一種用作皮膚填充材料的水凝膠及其製備方法
2023-06-26 02:34:51
一種用作皮膚填充材料的水凝膠及其製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種用作皮膚填充材料的水凝膠及其製備方法。白蠟、矽樹脂、鹽水袋、矽凝膠等皮膚填充材料均存在對組織產生慢性炎症、腫塊以及損傷組織的缺陷，生物相容性差，無法滿足修復要求。本發明向類人膠原蛋白溶液中加入殼聚糖溶液，攪拌反應，加入透明質酸溶液，攪拌反應，加入交聯劑溶液，攪拌反應；恆溫水浴加熱製得水凝膠；類人膠原蛋白為基因工程菌BL21高密度發酵生產的類人膠原蛋白。本發明的水凝膠，採用自組裝和物理/化學交聯兩種方法製成，具有穩定性良好、生物學效價高、可避免外科手術的創傷和減少病人的疼痛的優點，從而真正實現皮膚填充的優勢。
【專利說明】一種用作皮膚填充材料的水凝膠及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種水凝膠，具體涉及一種用作皮膚填充材料的水凝膠及其製備方法。
【背景技術】
[0002]水凝膠是一種高分子網絡體系，性質柔軟，能保持一定的形狀，能吸收大量的水。人體面部美容整形主要有修正皺紋、改善面部輪廓、填平凹陷瘢痕或唇部、修復受傷的組織等，適合人體組織結構，其要求水凝膠不吸收、不脫落、不碎裂，在彌散的環境下能很好地保持水分，有較好的粘度、彈性和柔軟度。當水凝膠被移植到生物體後，由於組織損傷程度不同，很難滿足修復的效果；當水凝膠注射到生物體後，如果水凝膠是環境敏感型的，比如溫度敏感型，在室溫下呈溶膠狀，當溫度達到人體溫度後，水凝膠能形成凝膠，能維持形態且具有良好的生物相容性。因此，可注射式水凝膠作為組織填充材料，其研究、發展和應用具有不可估量的市場前景。製備水凝膠常用的方法有化學交聯和物理交聯兩種。自組裝技術在生物材料領域逐漸成為研究的熱點，可以通過生物分子之間的特異性生物作用力，疏水之間的相互作用，氫鍵相互作用以及靜電相互作用由簡單到複雜，無序到有序的自發過程。因此，採用類人膠原蛋白、殼聚糖和透明質酸為原料，應用自組裝和化學/物理交聯技術來製備水凝膠，成功應用於組織修復材料。
[0003]水凝膠的發展歷經了以下三個發展階段:第一代產品以白蠟注射、脂肪移植、矽樹月旨、塑料海綿等；第二代產品以凝膠植進體為主，如鹽水袋、矽凝膠、假體等。以上兩類產品均存在對組織產生慢性炎症、腫塊以及損傷組織的缺陷，而且凝膠與組織沒有良好的生物相容性，因此不能充分滿足 機體的要求。第三代產品可注射水凝膠作為一種優良的填充材料也得到了一定程度的發展，雖然克服了組織損傷的缺點，但其亦不能做到完全滿足修復的要求。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種用作皮膚填充材料的水凝膠及其製備方法，結合自組裝和物理/化學交聯兩種方法製備更具生物相容性、安全性更高的皮膚填充材料。
[0005]本發明所採用的技術方案是:
一種用作皮膚填充材料的水凝膠的製備方法，其特徵在於:
由以下步驟實現:
步驟一:稱取類人膠原蛋白溶於雙蒸水中，然後向類人膠原蛋白溶液中加入殼聚糖溶液，令類人膠原蛋白與殼聚糖的質量比為(I~6):5，反應溫度控制為-4~0°C，在攪拌條件下反應0.5~Ih ;
步驟二:加入透明質酸溶液，透明質酸與殼聚糖的質量比為(0.1~0.4):1，反應溫度控制為20~30°C，在攪拌條件下反應0.2~0.5h ;
步驟三:加入交聯劑溶液，交聯劑與殼聚糖的質量比是(6~8):1，反應溫度控制為-4~O °C，在攪拌條件下反應0.5~Ih;
步驟四:將反應液放於37°C恆溫水浴鍋中lh，製得水凝膠。
