg劑量的解酒飲,低劑量組灌服6.25g/kg劑量的解酒飲,聯苯雙酯陽性對照組灌服150mg/kg劑量的聯苯雙酯混懸液,模型和空白對照組灌服同體積蒸餾水。一天一次,連續給藥8天。第8天給藥後,除空白對照組外,其他各組小鼠均於末次給藥後2小時,按5ml/kg的劑量腹腔內注射0.3%CCl4橄欖油溶液,空白對照組等體積腹腔注射橄欖油溶劑。
2.3實驗動物處理及標本採集
2.3.1 ALT、AST、ALB、GLB、TP的活性測定
小鼠造模後禁食不禁水,12h後採用摘眼球取血法獲得血標本,血液靜置2h後置於離心機中,4℃溫度下轉速為3000r/min離心10分鐘,吸取上清液,用日立全自動生化分析儀檢測ALT、AST、GLB、TP、ALB活性值,然後計算出白球比(A/G)。
2.3.2肝臟指數的計算
採血後處死小鼠,剖腹取肝組織。用生理鹽水漂洗除去積血,擦拭後稱重。肝臟指數的計算為:肝臟指數=[肝臟重量(g)/體重(g)]×100%
2.3.3肝勻漿中MDA、SOD、GSH活性的測定
取肝臟組織,精密稱定0.2g肝組織,加入九倍量預冷的0.9%氯化鈉溶液中製成10%的肝勻漿液,勻漿液以4000r/min離心10分鐘,取上清液。-20℃冷藏備用。按試劑盒說明書方法測定超氧化物歧化酶(SOD)、穀胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的含量。組織中蛋白含量的測定按照考馬斯亮藍法。
2.3.4病理組織學觀察
取小鼠左葉肝組織,立即固定於10%中性緩衝甲醛。70%、80%、90%、100%乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋後切片,常規脫蠟,HE染色,中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察肝組織的組織病理學變化。
2.3.5免疫組化法測定肝組織MnSOD、BCL-2、Caspase-3蛋白的表達
2.3.5.1免疫組化法測定MnSOD蛋白的表達
每組分別取出10隻小鼠肝組織切片,共6組。常規脫蠟至水;3%H2O2室溫浸泡10min,PBS洗3次,每次5min;抗原修復:切片浸入0.01M枸櫞酸鹽緩衝液(pH6.0),微波爐加熱至沸騰後斷電,10min後反覆一次,冷卻後0.1MPBS洗滌2次,切片上滴加抗原修復液水浴箱37℃5~10min,0.1MPBS洗滌2次;加過氧化氫酶阻斷液,室溫孵育10min,以阻斷內源性過氧化物酶活性,PBS洗3次,每張片加1滴生物素標記的第二抗體;室溫下孵育10min,PBS衝洗3次,每次5min;每張片加鏈黴菌抗生物素蛋白—過氧化酶,室溫下10min,PBS衝洗3次,每次5min;每張片2滴新配製的DAB溶液,顯微鏡下3~10min鍾觀察顯色情況,自來水衝洗;蘇木素復染,自來水衝洗返藍;脫水,透明中性樹酯膠封固;正置顯微鏡鏡下觀察結果並拍照。用Image Pro Plus 6.0軟體計算每張片的平均光密度值(mean density),再進行統計學分析。
2.3.5.2免疫組化法測定BCL-2蛋白的表達
每組分別取出10隻小鼠肝組織切片,共6組。常規脫蠟至水;3%H2O2孵育10min以消除內源性過氧化氫酶的活性,蒸餾水衝洗,PBS浸洗5min;滴加正常山羊血清封閉液室溫孵育15min以消除背景非特異染色;滴加兔抗Bcl-2蛋白多克隆抗體,37℃孵育1h,PBS衝洗3次,每次5min;滴加生物素標記羊抗兔lgG,37℃孵育15min,PBS衝洗3次,每次5min;滴加辣根酶標記鏈黴卵白素,37℃孵育,15min PBS衝洗3次,每次5min;DAB顯色,自來水充分衝洗,蘇木素復染,封片。正置顯微鏡鏡下觀察結果並拍照。用Image Pro Plus 6.0軟體計算每張片的平均光密度值(mean density),再進行統計學分析。
2.3.5.3免疫組化法測定Caspase-3蛋白的表達
每組分別取出10隻小鼠肝組織切片,共6組。常規二甲苯脫蠟,經梯度乙醇水化後滅活內源性酶,高壓修復抗原,再經抗原抗體反應後,DAB室溫顯色,蘇木素復染60s,返藍,乾燥,中性樹膠封片,正置顯微鏡鏡下觀察。用Image Pro Plus 6.0軟體計算每張片的平均光密度值(mean density),再進行統計學分析。
