有缺陷的流感病毒顆粒的製作方法

2023-06-11 17:43:01 1

專利名稱：有缺陷的流感病毒顆粒的製作方法
技術領域：
本發明涉及流感病毒和針對流感的疫苗接種的領域。
流感病毒(正粘病毒科)是有包膜的具有分段的基因組的負鏈RNA病毒(Taubenberger和Layne，Molecular Diagnosis Vol.6 No.4 2001)。根據它們的核蛋白和基質蛋白之間的顯著的抗原差異，可以將它們分成2類一類包含流感A和B，另一類包含流感C。這3個病毒類型也存在致病性和基因組組織的差異。發現類型A廣泛存在於恆溫動物中，但是類型B和C主要是人病原體。通過從病毒粒子表面伸出的血細胞凝集素(HA)和NA表面糖蛋白的抗原特徵，進一步細分流感A病毒。目前，有15種HA和9種NA亞型。流感A病毒能感染廣泛種類的動物，包括鳥、豬、馬、人和其它哺乳動物。水鳥是所有已知亞型的流感A的自然宿主，且可能是人流行流感株的遺傳物質源。
不同於相關的副粘病毒，流感病毒具有分段的RNA基因組。流感A和B病毒具有類似的結構，而流感C是更離散的。A和B類病毒都含有8個離散的分別編碼至少一種蛋白的基因片段，C類型含有7個離散的片段，它組合了A和B類型的片段4和6。流感A和B病毒覆蓋著3種蛋白的突出部分HA，NA，和基質2(M2)。流感C病毒僅僅具有一種表面糖蛋白。每種流感RNA片段由核蛋白(NP)包裹成殼，形成核糖核苷酸核蛋白(RNP)複合物。這3種聚合酶蛋白與RNP複合物的一端相連。RNP被膜圍繞，所述的膜含有作為組成部分的基質蛋白(基質1)。包膜的磷脂部分源自宿主細胞膜。在病毒顆粒內，還發現了非結構性蛋白2(NS2)。
世界衛生組織(WHO)關於流感病毒命名法的規則如下。首先，指定病毒的類型(A，B，或C)，然後為宿主(如果非人)，分離地，分離數目，和分離的年(以斜線分隔)。對於流感A，在括號中註明了HA和NA亞型。例如，包含在近期的2000至2001季的三價疫苗中的株是A/巴拿馬/2007/99(H3N2)，A/新喀裡多尼亞/20/99(H1N1)，和B/Yamanashi/16/98。自1977年以來，已經有2種流感A亞型共存於人類H1N1和H3N2。
流感病毒能積累複製過程中的點突變，因為它們的RNA聚合酶複合物不具有校對活性。能改變表面糖蛋白的抗原部分中的胺基酸的突變能通過逃避預先存在的免疫而為病毒株提供選擇優勢。通過結合某些宿主細胞上的受體，HA分子能啟動感染。針對HA蛋白的抗體可以阻止受體結合，能非常有效地預防相同株的再次感染。通過抗原性漂移(其中目前循環的HA基因的突變會破壞抗體結合)或抗原性轉變(其中病毒獲得新亞型的HA)，HA可以逃避以前獲得的免疫。抗原性漂移壓力在HA分子中是不均等的，陽性選擇變化主要發生在HA蛋白的球形頭上。這些變化在HA中的積累程度也大於在NA中的。在其它流感蛋白中更慢產生變化。同樣地，抗原性漂移壓力在人-適應的流感株中最大，在豬-和馬-適應的株中中等，在鳥-適應的株中最小。
因為流感病毒具有分段的基因組，2種不同株在同一宿主中的共感染可以導致生成新的重新組合的流感株，其含有親本基因片段的不同組合。已知15種HA亞型存在於野鳥中，並提供了HA的來源，所述HA對於人類而言是新的。含有新的亞型(通過抗原性轉變)的流感株在人循環中的出現，已經成為1957和1968年的最近2次流感大流行的原因，且極有可能是1918年流感大流行的原因。為了與已知的關於流行性流感病毒的出現相一致，流行株必須具有在抗原性上不同於目前流行的HA；該HA不得已經在人類中循環了60至70年；且該病毒必須是可以在人間傳播的。在1957和1968年，HA的轉變導致了大流行，且在2種情況下，流行株的HA與鳥毒株密切相關。儘管大流行的一個絕對條件是HA必須變化，尚不清楚病毒的其它部分可以或必須變化的程度。僅僅可以得到1957和1968年的流行性病毒用於直接研究，使用分子考古學，表徵了1918年的流行性流感病毒。在1957年，3個基因被替換為鳥類基因HA，NA，和聚合酶複合物的亞基(PB1)。在1968年，僅僅替換了HA和PB1。
通過病毒分離、血凝抑制(HI)實驗、免疫測定法檢測抗原、血清學實驗、驗證分泌物中的NA活性或基於分子的實驗，可以特異性地診斷流感感染。可以將試樣收集為唾液、鼻咽拭子或通過口漱緩衝鹽水溶液得到的鼻咽洗液。流感診斷的標準是培養後進行免疫學表徵。血清學分析能提供精確的、但是可追溯的流感感染方法，因為它需要收集急性期和漸愈期的血清。
流感病毒可以在含胚的雞蛋或許多組織培養系統中生長。加入胰蛋白酶(用於HA的切割活化)，會使流感病毒在Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞和其它系中繁殖。疫苗生產的主要方法仍然是在蛋中培養流感病毒。細胞系的培養物通常用於人流感病毒(類型A和B)的初步分離。可以直接在含胚的蛋的尿囊腔中培養許多人流感病毒。有些流感A和B病毒需要首先在羊膜腔中培養，然後轉移到尿囊腔中。培養物分離後，使用免疫測定法或免疫螢光法，確定地鑑別出了大多數流感分離物。流感病毒的HA分子能結合呼吸細胞表面上的唾液酸殘基，以利於病毒的進入。
利用流感病毒體外使紅細胞凝集的能力，可以在抗原方面表徵流感株。抗-HA抗體可以抑制凝集。因而，血凝反應抑制(HI)實驗是用於表徵流感株的標準方法之一。HI實驗可以用於確定樣品株是否在免疫學上與近來的疫苗株相關(即交叉反應性的)。以一系列的2倍稀釋，向孔中加入分型血清，後者一般在雪貂中生產，實驗人員通過觀察懸浮的和凝集的紅細胞，對實驗孔打分。在大多數情況下，一組血清用於匹配針對疫苗的樣品株和參照株，且在任何給定的流感季的過程中，通過HI實驗成功地匹配了大多數樣品株。
關於鑑別各病毒株的抗原特徵，WHO提供了準則，WHO協作中心提供了指南。根據免疫學系譜，例如A/莫斯科/10/99(H3N2)-樣，A/新喀裡多尼亞/20/99(H1N1)-樣，和B/北京/184/93-樣病毒，對樣品株進行分類。對於不能在HI實驗中進行表徵的樣品株，實驗室工作人員必須將它們接種進雪貂中，以生成株特異性的抗血清。當新的抗血清準備好後，再如所述進行HI實驗。如果新血清在交叉反應性中表現出顯著差異(通常定義為樣品和疫苗株之間的4倍差異)，則將它整合進常規實驗室組中，並用於尋找新的流行性株。因而，HI實驗在疫苗株選擇的流感病毒監視工作中非常重要，且是最常用的估計抗原性漂移的方法。
通過各基因片段的序列對比，可以遺傳地表徵流感株，WHO準則和WHO協作中心又提供了關於識別包含下述片段的個體性質的指南包含流感基因組的RNA片段；能編碼核蛋白(NP)、鹼性聚合酶1(PB1)、鹼性聚合酶2(PB2)、酸性聚合酶(PA)、血細胞凝集素(HA)、神經氨酸酶(NA)、基質蛋白(M1和M2)和非結構蛋白(NS1和NS2)的流感A和B病毒核酸片段，和能編碼核蛋白(NP)、鹼性聚合酶1(PB1)、鹼性聚合酶2(PB2)、血細胞凝集素-神經氨酸酶樣糖蛋白(HN)、基質蛋白(M1和M2)和非結構蛋白(NS1和NS2)的流感C病毒核酸片段。關於抗原分析、核酸序列對比和鑑別疫苗病毒的參照株的請求，可以致送WHO流感參考和研究協作中心，45 Poplar Road，Parkville，Victoria 3052，Australia(fax+61 3 9389 1881，web sitehttp//www.influenzacentre.org)；WHO流感參考和研究協作中心，National Institute of Infectious Diseases，Gakuen 4-7-1，Musashi-Murayama，Tokyo 208-0011，Japan(fax+81 42 5610812或+81 42 5652498)；WHO流感監視、流行病學和控制協作中心，Centersfor Disease Control and Prevention，1600 Clifton Road，Mail stop G16，Atlanta，GA 30333，United States of America(fax+1 404 639 23 34)；或WHO流感參考和研究協作中心，National Institute for MedicalResearch，The Ridgeway，Mill Hill，London NW7 1AA，England(fax+44 208 906 4477)。在WHO的網站http://www.who.int/influenza上，可以得到最新的流行病學信息，在http://www.who.int/flunet上，可以得到地理信息系統，FluNet。