[0006]步驟一中，類人膠原蛋白為基因工程菌BL21高密度發酵生產的類人膠原蛋白。
[0007]步驟一中，殼聚糖為脫乙醯度為90%以上的殼聚糖，質量體積分數為40mg/mL。
[0008]步驟二中，透明質酸為醫用級別的透明質酸，分子量為lOOOOOODa，透明質酸溶液的質量分數為2%。
[0009]步驟三中，交聯劑為甘油磷酸納、α-甘油磷酸鈉或α，β-甘油磷酸納，交聯劑溶液的質量分數為40%。
[0010]所述的一種用作皮膚填充材料的水凝膠的製備方法製備的水凝膠。
[0011]本發明具有以下優點:
本發明所涉及的一種用作皮膚填充材料的水凝膠，是將殼聚糖、透明質酸和類人膠原蛋白結合起來製成的皮膚填充材料，以基因工程菌BL21高密度發酵生產的類人膠原蛋白、殼聚糖和透明質酸為原料，採用自組裝和物理/化學交聯兩種方法製成，具有穩定性良好、生物學效價高、可避免外科手術的創傷和減少病人的疼痛的優點，從而真正實現皮膚填充的優勢，而且水凝膠隨溫度變化實現溶膠-凝膠的轉變過程，最終達到增強皮膚彈性和美容的目的。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1為水凝膠的紅外光譜圖。
[0013]圖中，橫軸為波數(cnT1)，縱軸為透過率(％)，1號線為β_甘油磷酸納曲線，2號線為透明質酸曲線，3號線為水凝膠曲線，4號線為類人膠原蛋白曲線，5號線為殼聚糖曲線。
[0014]圖2為水凝膠的X射線光電子能譜圖。
[0015]圖中，橫軸為結合能(eV)，縱軸為計數(s)，l號線為甘油磷酸納曲線，2號線為水凝膠曲線，3號線為透明質酸曲線，4號線為殼聚糖曲線，5號線為類人膠原蛋白曲線。
[0016]圖3為水凝膠的樣品圖。
[0017]圖中，A、B、C為自組裝纖維的照片圖，D為水凝膠的溶膠圖，E為水凝膠的呈膠圖，F為水凝膠的照片圖。
[0018]圖4為自組裝纖維和水凝膠的掃描電鏡圖。
[0019]圖中，I號為水凝膠的掃描電鏡圖(放大250倍)，2號為水凝膠的掃描電鏡圖(放大100倍)，3號為混合纖維的掃描電鏡圖(放大250倍)，4號為混合纖維的掃描電鏡圖(放大100 倍)。
[0020]圖5為水凝膠注射於小鼠皮下圖。
[0021]圖中，A為注射於小鼠皮下一周後的圖，B為注射於小鼠皮下2周後的圖，C為注射於小鼠皮下6周後的圖，D為注射於小鼠皮下10分鐘後的圖，E為注射於小鼠皮下10分鐘後取出的水凝膠的圖，F為水凝膠從離心管中取出的圖，G為水凝膠在離心管中成膠的圖。
[0022]圖6為水凝膠注射於小鼠皮下後的透射電鏡圖。
[0023]圖中，A (第一周)、B (第二周)、C (第六周)為對照組(注射生理鹽水)的透射電鏡圖，實施例1 (D、G、J、M)，實施例2 (E、H、K、N)，實施例3 (F、1、L、0)為水凝膠的透射電鏡圖。注射於小鼠皮下後分別在第1、2、6、12周取樣，D、E、F為第一周，G、H、I為第二周，J、K、L為第三周，Μ、Ν、0為第四周。圖中I代表膠原纖維，2代表巨噬細胞，3代表中性粒細胞，4代表成纖維細胞，5代表纖維細胞，6代表脂滴，7代表細胞體，8代表炎症細胞。
[0024]圖7為水凝膠注射於小鼠皮下後的免疫組化圖。
[0025]圖中，A (第一周)、B (第二周)、C (第六周)、D (第十二周)為對照組(沒有加⑶68單克隆抗體染色)的免疫組化圖，實施例1 (E、F、G、H)、實施例2 (1、J、Q、L)、實施例3 (M、Ν、0、Ρ)為水凝膠(加CD68單克隆抗體染色)的免疫組化圖。注射於小鼠皮下後分別在第1、
2、6、12周取樣，E、1、M為第一周，F、J、N為第二周，G、Q、0為第六周，H、L、P為第十二周。T代表組織，G代表水凝膠，g-t代表組織與水凝膠界面，FC代表脂肪細胞，PC代表色素細胞。