2.3.6螢光定量PCR法檢測肝組織中Nrf2,SOD的mRNA表達水平
1.RNA的提取
(1)稱取小鼠肝臟0.1g,加iso plus試劑lml勻漿,靜置5min,離心取上清,轉移至1.5ml無RNAase的EP管中。
(2)每管中加入0.2ml氯仿,上下顛倒混勻,室溫靜置5min。以12000r/min於4℃離心機中離心1 5min,樣品分為三層,下層為淺紅色酚-氯仿層,中間層和無色上層水相,RNA即存在於水相中。一般水相佔細胞勻漿液體積的60%左右。
(3)小心吸取上層水相約600μl移至另一無RNAase的EP管中,加入等體積的異丙醇,上下輕輕顛倒混勻,沉澱水相中的RNA,室溫靜置20min,於離心機內12000r/min、4℃離心10min。
(4)棄上清,加入0.1%DEPC水配製的75%乙醇約lml洗滌RNA沉澱,混勻後於離心機內12000r/min、4℃離心10min。重複一次。
(5)小心棄上清,超淨臺內吹乾RNA沉澱,使乙醇完全揮發。加入40μl DEPC水,用移液槍充分吹打使沉澱溶解,待溶解完全後保存於-80℃冰箱備用。取1μl提取的總RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢查。
2.反轉錄反應
(1)反轉錄前用Thermo Scientific Nano Drop 2000/2000c微量紫外分光光度計測定總RNA純度及濃度。
(2)按以下組分在冰上操作配製RT反應液,見表1。
表1 RT反應液的配製
*根據上述測定的RNA濃度,計算500ng的Total RNA的使用量。
(3)反轉錄反應條件:37℃15分鐘(反轉錄反應);85℃5秒(反轉錄酶的失活反應)。
(4)反轉錄後的cDNA分裝後於-80℃冰箱保存或進一步螢光定量PCR反應,cDNA液的加入量不要超過PCR反應體積的1/10(v/v)量。
3.PCR反應
(1)PCR引物序列、稀釋及儲備液的製備:引物存管離心後,用DEPC處理水稀釋成100pmol/μl的儲備液,每lOμl分裝於PCR管中-80℃保存備用。序列及稀釋成儲各液時加DEPC水的量,見表2。
表2引物序列及稀釋
(2)PCR工作液的配製:取6個EP管,分別標記為Nrf2-F、Nrf2-R、SOD-F、SOD-R、β-actin-F、β-actin-R;每管加入上述儲備液10μl,再加入9μlDEPC水後充分混勻,即製成10pmol/μl的工作液。
(3)按以下組分在冰上操作配製PCR反應液,見表3。
表3 PCR反應液的配製
*1通常引物終濃度為0.2μM可以得到較好結果。反應性能較差時,可以在0.1-1.0μM範圍內調整引物
濃度。
*2在20μl的反應體系中,DNA模板的添加量通常在100ng以下。因不同種類的DNA模板中含有的靶基因的拷貝數不同,必要時可進行梯度稀釋,確定最佳的DNA模板添加量。另外,反轉錄反應的cDNA(RT反應液)作為模板時的添加量不要超過PCR反應液總體積的10%。
(4)PCR條件:預變性:95℃30秒1個循環;PCR反應:95℃變性5秒,60℃退火復性34秒,擴增40個循環;最後72℃熔解10分鐘。
(5)擴增目的基因時加入β-actin引物作為內參對照。
2.4統計學處理
實驗數據均使用SPSS17.0統計軟體進行分析,採用均數±標準差表示。對實驗數據的顯著性檢驗採用單因素方差分析方法,先進行方差齊性檢驗,各組方差齊用LSD進行統計,若方差不齊,用Tamhaneg T2進行統計。P<0.05表示在統計學上有差異性,對P<0.01表示在統計學上有顯著性差異。
3.實驗結果
3.1解酒飲對CCl4致急性肝損傷小鼠的形態學觀察
各組小鼠造模前狀態良好,進食及飲水正常,黑褐色顆粒狀大便,毛色潤澤。造模後,除正常對照組以外,其餘各組小鼠均不同程度表現為反應遲緩,少動,聚堆;其中以模型對照組最為明顯,大便稀軟或不成形,毛髮蓬亂,不潤澤。解酒飲各劑量組狀態較模型對照組好轉。解剖後,觀察肝臟,正常對照組小鼠肝臟顏色鮮紅,質地柔軟;模型對照組小鼠肝臟體積增大,呈土黃色,質地變硬,或可見針尖樣大小結節;解酒飲各劑量組小鼠肝臟形態介於正常對照組與模型對照組之間,保護效果明顯。
