一種提高動物繁殖力的抑制素dna疫苗及製備與應用的製作方法

2023-06-23 07:13:16

專利名稱：：一種提高動物繁殖力的抑制素dna疫苗及製備與應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及動物抑制素DM疫苗的構建及應用，特別是涉及一種無抗生素基因殘留的提高動物繁殖力的豬霍亂沙門氏菌抑制素DNA疫苗及製備方法與應用。
背景技術：
：抑制素(inhibin—INH)是由卵巢分泌的糖蛋白質激素，能抑制垂體促卵泡素(FSH)的分泌，對於卵泡發育的調節具有重要作用。許多實驗證明，應用INH主動或被動免疫動物，均能促進卵泡發育、誘導多排卵、提高產仔數，並能誘導單胎動物孿生(MedanMS，等.Theeffectofactiveimmunizationagainstinhibinongonadotropinsecretionsandfolliculardynamicsduringtheestrouscycleincows.JReprodDev.2006，52(1):107-13;MedanMS等.EffectofactiveimmunizationagainstinhibinonhormonalconcentrationsandsemencharacteristicsinShibabucks.Theriogenology-2006,65(4):691-702;MedanMS等.Passivei鵬uno-neutralizationofendogenousinhibinincreasesovulationrateinminiatureShibagoats.JR印rodDev.2004,50(6〉705-10)。眾所周知免疫原製備很困難對於天然的免疫原，目前仍存在分離純化困難的問題；人工合成或重組的抑制素免疫原存在工作量大，成本高的難題。為解決這些困難，申請人自1998年開始，開始了抑制素DNA疫苗的研究，先後構建了7種I朋真核表達質粒，並比較了各種疫苗的免疫效果和安全性(姜勳平，等.抑制素基因免疫對小鼠生殖的影響.中國獸醫學報，2002，22(4):368-9;茆達幹，等.抑制素a(1-32)基因免疫對大鼠卵泡發育和生殖激素的影響..中國農業科學，2003,36(12):1554-9:張德坤，等.抑制素基因免疫誘導單胎綿羊孿生的研究.中國農業大學學報，2004，9(4):40-5參考文獻)。但是，由於以前構建的抑制素融合表達質粒(pCIS)中①含有卡那黴素基因或氨苄青黴素基因等抗性基因；②克隆後的質粒DNA必須提取、純化才能用於免疫，提純的成本很高；③免疫途徑局限於肌肉注射，使用不太方便，只能用於實驗研究，而不能用於產品開發。針對卵泡抑制素(INH)基因免疫和其他基因疫苗研究中存在的共性問題，本項目利用天冬氨酸半乳糖脫氫酶基因(asd)-減毒沙門氏菌載體-宿主平衡致死系統(以下簡稱平衡致死系統)替換現有抑制素真核表達質粒中的抗性基因，構建不含抗性基因的真核表達質粒得到一種新型抑制素咖A疫苗。本發明對於提高卵泡抑制素基因免疫的安全性和效果，降低生產成本，簡化使用程序等，均具有重要意義。
發明內容本發明的任務在於克服5見有技術的缺陷，研製一種提高動物繁殖力的無抗生素基因殘留的豬霍亂沙門氏菌抑制素DNA疫苗。本發明的目的還包括獲得一種無抗性基因的真核表達質粒和將上述DNA疫苗應用於動物(小鼠)上，以提高其繁殖力，其中包含產仔數'泌乳力以及仔鼠成活率等關鍵技術指標的提高。本發明是這樣實現的申請人通過製備，獲得了一株含有抑制素真核表達質粒PXAIS的豬霍亂沙門氏菌(5a/mweLae加erj'casv.OoJe2-ses"i59C500/pXAIS'該菌株於加08年10月30日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCCNO:M208195。