人們對於流感的影響和預防它的健康和經濟益處的認識正在逐步提高，過去十多年已經觀察到了疫苗接種的應用和益處，且顯著地出現了許多抗流感藥物。作為在許多國家更長的壽命預期的結果，更多的人處於併發症的危險中，在流感流行病過程中的保健系統的負擔被更廣泛地承認，更頻繁的國際旅行已經為病毒的傳播創造了機會，儘管新產品的出現已經增加了預防和治療疾病的選擇。約50個國家具有政府資助的國家流感免疫計劃，且在許多其它國家可以得到疫苗。關於使用疫苗的具體推薦是不同的，但是通常包含年老個體和由於以前存在的慢性醫學病而處於嚴重疾病的高危險中的大於6個月齡的個體的年度免疫。在有些國家中，疫苗用於減少流感向高危人群中的傳播。在它們的總體公共健康優先權的範圍內，成員國需要考慮流感預防活動的益處。
根據它們是否含有全病毒顆粒，部分打破的病毒顆粒(分裂的疫苗)或純化的包膜抗原(亞單位疫苗)，可以將失活的疫苗分成幾種類型。已經將有些亞單位疫苗與佐劑或輸送系統相組合。
少數國家已經許可了用於某些目標群體的活的減毒的流感疫苗。在俄羅斯聯邦，已經將一種疫苗的2種不同的製劑用於健康的成年人和兒童，已經廣泛測試了另一種活疫苗。但是，在可以更廣泛地得到活的減毒疫苗之前，一般仍不推薦將它們用於流感預防。
為了預防和治療流感，已經開發出了2類抗病毒藥。M2抑制劑即金剛烷胺和金剛乙胺限於治療流感A病毒，且已經報導它們能有效地預防感染。儘管二種產品都會造成一些副作用，金剛烷胺更常見明顯的神經副作用。最近，許多國家已經許可神經氨酸酶抑制劑(例如扎那米韋和奧賽米韋)用於治療類型A和B流感，且已經報導它們對於預防也是有效的。已經在接受2類抗病毒藥的患者中檢測到了抗性突變株。儘管目前尚未將其視為重要的公共健康問題，但是如果非常大規模地使用這些藥物，情況可能會發生變化。
WHO維持著全球國際監視計劃，它在位於82個國家的110個國家流感中心和位於亞特蘭大(美國)、倫敦(英國)、墨爾本(澳大利亞)和東京(日本)的4個WHO流感參考和研究協作中心的合作下運行。這些中心提供關於出現具有流行病潛能的株的早期警告系統。該系統很重要，因為如果流感疫苗不含有目前循環的株，則其功效會降低。WHO會發布關於疫苗組成的推薦，如可以在由世界衛生組織出版的WeeklyEpidemiological Record(例如見，issue 9，2004，79，第88頁或http://www.who.int/wer)中所見的，2月發布在北半球使用的疫苗，9月發布在南半球使用的疫苗。由於流感在赤道區具有不太確定的季節特徵，流行病學的考慮會影響這些推薦中的哪一種(2月或9月)適用於在赤道國家使用的疫苗。
協作中心對國家中心提交的流感分離株進行抗原和遺傳分析。當觀察到抗原變化的證據時，將其與流行病學數據進行比對，以估計該變體的流行病學顯著性。使用在疫苗接種之前和之後收集的人血清組，將代表性的分離株與目前的疫苗株進行對比，以確定能否認為現在的疫苗會保護免受這些病毒。在出版WHO的年度疫苗推薦後，開發了高生長株，並提供給生產商作為參照病毒，以輔助生成用於疫苗生產的種子病毒。對流感疫苗的安全性和效力的測試，包括病毒失活、微生物滅菌、用於破壞病毒的化學試劑的測量和確認推薦的抗原濃度。推薦疫苗能符合WHO的要求，但是，國家控制機關應當批准在每個國家使用的特定疫苗病毒。國家公共衛生機關負責推薦疫苗的使用。另外，WHO已經出版了關於預防流感的推薦(見WER No.35，2002，pp.281-288)。
已經證實，現在的流感疫苗不能保護未免疫(naive)個體，當從未遇到流感感染的許多個體處於危險中並出現流感大流行爆發時，該事實會變得非常重要。病毒一般通過下述方法開始它們的壽命周期結合到宿主細胞表面受體上，進入細胞，使它們的病毒核酸脫殼，隨後複製病毒基因組。在合成了新拷貝的病毒蛋白和基因後，將這些組分包裝進後代病毒粒子中，它們然後退出細胞。在裝配步驟的過程中，後代病毒必須從存在於細胞質中的大量病毒和細胞核酸中有效地選擇它的基因組核酸。將病毒基因組包裝進病毒粒子中，典型地包含被病毒核酸中的順式作用序列的病毒組分所識別，所謂的「包裝信號」。定義這樣的信號對於理解病毒生命周期是重要的，且為我們提供了可以用於構建表達外來蛋白的病毒載體的信息。實際上，使用逆轉錄病毒作為表達外來蛋白的基因輸送載體的運輸工具，可以在很大程度上歸因於非常確實地理解將它們的vRNA包裝進後代病毒粒子的過程。
不太理解其它RNA病毒的基因組包裝信號，阻礙了它們作為表達和輸送外來基因的載體的應用進程。例如，流感A病毒是有包膜的負鏈RNA病毒，它的分段的基因組具有核蛋白(NP)、鹼性聚合酶1(PB1)、鹼性聚合酶2(PB2)、酸性聚合酶(PA)、血細胞凝集素(HA)、神經氨酸酶(NA)、基質蛋白(M1和M2)和非結構蛋白(NS1和NS2)的編碼能力。
該病毒在包膜上具有2種跨膜糖蛋白，血細胞凝集素(HA)和神經氨酸酶(NA)。HA蛋白能結合到宿主細胞表面上的含有唾液酸的受體上，並在受體介導的胞吞作用後，介導病毒包膜與內體膜的融合。相反地，NA蛋白提供下述機理在感染晚期起關鍵作用從唾液酸寡糖去除唾液酸，從而從細胞表面釋放出新裝配的病毒粒子，並阻止病毒粒子的自聚集。在包膜內，包含8個不同病毒RNA(vRNA)片段的病毒基因組緊密連接到核蛋白(NP)和聚合酶蛋白(PA，PB1，和PB2)上，形成核糖核蛋白複合物。為了生成感染性病毒，需要全部8個(或者在C類型病毒的情況下全部7個)功能性基因片段。已經描述了聚合酶基因中的多個突變(WO2004/094466，WO2003/091401，US 5578473，Fodor等，J.Virol.77，5017-5020，2003)，其會改變聚合酶活性，或者以另一種方式改變聚合酶，但不會使它減弱在合成病毒RNA中的功能性，以使含有這種突變的聚合酶的病毒不能複製。在WO2004/094466中，生成了具有突變的PA基因的感染性病毒，由此證實了允許生產和回收具有突變的基因的感染性病毒的選擇系統的益處。在WO2003/091401中，證實了如何生產具有聚合酶基因突變的感染性病毒，以便生產和回收具有與活的減毒的疫苗病毒生產有關的理想性能(例如溫度敏感性或其它類型的減毒)的流感病毒。在US55788473中，提出了可以改變多種聚合酶的特異性和降低其活性的聚合酶基因片段。但是，它們沒有用於重構病毒，更不用說重構已經完全喪失了它的聚合酶活性的病毒了。另外，在上述的申請中，都沒有生產出有缺陷的已經喪失了它們的複製能力的顆粒。眾所周知，當流感A病毒以高感染複數傳代時，會生成有缺陷的病毒顆粒，其缺少一個或多個功能性基因片段。在這樣的病毒顆粒中，由於流感病毒聚合酶造成的錯誤，一個或多個功能基因被替換為有缺陷的幹擾(DI)基因片段。