具有降血壓功能的重組乳酸菌及其製備方法

2023-06-12 01:00:51

專利名稱：具有降血壓功能的重組乳酸菌及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，一種具有降血壓功能的重組乳酸菌及其製備方法。
背景技術：
高血壓是危及人類身體健康的主要疾病之一，是一種最常見的慢性心腦血管疾 病，它發病率高，可以誘發冠心病、腦出血等疾病的發生，並大多數引起心、腦、腎等重要器 官的一系列損傷與嚴重的病變，甚至是功能衰竭，以及糖、脂質代謝紊亂，對人們的身體健 康造成很大的威脅。據統計，全世界人群高血壓患病率高達10%-20%，患高血壓的人數已 經達到10億，每年超過1200萬人死於高血壓引起的各類疾病。我國人群高血壓患病率呈 上升趨勢，三次全國性高血壓調查顯示，1959年的發病率是5. 11%, 1979-1980年發病率為 7. 73%，1990-1991年發病率為11. 26%，我國現有的高血壓患者已經超過1. 2億人，而且每 年仍以600多萬人的速度遞增[3』4]。根據世界衛生組織預測，至2020年，非傳染性疾病將佔 我國死亡原因的79%，其中高血壓等心血管疾病將佔首位。因此，預防和治療高血壓病已成 為當今社會研究的熱點[5]。衛生部的最新統計結果顯示，我國高血壓發病率為18.8%，高 血壓患者數達1.6億左右。因此，有效預防和治療高血壓是目前亟待解決的重大問題之一。目前世界衛生組織(WHO)推薦的治療高血壓的一線藥物6大類，即利尿劑、α工受 體阻斷劑、β受體阻斷劑、鈣拮抗劑、血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素II受 體拮抗劑(ARB)。在藥物治療時，最常用方法是利用血管緊張素轉換酶抑制劑藥物為主，但 是常規的降血壓藥對人體肝、腎等有較大副作用且易引發咳嗽、浮腫、頭暈等不適反應。所 以，尋找天然的、安全的、食品源性的生物活性降血壓物質來治療高血壓引起了廣大科學家 的極大關注。降血壓肽又稱為血管緊張素轉化酶抑制肽(Angiotensin I-Converting EnzymeInhibitory Peptides,筒稱ACEIP或ACE抑制肽)，是一類具有抑制血管緊張素轉 化酶(Angiotensin-converting enzyme，筒稱ACE)活性，或稱ACE抑制活性的多肽物質， 一般分子量都比較小，這些多肽的胺基酸序列和肽鏈長度各有不同，但都具有類似的功能， 同時它也是一種競爭性抑制劑，與ACE活性區域的親和力強於血管緊張素I或緩激肽，且 不易釋放，從而阻止ACE催化水解血管緊張素I成為血管緊張素II，打斷RAS系統鏈，舒張 血管，減少水鈉瀦留，引起血壓下降；同時阻止緩激肽失活，加強緩激肽的作用，起到安全降 壓的效果。通常由蛋白酶在溫和條件下水解蛋白質而獲得ACE抑制肽，安全性高，其突出的 優點在於不會發生降壓過度的現象，它只對高血壓患者有明顯的降壓作用，而對血壓正常 者無降壓作用。除降壓功能，ACE抑制肽還具有免疫調節、抗凝血、抗腫瘤和容易被消化吸 收等諸多功能。不同長度和來源的ACE抑制肽結構_活性的關係表明，ACE抑制肽的C-末端三肽 序列強烈影響其同ACE的結合能力。ACE對水解底物的末端，尤其是C-末端的胺基酸殘基的性質具有高度的特異性。 研究表明ACE更傾向於同C-末端的3個位置上為疏水性胺基酸的底物或競爭性抑制劑結