3.2解酒飲對CCl4致急性肝損傷小鼠肝臟指數的影響
與正常對照組比較,模型對照組小鼠肝臟指數明顯增高(P<0.05)。與模型對照組比較,解酒飲高劑量組可明顯降低肝損傷小鼠肝臟指數(P<0.05)。見表4。
表4解酒飲對CCl4致急性肝損傷小鼠肝臟指數的影響(n=10)
註:與正常對照組相比,*P<0.05,**P<0.01;與CCl4模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01
3.3解酒飲對CCl4致小鼠急性肝損傷生化指標ALT、AST的影響
通過生化儀測出血清數據顯示,與正常組相比,模型組小鼠血清中ALT、AST的值升高(P<0.01);說明該方法造模成功。與模型組對比,聯苯雙酯組小鼠血清中ALT、AST值下降(P<0.01),解酒飲各劑量組小鼠血清中ALT值下降(P<0.01或P<0.05),解酒飲高劑量組AST活性降低(P<0.05)。解酒飲中、低劑量組AST活性降低但無差別。這說明高劑量組解酒飲可能對CCl4所致的小鼠急性肝損傷有較明顯的保護作用,結果見表5。
表5解酒飲對CCl4致小鼠急性肝損傷ALT、AST生化指標的影響(n=10)
註:與正常對照組相比,*P<0.05,**P<0.01;與CCl4模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01
3.4解酒飲對CCl4致小鼠急性肝損傷ALB、GLB、TP生化指標的影響
肝細胞損害可影響TP與ALB合成。ALB減少常伴有GLB增加,ALB含量與有功能的肝細胞數量呈正比,ALB持續下降,提示肝細胞壞死進行性加重,預後不良。ALB與GLB比值(A/G)下降也是反應肝臟受到損傷的指標之一。從表2看,與模型組比較,儘管各組間ALB、GLB、TP、A/G差異無統計學意義的。但用解酒飲和聯苯雙酯治療後,小鼠ALB、TP、A/G在數值上是回升的,GLB是下降的,這提示治療可能有效果的,只是數值差別不是很大。結果見表6。
表6解酒飲對CCl4致小鼠急性肝損傷ALB、GLB、TP指標的影響(n=10)
註:與正常對照組相比,*P<0.05,**P<0.01;與CCl4模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01
3.5解酒飲對CCl4致急性肝損傷小鼠肝勻漿SOD、MDA、GSH水平的影響
表7的結果表明,模型組肝勻漿MDA水平升高,同時,SOD、GSH的水平降低。給予高劑量解酒飲可以降低肝勻漿MDA水平的升高,低、中劑量組解酒飲對MDA水平無作用。中、高劑量組解酒飲可提高肝勻漿SOD、GSH水平,而低劑量組的解酒飲對SOD、GSH含量無顯著影響。
表7解酒飲對CCl4致小鼠急性肝損傷MDA、SOD、GSH指標的影響(n=10)
註:與正常對照組相比,*P<0.05,**P<0.01;與CCl4模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01
3.6解酒飲對肝組織病理組織學改變的影響
參考圖1可知,正常組肝組織結構基本正常,清晰可見,肝細胞呈放射狀排列整齊,細胞核圓形,核仁清晰,胞質內兒乎無脂滴。模型組模型組肝小葉中央靜脈擴大,肝竇淤血和出血,肝細胞明顯腫脹,瀰漫性肝細胞脂肪變性。陽性對照組肝小葉的組織結構基本接近正常,肝細胞未見明顯腫脹,肝細胞索排列整齊,但仍可見少量充血。低劑量組肝細胞腫脹,大量肝細胞脂肪變性。中劑量組中央靜脈周圍部分肝細胞脂肪變性,病變範圍變小,腫脹程度減輕。高劑量組肝小葉排列較齊,未見明顯的竇腔狹窄,偶見散在肝細胞脂肪變性肝組織病理學檢查正常組小鼠肝小葉和細胞結構正常。模型組小鼠肝組織有更多的炎症和壞死和炎症細胞浸潤,解酒飲治療後,其症狀均減輕。
3.7解酒飲對CCl4致急性肝損傷小鼠肝MnSOD、BCL-2、Caspase-3蛋白表達的影響
參考圖2和表4,MnSOD是一種能夠對抗氧化損傷的金屬酶,它能催化超氧陰離子自由基發生歧化反應,提高機體抗氧化能力。免疫組化切片染色可以看出,四氯化碳造模導致急性肝損傷的肝臟中MnSOD蛋白表達水平下降。與模型組相比較,解酒飲高劑量組的MnSOD表達升高(P<0.01)。這表明解酒飲可以上調MnSOD表達,提高肝臟抗氧化能力,起保護肝損傷作用。