[0026]圖8為水凝膠注射於小鼠皮下後的H&E染色圖。
[0027]圖中，實施例1 (A、E、1、J)、實施例2 (B、F、G、K)、實施例3 (C、D、H、L)為水凝膠的H&E染色圖。注射於小鼠皮下後分別在第1、2、6、12周取樣，A、B、C為第一周，E、F、D為第二周，1、G、H為第六周，J、K、L為第十二周。
[0028]圖9為本發明反應原理過程圖。
【具體實施方式】
[0029]下面結合【具體實施方式】對本發明進行詳細的說明。
[0030]本發明所涉及的一種用作皮膚填充材料的水凝膠，以基因工程菌BL21高密度發酵生產的類人膠原蛋白、殼聚糖和透明質酸為原料，採用自組裝技術形成自組裝纖維，然後通過交聯劑進行化學交聯，再在-4°C攪拌下進行物理交聯，反應結束後，將反應液放入37°C下靜態放置10-30分鐘， 製備得到水凝膠。
[0031]原料中的類人膠原蛋白採用的是由基因工程菌BL21高密度發酵生產的類人膠原蛋白，與來自動物源提取的膠原蛋白相比，其具有水溶性好、低排異反應、無病毒隱患，結構與人體自身膠原蛋白極其接近的顯著優點。另外，動物源膠原蛋白也可作為原料製造水凝膠。殼聚糖本身具有良好的生物相容性和可降解性，可應用於組織工程領域。透明質酸可直接通過交聯劑製備水凝膠用於注射填充，其具有良好的生物相容性，但是其降解比較快。
[0032]並且，類人膠原蛋白、殼聚糖和透明質酸本身具有良好的生物相容性和可降解性，其本身沒有溫度敏感的性質，通過自組裝技術和化學/物理交聯製備得到的水凝膠具有溫度敏感性，在室溫下呈溶膠狀，即可以注射到要填充部位，當水凝膠在人體溫度環境下自發形成凝膠，其穩定性高，不吸收，不脫落，不碎裂，有較好的粘度，彈性和柔軟度，且有良好的生物相容性，適合用於組織填充。
[0033]具體製備方法如下:
步驟一:稱取類人膠原蛋白溶於雙蒸水中，然後向類人膠原蛋白溶液中加入殼聚糖溶液，令類人膠原蛋白與殼聚糖的質量比為(I~6):5，反應溫度控制為-4~0°C，在攪拌條件下反應0.5~lh。
[0034]其中，類人膠原蛋白為基因工程菌BL21高密度發酵生產的類人膠原蛋白；殼聚糖為脫乙醯度為90%以上的殼聚糖，質量體積分數為40mg/mL。
[0035]步驟二:加入透明質酸溶液，透明質酸與殼聚糖的質量比為(0.1~0.4):1，反應溫度控制為20~30°C，在攪拌條件下反應0.2~0.5h。
[0036]其中，透明質酸為醫用級別的透明質酸，分子量為lOOOOOODa，透明質酸溶液的質量分數為2%。
[0037]上述類人膠原蛋白、殼聚糖和透明質酸三種聚合物混合後，其水體系在溶液中能夠自發的通過自組裝形成混合纖維，其驅動力是多聚陽離子和多聚陰離子通過靜電吸附相互作用、氫鍵相互作用以及疏水相互作用，各共聚物的水體系單獨不具有熱敏凝膠化的性質，同時本身在1_50°C範圍內只能溶解於水中。
[0038]步驟三:加入交聯劑溶液，交聯劑與殼聚糖的質量比是(6~8):1，反應溫度控制為-4~O °C，在攪拌條件下反應0.5~Ih。
[0039]其中，交聯劑為甘油磷酸納、α-甘油磷酸鈉或α，甘油磷酸納，交聯劑溶液的質量分數為40%。
[0040]加入交聯劑進行化學交聯，在-4~O°C條件下攪拌進行物理交聯(冰凍-解凍過程實現)，即採用物理/化學結合交聯的方法進行聯合反應。反應後的水體系具有溫度相應性，即在體溫下可自發形成水凝膠。
[0041]步驟四:將反應液放於37°C恆溫水浴鍋中lh，製得水凝膠。
[0042]實施例1:
步驟一:稱取類人膠原蛋白溶於雙蒸水中，然後向類人膠原蛋白溶液中加入殼聚糖溶液，令類人膠原蛋白與殼聚糖的質量比為1:5， 反應溫度控制為-4°C，在攪拌條件下反應