申請人:利用上述保藏的菌株直接生產出豬霍亂沙門氏菌抑制素DNA疫苗。在本發明的技術方案中，表達豬抑制素融合基因IS的表達質粒pXAIS是這樣構建的首先將質粒pVAXl用pWII內切酶進行消化，從質粒PYA3493中擴增得到天冬氨酸半乳糖脫氫酶基因的核苷酸序列插入到pVAXl質粒中，得到不含卡那黴素的真核表達質粒載體pYAX—asd,將抑制素融合表達質粒PCIS中酶切回收得到B肝表面抗原和抑制素a(1-32)的融合基因，再將該融合基因插入到真核表達質粒載體pVAX-asd中，得到抑制素真核表達質粒pXAIS。申請人建立一種提高動物繁殖力的豬霍亂沙門氏菌抑制素DNA疫苗的製備方法，其步驟如下(1)將質粒pVAXl用pVUII內切酶進行消化，從質粒PYA3493中擴增得到天冬氨酸P-半乳糖脫氫酶基因的核苷酸序列插入到pVAXl質粒中，得到不含卡那黴素的真核表達質粒載體pVAX—asd;(2)將抑制素融合表達質粒PCIS中酶切回收得到B肝表面抗原和抑制素a(1-32)的基因，將該融合基因插入到真核表達質粒載體pVM—asd中，得到抑制素真核表達質粒pXAIS;(3)用抑制素真核表達質粒pXAIS轉化豬霍亂沙門氏菌C500，得到保藏號為CCTCCNO:M208195豬霍亂沙門氏菌(5a^o"e/7ae/JfericaC力o7eraesu/s^C500/pXAIS;(4)擴大培養步驟(3)的豬霍亂沙門氏菌，得到豬霍亂沙門氏菌抑制素DNA疫苗。更詳細的技術方案見《具體實施方式》。本發明的豬霍亂沙門氏菌抑制素DNA疫苗不含卡那黴素基因，在應用上比現有的抑制素DNA疫苗具有更好的安全性，其製備工藝簡單，不需要經過純化等製備步驟。圖l:是本發明所克隆的天冬氨酸半乳糖脫氫酶基因(asd)的基因片段的擴增圖譜，圖中M:250bp的DNAmarker;l—4:以PYA3493為模板用asd的primers擴增得到的目的片段；5:以水為模板用asd的primers擴增得到的結果。圖2:是真核表達質粒載體pVAX—asd酶切鑑定圖譜，圖中M:250bp的DNAmarker;1:真核表達質粒載體pVAX—asd通過pVUII進行酶切的結果。圖3:是本發明抑制素真核表達質粒pXAIS的構建圖譜。圖4:是抑制素融合基因IS回收後的圖譜lanel—5:從抑制素融合表達質粒PCIS上用Me/和ffi/w!Z7/進行雙酶切回收後的結果；M:250bp的DNAmarker。圖5:是抑制素真核表達質粒pXAIS酶切鑑定圖譜M:250bp的DMmarker;1:pXAIS通過MeJ和ffi"^JJJ雙酶切得到的結果。圖6:添加抗生素對以豬霍亂沙門氏菌C500為載體的抑制素DNA疫苗的影響圖左側為在添加卡那黴素抗生素的LB固體培養基培養的以豬霍亂沙門氏菌C500為載體的抑制素DNA疫苗；圖右側為在不添加任何抗生素的LB固體培養基培養的以豬霍亂沙門氏菌C500為載體的抑制素DNA疫苗。圖7:是抑制素真核表達質粒PXAIS在PK15細胞中轉染48小時後通過RT-PCR進行轉錄水平的檢測結果泳道l:無質粒轉染的PK15細胞；泳道2:真核表達質粒載體pVAX—asd轉染後RT-PCR結果；泳道3-5:抑制素真核表達質粒PXAIS轉染後的RT-PCR結果。圖8:是抑制素真核表達質粒pXAIS在PK15細胞中轉染48小時後的蛋白表達間接免疫螢光檢測結果圖8A:抑制素真核表達質粒pXAIS在PK15細胞中表達情況檢測有螢光，顯示該融合蛋白有免疫活性；圖8B:真核表達質粒載體pVAX—asd在PK15細胞中表達情況檢測無螢光；圖8C:無質粒轉染的細胞檢測為無螢光(空白對照)。圖9:昆明鼠免疫後不同時間的抗抑制素IgG抗體滴度檢測免疫後兩周試驗組的IgG抗體水平明顯高於其他對照組，而在加強免疫後抗體水平沒有顯著差異。