參考圖3和表4,四氯化碳造模能夠引起肝細胞的凋亡。在細胞凋亡過程中,bcl-2家族的調控對減少細胞凋亡起著重要的作用。Bcl-2是細胞膜和細胞質受體,細胞核不著色,經免疫組化染色顯示陽性細胞呈棕黃色的環形,陽性細胞越多,說明bcl-2蛋白表達越高。從圖3和表4可以看出,與模型組相比,解酒飲高劑量組的bcl-2表達升高(P<0.01)。這提示解酒飲可以上調bcl-2蛋白表達的作用,減少細胞的凋亡。
從圖4和表8可以看出,模型組肝細胞胞質內caspase-3呈棕黃色瀰漫表達比較顯著。caspase-3的表達水平在解酒飲各劑量組較模型組降低,其中,高劑量解酒飲caspase-3的表達下降最明顯(P<0.01)。這提示高劑量組的解酒飲可以下調caspase-3蛋白表達的作用,減少細胞的凋亡。
表8解酒飲對小鼠肝MnSOD、BCL-2、Caspase-3平均光密度值比較(n=10)
註:與正常對照組相比,*P<0.05,**P<0.01;與CCl4模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01
3.8螢光定量PCR檢測肝組織中Nrf2、SODmRNA表達的變化
3.8.1 RNA純度分析
280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了總RNA提取液中核酸、背景(溶液渾池度)、鹽濃度和蛋白等有機物的值。一般的情況下,當OD260/OD280的值在1.8-2.0時,可認為RNA中蛋白或者其他有機物的汙染是可以接受的,當比值2.2時,說明RNA已經水解成了單核酸。因此OD260/OD280的比值可以反映所提取RNA的純度。經微量紫外分光光度計分析,各組小鼠肺臟組織提取的總RNA的OD260/OD280比值的平均值均在1.8-2.2之間,符合實驗要求。
3.8.2螢光定量RT-PCR產物的擴增曲線和溶解曲線
參考圖5及圖6,擴增曲線和溶解曲線可以分別反映擴增的效率及擴增產物的純度。本實驗中的擴增曲線表明擴增效率較高,熔解曲線說明擴增產物純度較好。
3.8.3肝組織中Nrf2、SODmRNA表達的變化
表9顯示,與模型組比較,解酒飲各劑量組和聯苯雙酯組肝組織屮Nrf2mRNA、SODmRNA表達的差異均無統計學意義。
表9解酒飲對CCl4致小鼠急性肝損傷Nrf2mRNA、SODmRNA表達的變化(n=10)
註:與正常對照組相比,*P<0.05,**P<0.01;與CCl4模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01
4.討論
CCl4能造成肝臟損傷。在肝臟中,CCl4經肝臟細胞色素P450激活,生成有毒性的三氯甲基自由基,破壞細胞膜結構,它自身的溶酶作用可造成肝細胞脂質過氧化損傷,誘導肝臟病理變化包括肝腫大和血清學變化,伴隨著谷丙轉氨酶(AST),穀草轉氨酶(ALT)活性的增加。因此血清AST和ALT活性被認為是肝損傷最敏感的生物學指標而被廣泛應用於對肝損傷的判斷。本實驗選擇CCl4複製動物模型。按5mL/kg腹腔注射0.3%CCl4橄欖油溶液12小時後,從生化指標結果分析,高劑量的解酒飲有可能抑制CCl4引發的小鼠ALT、AST活性的提高。從指標MDA、SOD、GSH結果發現,解酒飲高劑量組可以降低肝勻漿中升高的MDA水平和提高肝勻漿SOD和GSH水平,這提示解酒飲對CCl4肝損傷的保護作用與抗脂質過氧化和提高機體的抗氧化酶活性有關。
小鼠肝臟病理組織學檢查中,正常組肝臟組織結構正常,肝細胞完整,肝細胞胞漿均勻,核仁清晰。模型組肝臟切片中則發現肝細胞腫大,胞漿疏鬆,細胞核固縮,脂肪空洞,匯管區炎症細胞浸潤等現象。解酒飲各劑量組和陽性對照組較模型組炎症減輕,脂肪空泡減少,其中解酒飲高劑量組除了血管周圍少量肝細胞腫脹之外,肝細胞排列較整齊。
MnSOD是一種能夠對抗氧化損傷的金屬酶,它能催化超氧陰離子自由基發生歧化反應,提高機體抗氧化能力。本實驗研究可以看出急性CCl4導致肝臟中MnSOD蛋白表達水平下降,而在給予解酒飲高劑量的藥物後,MnSOD的表達水平上調(P<0.01)。所以解酒飲可能有抗氧化活性,通過抗氧化應激作用,起到較強的清除氧自由基作用,保護和修復肝細胞病理損傷,從而保護肝臟的結構和功能。