由於高感染複數，和因此細胞感染了超過一個病毒顆粒，含有DI RNA的病毒的缺陷被含有完整拷貝的丟失的功能基因的病毒所補償。近來證實，酸性聚合酶基因中的某些突變會提高生成具有缺陷基因的病毒顆粒的效率(Fodor 2003)。重要的是注意到，在這些實驗中的有缺陷的病毒顆粒的生成和互補都在這些實驗中隨機地發生。該隨機的過程會限制DI RNA和條件性缺陷的病毒顆粒在實際應用中的使用。而且，當使用這些公開的方法生產有缺陷的病毒顆粒時，除了需要的條件性缺陷的病毒外，還生成了野生型能複製的病毒。這種能複製的病毒可以是完全野生型(輔助病毒)或由輔助病毒和缺陷病毒的遺傳混合形成的重排株(reassortant)。流感病毒的基因片段的包裝過程，無論是通過隨機的還是特異性的機理，都已經爭論了許多年。已經描述了這2種選擇的一些證據。隨機包裝的證據是，聚集的病毒顆粒具有比未聚集的病毒顆粒更高的感染性，且當以低傳染方式(moi)感染細胞培養物時，一些感染的細胞不能表達一個片段，這二者表明存在不含有完整流感病毒基因組的病毒粒子。隨機包裝的其它證據是，已經在實驗中生產了含有9個片段的流感病毒。
一個支持特異性包裝過程的理由是，儘管所有基因片段都等量地存在於病毒原液中，它們以不同的量存在於生產細胞中。另外，當生成了有缺陷的幹擾(DI)顆粒時，DI vRNA會替換其所源自的片段(有缺陷的幹擾顆粒是其中一個基因片段具有較大的內部缺失的病毒顆粒。當病毒以高moi傳代時，會出現這些顆粒)。最後，病毒粒子形成的效率隨著基因片段數目的增加而增加。
發明概述有缺陷的流感病毒顆粒(例如Mena I.等.，J.Virol.705016-24(1996)；Neumann G.等.，J.Virol.74547-51(2000).)可以用作疫苗候選品，因為它們會誘導針對除了HA和NA以外的其它病毒蛋白的抗體，如果它們能進入宿主細胞，因為它們除了體液反應之外還可以誘導針對病毒的細胞免疫反應(例如輔助T細胞，細胞毒性T細胞)。迄今為止，已經通過轉染生產了有缺陷的流感病毒顆粒(Mena I.等.，J.Virol.705016-24(1996)；Neumann G.等.，J.Virol.74547-51(2000).)，減少了生產大量這種顆粒的可能性。該方法的一個替代方案是，生產條件性缺陷的病毒顆粒，使它們能在某些生產系統中複製，但是不能在正常細胞或生產系統中複製。為此，修飾了生產系統的細胞，使其能生產一個或多個流感病毒基因或基因產物，能反式互補有缺陷的流感病毒顆粒。本發明首次公開了有缺陷的流感病毒顆粒的確定的反式互補。在實驗室中，當攜帶野生型的有缺陷的幹擾基因片段的病毒補償了同一細胞中的有缺陷的幹擾流感病毒時，已經觀察到了流感病毒顆粒的反式互補。該反式互補的「自然系統」不能用於生產確定的條件性缺陷的流感病毒顆粒。首先，該系統要求，一種(部分地)有缺陷的病毒被至少一種(部分地)能複製的病毒所補償，這會導致意外地生成全感染性的病毒。其次，因為不同的基因片段以隨機方式生產有缺陷的幹擾顆粒，不能生產確定的條件性缺陷的病毒顆粒。
條件性缺陷的流感病毒顆粒理論上可以基於完整基因片段或其部分的缺失。如果流感病毒基因組的包裝依賴於所有8個片段的存在(這是許多爭論中的一種版本(見本說明書中的其它地方))，通過刪除完整基因片段(和反式生產編碼的基因產物)來生產確定的條件性缺陷的病毒顆粒的能力會受到限制。如果包裝過程要求所有8個基因片段的存在，不知道是否需要所有的基因片段都以全長形式存在，這使得條件性缺陷的病毒顆粒的生產進一步複雜化。本發明已經解決了這些問題。
本發明提供了得到條件性缺陷的流感病毒顆粒的方法，其包括第一步，用下述物質轉染合適的第一種細胞，例如293T細胞具有內部缺失的基因構建體，例如本文提供的通過內部刪除編碼流感聚合酶的核酸衍生的pΔPB2，pΔPB1，pΔPA或pDIPA，由此使所述的基因構建體不能生產能拷貝或合成病毒RNA的功能聚合酶；和編碼流感病毒的互補流感病毒核酸片段，例如7個能編碼A/WSN/33的互補構建體(HW181-188，Hoffmann等.，2000)；和能在所述細胞中表達所述聚合酶的表達質粒，例如本文提供的HMG-PB2，HMG-PB1，HMG-PA中的一個；在轉染後合適的時間點，例如10-50小時內、優選地在約20-30小時，從所述的第一種細胞的上清液中收穫至少一個病毒顆粒；第二步，用能在所述細胞中表達所述聚合酶的表達質粒轉染合適的第二種細胞，例如MDCK細胞；第三步，用包含從所述的第一種細胞得到的至少一個病毒顆粒的上清液轉染所述的第二種細胞；第四步，包括在轉染後合適的時間點，例如24-96小時、優選48-72小時，從所述的第一種細胞的上清液中收穫至少一個(現在為條件性缺陷的，因為生成的病毒缺少能表達拷貝或合成病毒RNA的功能聚合酶的基因片段，因為它們包裝了具有內部缺失的基因片段)病毒顆粒。
優選的是能使基因片段不能生產功能蛋白的內部缺失，但是它不得阻止將病毒的基因片段包裝進病毒顆粒中。優選地，這些缺失分別從5』和3』非編碼區計算。對於流感A，對於PA蛋白，這些優選的缺失從例如位於核苷酸58至75之間(不含端點)的5』-核苷酸開始，至位於核苷酸27至50之間(不含端點)的3』-核苷酸結束；對於PB1蛋白，從位於核苷酸43至75之間(不含端點)的5』-核苷酸開始，至位於核苷酸24至50之間(不含端點)的3』-核苷酸結束；對於PB2蛋白，從位於核苷酸34至50之間(不含端點)的5』-核苷酸開始，至位於核苷酸27至50之間(不含端點)的3』-核苷酸結束。更優選地，這些缺失對於PA蛋白，從位於核苷酸58至100之間(不含端點)的5』-核苷酸開始，至位於核苷酸27至100之間(不含端點)的3』-核苷酸結束；對於PB1蛋白，從位於核苷酸43至100之間(不含端點)的5』-核苷酸開始，至位於核苷酸24至100之間(不含端點)的3』-核苷酸結束；對於PB2蛋白，從位於核苷酸34至100之間(不含端點)的5』-核苷酸開始，至位於核苷酸27至100之間(不含端點)的3』-核苷酸結束。甚至更優選地，這些缺失對於PA蛋白，從位於核苷酸58至150之間(不含端點)的5』-核苷酸開始，至位於核苷酸27至150之間(不含端點)的3』-核苷酸結束；對於PB1蛋白，從位於核苷酸43至150之間(不含端點)的5』-核苷酸開始，至位於核苷酸24至150之間(不含端點)的3』-核苷酸結束；對於PB2蛋白，從位於核苷酸34至150之間(不含端點)的5』-核苷酸開始，至位於核苷酸27至150之間(不含端點)的3』-核苷酸結束。更優選地，這些缺失對於PA蛋白，從位於核苷酸58至175之間(不含端點)的5』-核苷酸開始，至位於核苷酸27至175之間(不含端點)的3』-核苷酸結束；對於PB1蛋白，從位於核苷酸43至175之間(不含端點)的5』-核苷酸開始，至位於核苷酸24至175之間(不含端點)的3』-核苷酸結束；對於PB2蛋白，從位於核苷酸34至175之間(不含端點)的5』-核苷酸開始，至位於核苷酸27至175之間(不含端點)的3』-核苷酸結束。最優選地，這些缺失對於PA蛋白，從位於核苷酸58至207之間(不含端點)的5』-核苷酸開始，至位於核苷酸27至194之間(不含端點)的3』-核苷酸結束；對於PB1蛋白，從位於核苷酸43至246之間(不含端點)的5』-核苷酸開始，至位於核苷酸24至197之間(不含端點)的3』-核苷酸結束；對於PB2蛋白，從位於核苷酸34至234之間(不含端點)的5』-核苷酸開始，至位於核苷酸27至209之間(不含端點)的3』-核苷酸結束。