圖10:是昆明鼠免疫後不同時間段的抗抑制素IgG分型抗體水平檢測免疫後兩周試驗組的IgGl和IgG2a的抗體水平均高丁其他免疫組的，且lgG2a的0D值高於IgGl，而在4、6周兩種分型的OD值幾乎無差異。具體實施方式實施例1真核表達質粒載體pVAX—asd的構建1、天冬氨酸e-半乳糖脫氫酶基因(asd)基因克隆及序列分析採用Primer5.0引物設計軟體，根據GenBank(AF015781)登錄的沙門氏菌asd基因序列，設計了引物對(正向引物PIATGCAGCTGGCACATCTCTTTGCAGG;反向引物P2TTACAGCTGCTACGCCMCTGGCGCA)，以PYA3493質粒(KangHY等,I咖imeresponsestorecombinantpneumococcalPspAantigendeliveredbyliveattenuatedSalmonellaentericaserovartyphimuriumvaccine.InfectImmuti,2002,70(4):1739-49.)為模板，通過PCR方法克隆鼠傷寒沙門氏菌的asd基因片段。鼠傷寒沙門氏菌與豬霍亂沙門氏菌的asd基因同源性為100%，其cDNA開放閱讀框為1107bp，編碼368個胺基酸。以PYA3493質粒為模板，對asd基因片段盡行擴增；反應總體積20HL，其中含MgCl2(購自Toyobo公司)2uL引物(lOpmol/iiL上海生工生物工程技術有限公司合成)各0.5uLdNTPMixture(各lOmM,購自Toyobo公司)1ixLTaq酶(40U/PL，購自Toyobo公司)0.5uL模板0.5uL10XTaq緩衝液(購自Toyobo公司)1nL雙蒸水使反應總體積20uL。按以下條件進行PCR反應94'C變性4min，然後94。C變性lrain、60°。退火45sec、"72。C延伸1min，35個循環後72'C再延伸7min。最後，將PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，以DL2000作為分子量標準，觀察電泳結果。(見圖1)2、酶切和連接用PCR產物純化試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司)，參照試劑盒使用說明書將PCR擴增產物回收和純化。純化後的PCR產物與質粒載體PVAX分別用"K"//內切酶進行酶切。酶切體系10XH緩衝液(購自Toyobo公司)5uLasd(或pVAX)20uLp吸Z7(購自Toyobo公司)為2nL雙蒸水至總體積50uL，37°C，反應3-5h,酶切後用低融點瓊脂糖凝膠電泳分離回收1107bp的asd目的片段和2640bp的pVAX片段。然後按如下體系進行連接反應，連接目的片段和載體，連接體系為10Xligase緩衝艱(購自Toyobo公司)2jiLssd6"pVAX2uLT4DNA連接酶(購自Toyobo公司)1nL雙蒸水至總體積20yL，16。C過夜。連接產物-2(TC保存，備用。3、感受態細菌的製備和重組質粒轉化感受態細菌1)採用常規的CaCl2法(J,薩姆布魯克，D.W.拉賽爾，分子克隆實驗指南[M].第三版，北京科學出版杜，2002)製備新鮮感受態細菌大腸桿菌6097(NakayamaK等，ConstructionofanAsd+expression-cloningvector:stablemaintenanceandhighlevelexpressionofclonedgenesinaSalmonellavaccinestrain.Bio/Technology1988.6:693-697)。