3合。Kohama等研究認為，ACE抑制肽的C-端胺基酸是與ACE活性部位結合的關鍵，並指出 了其與腦啡肽酶活性位點的不同之處。活性較強的ACE抑制肽的C-末端胺基酸一般為環 狀結構的芳香族胺基酸或脯氨酸；在N-端最具活性的是長鏈或具有支鏈的疏水胺基酸或 鹼性胺基酸，脯氨酸除外。如果C-末端為精氨酸殘基，其攜帶的正電荷對於多種ACE抑制 肽的抑制作用至關重要。ACE的N-區和C-區是具有活性的兩個基團，其功能基本相同，只是對底物的親和 力不同，ACE抑制肽與血管緊張素I和舒緩激肽相比，對活性區域的親和力更強，從而競爭 性地抑制ACE的活性，使血管緊張素I不能轉化為血管緊張素II，並水解舒緩激肽為無活 性的短肽片段，起到降血壓的作用。ACE的活性與結構之間存在著密切的關係，當ACE與競爭性抑制劑或底物的氨基 酸殘基結合時，具有高度的專一性。目前認為如果要使ACE抑制肽具備較高的活性，C末端 的一般要為Thr、Phe, Pro而且序列中最好要含有疏水性胺基酸；N末端最好為Val、Ile和 Argo目前從食品或天然藥物中分離出的降血壓肽大多數在結構上都符合這個要求，如從酸 奶中分離出來的2種高活性的降血壓肽，Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro，還有來自天然食物 中的多種有活性的降血壓肽都符合此規律。自從在南美洲蝮蛇(Bothrops jararaca)毒液中發現了一種多肽類ACE抑制肽， 並驗證其具有降壓作用以來，生物源性降血壓物質成為廣大學者的關注焦點。Oshima等首 次通過蛋白酶水解食品蛋白中獲得ACEIP。隨後國內外學者應用單一蛋白酶或多種蛋白酶 聯合水解不同的食品蛋白，獲得多種ACE抑制肽。試驗所用的材料幾乎包括所有的食品蛋 白，如魚肉蛋白、豬肉及雞肉蛋白、卵蛋白、牛乳酪蛋白、乳清蛋白、血紅蛋白、血漿蛋白、大 豆蛋白、大麥醇溶蛋白、玉米蛋白、蕎麥蛋白、小麥蛋白、菜豆蛋白、油菜子蛋白、大蒜、海藻、 貝類、魚骨蛋白等等。隨著科技的發展，人工固相、液相多肽合成法被用於合成一些比較短的ACE抑制 肽，並取得了一定的成果。Kohmura等於1990年，以人κ-酪蛋白(f63 65)為目標用氨 基酸分段固相法合成了 23條肽，分析發現C-端帶有Pro殘基的肽段可能具有ACE抑制活 性。酶水解法過程中原料蛋白利用率有限，造成了一定程度的浪費，並且產物很難被 純化出來；人工合成法獲得ACE抑制肽，所需的反應條件高，成本高、副反應物及殘留化合 物多等不利因素，不適於大規模的工業生產。微生物發酵法，大多是利用乳酸菌發酵食物蛋白(一般採用牛乳)生產ACE抑制 肽。這是因為乳酸菌具有較強的蛋白分解酶系統，在代謝過程中能產生某些蛋白酶，限制性 水解蛋白，水解牛乳中的蛋白產生分子大小以及作用各有差異的生物活性肽段，其中包括 具有抑制ACE活性的小肽。使發酵酸乳中含有大量的ACE抑制肽，並從中可以分離提取到 具有抗高血壓作用的ACE抑制肽。高血壓病人服用該酸乳(或用其提取的ACE抑制肽)，具有良好的降低血壓的作 用，而對血壓正常者無降壓作用，來源於食品蛋白的ACE抑制肽具有無毒、無副作用的特 性，顯示出良好的開發潛力及應用前景。但高血壓病人需要連續不間斷地服用，一旦停藥， 血壓又恢復到原來的狀態。乳酸菌(Lactic acid bacteriaor, LAB)是一類群可以發酵碳水化合物(主要指葡萄糖)產生大量乳酸的細菌統稱，革蘭氏染色陽性。乳酸菌作為人和動物消化道重要的 共生益生菌，對調節消化道微生態平衡，提高機體黏膜免疫具有積極的作用。。

發明內容