在本文中，將互補片段定義為能導致一整套8個基因片段(例如流感A病毒的)的片段。因而，如果片段1已經用於生產有缺陷的片段，則互補(無缺陷的)片段是片段2，3，4，5，6，7和8。如果片段2是有缺陷的，則互補片段是片段1，3，4，5，6，7和8。依此類推。
有利地，本發明提供了一種方法，由此不需要或不存在輔助病毒。
本發明提供了分離的和條件性缺陷的流感病毒顆粒，其缺少編碼選自酸性聚合酶(PA)、鹼性聚合酶1(PB1)和鹼性聚合酶2(PB2)的聚合酶的功能性流感病毒核酸片段(在本文中也稱作條件性缺陷的流感病毒顆粒)，所述的顆粒不能生成聚合酶或不能用作聚合酶的來源，以拷貝或合成病毒RNA，由此僅僅且有條件地允許在用功能聚合酶反式補償的細胞中生成可複製的病毒顆粒。另外，本發明提供了得到條件性缺陷的流感病毒顆粒的方法，包括通過用功能性流感病毒聚合酶反式補償，來提供細胞。
在一個優選的實施方案中，根據本發明的顆粒能在用該顆粒自身缺少的類似核酸片段補償的細胞中複製，例如缺少功能性流感病毒核酸PA片段的顆粒可以在至少已經提供或補償了功能性流感病毒核酸PA片段的細胞中複製，缺少功能性流感病毒核酸PB1片段的顆粒可以在至少已經提供了功能性流感病毒核酸PB1片段的細胞中複製，缺少功能性流感病毒核酸PB2片段的顆粒可以在至少已經提供了功能性流感病毒核酸PB片段的細胞中複製。在一個優選的實施方案中，本發明提供了根據本發明的顆粒，其具有能編碼病毒糖蛋白的流感病毒核酸片段，更優選地具有能編碼核蛋白(NP)、血細胞凝集素(HA)、神經氨酸酶(NA)、基質蛋白(M1和M2)和非結構蛋白(NS1和NS2)的流感病毒核酸片段。在一個實施方案中，提供了根據本發明的顆粒，其具有源自流感A病毒的流感病毒核酸片段。另外，提供了根據本發明的顆粒，其含有不能編碼流感肽的核酸。另外，本發明提供了分離的細胞，其包含根據本發明的顆粒，所述細胞不含有野生型流感病毒或輔助病毒，但是優選地已經被提供了或補償了流感病毒聚合酶或編碼它的基因片段。在一個優選的實施方案中，這樣的細胞是反式補償的293T或MDCK細胞。在一個實施方案中，本發明提供了分離的細胞，其包含缺少功能性流感病毒核酸PA片段的顆粒，所述細胞不含有野生型流感病毒或輔助病毒，但是至少已經被提供或補償了功能性流感病毒核酸PA片段或功能性PA。在另一個實施方案中，本發明提供了分離的細胞，其包含缺少功能性流感病毒核酸PB1片段的顆粒，所述細胞不含有野生型流感病毒或輔助病毒，但是至少已經被提供了功能性流感病毒核酸PB1片段或功能性PB1。在另一個實施方案中，本發明提供了分離的細胞，其包含缺少功能性流感病毒核酸PB2片段的顆粒，所述細胞不含有野生型流感病毒或輔助病毒，但是至少已經被提供了或補償了功能性流感病毒核酸PB2片段或功能性PB2。另外，本發明提供了組合物，其包含根據本發明的顆粒或細胞或源自根據本發明的細胞的物質，和這樣的組合物在生產藥物組合物中的應用，所述的藥物組合物能產生使對象免受流感病毒感染的免疫保護。因此，本發明提供了產生使對象免受流感病毒感染的免疫保護的方法，包括給需要的對象提供根據本發明的組合物。另外，本發明提供了根據本發明的流感病毒顆粒在生產組合物中的應用，所述的組合物用於將不編碼流感肽的核酸輸送進細胞中。另外，本發明提供了根據本發明的顆粒在生產藥物組合物中的應用，所述的組合物用於將不編碼流感肽的核酸輸送進對象的細胞中，和將不編碼流感肽的核酸輸送進細胞或對象中的方法，包括給所述的細胞或對象提供根據本發明的顆粒。
本發明提供了條件性缺陷的流感病毒顆粒，當與它的自然基因組相比較時，其缺少一個功能性流感病毒片段，它是與野生型或輔助A或B類型病毒相比時，具有7個(而不是8個)不同的功能性流感病毒核酸片段，或與野生型或輔助C類型病毒相比時，具有6個(而不是7個)不同的功能性流感病毒核酸片段。當在本文中使用術語「條件性缺陷的」時，它包括但不限於，病毒顆粒，其中一個病毒基因片段具有較大的內部缺失，這導致從它表達無功能的蛋白。感染性病毒的生產，需要所有8個基因片段(例如流感A病毒的)和它們編碼的所有蛋白。因而，含有缺陷基因片段的病毒自身是有缺陷的它可以感染細胞，且可以經過一個複製周期，因為所有病毒蛋白都存在於該病毒粒子(例如，當生產病毒時，通過表達質粒生產該蛋白)中，但是在感染的細胞中沒有生成感染性病毒顆粒，因為該病毒不能生產一種病毒蛋白。但是，當感染的細胞能表達一般由有缺陷的基因片段表達的蛋白時，有缺陷的病毒可以在這些細胞中複製，因為所有的病毒蛋白都存在。因而，這些病毒是條件性缺陷的直到提供具有正確條件的細胞，它們才可以複製(在該情況下，細胞會表達因為病毒缺少基因片段而不編碼的病毒蛋白)。
另外，本發明提供了條件性缺陷的流感病毒顆粒，其缺少能編碼聚合酶的功能性流感病毒核酸片段。在本文中，功能性流感病毒核酸片段包含能編碼功能性流感蛋白的核酸，其允許生成可複製的病毒，且是必需的。例如，流感A病毒是負鏈RNA病毒，其具有8-段的基因組。8個基因片段能編碼11種蛋白；基因片段1-8能分別編碼鹼性聚合酶2(PB2)、鹼性聚合酶1(PB1)和PB1-ORF2(F2)，酸性聚合酶(PA)，血細胞凝集素(HA)，核蛋白(NP)，神經氨酸酶(NA)，基質蛋白1和2(M1，M2)和非結構蛋白1和2(NS1，NS2)。8個基因片段的編碼區的側翼為病毒RNA合成必需的非編碼區(NCR)。分別在病毒基因組RNA的5』和3』-端的末端13和12個核苷酸在所有流感A病毒片段中是保守的，且是部分地互補的，以形成能被病毒聚合酶複合物識別的二級結構。NCR可以含有至多60個其它核苷酸，它們在8個基因片段之間是不保守的，但是在不同的流感病毒之間是相對保守的。有效的病毒基因組包裝需要NCR和編碼區中的側翼序列。因而，功能性流感病毒核酸片段由具有編碼功能性流感蛋白的潛力、允許生成可複製的病毒的序列(1或2個開放讀碼框/片段)、mRNA、病毒RNA(vRNA)和與病毒RNA互補的RNA(cRNA)轉錄所需的NCR和存在於NCR和側翼編碼序列中的包裝信號組成。
優選地，所述的條件性缺陷的缺少一個流感病毒核酸的流感病毒顆粒缺少能編碼功能聚合酶PA、PB1或PB2的片段。另外，對於疫苗目的，所述的顆粒優選地具有能編碼病毒糖蛋白的流感病毒核酸片段。
在一個實施方案中，本發明提供了流感A病毒顆粒，其具有7個不同的流感A核酸片段。根據本發明的有缺陷的流感病毒顆粒能夠複製，雖然在合適的、未補償的宿主動物或細胞中僅僅一次。
在合適的補償的細胞中，根據本發明的顆粒可以複製多個循環。對於疫苗和基因輸送目的，有缺陷的顆粒不能在正常的、未反式補償的細胞中無限複製是一個很大的優點，由此減少了疫苗病毒在宿主間擴散的危險，並減少了回復到野生型病毒的危險。