具體步驟如下(1)從含二氨基庚二酸MP(DAP終濃度為50ug/mL)的LB平板上(1LLB固體培養基組成10g氯化鈉、5g酵母提取物、10g胰蛋白腖，15g瓊脂粉，PH7.0)挑取新活化的缺失asd基因的fsc力e2"ic力j'acWi單菌落，接種於10mLLB液體培養基中(DAP終濃度為50ug/mL)(1LLB液體培養基組成10g氯化鈉、5g酵母提取物、10g胰蛋白腖，pH7.0),37'C下振蕩培養12h左右,直至對數生長後期即0D6。。>0.5時。將該菌懸液以1:100(體積比)接種於100mLLB液體培養基中，37。C振蕩培養2.5h至0DM。=0.5左右。(2)培養液轉入離心管中，冰上放置lOmin,然後於4'C下3000g離心lOmin。(3)去上清，用預冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10mL輕輕懸浮細胞,冰上放置30min後，4'C下3000g離心lOmin。(4)棄去上清,加入4mL預冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置lOmin,即成感受態細胞懸液。(5)將感受態細胞分裝成100ixL的小份,可以立刻用於轉化，或者將其貯存於-70'C下，備用。2)用熱休克法(J.薩姆布魯克，D.W.拉賽爾，分子克隆實驗指南[M].第三版，北京科學出版社,2002)將連接產物轉化感受態細菌DH5a，步驟如下(1)從-7(TC冰箱中取100wL感受態細胞懸液,置於冰上融解。(2)加入連接產物DNA溶液，輕輕搖勻，冰上放置30min後。(3)42'C水浴中熱擊90s，熱擊後迅速置於冰上冷卻3min。(4)向管中加入400uLLB液體培養基，混勻後37。C振蕩培養lh,使細菌恢復正常生長狀態，並表達DNA編碼的氨苄抗生素抗性基因。(5)將上述菌液搖勻後取100ul塗布於不含DAP(DAP終濃度為50ug/mL)的篩選平板上，正面向上放置半小時,待菌液完全被培養基吸收後倒置培養皿，37'C培養16-24h。4、陽性克隆的篩選、鑑定與測序從上述(5)的平板中挑取陽性克隆，接種於不含DAP的LB液體培養基培養，用質粒小量試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司)抽提質粒(參照試劑盒使用說明書〉，/^〃//酶切，酶切體系為10XH緩衝液(購自Toyobo公司)1.6uL，提取的重組質粒9uL,p吸Z7為0.8uL，力卩ddH20至總體積16uL,37'C，反應2-3h，觀察酶切結果，電泳條帶與目的條帶大小相符，送上海英駿生物技術有限公司測序。獲得真核表達質粒載體pVAX—asd。(見圖2)實施例2抑制素真核表達質粒pXAIS的構建(見圖3)1、真核表達質粒載體pVAX—asd提取與純化從LB平板上挑取新活化的真核表達質粒載體pVAX—asd單菌落，接種至lOmLLB液體培養基中，37'C、240rpra培養過夜，按體積比1:250的比例稀釋到適當體積LB中，繼續培養12h，離心收集菌體，抽提純化真核表達質粒載體pVAX—asd。2、抑制素融合基因片段製備採用本申請人以前構建的抑制素融合表達質粒PCIS(HanL等，DevelopmentandevaluationofanovelDNAvaccineexpressinginhibinalpha(1-32)fragmentforimprovingthefertilityinratsandshe印.Animalreproductionscience,2008，109(1-4):251-65)通過Afteif卩A7"oT77雙酶切可以得到858bp的抑制素與B肝表面抗原(Davis等，DM-basedimmunizationforHepatitisBinducescontinuoussecretion269ofantigenandhighlevelsofcirculatingantibody,Hum.Mol.Genet.1993(2):1847-1851)融合基因片段IS(見圖4)。