一種合成苦馬豆素的棘豆埃裡格孢菌及其製備方法和應用的製作方法
2023-07-04 02:04:06 3
專利名稱：一種合成苦馬豆素的棘豆埃裡格孢菌及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物技術領域，涉及一種新的棘豆埃裡格孢菌(^^eWiw'a oyWr &)，具體涉及一種能te合成瘋草主要毒素苦馬豆素(Swainsonine， SW) 的棘豆埃裡格孢菌FELla-AVB3，還涉及該菌的製備及其應用。
背景技術：
瘋草(Locoweed)是豆科棘豆屬(Qxy/ropis)和黃芪屬(^^raga/MS)有毒植物的 總稱，也是世界範圍內危害草原畜牧業最嚴重的一類毒草。在我國，瘋草廣泛 分布於西北、華北和西南的廣大草原，危害面積達1100萬hm2，佔全國草場面 積的2.8%。變異黃芪是我國瘋草黃芪屬的一種，主要分布於內蒙古、新疆、甘 肅、青海、寧夏等地；變異黃芪主要危害馬、羊、牛、駱駝等家畜，不僅引起 中毒死亡，還會導致母畜繁殖，公畜發情，影響畜種改良。每年都有很多家畜 因採食該草而中毒，嚴重危害我國西部地區草原畜牧業的發展。
變異黃芪的主要毒性成份是苦馬豆素(Swainsonine， SW)，化學名稱為1,2，8-三羥基八氫吲哚裡西啶(trihydroxyoctahydro-indolizidine)。苦馬豆素可抑制哺乳 動物細胞的溶酶體a -甘露糖苷酶和高爾基體甘露糖苷酶II的活性，導致低聚糖 代謝和糖蛋白合成障礙，從而引起動物組織器官功能紊亂。動物採食變異黃芪 等瘋草後，會發生中毒，導致大批家畜死亡，給畜牧業造成巨大損失。
變異黃芪是豆科草本植物，其營養價值豐富，據報導，其乾物質含量為 91.40%，粗蛋白含量為14.40%，營養價值與優良牧草苜蓿相當。如果能釆取相 應的措施將毒草變為可利用的牧草資源，既可以保護生態環境，防止草地退化，又可促進當地畜牧業的發展，對社會、牧民、生態都有著深遠的意義。
近年來，在變異黃芪的危害、有毒成分、毒理機制、防除和利用等方面的 研究取得了重要進展，但迄今還沒有控制變異黃芪蔓延和防止動物採食變異黃 芪中毒的特效方法，致使動物變異黃芪中毒問題日趨嚴重，成為草原畜牧業的 大患。對於變異黃芪中毒病的治療目前尚無特效療法，關鍵在於預防。其預防 和治療方法與其他瘋草相同。國內學者曾嘗試用人工挖除、焚燒、應用除草劑、 浸泡、生物控制、生態控制、免疫注射、飼料添加劑、投放緩釋丸等。但仍然 在特定地區或季節實施，尚未大面積推廣應用，對主要毒性成份的合成機理和 導致動物中毒的分子機理仍不清楚，因而不能從根本上放出動物瘋草中毒病。
研究發現， 一些植物中的有毒成分與其內部寄生的內生真菌、病原真菌或 汙染的黴菌有關，通過控制植物中的這些微生物可以防止動物中毒。如麥角菌 寄生在牛尾草和黑麥草中，產生很高含量的麥角生物鹼，致使家畜中毒，造成 嚴重的經濟損失。人們通過改良這種牧草，推出不含麥角菌的牛尾草和黑麥草， 從根本上解決了動物牛尾草和黑麥草中毒的問題。通過抑制變異黃芪中合成苦 馬豆素的內生菌的生長可以降低瘋草毒素的含量，不僅能從根本上解決動物變 異黃芪中毒問題，還可以為防治動物瘋草中毒病提供借鑑，對草原毒草的生物 學控制利用和草原生態學研究起到積極作用，具有很好的經濟效益和社會效益。 苦馬豆素具有抗腫瘤作用，不僅能抑制實體瘤的生長和轉移，具有免疫刺 激功能和抗輻射作用，而且能減輕化療和放療對機體造成的不良影響，從而促
進機體的抗腫瘤免疫功能，加拿大已用於ni期臨床試驗。苦馬豆素具有開發抗