CCl4造模能夠引起肝細胞的凋亡。細胞凋亡是複雜的分子調控過程,在凋亡信號調控中有3個關鍵的調控因素:Caspase家族、Bcl-2基因家族和線粒體。Caspase-3是Caspase家族中最重要的成員,它能在各種程序啟動的凋亡程序中起最後樞紐的作用,也是凋亡發生的標誌酶。Caspase-3表達增加,促進細胞的凋亡。本實驗結果發現,模型組小鼠肝細胞胞質內Caspase-3表達強度顯著高於正常組,聯苯雙酯組和解酒飲高劑量組Caspase-3表達降低(P<0.01),表明解酒飲高劑量組可能通過降低Caspase-3表達,減少肝細胞凋亡。另外,Bcl-2家族相關基因的表達和調控是影響細胞凋亡的關鍵因素之一,Bcl-2基因是一種重要的凋亡抑制基因。Bcl-2表達增加,抑制細胞的凋亡。在細胞凋亡過程當中,Bcl-2家族蛋白參與線粒體自噬/細胞凋亡互調節及線粒體分裂,發揮抗凋亡作用。本實驗免疫組化結果表明,解酒飲各劑量組小鼠肝組織中Bcl-2表達均高於模型組對照組(P<0.01),Bcl-2主要分布於中央靜脈及肝細胞壞死灶周。這提示,高劑量的解酒飲可能通過調節凋亡抑制基因Bcl-2從而起到保護肝臟的作用。
Nrf2是在1994年被發現的一種66000的蛋白質,當時是被作為結合在β-珠蛋白基因啟動子NF-E2重複序列的因子,該轉錄因子是CNC轉錄因子家族的成員,含有一個基本亮氨酸拉鏈結構域。Nrf2是調節抗氧化應激反應的重要轉錄因子,Kelch樣ECH相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein1,Keap1)是其特異性受體。正常情況下,在胞質內Keap1與Nrf2形成複合物以抑制Nrf2的活性。在氧化應激等情況下,Keap1與Nrf2解離,Nrf2發生核轉位進入細胞核,與抗氧化反應元件(antioxidant response elements,ARE)結合,啟動ARE調控的第Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因表達,增強細胞對氧化應激和親核化合物的抗性。ARE調控的抗氧化基因有HO-1、SOD、NQO1等,這些酶能夠保護機體免受活性氧的侵害。激活Keap1/Nrf2/ARE通路,促進SOD等基因的表達,可以減輕氧化損傷。研究表明,Nrf2具有保護肝臟作用。敲除Nrf2後導致肝內氧化應激水平增高,GSH、解毒酶、CAT、SOD水平降低、炎症因子、脂肪酸代謝相關酶、纖維化相關酶活性顯著增高,肝病的發生和進展加速。所以抗氧化治療可以減輕肝臟炎症和纖維化。實驗結果從數值上看,解酒飲各劑量組和聯苯雙酯組肝組織屮Nrf2mRNA、SODmRNA表達均數比模型組均數高,比正常組均數低。可能因為樣本量不夠大,各組之間差異均無統計學意義。如果增大樣本量,解酒飲有可能通過調節Nrf2/SOD通路發揮抗氧化作用。
從中醫學的角度來看,急性肝損傷是歸屬「脅痛」、「黃疸」、「積聚」等範疇,本病邪侵正虛,脾胃功能受損。病理性質有虛實之分,治療大法應清熱解毒,益氣利溼。解酒飲中葛根、枸杞子、葛花、山楂、甘草、女貞子皆具保護急性的肝臟損害的作用。丹參具有促進細胞組織的修復與再生,促進肝臟微循環的作用。女貞子明顯改善肝臟損傷,抗肝纖維化,起到養肝功效。同時甘草渣中的黃酮類化合物具有良好的抗氧化活性,能保護正常細胞免受氧化損傷。而陳皮、黨參對胃腸痙攣有抑制作用,還有抗胃酸分泌,保護胃黏膜,健脾益胃。葛根具有抗氧化作用,山楂對腦缺血再灌注後細胞凋亡具有明顯保護作用,這樣可以減輕因醉酒產生的頭痛。此外枸杞子具有滋補陰,活血化瘀功效和保肝作用。根據中醫理論,解酒飲具有醒脾養肝益胃、解酒毒、祛煩渴、理氣止嘔和升清陽而止頭痛的功效。通過對實驗數據的分析表明,解酒飲能降低脂質過氧化程度,提高人體的抗氧化酶活性,發揮對氧自由基的清除作用,保護氧化應激對肝細胞損傷的病理修復,從而保護肝功能。同時,解酒飲在一定程度上幹預了肝細胞的凋亡的發生和發展,進而起到保護肝臟的作用。
解酒飲對小鼠急性胃黏膜損傷的保護作用實驗
1.材料和方法
1.1實驗動物