3、抑制素真核表達質粒的連接將純化、回收得到的抑制素融合基因片段IS和真核表達質粒載體pVAX—asd分別按如下體系進行池e/J和ffi/K/JJ/雙酶切。反應體系為10XH緩衝液(購自Toyobo公司)5uL、IS15uL(或真核表達質粒載體pVAX—asd20uL)、順e//和^//^///分別為1.5uL、加雙蒸水至總體積50uL，37°C,反應3-5h，酶切後，用低融點瓊脂糖凝膠電泳分離回收858bp的抑制素融合基因片段IS和3780bp的真核表達質粒載體pVAX—asd大片段。然後按如下體系進行連接反應10X連接緩衝液(購自Toyobo公司)2uL、IS6uL、真核表達質粒載體pVAX—asd大片段3"L、T4DNA連接酶(購自Toyobo公司)1wL、加雙蒸水至總體積20uL,4°C過夜。4、參照通用的甘油法(J.薩姆布魯克，D.W.拉賽爾，分子克隆實驗指南[M].第三版，北京科學出版杜，2002)製備新鮮感受態豬霍亂沙門氏菌C500，具體步驟如下1)將豬霍亂沙門氏菌C500置於LB培養基上，在37'C下過夜培養；2)將過夜培養液按1:100體積比接種50ralLB液體培養基；3)37°C下200r/min培養至OD6。。達0.3-0.4，一般需要2.5-3小時;4)細胞在4。C5000g下離心15分鐘，棄上清液；5)用預冷的50ml去離子水輕輕懸浮菌體；6)重複上步驟2次，去離子水體積分別為25ml和12.5ml;7)細胞在4°C5000g下離心15分鐘，棄上清液收集菌體；8)用50ml滅菌的、冰冷後的10%甘油輕輕懸浮細胞；9)細胞在4。C5000g下離心15分鐘，棄上清液；10)照上面步驟重複三次，10%甘油體積分別為50,25,12.5ml;11)最後於4°C7500r/min離心15rain收穫細胞；11)沉澱細胞中加入0.25ml冰預冷的10%甘油重懸；12)將細胞按40ul等份裝入微量離心管，於-80'C保存備用。5、將連接產物電轉化入豬霍亂沙門氏菌的感受態細胞，方法如下1)在冰上解凍電感受態細胞，冰上培育約5分鐘；2)添加10lil連接產物，冰上培育約5分鐘；3)轉移混合物至冷卻後的電轉杯中；4)對電轉杯進行脈衝，時間4秒(脈衝電阻200Q，電容25uFd，電壓2.0千伏)；5)立即添加1000u1的SOC培養基(蛋白腖20g，酵母提取物5g,氯化鈉0.5g,1mol/L氯化鉀2.5tnl，溶於1L水中高壓滅菌，只是在培養基冷卻到室溫後，除了加10ml滅過菌的lnrol/L氯化鎂外，再加20ml滅菌的lmol/L葡萄糖(18g葡萄糖溶於足夠水中，再用水補足到100ml，用0.22um的濾膜過濾除菌)。6)37°C下培養1小時以復原；7)轉移細胞至相應的LB固體培養基上培養。6、抑制素真核表達質粒(pXAIS)和以豬霍亂沙門氏菌C500為載體的抑制素DNA疫苗的篩選和鑑定挑取陽性克隆，接種於LB液體培養，提取質粒DM,迸行酶切鑑定，分別用Nhel和Hi/riin、雙酶切鑑定重組質粒，酶切體系為10XHbuffer2wL、提取的重組質粒9"L、N力el和Hi/jdlII分別為0.5uL、加ddH20至總體積20wL,37°C,反應3-5h，1.2%瓊脂糖電泳檢測，電泳條帶與目的條帶大小相符(見圖5)，送上海英駿生物技術有限公司進行測序，得到鑑定正確的抑制素真核表達質粒pXAIS和以豬霍亂沙門氏菌C500為載體的抑制素DNA疫苗。7、以豬霍亂沙門氏菌C500為載體的抑制素DNA疫苗的卡那黴素抗性檢測將篩選鑑定正確的豬霍亂沙門氏菌C500為載體的抑制素DNA疫苗分別進行添加和不添加卡那黴素培養，結果顯示，添加了卡那黴素的LB液體培養基中的豬霍亂沙門氏菌C500為載體的抑制素DNA疫苗沒有生長，而沒有添加卡那黴素的LB液體培養基中的豬霍亂沙門氏菌C500為載體的抑制素DNA疫苗則正常生長(見圖6)。