腫瘤新藥的良好前景，然而苦馬豆素的來源卻十分匱乏，價格昂貴，遠遠不能 滿足人們研究和臨床醫療的需要。因此，挖掘苦馬豆素的資源，開闢生產苦馬
5豆素的新途徑是解決苦馬豆素匱乏的關鍵環節。
發明內容
針對現有技術中存在的問題與缺陷，本發明的目的在於提供一種合成苦馬 豆素的棘豆埃裡格孢菌，它能有效的合成苦馬豆素，為徹底解決變異黃芪的毒 害奠定基礎，也為研製抗癌新藥提供材料。
為實現上述目的，本發明的技術方案如下
一種合成苦馬豆素的棘豆埃裡格孢菌(fin6eJi/sf/tropj's)FELla-iWB3， 於2008年10月8日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCNO: M208141，保藏地址中國武漢武漢大學。
本發明的另一目的是提供棘豆埃裡格孢菌FELla-AVB3的製備方法，包括下 列步驟
1) 採自甘肅省民勤縣戈壁上生長的整株變異黃芪，用去離子水對其表面 進行清洗後，用滅菌的鑷子將植物的葉、莖、花、種分離，然後將葉、莖、花、 種分別用紗布包紮，進行表面消毒。
2) 用滅菌的濾紙將經表面消毒的植物組織上的水分吸去，再用滅菌的剪 刀將葉、莖、花、種分別剪成3mm大小的組織i央，然後分別用滅菌的鑷子將各 組織塊接種於水瓊脂培養基表面，置培養箱中18 'C培養。
3) 待菌絲從組織塊周圍長出時，挑取菌落邊緣的菌絲接種於富集培養基 表面，置18 。C培養箱中進行富集培養。收集富集培養的真菌菌絲，提取其生物 鹼並應用薄層色譜法和氣相色譜法檢測，用苦馬豆素標準品作對照，檢測菌絲 生物鹼中是否含有苦馬豆素，最後篩選得到可以合成苦馬豆素的棘豆埃裡格孢 菌FELla-AVB3。所述表面消毒的方法為首先用體積分數為75 %的乙醇浸泡20 S;再用
有效氯含量為l %的次氯酸鈉溶液浸泡葉、花2min，浸泡莖、種4min;最後 用滅菌的去離子水衝洗2次，每次1 min。
所述的富集培養基的組分及配比為葡萄糖20g， MgS04*7H20 0.5g， KC1 0.5g， FeS04'7H20 0. Olg， K2HP04 lg，大豆蛋白腖5 g，蒸餾水1 000 mL，瓊 脂13g， pH為6 6.5， 12 rC高壓滅菌20 min。
本發明還有一個目的是提供棘豆埃裡格孢菌FELla-AVB3在合成苦馬豆素中 的應用。
本發明還有一個目的是提供棘豆埃裡格孢菌FELla-AVB3在製藥中的應用。 本發明還有一個目的是提供棘豆埃裡格孢菌FELla-AVB3在製備預防動物瘋 草中毒藥物中的應用。
棘豆埃裡格孢菌FELla-AVB3菌株寄生於變異黃芪的葉、莖、花、種的組織 內部，與變異黃芪共生並且不會引起變異黃芪發生病害，經體外培養發現 FELla-AVB3能夠產生SW，說明其參與著變異黃芪中SW的生物合成，與變異黃芪 的毒性緊密相關，通過抑制FELla-AVB3在變異黃芪中的生長可以降低變異黃芪 中SW的含量，達到減少動物變異黃貧中毒的目的。
棘豆埃裡格孢菌FELla-AVB3菌株經體外培養能夠大量繁殖擴增，並能在人 工培養的條件下合成抗腫瘤活性物質SW，為研製抗癌藥提供了新材料。
圖1 FELla-AVB3菌株的單個菌落形態照片。 圖2 FELla-AVB3菌株的分生孢子的顯微鏡圖。 圖3利用MEGA軟體構建系統進化樹結構圖。圖4苦馬豆素(SW)標準品的氣相色譜圖。
圖5 FELla-AVB3菌絲提取物的氣相色譜圖。
具體實施例方式