0.5h0
[0043]其中，類人膠原蛋白為基因工程菌BL21高密度發酵生產的類人膠原蛋白；殼聚糖為脫乙醯度為90%以上的殼聚糖，質量體積分數為40mg/mL。
[0044]步驟二:加入透明質酸溶液，透明質酸與殼聚糖的質量比為0.1:1，反應溫度控制為20°C，在攪拌條件下反應0.2h。
[0045]其中，透明質酸為醫用級別的透明質酸，分子量為lOOOOOODa，透明質酸溶液的質
量分數為2%。
[0046]步驟三:加入交聯劑溶液，交聯劑與殼聚糖的質量比是6:1，反應溫度控制為_40°C，在攪拌條件下反應0.5h。
[0047]其中，交聯劑為β -甘油磷酸納，交聯劑溶液的質量分數為40%。
[0048]步驟四:將反應液放於37°C恆溫水浴鍋中lh，製得水凝膠。
[0049]實施例2:
步驟一:稱取類人膠原蛋白溶於雙蒸水中，然後向類人膠原蛋白溶液中加入殼聚糖溶液，令類人膠原蛋白與殼聚糖的質量比為3:5，反應溫度控制為-2°C，在攪拌條件下反應
0.5h0
[0050]其中，類人膠原蛋白為基因工程菌BL21高密度發酵生產的類人膠原蛋白；殼聚糖為脫乙醯度為90%以上的殼聚糖，質量體積分數為40mg/mL。
[0051]步驟二:加入透明質酸溶液，透明質酸與殼聚糖的質量比為0.2:1，反應溫度控制為25 °C，在攪拌條件下反應0.3h。
[0052]其中，透明質酸為醫用級別的透明質酸，分子量為lOOOOOODa，透明質酸溶液的質
量分數為2%。
[0053]步驟三:加入交聯劑溶液，交聯劑與殼聚糖的質量比是7:1，反應溫度控制為-2 °C，在攪拌條件下反應0.5h。[0054]其中，交聯劑為α -甘油磷酸鈉，交聯劑溶液的質量分數為40%。
[0055]步驟四:將反應液放於37°C恆溫水浴鍋中lh，製得水凝膠。
[0056]實施例三:
步驟一:稱取類人膠原蛋白溶於雙蒸水中，然後向類人膠原蛋白溶液中加入殼聚糖溶液，令類人膠原蛋白與殼聚糖的質量比為6:5，反應溫度控制為0°C，在攪拌條件下反應lh。
[0057]其中，類人膠原蛋白為基因工程菌BL21高密度發酵生產的類人膠原蛋白；殼聚糖為脫乙醯度為90%以上的殼聚糖，質量體積分數為40mg/mL。
[0058]步驟二:加入透明質酸溶液，透明質酸與殼聚糖的質量比為0.4:1，反應溫度控制為30°C，在攪拌條件下反應0.5h。
[0059]其中，透明質酸為醫用級別的透明質酸，分子量為lOOOOOODa，透明質酸溶液的質
量分數為2%。
[0060]步驟三:加入交聯劑溶液，交聯劑與殼聚糖的質量比是8:1，反應溫度控制為0°C，在攪拌條件下反應lh。
[0061]其中，交聯劑為α，β -甘油磷酸納，交聯劑溶液的質量分數為40%。
[0062]步驟四:將反應液放於37°C恆溫水浴鍋中lh，製得水凝膠。
``[0063]對以上實施例的產物進行紅外光譜分析、X射線光電子能譜、掃描電鏡分析、樣品觀察、透射電鏡分析、免疫組化分析和H&E染色分析，其分析結果如下:
1、水凝膠填充材料的紅外光譜分析如圖1所示，與純的類人膠原蛋白、殼聚糖、透明質酸的C=O吸收峰(1644 cm-1,1644 cm-1,1646 cnT1)相比，水凝膠的C=O (1619CHT1)吸收峰發生藍移，且在1413 cnT1處有新的吸收峰，是醯胺鍵(-RC0NHR』 )的C-N伸縮振動的吸收峰。在水凝膠光譜圖中，1619 cnT1和2625 cnT1處吸收峰是新生成的銨鹽(-RNH2+)的吸收峰。