本發明的目的是為解決用ACE抑制肽治療高血壓，需連續服藥的問題，而提供能 夠定植於腸道內，持續分泌ACE抑制肽的，對高血壓患者有明顯的降壓作用，而對血壓正常 者無降壓作用的，具有降血壓功能的重組乳酸桿菌及其製備方法。一種ACE抑制肽基因，筒稱ACEIPn，它是將n個ACE抑制肽基因用精氨酸(Arg)串 聯，並根據乳酸菌偏愛密碼子設計的基因序列；n為3-10。所述的ACE抑制肽基因可以重複；一種ACE抑制肽基因，其鹼基序列如序列表SEQ ID No. 1、2、3或4所示。一種重組質粒pW425et-ACEIPn ；它是插入了上述的ACEIPn的大腸桿菌-乳酸菌 穿梭表達載體pW425et。具有降血壓功能的重組乳酸桿菌，是轉化了重組質粒pW425et-ACEIPn的乳酸杆 菌；所述的乳酸桿菌為植物乳酸桿菌；具有降血壓功能的重組乳酸桿菌製備方法，它包括1)人工合成ACE抑制肽基因序列ACEIPn，上下遊酶切位點分別為Sac I和Kpn I ；2)將ACEIPn插入大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達載體pW425et中，構建大腸桿菌-乳 酸菌穿梭表達重組質粒pW425et-ACEIPn ；3)將重組質粒pW425et_ACEIPn轉化至乳酸桿菌中；4)將重組乳酸桿菌接種於液體MRS培養基中，37°C，靜止厭氧培養。本發明根據乳酸菌偏愛密碼子，將若干個ACE抑制肽基因序列用精氨酸串連，上 下遊分別加入Sac I和Kpn I酶切位點，人工合成一種ACE抑制肽基因ACEIPn ；構建大 腸桿菌_乳酸菌穿梭表達的重組質粒pW425et-ACEIPn，將重組質粒轉化至乳酸桿菌中，得 到的具有降血壓功能的重組乳酸桿菌，經大量增菌培養後，直接罐服給原發性高血壓大鼠 (SHR)，灌服14天，SHR大鼠於第2天起血壓明顯降低，停藥10天後，仍然有降壓作用，這說 明本發明一種具有降血壓功能的重組乳酸桿菌，已經定植於腸道內，並分泌ACE抑制肽降 壓肽。本發明利用乳酸桿菌作為人類消化道共生菌的優勢，製備了降血壓功能的重組乳 酸桿菌。規避現有化學合成降血壓藥物副作用的風險，患者無需天天服藥。重組乳酸桿菌表 達的降血壓肽對血壓正常者無降壓作用，而且不被腸道蛋白酶所作用，吸收率高，具有「降 壓效果顯著、安全性高、無毒副作用」等優勢，為高血壓的防治提供新策略。解決了目前從天然動植物中分離提取降血壓肽主要採用酶解法，而由於利用特異 性蛋白酶篩選繁瑣、分離純化工藝複雜、產量低等問題而制約產業化進程；採用化學合成來 獲取多肽的成本相對較高，且存在安全等問題。本發明採用重組DNA技術，將具有降血壓 功能短肽片段的基因整合至植物乳酸桿菌中，使植物乳酸桿菌能夠持續穩定地表達降血壓 肽，製備方法和生產工藝相對簡便，利於規模化生產。植物乳酸桿菌具有很多營養和保健功能，特別是具有增強黏膜免疫，抗腫瘤、抗動
5脈粥樣硬化、調節微生態平衡等諸多生理功能。本發明在植物乳酸桿菌原有益生功能的基 礎上，創造性地賦予其降血壓功能，「一菌多效」，促進健康，具有潛在的應用前景和一定的 社會效益。


圖1.質粒pUC57-p印4提取結果。
圖2.質粒pW425et提取結果。
圖3.ρ印4和pW425et大片段回收結果。
圖4.大腸桿菌X51中重組表達載體pW425et-p印4提取結果。
圖5.大腸桿菌X51中重組表達載體pW425et-p印4雙酶切鑑定結果。
圖6.重組植物乳酸桿菌Lb. ρlanturm Wang中pW425et_p印4提取結果。
圖7.重組植物乳酸桿菌Lb. ρ lanturm Wang中pW425et_p印4雙酶切鑑定結果。