昆明種健康小鼠60隻:SPF級,雌雄各半,體質量18~22g,由廣西醫科大學動物中心提供,實驗動物使用許可證:SCXK桂2014-0002,飼養環境溫度為(23±2)℃,溼度為40%~60%。
1.2受試藥物
本發明方法所製備的解酒飲
硫糖鋁咀嚼片:江蘇鵬鷂藥業有限公司,批號:1501152,規格:0.25g/片。
1.3試劑與儀器
95%乙醇:成都市新都區木蘭鎮工業開發區,批號:2014041801;
NO一步法試劑盒:南京建成生物工程研究所,批號:20151104;
TNF-α試劑盒:北京誠林生物科技有限公司,批號:20151211;
IL-6試劑盒:北京誠林生物科技有限公司,批號:20151219;
PGE2試劑盒:北京東亞免疫技術研究所,批號:20041106;
ET-1試劑盒:北京東亞免疫技術研究所,批號:15092503;
BCA法蛋白定量測試盒:南京建成生物工程研究所,批號:20151126;
電子分析天平:型號:EL204,上海梅特勒一立託儀器公司;
酶標儀:型號:SpectraMaxPlus384,Bio-Rad公司;
Olympus生物顯微鏡:型號:CX31+DP73,日本奧林巴斯株式會社;
2方法
2.1藥物的製備
高劑量組用藥:解酒飲流浸膏1g/ml的濃度;
中劑量組用藥:將解酒飲流浸膏用蒸餾水進行2倍稀釋成0.5g/ml的濃度;
低劑量組用藥:將解酒飲流浸膏用蒸餾水進行4倍稀釋成0.25g/ml的濃度;
陽性藥物的製備:硫糖鋁咀嚼片2粒(規格0.25g,共60mg)研磨成粉末,用蒸餾水稀釋至10ml,配製成濃度為0.006g/ml藥物混懸液,用時新鮮配製,搖勻使用。
2.2酒精緻小鼠急性胃黏膜損傷實驗
2.2.1實驗動物分組
健康的60隻昆明種小鼠,4周齡,體重18~22g,適應性餵養一周後,隨機分為模型對照組、空白對照組和解酒飲高、中、低劑量組及硫糖鋁治療組,每組10隻,雄雌各半。
2.2.2給藥及造模
實驗前先禁食24小時,自由飲水。解酒飲組小鼠分別按生藥25g/kg、12.5g/kg、6.25g/kg的劑量灌服解酒飲,硫糖鋁治療組小鼠按600mg/kg的劑量灌服硫糖鋁咀嚼片製成的混懸液,模型組和空白對照組小鼠灌服同體積蒸餾水,每天一次,連續給藥8天。在第7天給藥後,禁食24小時。第8天用藥2小時後,除空白對照組外,其他各組小鼠均按10ml/kg的劑量灌胃給予95%乙醇造模。
2.3實驗動物處理及標本採集
2.3.1小鼠急性胃黏膜損傷指數和抑制率測定
小鼠於造模2h後頸椎脫臼處死,取出胃,沿胃大彎剪開,生理鹽水漂洗乾淨,可見局限於胃黏膜的損傷病灶。置載玻片上,在10倍放大鏡下,拍照並用遊標卡尺測量病灶長度,按改良Guth標準計算損傷指數和抑制率:其中病灶長度﹤1mm為1分,1mm≤病灶長度﹤2mm為2分,2mm≤病灶長度﹤3mm為3分,3mm≤病灶長度﹤4mm為4分,若病灶長於4mm,則分段計分,病灶寬於2mm時,分數乘以2,最後以全胃病灶分數總和作為該動物胃黏膜損傷指數。損傷抑制率採用模型組平均損傷指數和用藥組平均損傷指數之差所得的結果與模型組平均損傷指數的比值。
2.3.2小鼠胃黏膜ET-1、NO的含量測定
剪下損傷嚴重的胃黏膜0.1g,置於0.9ml的冰生理鹽水中,冰浴下進行勻漿,3000r/min離心15min,取上清液體,即為10%的胃組織勻漿液體。根據試劑盒採用酶聯免疫吸附法檢測ET-1含量,一步法檢測NO含量,並用蛋白含量校正。
2.3.3小鼠胃黏膜TNF-α、IL-6、PGE2含量測定
剪下損傷嚴重的胃黏膜0.1g,置於0.9ml的冰生理鹽水中,冰浴下進行勻漿,3000r/min離心15min,取上清液體,即為10%的胃組織勻漿液體。採用酶聯免疫吸附法對TNF-α、IL-6、PGE2含量測定,並用蛋白含量校正。
2.3.4小鼠胃黏膜病理組織學觀察及評分
將損傷最嚴重的胃黏膜部位剪下來,立即固定於10%中性緩衝甲醛。70%、80%、90%、100%乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋後切片,常規脫蠟,HE染色,中性樹膠封片。顯微鏡下觀察胃黏膜的病理組織學的變化。評分方法:以充血、出血、黏膜細胞變性壞死在切片的整個黏膜上皮層的累及程度分為5級。充血權重為1,出血權重為2,上皮細胞變性壞死權重為3,評分標準及病變總積分公式見表10。