以下結合發明人給出的附圖和具體試驗例及具體實施例來進一步說明本發 明菌棘豆埃裡格孢菌FELla-AVB3的有益效果和製備方法。 實施例1:菌棘豆埃裡格孢菌FELla-AVB3的分離篩選
1) 將採自甘肅省民勤縣戈壁上生長的整株變異黃芪用去離子水洗去變異 黃芪表面的塵土，用滅菌的鑷子將植物的葉、莖、花分離，然後將葉、莖、花 分別用紗布包紮，進行表面消毒。 ，
2) 用滅菌的濾紙將經表面消毒的植物組織上的水分吸去，再用滅菌的剪 刀將葉、莖、花等分別剪成3mm大小的組織塊，然後分別用滅菌的鑷子將各組 織塊接種於水瓊脂培養基表面，置培養箱中18 'C培養。
3) 待菌絲從組織塊周圍長出時，挑取菌落邊緣的菌絲接種於富集培養基 表面，置18 。C培養箱中進行富集培養；收集富集培養的真菌菌絲，提取其生物 鹼並應用薄層色譜法和氣相色譜法檢測，用苦馬豆素標準品作對照，檢測菌絲 生物鹼中是否含有苦馬豆素，最後篩選得到可以合成苦馬豆素的棘豆埃裡格孢 菌FELla-AVB3。
實施例2:菌棘豆埃裡格孢菌FELla-AVB3的鑑定 1、形態學特徵
FELla-AVB3菌株的菌落呈圓形，起初為白色，隨著培養時間的延長逐漸轉 變為灰綠色、灰褐色、黑色，中央略突起(圖1)。菌絲體具橫隔，無縱隔，部 分老齡菌絲生出分生孢子梗，少有分支。分生孢子及分生孢子梗具橫隔，無縱 隔，分生孢子的橫隔膜較厚，橫隔數為1 4個不等，孢子呈棒狀，近圓柱形，分生孢子大小為20 80 timX6 12 um(圖2)。 2)培養學的特徵
該菌株在在PDA、 PCA、 Czapek等培養基上生長非常緩慢，其生長速度分別 為0.53， 0. 60和0.40 mm/d，最適生長溫度為18°C,當溫度高於25。C時生長 受到抑制。
所述的PDA、 PCA、 Cz印ek培養基的組分及配比為
PDA培養基去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂13g，蒸餾水1000mL, pH 為6 7， 121。C高壓滅菌20min。
PCA培養基去皮馬鈴薯20g，胡蘿蔔20g，瓊脂13，蒸餾水1000mL， pH 為6 7， 12rC高壓滅菌20min。
Czapek培養基葡萄糖20g， MgS04. 7H20 0. 5g， KC1 0. 5g， FeS04. 7H20 0. Olg， K2HP04 lg， NaN03 2g，蒸餾水1000mL，瓊脂13g， pH為6 6. 5， 121。C高壓滅 菌20 min。
3)分子生物學鑑定
FELla-AVB3菌株ITS-5.8S rDNA序列已在GenBank公開，登錄號為 EU604062。將FELla-AVB3菌株的5.8S rDNA-ITS序列用BLAST與Genbank中 的5.8SrDNA-ITS序列進行同源性比較，以假球殼科(戶/eo^oracefle)的鏈格孢 屬Utemm7'a)、匍柄黴屬(5temp/^/ww)、假格孢屬(7V!7n a)、埃裡格孢屬
(￡m6e//isz'a)、細基格孢屬(C/7oc/aJ/Mm)、突臍蠕孢屬(ExseraW/wmX平臍蠕 孢屬(A)70^^s)、彎孢屬(Cwrvw/an'a)、內臍蠕孢屬(2>ec/w/era)等菌株序列 構建系統發育樹。應用ClustalX 1.83 version和MEGA 4.0軟體採用鄰接法
(neighbor-joining,NJ)構建系統發育樹(圖3)， FELla-AVB3菌株的遺傳進化距
9離與埃裡格孢屬最近，與五m6e/fc/a oj^rro/^ strain DA0M 237697同源性最高，說明該菌在分子系統發育分類學上為棘豆埃裡格孢。