[0064]2、水凝膠填充材料的X射線光電子能譜分析如圖2所示，在N譜中，399.31eV處有新的N結合能生成。在C譜中，在287.85eV處C結合能與純殼聚糖相比減小，與純透明質酸相比增加；在286.2eV處C結合能與純殼聚糖和透明質酸相比均減小。從而證明有新的醯胺鍵(-RC0NHR』 )和銨鹽(-RNH2+)生成。
[0065]3、水凝膠填充材料的樣品如圖3所示，自組裝纖維呈有規則的排布。水凝膠在室溫條件下呈溶膠，在體溫條件下形成凝膠，而且呈類似於果凍狀的乳白色凝膠。
[0066]4、水凝膠填充材料的掃描電鏡分析如圖4所示，自組裝纖維呈有規則的排布。水凝膠呈三維網絡狀的多孔結構，排布比較規整。
[0067]5、水凝膠填充材料注射於小鼠皮下分析如圖5所示，在第一周水凝膠存在於小鼠皮下；第二周水凝膠存在於小鼠皮下，略微有些降解；第六周水凝膠殘留小部分，大部分已經降解完。水凝膠填充材料注射於小鼠皮下10分鐘取出後與從試管中取出後相比，都成乳白色的類似於果凍狀的水凝膠。
[0068]6、水凝膠填充材料注射於小鼠皮下後的透射電鏡分析如圖6所示，實施例一、二和三製備出的水凝膠有膠原纖維和細胞體，與空白對照組(A、B、C)的分析結果一樣，組織相容性良好。
[0069]7、水凝膠填充材料的注射於小鼠皮下後的免疫組化分析如圖7所示，實施例一、二和三製備出的水凝膠，炎症反應最小。
[0070]8、水凝膠填充材料的注射於小鼠皮下後的H&E染色分析如圖8所示，實施例一、二和三製備出的水凝膠，可降解且速率比較慢。
[0071]本發明製得的水凝膠填充材料用於成年雌性ICR小鼠的動物實驗表明:用自組裝和物理/化學交聯法製備出的水凝膠，具有較好的生物相容性和組織相容性，且降解慢，適合用於組織填充。
[0072]本發明的內容不限於實施例所列舉，本領域普通技術人員通過閱讀本發明說明書而對本發明技術方案採取的任何等效``的變換，均為本發明的權利要求所涵蓋。
【權利要求】
1.一種用作皮膚填充材料的水凝膠的製備方法，其特徵在於: 由以下步驟實現: 步驟一:稱取類人膠原蛋白溶於雙蒸水中，然後向類人膠原蛋白溶液中加入殼聚糖溶液，令類人膠原蛋白與殼聚糖的質量比為(I~6):5，反應溫度控制為-4~0°C，在攪拌條件下反應0.5~Ih ; 步驟二:加入透明質酸溶液，透明質酸與殼聚糖的質量比為(0.1~0.4):1，反應溫度控制為20~30°C，在攪拌條件下反應0.2~0.5h ; 步驟三:加入交聯劑溶液，交聯劑與殼聚糖的質量比是(6~8):1，反應溫度控制為-4~O °C，在攪拌條件下反應0.5~Ih; 步驟四:將反應液放於37°C恆溫水浴鍋中lh，製得水凝膠。
2.根據權利要求1所述的一種用作皮膚填充材料的水凝膠的製備方法，其特徵在於: 步驟一中，類人膠原蛋白為基因工程菌BL21高密度發酵生產的類人膠原蛋白。
3.根據權利要求2所述的一種用作皮膚填充材料的水凝膠的製備方法，其特徵在於: 步驟一中，殼聚糖為脫乙醯度為90%以上的殼聚糖，質量體積分數為40mg/mL。
4.根據權利要求3所述的一種用作皮膚填充材料的水凝膠的製備方法，其特徵在於: 步驟二中，透明質酸為醫用級別的透明質酸，分子量為lOOOOOODa，透明質酸溶液的質量分數為2%。
5.根據權利要求4所述的一種用作皮膚填充材料的水凝膠的製備方法，其特徵在於: 步驟三中，交聯劑為甘油磷酸納、α-甘油磷酸鈉或α，甘油磷酸納，交聯劑溶液的質量分數為40%。
6.如權利要求5所述的一種用作皮膚填充材料的水凝膠的製備方法製備的水凝膠。
【文檔編號】C08L89/00GK103755981SQ201410015731
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月14日 優先權日:2014年1月14日
【發明者】李賢 , 範代娣, 馬曉軒 申請人:西北大學