這是首次使用反向遺傳學生產有缺陷的流感A病毒，其僅僅含有7個功能性基因片段，且可以經歷1個周期的複製，或者當反式補償了有缺陷的基因片段時，可以經歷多個周期的複製。在一個實施方案中，本發明提供了條件性缺陷的流感病毒顆粒，其缺少基本編碼酸性聚合酶(PA)的流感核酸片段。與PA的反式互補類似，可以預見其它流感病毒基因的反式互補。但是，由於已經證實PA表達水平不如其它流感病毒蛋白的表達水平關鍵，PA是缺失的聚合酶組的優選基因片段，也可以生產缺失了PB2和PB1的病毒，不能反式補償缺失了NP的病毒。在一個優選的實施方案中，本發明提供了條件性缺陷的流感A病毒顆粒，其具有7個不同的流感A核酸片段，且缺少基本編碼酸性聚合酶的流感A核酸片段。對於疫苗目的，優選的根據本發明的條件性缺陷的流感A病毒顆粒具有基本編碼血細胞凝集素(HA)和神經氨酸酶(NA)蛋白的流感A核酸片段，這些蛋白對於賦予保護是免疫學上最相關的。為了選擇合適的包含在疫苗中的基因片段，基因片段優選地選自WHO推薦的用於疫苗用途的病毒。當然，根據要接種預防的流感變體的HA和NA亞型，HA和NA亞型可以變化。最優選地，生產根據本發明的條件性缺陷的流感病毒顆粒，其具有基本編碼核蛋白(NP)、鹼性聚合酶1(PB1)、鹼性聚合酶2(PB2)、血細胞凝集素(HA)、神經氨酸酶(NA)、基質蛋白(M1和M2)和非結構蛋白(NS1和NS2)的流感A核酸片段，「基本編碼」在本文中具體指功能性蛋白由各自的基因片段表達。特別地，在具有功能性PA或能編碼PA的功能性基因片段的分離的細胞中提供了這樣的顆粒。在另一個實施方案中，在本文中提供了根據本發明的條件性缺陷的流感病毒顆粒，其具有基本編碼核蛋白(NP)、酸性聚合酶(PA)、鹼性聚合酶2(PB2)、血細胞凝集素(HA)、神經氨酸酶(NA)、基質蛋白(M1和M2)和非結構蛋白(NS1和NS2)的流感A核酸片段，「基本編碼」在本文中具體指功能性蛋白由各自的基因片段表達。特別地，在具有功能性PB1或能編碼PB1的功能性基因片段的分離的細胞中提供了這樣的顆粒。在另一個實施方案中，在本文中提供了根據本發明的條件性缺陷的流感病毒顆粒，其具有基本編碼核蛋白(NP)、酸性聚合酶(PA)、鹼性聚合酶1(PB1)、血細胞凝集素(HA)、神經氨酸酶(NA)、基質蛋白(M1和M2)和非結構蛋白(NS1和NS2)的流感A核酸片段，「基本編碼」在本文中具體指功能性蛋白由各自的基因片段表達。特別地，在具有功能性PB2或能編碼PB2的功能性基因片段的分離的細胞中提供了這樣的顆粒。在另一個實施方案中，本發明提供了根據本發明的顆粒，其另外含有不能編碼流感肽的核酸，例如，編碼用於引發免疫反應的外來蛋白或肽，或其含有能干擾細胞或病原體在細胞中的功能的核酸。
另外，本發明提供了包含根據本發明的流感病毒顆粒的細胞。當沒有為顆粒提供基本編碼所需的聚合酶的基因片段時，有用的是考慮已經被提供了合適的功能性流感病毒聚合酶的細胞，允許有缺陷的流感病毒顆粒在這樣補償的細胞中複製多個周期。
另外，本發明提供了組合物，其包含根據本發明的有缺陷的流感病毒顆粒或細胞或源自根據本發明的細胞的物質；這樣的組合物可以例如用於生產旨在生成使對象免受流感病毒感染的免疫保護的藥物組合物。另外，本發明提供了產生使對象免受流感病毒感染的免疫保護的方法，包括給需要的對象提供這樣的組合物。除了根據本發明的顆粒作為疫苗或免疫組合物的應用外，優選地將這樣的組合物配製成疫苗，即通過混合病毒顆粒或源自這樣的顆粒的病毒蛋白(分裂-疫苗)與適當的藥物載體，例如鹽溶液或佐劑(例如常用的鋁鹽或其它賦形劑(見例如http://www.cdc.gov/nip/publications/pink/Appendices/A/Excipient.pdf.)。根據本發明的條件性缺陷的流感病毒顆粒也是用於外來基因輸送和表達外來蛋白的備選載體，因為可以將功能性基因例如插入在5』和3』PA序列之間。考慮到本發明提供了得到條件性缺陷的、可能含有外來或宿主核酸片段或其片段的流感病毒顆粒的方法，其包括第一步，用下述物質轉染合適的第一種細胞通過內部刪除能編碼流感蛋白的核酸而衍生的一個或多個基因構建體，由此使所述的基因構建體不能生產功能蛋白，且不能阻止將病毒的基因片段包裝進病毒顆粒；和能編碼流感病毒的互補流感病毒核酸片段；和能在所述細胞中表達所述蛋白的一個或多個表達質粒；在轉染後合適的時間點，從所述的第一種細胞的上清液中收穫至少一個病毒顆粒；第二步，用能在所述細胞中表達所述蛋白的一個或多個表達質粒轉染合適的第二種細胞；第三步，用包含從所述的第一種細胞得到的至少一個病毒顆粒的上清液感染所述的第二種細胞；第四步，包括在感染後合適的時間點，從所述的第二種細胞的上清液中收穫至少一個病毒顆粒。因此，本發明提供了得到條件性缺陷的流感病毒顆粒的方法，其包括用下述物質轉染合適的細胞通過內部刪除能編碼流感聚合酶的核酸而衍生的一個或多個基因構建體，由此使所述的基因構建體不能生產功能聚合酶，且不能阻止將病毒的基因片段包裝進病毒顆粒；和能編碼流感病毒的互補流感病毒核酸片段；和能在所述細胞中表達所述聚合酶的一個或多個表達質粒；在轉染後合適的時間點，從所述細胞的上清液中收穫至少一個病毒顆粒。所述的得到條件性缺陷的流感病毒顆粒的方法，包括第一步，用能在所述細胞中表達流感聚合酶的一個或多個表達質粒轉染合適的細胞；第二步，用包含條件性缺陷的流感病毒顆粒的上清液感染所述的細胞；第三步，包括在感染後合適的時間點，從所述細胞的上清液中收穫至少一個病毒顆粒；或得到條件性缺陷的流感病毒顆粒的方法，其包括第一步，用下述物質轉染合適的第一種細胞通過內部刪除能編碼流感聚合酶的核酸而衍生的一個或多個基因構建體，由此使所述的基因構建體不能生產功能聚合酶，且不能阻止將病毒的基因片段包裝進病毒顆粒；和能編碼流感病毒的互補流感病毒核酸片段；和能在所述細胞中表達所述聚合酶的一個或多個表達質粒；在轉染後合適的時間點，從所述的第一種細胞的上清液中收穫至少一個病毒顆粒；第二步，用能在所述細胞中表達所述聚合酶的一個或多個表達質粒轉染合適的第二種細胞；第三步，用包含從所述的第一種細胞得到的至少一個病毒顆粒的上清液感染所述的第二種細胞；第四步，包括在感染後合適的時間點，從所述的第二種細胞的上清液中收穫至少一個病毒顆粒。在該方法中，所述的聚合酶可以是例如酸性聚合酶(PA)、鹼性聚合酶1(PB1)或鹼性聚合酶2(PB2)。優選地，本發明提供了通過內部刪除能編碼流感聚合酶的核酸造成內部缺失的方法，對於PA蛋白，所述的內部缺失從位於由非編碼區計起的核苷酸58至207之間(不含端點)的5』-核苷酸開始，至位於由非編碼區計起的核苷酸27至194之間(不含端點)的3』-核苷酸結束；或者對於PB1蛋白，從位於由非編碼區計起的核苷酸43至246之間(不含端點)的5』-核苷酸開始，至位於由非編碼區計起的核苷酸24至197之間(不含端點)的3』-核苷酸結束；或者對於PB2蛋白，從位於由非編碼區計起的核苷酸34至234之間(不含端點)的5』-核苷酸開始，至位於由非編碼區計起的核苷酸27至209之間(不含端點)的3』-核苷酸結束。在另一個變體中，將外來片段插入該內部缺失中。另外，本發明提供了用包含條件性缺陷的流感病毒顆粒的上清液感染細胞的方法，所述的細胞已經能表達無功能的聚合酶，例如酸性聚合酶(PA)、鹼性聚合酶1(PB1)或鹼性聚合酶2(PB2)，和可以通過本文所述的方法得到的流感顆粒。例如，要用基因構建體和核酸片段轉染的細胞已經能表達無功能的聚合酶。更具體地，本發明提供了流感病毒顆粒，其包含一個或多個在片段中具有內部缺失的核酸片段，所述缺失使片段不能生產功能性流感聚合酶，且不能阻止將病毒的基因片段包裝進病毒顆粒中，其中聚合酶選自酸性聚合酶(PA)、鹼性聚合酶1(PB1)或鹼性聚合酶2(PB2)。優選地，內部缺失對於PA蛋白，從位於由非編碼區計起的核苷酸58至207之間(不含端點)的5』-核苷酸開始，至位於由非編碼區計起的核苷酸27至194之間(不含端點)的3』-核苷酸結束；對於PB1蛋白，從位於由非編碼區計起的核苷酸43至246之間(不含端點)的5』-核苷酸開始，至位於由非編碼區計起的核苷酸24至197之間(不含端點)的3』-核苷酸結束；對於PB2蛋白，從位於由非編碼區計起的核苷酸34至234之間(不含端點)的5』-核苷酸開始，至位於由非編碼區計起的核苷酸27至209之間(不含端點)的3』-核苷酸結束。在一個優選的實施方案中，本發明提供了根據本發明的顆粒，其具有能編碼病毒糖蛋白的流感病毒核酸片段。