圖8.血壓測定結果。
具體實施例方式實施例1降血壓肽基因序列ACEIPn的獲得設計兩段降血壓活性較高的短肽，由精氨酸(Arg)串聯，並具有兩個重複，其氨基 酸序列如SEQ ID No. 1 ；根據乳酸菌偏愛密碼子，上下遊分別加入Sac I和Kpn I酶切位 點，設計ACEIPn基因序列，分別命名為ρ印1、ρ印2、ρ印3、pep4，其基因序列分別如SEQ ID No. 1、2、3、4所示，由北京華大基因公司合成，合成形式為pUC57-ACEIPn ；其中ρ印4是由兩 段ACE抑制肽，由精氨酸(Arg)串聯，並具有兩個重複，其胺基酸序列如SEQ ID No. 5。
實施例2重組表達載體pW425et_p印4的構建1)質粒 pUC57_p印4 和 pW425et 的製備分別製備含有pUC57-p印4和pW425et的大腸桿菌菌液，按照質粒DNA提取試劑 盒說明書操作，提取質粒，取2 μ L進行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果成功獲得了質粒 pUC57-p印4，如圖1所示；質粒pW425et，如圖2所示。2)目的基因的回收、連接和轉化目的基因的回收採用Sac I和Kpn I限制性內切酶分別對pUC57_p印4和pW425et進行雙酶切，以 獲得ρ印4基因和pW425et大片段；雙酶切體系如下IOxL Buffer2. 0 μ L重組質粒(或載體)2. 0 μ LSac I(12U/y L) l.OyLKpn I(12U/y L) l.OyLddH2014. 0μ L_Total V20. 0 μ L反應條件37°C水浴3h。結束後，按DNA凝膠回收試劑盒說明書操作，對目的基因 片段進行回收，並取ι μ L進行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果成功回收了 pep4和載體大
6片段，如圖3所示。ρ印4和載體大片段的連接對回收的目的基因片段進行連接，連接體系如下IOxLigation Bufferl.OyLρ印4基因回收產物7. OyLpff425et 回收產物LOyLT4DNA 連接酶(3U/ μ L)l.OyL_Total V10. 0 μ L反應條件21°0連接51!，41過夜；次日轉化大腸桿菌Χ51感受態。重組表達載體pW25et_p印4的轉化取10 μ L上述連接混合物加入100 μ L大腸桿菌Χ51感受態中，混勻後冰浴30min ； 42°C熱激90s，立即冰浴5min ；加800 μ L新鮮液體LB培養基，37 °C，160r/min搖床培養 2-3h ；分別取50 μ L、100y L、150 μ L、200 μ L菌液塗布於準備好的含有紅黴素(200 μ g/mL) LB瓊脂平板上，37°C培養8-16h，篩選重組陽性克隆子。重組表達載體pW425et_p印4的酶切鑑定按試劑盒說明書操作提取篩選疑似陽性克隆子質粒，並取2 μ L進行0. 8%瓊脂糖 凝膠電泳，如圖4所示。採用SacI和Kpn I限制性內切酶對所提取的質粒載體進行酶切鑑 定，酶切體系如下IOxL Buffer2. 0 μ L重組質粒(或載體)2. 0 μ LSac I(12U/y L) l.OyLKpn I(12U/y L) l.OyLddH2014. 0μ L_tal V20. 0μ L反應條件37°C水浴3h。結束後，取2 μ L進行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯 示成功構建了重組表達載體pW425et-p印4，如圖5所示。