實施例4:抑制素真核表達質粒pXAIS質粒在體外蛋白表達的檢測1、抑制素真核表達質粒pXAIS轉染細胞後轉錄水平的檢測用質粒提取試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司)抽提質粒，待PK15細胞(野豬正常腎臟的細胞)單層長至60%-70%時按脂質體轉染試劑盒(購自Invitrogen公司)說明書進行轉染。轉染PK15細胞48h後，用胰酶消化並收集細胞。按照Trizol(購自Invitrogen公司)使用說明書提取細胞的mRM'反轉錄獲得cDM,根據抑制素引物進行擴增。以反轉錄得到的cDNA為模板，用INHprimers(INHP1:TGCTGGATATCTGCAGAATTCCCT，INHP2:CTTCTCGAGATCTGTGGCAGTCGG。這引物是由上海生工生物工程技術有限公司合成)進行INH目的片段的擴增。經r/6瓊脂糖電泳檢測可發現一條858bp左右的片段(見圖7),經上海生丄生物工程技術有限公司測序鑑定該片段為抑制素目的片段，片段全長為858bp。2、抑制素真核表達質粒pXAIS體外表達的檢測將待檢測細胞(瞬吋轉染細胞)用PBS緩沖液(8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HP04和0.24gKH2P04,溶於800ml蒸餾水中，用HC1調節溶液的pH值至7.4，最後加蒸餾水定容至1L即可)洗滌3次，100%甲醇室溫固定10min,PBS緩衝液洗滌3次，用含10%牛血清的PBS封閉30min，然後依次分別與鼠抑制素單克隆抗體(購自Thermo公司，貨號為MS-1863-S0)和FITC標記的羊抗鼠二抗(購自武漢博士得生物工程有限公司)37'C作用各30rain,其間用PBS緩衝液洗滌，與二抗反應後在用PBS緩衝液洗滌3次，直接於螢光顯微鏡下鏡檢(型號Olympus，1X70)。抑制素真核表達質粒pXAIS在轉染PK15細胞48h後，通過間接免疫螢光方法檢測質粒是否在真核細胞中表達。結果表明PBS緩衝液及真核表達質粒載體pVAX—asd質粒轉然後的細胞用抑制素抗體檢測後通過螢光顯微鏡沒有發現綠色螢光，而抑制素真核表達質粒pXAIS轉染的細胞經檢測後發現綠色螢光(見圖8)。這結果表明抑制素真核表達質粒pXAIS轉染真核細胞後表達的融合蛋白具有抑制素免疫活性。3、ELISA法檢測細胞表達產物的免疫學活性包被待測樣每孔100nL,用PH9.6,0.05M碳酸鹽包被緩衝(Na2C031.59克，NaHC(h2.93克，加蒸餾水至1000ral)液稀釋的抑制素抗原濃度為100ng/100uL包被作陽性對照，4匯過夜；自動洗板機上用PBST緩衝液(KH2P04-0.2克，Na2HP04■12H20-2.9克，NaCl-8.0克，KC1-0.2克，TVeen-200.05%_0.5ml，加蒸餾水至1000ml)洗6次，然後每孔加封閉液(牛血清白蛋白-BSA0.1克加洗滌緩衝液至100ml)200uL,37'C反應lh;洗滌，加鼠抑制素單克隆抗體100uL，37'C反應lh;洗滌，加兔抗鼠IgG-HRP(1:5000,購自武漢博士德公司)100ul/孔，反應l小時；洗滌，加入150uLT肥底物液(0.2MNa2HP0-(28.4g/L)25.7ml，0.1M檸檬酸(19.2g/L)24.3ml，加蒸餾水50ml即為100ml的底物緩沖液；0.75%TMB即稱取37.5呢溶於5ral無水乙醇；A液:0.75mlTMB0.75%+6.75ralddH20—7.5ml;B液:7.5ral底物緩衝液+45ul過氧化脲一7.5ral)顯色，37。C反應25分鐘；力[]50uL2raol/L1^04終止反應，於酶標儀上測0D站。值。