本發明還提供了根據本發明的顆粒，其具有能編碼核蛋白(NP)、鹼性聚合酶1(PB1)、鹼性聚合酶2(PB2)、血細胞凝集素(HA)、神經氨酸酶(NA)、基質蛋白(M1和M2)和非結構蛋白(NS1和NS2)的流感病毒核酸片段，或者提供了顆粒，其具有能編碼核蛋白(NP)、酸性聚合酶(PA)、鹼性聚合酶2(PB2)、血細胞凝集素(HA)、神經氨酸酶(NA)、基質蛋白(M1和M2)和非結構蛋白(NS1和NS2)的流感病毒核酸片段，或者提供了顆粒，其具有能編碼核蛋白(NP)、酸性聚合酶(PA)、鹼性聚合酶1(PB1)、血細胞凝集素(HA)、神經氨酸酶(NA)、基質蛋白(M1和M2)和非結構蛋白(NS1和NS2)的流感病毒核酸片段。更具體地，本發明提供了根據本發明的顆粒，其具有源自流感A病毒的流感病毒核酸片段。本發明還提供了根據本發明的顆粒，其含有不編碼流感肽的核酸。另外，本發明提供了包含根據本發明的顆粒的細胞，更具體地，細胞已經含有一種或多種流感病毒聚合酶，其中聚合酶選自酸性聚合酶(PA)、鹼性聚合酶1(PB1)或鹼性聚合酶2(PB2)。另外，本發明提供了組合物，其包含根據本發明的顆粒或細胞或源自根據本發明的細胞的物質，這樣的組合物在生產旨在生成使對象免受流感病毒感染的免疫保護的藥物組合物中的應用，和產生使對象免受流感病毒感染的免疫保護的方法，包括給需要的對象提供這樣的組合物。另外，本發明提供了根據本發明的顆粒在生產旨在將不編碼流感肽的核酸輸送給細胞的組合物中的應用，和根據本發明的顆粒在生產旨在將不編碼流感肽的核酸輸送給對象的細胞中的藥物組合物中的應用。這樣的核酸(在本文中也稱作外來核酸)可以編碼外來基因或基因片段，後者能編碼合適的抗原表位或蛋白，或者可以編碼一段核苷酸，後者能干擾細胞中的核酸轉錄。在一個實施方案中，本發明提供了根據本發明的流感A病毒顆粒在生產旨在將不編碼流感肽的核酸輸送進細胞或對象的細胞中的組合物中的應用。另外，本發明提供了將不編碼流感肽的核酸輸送進細胞或對象中的方法，包括給所述細胞或所述的對象提供有缺陷的流感病毒顆粒，其含有根據本發明的外來核酸。
附例

圖1的圖例條件性缺陷的流感A病毒的生產和繁殖。首先，用7個能編碼A/PR/8/34的雙向質粒、pHMG-PA和適當時的pΔPA或pDIPA轉染了293T細胞。轉染後48小時，收穫轉染的細胞的上清液，並用於接種給MDCK細胞和提前24小時用HMG-PA轉染的MDCK細胞。將病毒複製陽性的MDCK-PA細胞的上清液在MDCK和MDCK-PA細胞中傳代4次。
圖2的圖例用於生產條件性缺陷的病毒顆粒的構建體。上圖顯示了野生型PA基因片段。標示了非編碼區(NCR)和起始密碼子。通過用StuI消化pHW183，一種含有A/WSN/33的PA的雙向質粒(9)，並隨後重新連接，構建了pΔPA。通過將A/PR/8/34的PA基因片段的5』194和3』207nts克隆入pSP72中，構建了pDIPA。然後將插入物轉移給雙向的反向遺傳學載體。如本文所述，構建了pΔPB1和pΔPB2。
圖3的圖例RT-PCR分析PA基因片段在上清液rPR8-7，rPR8-ΔPA和rPR8-DIPA中的存在。使MDCK-PA第4代上清液穿過22μM過濾器，並離心濃縮。隨後，分離RNA，並使用針對PA片段的非編碼區的引物，進行RT-PCR。使用從野生型A/PR/8/34分離出的RNA作為對照。泳道1rPR8-7；泳道2rPR8-ΔPA；泳道3 rPR8-DIPA；泳道4野生型A/PR/8/34。標記物大小標示在左側。
圖4的圖例再刪除pΔPA構建體的較大部分，產生了pΔPA-2，pΔPA-3，pΔPA-4，pΔPA-5。
發明詳述實施例1從重組DNA生成有缺陷的流感A病毒顆粒流感A病毒是負鏈的、分段的病毒。其基因組由8個基因片段組成。所有8個功能性基因片段是生產感染性病毒所必需的，即所述的感染性病毒是可複製的病毒，其能在通常認為適合流感病毒複製的細胞中複製無限個或至少幾個周期。流感A病毒的基因片段的包裝過程，無論是通過隨機的還是特異性的機理，都已經爭論了許多年。已經描述了這2種選擇的一些證據。隨機包裝的證據是，聚集的病毒顆粒具有比未聚集的病毒顆粒更高的感染性(6)，且當以低moi感染細胞培養物時，一些感染的細胞不能表達一個片段(8)，這二者表明存在不含有完整流感病毒基因組的病毒粒子。隨機包裝的其它證據是，已經在實驗中生產了含有9個片段的流感病毒(4)。Bancroft和Parslow發現，源自相同的基因片段的vRNA之間在包裝病毒粒子方面沒有競爭(1)。
一個支持特異性包裝過程的理由是，儘管所有基因片段都等量地存在於病毒原液中，它們以不同的量存在於生產細胞中(10)。另外，當生成了有缺陷的幹擾(DI)顆粒時，DI vRNA會替換其所源自的片段(3)(有缺陷的幹擾顆粒是其中一個基因片段具有較大的內部缺失的病毒顆粒。當病毒以高moi傳代時，會出現這些顆粒，且認為其發生的原因是聚合酶酸性蛋白的R638A突變[Fodor等；J.Virol.77，5017-5020，2003])。最後，病毒粒子形成的效率隨著基因片段數目的增加而增加(5)。Fujii等也證實了NA片段區，它是將片段有效地整合進病毒粒子所必需的，後來該研究組也證實了HA和NS區，其對於包裝進病毒顆粒是重要的[Fujii，2005#256；Watanabe，2003#184]。
在這裡，我們提出了特異性包裝的證據。為了生產僅僅含有7個功能性基因片段的病毒顆粒，我們必須確定可以省去哪個基因片段，而不妨礙病毒生產。鑑於有複製缺陷的病毒作為疫苗的應用，未省去HA和NA，也未省去MA或NS，因為需要2個分開的表達質粒。我們生產了缺少聚合酶基因的病毒。當沒有用表達質粒反式補償缺失的基因片段時，我們不能生產病毒(表1，2和3，rPR8-7ntc)。在7個基因片段和能以非常低的滴度表達通常由缺失的基因片段表達的蛋白的質粒轉染後，可以生產病毒(表1，2和3，rPR8-7)。因此，生產了流感病毒A/WSN/33的基因片段1，2和3的缺失突變體，其分別攜帶1032，528和1120個核苷酸的內部缺失。將這些缺失突變體命名為pΔPB2，pΔPB1和pΔPA(見圖2)。如前所述(de Wit，E.，M.I.Spronken，T.M.Bestebroer，G.F.Rimmelzwaan，A.D.Osterhaus，and R.A.Fouchier.2004.Efficient generation and growth of influenza virus A/PR/8/34from eight cDNA fragments.Virus Res 103155-61)，用這些缺失的基因片段中的每一個和7個互補的能編碼A/PR/8/34的雙向構建體(DeWit等，2004)和合適的表達質粒，轉染了293T細胞。在轉染後48小時，收穫上清液。隨後，如前所述(2)，用表達質粒HMG-PB2，HMG-PB1或HMG-PA中的一個，轉染了MDCK細胞。將這些轉染的細胞接種給轉染的293T細胞的對應上清液(見圖1，其解釋了實驗方法)。通過HA-實驗，確定了這些MDCK細胞中的病毒複製。開始時，在未轉染的MDCK細胞中沒有病毒複製。在用HMG-PB2，HMG-PB1或HMG-PA轉染的、接種到對應上清液中的MDCK細胞中，發現了病毒複製。接著，在從流感序列資料庫(www.flu.lanl.gov，登記號K00867)得到的流感病毒A/PR/8/34的有缺陷的幹擾PA vRNA的序列的基礎上，我們克隆了有缺陷的PA基因片段。PCR-擴增了PA的5』207nt和3』194nt，克隆進源自如前所述(De Wit等.，2004)修飾的pHW2000(7)的雙向轉錄載體中。得到的質粒稱作pDIPA(見圖2)。用pDIPA，HMG-PA和7個能編碼剩餘的流感病毒A/PR/8/34基因片段的雙向構建體轉染了293T細胞(見圖2)。轉染後48小時，收穫上清液，隨後，將提前24小時用HMG-PA轉染的MDCK細胞接種給該上清液。接種後72小時，在這些MDCK細胞的上清液中進行HA-實驗，發現是陽性的，這指示著這些細胞中的病毒複製。如通過HA-實驗所確定的，接種未轉染的MDCK細胞也不能導致病毒生產。隨後在未轉染或轉染了HMG-PA的MDCK細胞上，傳代含有PA-缺陷的病毒顆粒的上清液，產生了相同的結果(表1)。直到第4代，在用HMG-PA轉染的MDCK細胞中生產了病毒。系列稀釋了MDCKp4的上清液，得到病毒滴度的示度(indication)，證實它是約104TCID50/ml。