根據形態學特徵、培養特性、系統發育分析，並結合文獻報導，確定該菌為棘豆埃裡格孢菌FELla-AVB3。
試驗例1:菌棘豆埃裡格孢菌FELla-AVB3合成苦馬豆素試驗將FELla-AVB3菌株接種於富集培養基表面，置18 'C培養30d，然後將菌絲刮下，50 。C烘乾，然後稱量菌絲。將乾燥的菌絲研磨成粉後，用濾紙將其包裹放入索氏提取器中用甲醇70 'C加熱提取24h，將甲醇提取液濃縮揮幹得殘渣。用去離子水將殘渣溶解，加入5cm長的AG 50W陽離子交換樹脂柱。先用去離子水洗脫樹脂柱，再用氨水洗脫樹脂柱，收集氨水洗脫液，並將其濃縮揮幹，用甲醇將SW標準品、FELla-AVB3中提取的生物鹼溶解，並分別點樣於矽膠薄層板上，用薄層色譜法檢測。若菌絲生物鹼經薄層色譜分離後具有與SW標準品的顏色和位移相同的斑點，即可確定其對應的真菌可以合成SW。應用氣相色譜法檢測菌絲中SW的含量為89.15 pg/g，其氣相色譜圖如圖5所示。試驗例2:幾種殺菌劑對棘豆埃裡格孢菌FELla-AVB3抑菌試驗
1) 供試菌棘豆埃裡格孢菌FELla-AVB3。
2) 供試殺菌劑50%多菌靈，70%甲基託布津，70%百菌清，50%福美雙，45%萬黴靈，25%丙環唑。
3) 抑菌試驗採用菌絲生長速率測定法測定不同殺菌劑對FELla-AVB3的生長抑制作用。在15mL的滅好菌的PDA培養基中分別加入不同的殺菌劑，配製成含不同殺菌劑的培養基平板。然後將直徑為6 mm的菌苔接入含有殺菌劑的培養基平板上，置於18 'C下培養，以不加殺菌劑的處理作對照。培養15d後測量菌落生長直徑，計算生長抑制率，每個處理重複6次。為了測試不同濃度殺菌劑
對FELla-AVB3的影響，每種殺菌劑採用2種濃度:500嗎/mL或l 000嗎/ mL。菌絲的生長抑制率按下面公式進行計算
菌絲生長抑制率(％)=(對照菌落生長直徑一處理菌落生長直徑)/對照菌落生長直徑XIOO。
4)不同殺菌劑對病原菌生長的抑制作用6種供試殺菌劑對棘豆埃裡格孢菌FELla-AVB3的菌絲生長均有一定程度的抑制作用(表l)。其中25 %丙環唑是6種供試殺菌劑中效果最好的，當供試濃度為500^ig/mL或1 000ug/mL時，25%丙環唑對FELla-AVB3菌絲的生長都有很強的抑制作用；70 %,甲基託布津的抑制作用略低於25%丙環唑，但仍可以達到比較好的效果，隨著濃度的升高，抑制作用越明顯；50%多菌靈，45%萬黴靈的效果較差，且不同濃度之間的抑制效果無顯著性差異;70 %百菌清和50 °/。福美雙抑制率最弱。
表l 不同殺菌劑對棘豆埃裡格孢菌FELla-AVB3菌絲生長的抑制作用
供試殺菌劑濃度(u g/mL).菌落直徑(mm)抑制率(％)
對照組(CK)18.70
50%多菌靈50012.234.76
50%多菌靈100012.135.29
70%甲基託布津5008.554.55
70%甲基託布津10007.162.03
70 %百菌清50014.522.46
70 %百菌清100014.22楊
50 %福美雙50015.716.04
50 %福美雙100015.119.25
45 %萬黴靈500U.339.57
45 %萬黴靈100011.140.64
25 %丙環唑5007.162.03
25 %丙環唑10006.366.31
由表l可以看出25%丙環唑是6種供試殺菌劑中效果最好的，當供試濃度為500