2.4統計學處理
實驗數據均使用SPSS17.0統計軟體進行分析,採用單因素方差分析方法,先進行方差齊性檢驗,各組方差齊用LSD進行統計,若方差不齊,用Tamhaneg T2進行統計。P<0.05則在統計學上有差異性,對P<0.01表示在統計學上有顯著性差異。
表10小鼠急性胃黏膜損傷病理切片評分標準
3結果
3.1解酒飲對酒精緻急性胃黏膜損傷小鼠的形態學觀察
各組小鼠造模前狀態良好,進食及飲水正常,黑褐色顆粒狀大便,毛色潤澤。造模後,除正常對照組以外,其餘各組小鼠均不同程度表現先出現興奮狀態,在籠內奔跑,打鬥,爾後見四肢癱軟、行走不穩、臥倒酣睡等中樞抑制狀態,或直接進入中樞抑制狀態。其中以模型對照組最為明顯,解酒飲各劑量組狀態較模型對照組好轉。
3.2解酒飲對小鼠急性胃黏膜損傷指數的影響
表11顯示,解酒飲中、高劑量組的胃黏膜損傷指數分別為12.00±6.68、6.40±3.438,與模型組33.40±14.32比較,均下降。解酒飲低劑量組損傷指數為16.10±9.55,然而其損傷指數下降不顯著(P>0.05)。解酒飲中、高劑量組損傷指數下降差別有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。這提示解酒飲中、高劑量組可以顯著降低胃黏膜的損傷指數來保護胃黏膜。
表11解酒飲對小鼠急性胃黏膜損傷的影響
註:與正常對照組相比,*P<0.05,**P<0.01;與CCl4模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01
3.3解酒飲對小鼠急性胃黏膜損傷胃水腫指數的影響
與正常對照組比較,模型對照組小鼠水腫指數明顯增高(P<0.01)。與模型對照組比較,硫糖鋁組、解酒飲中高劑量組可明顯降低胃黏膜損傷小鼠胃水腫指數(P<0.01)。見表12。
表12解酒飲對小鼠急性胃黏膜損傷胃水腫指數的影響(n=10)
註:與正常對照組相比,*P<0.05,**P<0.01;與CCl4模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01
3.4解酒飲對小鼠胃黏膜ET-1、NO含量的影響
與正常組比較,模型組小鼠在95%乙醇造模2小時後,胃黏膜ET-1含量升高(P<0.01)。與模型組比較,解酒飲中、高劑量組和硫糖鋁治療組ET-1含量明顯降低(P<0.05或P<0.01),而低劑量組ET-1含量也有所下降,但是差異無統計學意義。這表明中、高劑量組解酒飲通過降低ET-1含量來保護胃黏膜作用。
模型組小鼠胃黏膜與正常組相比,NO含量降低(P<0.01)。解酒飲高劑量組、硫糖鋁治療組的NO含量比模型組升高(P<0.05)。解酒飲低、中劑量組NO含量較模型組升高,但差異無統計學意義。這表明高劑量組解酒飲通過升高NO含量來保護胃黏膜作用。見表13。
表13解酒飲對小鼠胃黏膜ET-1、NO含量的影響(n=10)
註:與正常對照組相比,*P<0.05,**P<0.01;與CCl4模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01
3.5解酒飲對小鼠胃黏膜TNF-α、IL-6、PGE2含量的影響
與正常組比較,模型組小鼠胃黏膜TNF-α含量升高(P<0.01)。與正常組比較,模型組胃黏膜組織中的TNF-α含量升高(P<0.01)。與模型組比較,硫糖鋁治療組和解酒飲中、高劑量組TNF-α含量明顯降低(P<0.05)。這表明中、高劑量組解酒飲通過降低TNF-α含量來保護胃黏膜。
模型組與正常組相比,小鼠胃黏膜IL-6含量升高(P<0.01)。解酒飲中、高劑量組和硫糖鋁治療組的IL-6含量比模型組的降低(P<0.05)。這提示中、高劑量組解酒飲通過降低IL-6含量來保護胃黏膜。與正常組比較,模型組小鼠胃黏膜PGE2的值下降(P<0.05)。與模型組相比,PGE2的含量在解酒飲各劑量組均增加,但差異無統計學意義。見表14。
表14解酒飲對小鼠胃黏膜TNF-α、IL-6、PGE2含量的影響(n=10)
註:與正常對照組相比,*P<0.05,**P<0.01;與CCl4模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01