使用的方法步驟是用構建體pΔPB2，pΔPB1，pΔPA，pΔNP中的一個，7個能編碼A/PR/8/34的互補構建體(De Wit等.，2004)和HMG-PB2，HMG-PB1，HMG-PA中的一個(表達質粒描述在例如Pleschka，S.，R.Jaskunas，O.G.Engelhardt，T.Zurcher，P.Palese，and A.Garcia-Sastre.1996.A plasmid-based reverse genetics systemfor influenza A virus.J Virol 704188-92.；獲自A.Garcia-Sastre andP.Palese)，轉染了293T細胞(關於轉染方法，見De Wit等.，2004)。在轉染後48小時，收穫轉染的293T細胞的上清液。當生成了病毒時，它們存在於上清液中。同時，用表達質粒HMG-PB2，HMG-PB1，HMG-PA中的一個(根據使用的缺失突變體，所以在使用pΔPB2的情況下，則用HMG-PB2轉染MDCK細胞)轉染了MDCK細胞(關於轉染方法，見Basler等.，2000)，因為生產的病毒缺少能表達該蛋白的基因片段，因為它們包裝了含有內部缺失的基因片段。在轉染後24小時，將轉染的MDCK細胞接種給從轉染的293T細胞得到的上清液。當病毒存在於293T上清液中時，該病毒會在轉染的MDCK細胞中複製，並生產更多的病毒。在接種後72小時，可以再次收集上清液。
為了證實沒有發生會產生功能性PA基因片段的PA或DIPA重組，從MDCKp4的上清液分離出了RNA。首先，使上清液穿過22μM過濾器，並離心濃縮。隨後，分離RNA，並使用針對PA片段的非編碼區的引物，進行RT-PCR。使用對PA vRNA特異性的引物進行的RT-PCR證實了，ΔPA和DIPA經過多次傳代後仍然穩定。在感染了DIPA病毒顆粒的MDCK細胞的上清液中，出現了約400bp的清晰帶，在感染了含有ΔPA的病毒的MDCK細胞的上清液中，出現了1100bp的帶。在感染了野生型A/PR/8/34的MDCK細胞的上清液中，可見約2300nt的帶(圖3)。這些結果表明，ΔPAPR8基因片段穩定地包裝進了病毒粒子中。
為了生產缺少PB2的病毒，用7個能編碼流感病毒A/PR/8/34的基因片段2，3，4，5，6，7和8(de Wit，E.，M.I.Spronken，T.M.Bestebroer，G.F.Rimmelzwaan，A.D.Osterhaus，和R.A.Fouchier.2004.Efficient generation and growth of influenza virus A/PR/8/34from eight cDNA fragments.Virus Res 103155-61)的雙向構建體轉染了293T細胞(Hoffmann，E.，G.Neumann，Y.Kawaoka，G.Hobom，和R.G.Webster.2000.A DNA transfection system for generation ofinfluenza A virus from eight plasmids.Proc Natl Acad Sci USA976108-13.)，導致了vRNA和mRNA的表達。共轉染了能表達A/PR/8/34的PB2、pHMG-PB2的質粒(Pleschka，S.，R.Jaskunas，O.G.Engelhardt，T.Zurcher，P.Palese，和A.Garcia-Sastre.1996.Aplasmid-based reverse genetics system for influenza A virus.J Virol704188-92.)。作為對照，僅僅轉染了能編碼A/PR/8/34的7個雙向構建體，省去了pHMG-PB2。轉染後48小時，收穫上清液，並接種給MDCK細胞或提前24小時在100mm盤中轉染了pHMG-PB2(MDCK-PB2)的MDCK細胞。接種後3天，使用火雞紅細胞作為病毒生產的指示劑，測試了接種的MDCK細胞的上清液的血細胞凝集活性。在接種了僅僅轉染了7個基因片段、沒有轉染pHMG-PB2(rPR8-7ntc，表2)的293T細胞的上清液的細胞中，沒有檢測到病毒。接種了轉染了7個基因片段和pHMG-PB2的293T細胞上清液的MDCK-PB2細胞上清液是陽性的。隨後，使rPR8-7上清液在MDCK和MDCK-PB2細胞中傳代。rPR8-7能在MDCK-PB2細胞中複製，但是在MDCK細胞中不能(表2)。我們接著生產了流感病毒A/WSN/33的基因片段1的1032nt缺失突變體，產生了344個胺基酸的缺失(pΔPB2，圖2)。如上所述，生產了含有ΔPB2(rPR8-ΔPB2)的重組病毒(圖1)。在MDCK細胞中沒有檢測到病毒，而在接種了rPR8-ΔPB2的MDCK-PB2細胞中檢測到了病毒。傳代rPR8-ΔPB2後，在MDCK細胞中沒有病毒生成的證據，這與MDCK-PB2細胞相反(表2)。
還生產了缺少PB1的病毒。用能編碼流感病毒A/PR/8/34的基因片段1，3，4，5，6，7和8的7個雙向構建體轉染了293T細胞，導致了vRNA和mRNA的表達。共轉染了能表達A/PR/8/34的PB1和pHMG-PB1的質粒。作為對照，僅僅轉染了能編碼A/PR/8/34的7個雙向構建體，省去了pHMG-PB1。轉染後48小時，收穫上清液，並接種給MDCK細胞或提前24小時在100mm盤中轉染了pHMG-PB1(MDCK-PB1)的MDCK細胞(2)(圖1)。接種後3天，使用火雞紅細胞作為病毒生產的指示劑，測試了接種的MDCK細胞的上清液的血細胞凝集活性。在接種了僅僅轉染了7個基因片段、沒有轉染pHMG-PB1(rPR8-7ntc，表3)的293T細胞的上清液的細胞中，沒有檢測到病毒。接種了轉染了7個基因片段和pHMG-PB1的293T細胞上清液的MDCK-PB1細胞上清液是陽性的。隨後，使rPR8-7上清液在MDCK和MDCK-PB1細胞中傳代。rPR8-7能在MDCK-PB1細胞中複製，但是在MDCK細胞中不能(表3)。我們接著生產了流感病毒A/WSN/33的基因片段2的528nt缺失突變體，產生了178個胺基酸的缺失(pΔPB1，圖2)。如上所述，生產了含有ΔPB1(rPR8-ΔPB1)的重組病毒(圖1)。在MDCK細胞中沒有檢測到病毒，而在接種了rPR8-ΔPB1的MDCK-PB1細胞中檢測到了病毒。傳代rPR8-ΔPB1後，在MDCK細胞中沒有病毒生成的證據，這與MDCK-PB1細胞相反(表3)。
因而，我們已經能使用如上所述的RNA聚合酶II-驅動的PB2，PB1或PA表達質粒，通過提供pΔPB2，pΔPB1，或pΔPA/pDIPA構建體和反式互補，生產缺少片段1，2，或3的病毒。這裡所述的條件性缺陷的病毒可以在非反式補償的細胞中僅僅經歷1個周期的複製，但是可以在反式互補的細胞系中繁殖。這是首次使用反向遺傳學生產有缺陷的病毒，其僅僅含有7個功能性基因片段，且可以經歷1個周期的複製，或者當反式補償了有缺陷的基因片段時，可以經歷多個周期的複製。