收集抑制素真核表達質粒PXAIS轉染48h後的PK15細胞製備待測樣，包被待測樣每孔100UL，包被抑制素100ng/100uL作陽性對照，OD咖值PBS〈抑制素真核表達質粒pXAIS〈抑制素抗原100ng,抑制素真核表達質粒pXAIS與抑制素抗原所測得的OD值差異較小，且大於PBS及真核表達質粒載體pVAX—asd對照組2倍以上，提示抑制素真核表達質粒pXAIS均具有抑制素的免疫學活性(表1)。表l轉染48小時後通過ELISA方法檢測重組蛋白的表達情況的OD450值tableseeoriginaldocumentpage9實施例4本發明在昆明鼠上對其繁殖性能以及免疫應答的影響1、疫苗製備-以豬霍亂沙門氏菌C500為載體的抑制素DNA疫苗和豬霍亂沙門氏菌C500空菌分別接種LB液體培養基中，於37。C、150rpm振搖培養至0D咖0.3-0.4，4°C、1500g離心10min,棄上清，用滅菌的PBS緩衝液調整細菌濃度至10"CFU/mL，得到試驗的備用疫苗。2、試驗動物免疫試驗選50日齡的昆明小鼠共45隻，分為3組，每組15隻，購自湖北省疾病控制中心提供，在本申請人所在的動物遺傳育種與繁殖實驗室飼養一周後進入試驗，各組試驗小鼠年齡和體重基本一致。這三組分別為試驗組T1(口服以豬霍亂沙門氏菌C500為載體的抑制素口服基因疫苗)，豬霍亂沙門氏菌C500空菌對照組T2(口服豬霍亂沙門氏菌C500〉，PBS對照組T3(只口服PBS緩衝液)；在發情期放入公鼠進行交配，直至產仔，觀察其產仔數，泌乳力，仔鼠成活率的變化T12，T22，T32在加強免疫一次後上組進行相同處理T13,T23,T33在加強免疫二次後進行相同處理。3、免疫方法受免疫的動物(50日齡性成熟昆明小鼠)免疫前12小時禁食，免前4小時禁水，免疫前30分鐘，預先口服7.5^的NaHC03(200uL/頭)以中和胃酸，免疫劑量為1X1(TCFU/頭。每個試驗組中的三個小組分別免疫不同次數，一組一免，兩外兩組初次免疫後2周以相同劑量、相同方法加強免疫一次，同樣，最後一組以相同劑量、相同方法加強免疫一次。4、飼養管理試驗用昆明小鼠為每5隻/籠，室內溫度一直保持在28度左右。試驗期期內動物房一直保持清潔、衛生，及時清除舍內糞尿，保持舍內乾燥。5、血漿製備以初次免疫為0周，分別在第0、2、4、6、8周進行尾靜脈採取血樣，肝素鈉抗凝，製備血漿，-20°C保存，用以抗體的檢測(參照楊利國等，酶免疫測定技術M南京農業大學出版社，南京，1998:138-139)。6、測定指標(1)小鼠產仔數，泌乳力，以及仔鼠成活率記錄每個試驗組小鼠產仔數，泌乳力，以及仔鼠成活率。以豬霍亂沙門氏菌C500為載體的抑制素口服基因疫苗對昆明小鼠繁殖性能的影響如表2所述，本發明Tl組試驗鼠平均產仔數，泌乳力均高於空菌組和對照組，但是在試驗組與各對照組之間沒有顯著差異。(2)抑制素抗體檢測採用間接ELISA方法檢測血漿中抑制素抗體。步驟如下包被抑制素抗原每孔100ng/100pL，4'C反應12h,棄反應液，於自動洗板機上洗滌6次，每次30秒；加封閉液(5%的脫脂牛奶溶液)200nL/孔，37'C反應1.5h,棄反應液，洗滌6次'每次30秒；將昆明小鼠血漿依次稀釋l:2,1:4，1:5，1-10,1:20，1:40,1:50，同時設陰性對照孔，每個樣本三個重複，37。C反應lh，棄反應液，洗滌6次'每次30秒；加羊抗鼠IgG-朋P1:5000稀釋(購自武漢博士德公司)，每孔100uL，37。C反應lh,棄反應液，洗滌6次'每次30秒；加TMB底物液，每孔150uL，37'C反應25min;加2mol/L硫酸終止反應，每孔50uL;OD450讀數。以P/N值》2判為最高抗體滴度，其中P為待測血樣的吸光值，N為陰性對照血樣吸光值，結果見表3和圖9。