3.6肉眼觀察小鼠急性胃黏膜損傷的情況
參考圖7,在10倍的放大倍率下,與正常組對比,模型組小鼠胃黏膜表面可見明顯的出血、糜爛、點狀潰瘍。與模型組對比,解酒飲高、中、低劑量組和硫糖鋁治療組出血、糜爛、潰瘍較少,解酒飲高劑量組對胃黏膜保護最好。
3.7解酒飲對胃黏膜病理組織學改變的影響
參考圖8,在光鏡下觀察病理組織切片,模型組胃黏膜充血腫脹並脫落,損傷嚴重,可見大量炎細胞浸潤,血管擴大,通透性增加。硫糖鋁治療組和解酒飲各劑量組胃黏膜損傷脫落減輕,炎細胞浸潤較少,血管通透性改變較少。
4討論
高濃度的乙醇是誘發急性胃黏膜損傷的常見物質。95%乙醇入胃後可以直接損傷細胞,破壞胃黏膜-碳酸氫鹽屏障,出現胃黏膜上皮細胞腫脹,氧自由基生成增加,並可致胃酸增多,胃蛋白酶增加等,在胃中,攻擊因子增強,使胃黏膜防禦功能降低了,由一定濃度酒精引發的胃黏膜組織損害,與氧自由基和胃血流量的降低有關。NO作為一種內源性血管擴張劑,對血管舒縮功能和血液的流動性有著重要調節作用,可以有效地增加胃血管的血流,以保持黏膜的完整性和黏膜的防禦功能。NO可以對ET-1的產物和效應產生影響,反過來,ET-1又可以對NO的產物和效應產生影響。這表明NO濃度的增高對ET-1起負反饋作用。其機制可能與NO促進eGMP生成而抑制ET-1生成有關,NO也可拮抗ET-1的血管反應。在血管反應中,ET-1可增加內皮細胞NO的生成,這次促進的反應可以作為負反饋機制調節ET-1誘導的血管收縮反應,抑制ET-1的生產。因此ET-1、NO是作為急性胃黏膜損傷的重要觀察指標。本實驗結果顯示,解酒飲各劑量組損傷抑制率分別為模型對照組的51.8%、64.1%、80.8%,提示解酒飲可以明顯減輕95%乙醇所致的小鼠胃黏膜損傷指數。解酒飲中、高劑量組可以降低小鼠急性酒精性胃黏膜損傷過程中胃組織ET-1含量的異常增高,並可以使胃黏膜降低的NO水平回升。通過增加胃黏膜NO含量、降低ET-1含量,增加胃黏膜血管的血流量,改善胃黏膜血液循環障礙,增強胃黏膜防禦能力和屏障功能。
乙醇致胃黏膜損傷後,可導致中性粒細胞活化,激活中性粒細胞可產生大量自由基,對胃黏膜有損傷作用。TNF-α主要由活化的單核-巨噬細胞產生,它能促進白細胞尤其是中性粒細胞活化,誘導中性粒細胞黏附,釋放氧自由基與過氧化物酶,導致胃血流減少,胃血供的影響進而加重了黏膜的損傷,甚至形成潰瘍。IL-6主要由T、B細胞和單核巨噬細胞分泌的細胞因子,在炎症和免疫調節過程中發揮著重要的作用。體內的IL-6水平升高可導致胃黏膜組織的炎症。IL-6因子可通過誘導磷脂酶-2基因的表達刺激TNF-α因子的產生,在炎症的發生發展中,TNF-α、IL-6在胃黏膜損傷以及炎症的發生共同起協同作用。本實驗結果顯示,模型組小鼠胃黏膜組織TNF-α、IL-6含量顯著高於正常組,說明TNF-α、IL-6的升高與胃黏膜損害有關。解酒飲中、高劑量組和硫糖鋁治療組與模型組相比,TNF-α、IL-6含量則明顯下降,顯示解酒飲中、高劑量組可通過有效降低TNF-α、IL-6含量,減輕胃黏膜的炎性損傷。
PGE2對胃黏膜起著重要的作用,它保護胃黏膜的機制主要通過抑制胃酸分泌和胃泌素的分泌,另一方面可以它還可以促進黏液和碳酸氫鹽分泌。PGE2在胃黏膜保護機制中發揮重要作用,PGE2一方面通過抑制胃酸及胃泌素的分泌保護胃黏膜,另一方面可以促進碳酸氫鈉和黏液的分泌,前列腺素受體可以供及胃豐富的營養物質,加強胃的防禦能力。但實驗結果顯示,解酒飲對小鼠急性酒精性胃黏膜損傷過程中胃黏膜PGE2水平的降低無明顯上升作用,提示解酒飲保護胃黏膜作用可能不是通過直接上調PGE2含量來發揮作用。
綜上所述,按生藥12.5g/kg、25g/kg給予解酒飲,可對小鼠急性酒精性胃黏膜損傷模型,能降低胃黏膜血管的通透性,通過局部血液供應促進抗酒精損傷,提高抗氧化能力和清除氧自由基,減輕酒精對血管內皮細胞結構的破壞作用。
實例2-3的研究數據表明,本發明對肝臟和胃黏膜具有良好的保護作用。
儘管本發明的實施方案已公開如上,但其並不僅僅限於說明書和實施方式中所列運用。它完全可以被適用於各種適合本發明的領域。對於熟悉本領域的人員而言,可容易地實現另外的修改。因此在不背離權利要求及等同範圍所限定的一般概念下,本發明並不限於特定的細節和這裡示出與描述的圖例。