以該方式生產的有缺陷的病毒顆粒是疫苗候選品，因為它們可以經歷1個周期的複製，而不生成感染性病毒。該單周期複製的結果是，疫苗會誘導體液和細胞免疫反應。儘管這些有缺陷的顆粒不能在正常細胞中複製，為了生產目的，可以使大量病毒在能表達有缺陷的蛋白的細胞系中生長。正如我們已經證實的，多個周期的複製不會影響病毒的基因型。除了有缺陷的病毒顆粒作為疫苗的應用外，它們也是基因輸送和表達外來蛋白的候選載體，因為可以將功能性基因插入5』和3』PA，PB2或PB1序列之間。這也得到了Watanabe等(11)的證實，他們用外來基因替換了HA和NA，仍然能生成病毒。
pΔPA的進一步截短另外，刪除了pΔPA構建體的更大部分，產生了pΔPA-2，pΔPA-3，pΔPA-4，pΔPA-5(圖4)。如前所述(De Wit等.，2004)，用這些缺失的基因片段之一和能編碼A/PR/8/34的7個互補雙向構建體(De Wit等，2004)和能表達PA的表達質粒轉染了293T細胞。轉染後48小時，收穫上清液。隨後，如前所述(Basler，C.F.，等.，2000.Proc Natl AcadSci USA 9712289-94.)，用表達質粒HMG-PA轉染了MDCK細胞。用轉染的293T細胞的上清液接種了這些轉染的細胞和未轉染的細胞。通過HA-實驗，檢測了這些MDCK和MDCK-PA細胞中的病毒複製。在未轉染的MDCK細胞中沒有病毒複製。在接種了任一種上清液的HMG-PA轉染的MDCK細胞中，發現了病毒複製。因而，所有源自這些構建體的vRNA都包裝進了病毒粒子(表4)。
表1.缺少完整的PA基因片段的重組流感A/PR/8/34病毒在MDCK和MDCK-PA細胞中的複製
ntc未反式補償的(在293T細胞中沒有轉染pHMG-PA)
表2.缺少完整的PB2基因片段的重組流感A/PR/8/34病毒在MDCK和MDCK-PB2細胞中的複製
ntc未反式補償的(在293T細胞中沒有轉染pHMG-PB2)表3.缺少完整的PB1基因片段的重組流感A/PR/8/34病毒在MDCK和MDCK-PB1細胞中的複製
ntc未反式補償的(在293T細胞中沒有轉染pHMG-PB1)表4.缺少完整的PA基因片段的重組流感A/PR/8/34病毒在MDCK-PA和MDCK細胞中的複製
實施例2用有缺陷的重組病毒接種疫苗在含有相關流行病病毒(例如A/莫斯科/10/99)的HA和NA基因的高通量病毒主鏈(例如源自疫苗株A/PR/8/34)的基礎上，如本文所述，生產了條件性缺陷的缺少功能性PA、PB1或PB2基因的重組病毒。通過轉染生產了條件性缺陷的病毒，其中通過反式互補實現了聚合酶蛋白表達。隨後，在能穩定表達相關聚合酶的合適細胞基質(例如MDCK細胞或Vero細胞)中擴增了病毒。通過在1000xg離心10分鐘，澄清了病毒上清液。通過在20-60％蔗糖梯度中進行超離心，濃縮和純化了病毒，沉澱後，重新懸浮到磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。使用考馬斯亮藍染色的12.5％SDS-聚丙烯醯胺凝膠，確認了病毒製品的純度和數量，通過MDCK細胞和能表達相關聚合酶的MDCK細胞的感染和用抗-核蛋白單克隆抗體染色，確定了條件性缺陷的病毒的病毒滴度。使用噴霧器，給小鼠氣管內地或鼻內地接種1×10550％組織-培養物感染劑量(TCID-50)。使用血凝反應抑制實驗、神經氨酸酶抑制實驗、ELISA或病毒中和實驗，確定了接種疫苗之前和之後收集的血清樣品中的針對流感病毒的HA、NA和內部蛋白的抗體滴度。通過流式細胞儀、CD4和CD8-陽性細胞的四聚體染色、細胞裂解活性、T-細胞增殖等，測量細胞內的細胞因子表達，對接種疫苗的動物中的抗原特異性的細胞免疫反應進行了定量。接種疫苗後6周，使用1×106TCID-50的流感病毒A/莫斯科/10/99或異源病毒分離株，攻擊接種疫苗的動物和對照動物。攻擊後，每天從動物收集鼻的或咽喉的拭抹樣品，進行10天，通過定量PCR分析或病毒滴定，確定了感染動物排出的病毒的量。通過對抗體滴度的升高進行定量，確定了得到的疫苗誘導的體液免疫，通過對輔助和細胞毒性T-細胞反應的升高進行定量，確定了得到的疫苗誘導的細胞免疫，通過確定針對攻擊病毒的感染的保護，確定了免疫的總水平。
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權利要求
1.有缺陷的流感病毒顆粒，當與它的天然基因組相比較時，其缺少一個功能性流感病毒核酸片段。
2.有缺陷的流感病毒顆粒，其缺少編碼酸性聚合酶(PA)的功能性流感病毒核酸片段。
3.根據權利要求1的有缺陷的流感病毒顆粒，其中缺少的片段編碼酸性聚合酶(PA)。
4.根據權利要求1至3中的任一項的有缺陷的流感病毒顆粒，其具有編碼病毒糖蛋白的流感病毒核酸片段。
5.根據權利要求1至4中的任一項的有缺陷的流感病毒顆粒，其具有編碼核蛋白(NP)、鹼性聚合酶1(PB1)、鹼性聚合酶2(PB2)、血細胞凝集素(HA)、神經氨酸酶(NA)、基質蛋白(M1和M2)和非結構蛋白(NS1和NS2)的流感病毒核酸片段。
6.根據權利要求1至5中的任一項的有缺陷的流感病毒顆粒，其具有源自WHO推薦的用於疫苗目的的流感病毒的流感病毒核酸片段。
7.根據權利要求1至5中的任一項的有缺陷的流感病毒顆粒，其具有源自流感A病毒的流感病毒核酸片段。
8.根據權利要求1至7中的任一項的有缺陷的流感病毒顆粒，其含有不編碼流感肽的核酸。
9.細胞，其含有根據權利要求1至8中的任一項的有缺陷的流感病毒顆粒。
10.根據權利要求9的細胞，其含有流感病毒酸性聚合酶(PA)。
11.組合物，其包含根據權利要求1至8中的任一項的有缺陷的流感病毒顆粒或根據權利要求9或10的細胞或源自所述細胞的物質。
12.根據權利要求11的組合物在生產旨在生成使對象免受流感病毒感染的免疫保護的藥物組合物中的應用。
13.產生使對象免受流感病毒感染的免疫保護的方法，包括給有此需要的對象提供根據權利要求11的組合物。
14.根據權利要求8的有缺陷的流感病毒顆粒在生產旨在將不編碼流感肽的核酸輸送給細胞的組合物中的應用。
15.根據權利要求8的有缺陷的流感病毒顆粒在生產旨在將不編碼流感肽的核酸輸送給對象的細胞的藥物組合物中的應用。
16.將不編碼流感肽的核酸輸送給細胞的方法，包括為所述細胞提供根據權利要求8的有缺陷的流感病毒顆粒。
17.將不編碼流感肽的核酸輸送給對象的方法，包括為所述對象提供根據權利要求8的有缺陷的流感病毒顆粒。
全文摘要
本發明涉及流感病毒和針對流感的疫苗接種領域。本發明提供了條件性缺陷的流感病毒顆粒，其具有7個不同的流感核酸片段。本發明還提供了條件性缺陷的流感病毒顆粒，其缺少選自基本編碼酸性聚合酶(PA)、鹼性聚合酶1(PB1)和鹼性聚合酶2(PB2)的片段的流感核酸片段。更具體地，本發明提供了有缺陷的流感病毒顆粒，其具有7個不同的流感核酸片段，且缺少基本編碼酸性聚合酶的流感核酸片段。另外，本發明提供了包含根據本發明的有缺陷的流感病毒顆粒的組合物在生產旨在生成使對象免受流感病毒感染的免疫保護的藥物組合物中的應用，並提供了產生使對象免受流感病毒感染的免疫保護的方法，包括給需要的對象提供包含這樣的有缺陷的流感病毒顆粒的組合物。
文檔編號A61K48/00GK101056976SQ200580038694
公開日2007年10月17日 申請日期2005年11月8日 優先權日2004年11月11日
發明者E·德維特, M·I·J·斯普隆肯, R·A·M·福切爾, A·D·M·E·奧斯特霍斯 申請人:索爾瓦藥物有限公司, 伊拉斯謨大學鹿特丹醫藥中心