本發明的以豬霍亂沙門氏菌C500為載體的抑制素口服基因疫苗笫一次口服免疫後的第2周抑制素抗體滴度值就達高峰，且一免後試驗組高於其它各組(P<0.05)，隨後各組的抗體滴度值都有所下降，但試驗組均高於對照組(P〉0.05)。表3:本發明製備的口服DNA疫苗昆明小鼠血漿中抑制素的抗體滴度免疫次數\分組試驗組T1空菌組T2PBS對照組一免後50±025±015±0二免後25±028.33±1.6718.33±1.67三免後13.33±0.834.17±0.8311.67±0.83(3)抗體水平分型檢測分型檢測與測定抗體的方法相同，只是在加入二抗時用羊抗小鼠IgGl-冊P和lgG2a-朋P替代羊抗小鼠lgG-HRP進行免疫血清抗體IgGl和lgG2a的分型檢測。抗體分型檢測顯示免疫後兩周IgG2a測定的0D值高於IgGl，而在加強免疫後兩種分型的OD值無顯著差異。結果見圖IO。表2免疫後昆明鼠繁殖力的比較(均值士方差,n=5)tableseeoriginaldocumentpage12注在水平上比較，顯著水平pO.05用完全不同的字母顯示，而iX).05則用相同的字母表示200810197980.3轉溢齒被10/105t權利要求1、一株含有抑制素真核表達質粒pXAIS的豬霍亂沙門氏菌(Salmonellaentericasv.Choleraesuis)C500/pXAIS，保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏號為CCTCCNOM208195。2、由權利要求1所述的豬霍亂沙門氏菌製備的豬霍亂沙門氏菌抑制素DNA疫苗。3、一種表達豬抑制素融合基因IS的表達質粒pXAIS，其特徵在於，將質粒pVAXl用pVUII內切酶進行消化，從質粒PYA3493中擴增得到天冬氨酸e-半乳糖脫氫酶基因的核苷酸序列插入到pVAXl質粒中，得到不含卡那黴素的pVAX—asd質粒，將抑制素真核表達質粒PCIS中酶切回收得到B肝表面抗原和抑制素a(1-32)的融合基因，再將該融合基因插入到pVAX一asd質粒中，得到抑制素真核表達質粒pXAIS。4、一種提高動物繁殖力的豬霍亂沙門氏菌抑制素DNA疫苗的製備方法，其特徵在於-(1)將質粒pVAXl用pVUII內切酶進行消化，從質粒PYA3493中擴增得到天冬氨酸e-半乳糖脫氫酶基因的核苷酸序列插入到pVAXl質粒中，得到不含卡那黴素的pVAX—asd質粒；(2)將抑制素真核表達質粒PCIS中酶切回收得到B肝表面抗原和抑制素a(1-32)的基因，將該融合基因插入到pVAX—asd質粒中，得到抑制素真核表達質粒pXAIS;(3)用質粒pXAIS轉化豬霍亂沙門氏菌C500，得到保藏號為CCTCCNO:M208195豬霍舌L沙門氏菌(^5k/頂o"eJ7ae"ter/casr.C力o/erae5tA2.5^C500/pXAIS;(4)擴大培養步驟(3)的豬霍亂沙門氏菌，得到豬霍亂沙門氏菌抑制素DNA疫苗。5、權利要求1所述的豬霍亂沙門氏菌在製備提高動物繁殖力的豬霍亂沙門氏菌抑制素DNA疫苗中的應用。全文摘要本發明屬於動物疫苗製備
技術領域：
，具體涉及一種無抗生素基因殘留的提高動物繁殖力的豬霍亂沙門氏菌抑制素DNA疫苗及製備與應用。將豬抑制素α(1-32)基因與B肝表面抗原融和基因插入到缺失了卡那黴素抗性基因的質粒載體pVAX1中，得到抑制素真核表達質粒pXAIS，將抑制素真核表達質粒pXAIS轉染入豬霍亂沙門氏菌C500中，構建了豬霍亂沙門氏菌抑制素DNA疫苗。與現有技術相比，本疫苗無抗生素基因殘留，具有運動效率高，免疫方法簡單，免疫效果好。載體菌本身可作為免疫佐劑，能同時激活黏膜免疫和全身免疫，並可獲得對載體菌的免疫等優點。文檔編號A61K39/00GK101407781SQ200810197980公開日2009年4月15日申請日期2008年12月1日優先權日2008年12月1日發明者楊利國,梁愛心,王慶玲,甄豔紅,麗韓申請人:華中農業大學