y g/mL或l OOOu g/mL時，25 。/。丙環唑對FELla-AVB3菌絲的生長都有很強的抑制作用；70%甲基託布津的抑制作用略低於25%丙環唑，但仍可以達到比較好的效果，隨著濃度的升高，抑制作用越明顯；50%多菌靈，45%萬黴靈的效果 較差，且不同濃度之間的抑制效果無顯著性差異；70 %百菌清和50 %福美雙抑制
1權利要求
1. 一種合成苦馬豆素的棘豆埃裡格孢菌(Embellisia oxytropis)FEL1a-AVB3，保藏號為CCTCC NoM208141。
2. 權利要求l所述的棘豆埃裡格孢菌FELla-AVB3的分離方法，其特徵在 於，包括下列步驟1) 將採自甘肅省民勤縣戈壁上生長的整株變異黃芪用去離子水洗去變異 黃芪表面的塵土，用滅菌的鑷子將植物的葉、莖、花、種分離，然後將葉、莖、花、種分別用紗布包紮，進行表面消毒；2) 用滅菌濾紙吸去經表面消毒的植物組織上的水分，再用滅菌的剪刀將 葉、莖、花、種分別剪成3mm大小的組織塊，然後分別用滅菌的鑷子將各組織 塊接種於水瓊脂培養基表面，置培養箱中18 'C培養；3) 待菌絲從組織塊周圍長出時，挑取菌落邊緣的菌絲接種於富集培養基 表面，置18 'C培養箱中進行富集培養；收集富集培養的真菌菌絲，提取其生物 鹼；4) 應用薄層色譜法和氣相色譜法對菌絲中提取的生物鹼進行檢測，用苦 馬豆素標準品作對照，檢測菌絲生物鹼中是否含有苦馬豆素，從而篩^t得到能 夠合成苦馬豆素的棘豆埃裡格孢菌FELla-AVB3。
3. 根據權利要求2所述棘豆埃裡格孢菌FELla-AVB3的分離方法，其特徵 在於，所述表面消毒的方法為首先用體積分數為75 X的乙醇浸泡20s;再用 有效氯含量為l %的次氯酸鈉溶液浸泡葉、花2min，浸泡莖、種4min;最後 用滅菌的去離子水衝洗2次，每次1 min。
4. 根據權利要求2所述棘豆埃裡格孢菌FELla:AVB3的分離方法，其特徵在於，所述的富集培養基的組分及配比為葡萄糖20g， MgS04.7H20 0.5g， KC10.5g， FeS04. 7H20 0. Olg， K2HP04 lg，大豆蛋白腖5 g，蒸餾水1 OOOmL，瓊脂13g， pH為6 7， 12rC高壓滅菌20min。
5. 權利要求1所述的棘豆埃裡格孢菌FELla-AVB3在合成苦馬豆素中的應用。
6. 權利要求1所述的棘豆埃裡格孢菌FELla-AVB3在製藥中的應用。
7. 權利要求1所述的棘豆埃裡格孢菌FELla-AVB3在製備預防動物瘋草中毒藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種合成苦馬豆素的棘豆埃裡格孢菌FEL1a-AVB3，於2008年10月8日在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號CCTCC NOM 208142。還公開該菌株的分離方法。FEL1a-AVB3菌株寄生於變異黃芪的葉、莖、花、種的組織內部，與變異黃芪共生並且不會引起變異黃芪發生病害，經體外培養發現FEL1a-AVB3能夠產生SW，說明其參與著變異黃芪中SW的生物合成，與變異黃芪的毒性緊密相關，通過抑制FEL1a-AVB3在變異黃芪中的生長可以降低變異黃芪中SW的含量，達到減少動物變異黃芪中毒的目的。
文檔編號C12N1/14GK101486973SQ20091002108
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月10日 優先權日2009年2月10日
發明者餘永濤, 王建華, 王建娜, 耿果霞, 趙清梅 申請人:西北農林科技大學