實施例3具有降血壓功能的重組乳酸桿菌Lb. planturm Wang的製備1)乳酸桿菌感受態細胞製備及轉化將_70°C超低溫凍存的植物乳酸桿菌、保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌、 乾酪乳桿菌、羅伊氏乳桿菌或發酵乳桿菌，37°C孵育至解凍，塗布於MRS平板(含胸苷酸 100 μ g/mL)，37°C厭氧靜止培養過夜。次日，挑取菌落接種於新鮮的IOmL MRS液體培養基中 (含1 %甘氨酸)，37 °C厭氧靜止培養至菌體OD6tltl值為0. 6-0. 8。取菌體培養液，按1 % _2 % 劑量接種於新鮮MRS液體培養基中(含甘氨酸)，37°C厭氧靜止培養，待菌體0D_值為 0. 2-0. 3時，收集備用；將以上收集的菌體培養物冰浴lOmin，4°C，6000r/min,離心5min。沉澱用冰冷的 清洗緩衝液清洗兩次；4°C，6000r/min，離心5min收集沉澱，最後重懸於電擊緩衝液中，冰 浴 5min ；
7
取上述處理的乳酸桿菌感受態200 μ L，加入20 μ L重組表達載體pW425et_p印4， 輕輕混合後轉置冰冷的電極杯中(Φ20πιπι)，冰浴5min後進行高壓電轉化，條件為電壓 2. 5kv，時間 3. Oms ；高壓電擊後，將電極杯冰浴5min，將杯中內容物轉置800 μ L新鮮的液體MRS培養 基中，37°C厭氧靜止復甦4-5h，塗布含有紅黴素(400yg/mL)的MRS平板，37°C厭氧靜止培 養16-20h，篩選陽性克隆子。2)乳酸桿菌中重組表達載體pW425et-p印4的鑑定試劑盒提取疑似陽性重組乳酸桿菌的質粒DNA，並取2 μ L進行0. 8%瓊脂糖凝膠 電泳，如圖6所示；採用SacI和Kpn I限制性內切酶對所提取的質粒載體進行酶切鑑定，酶 切體系如下
IOxLBuffer2. 0 μ L
重組質粒(或載體)2. OyL Sac I(12U/y L) l.OyL Kpn I(12U/y L) l.OyL ddH2014. 0μ L_Total V20. 0μ L 反應條件37 °C水浴3h。結束後，取2 μ L進行0. 8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖7 所示，證實成功了製備了重組乳酸桿菌Lb. planturm Wango3)將重組乳酸桿菌Lb. planturm Wang接種於液體MRS培養基中，37°C，靜止厭氧 培養至每毫升菌液中含有2 X IO11個活菌。實施例4ρ印1、ρ印2、ρ印3重複實施例2-3。實施例5重組乳酸桿菌Lb. planturm Wang降血壓功能的檢測原發性高血壓大鼠(SHR) 30隻，購自北京維通利華實驗動物有限公司，隨機分成 3組，每組10隻，分別是PBS緩衝液對照組(A)，Lb. planturm(B組)和重組植物乳酸桿菌 Lb. planturmffang實驗組(C組)，試驗分組及劑量如表1所示。試驗期為24天，自第1天 起，各組連續灌服15天，C組於第15天停止灌服重組植物乳酸桿菌Lb. planturm Wang，試 驗程序如表2所示。表1.對比試驗分組及劑量 表2.試驗程序
試驗結束後，應用GraphPad Prism統計軟體分析試驗數據，繪製折線圖，如圖8所 示。結果表明，重組植物乳酸桿菌Lb. planturm Wang灌服後，SHR大鼠於第2d血壓明顯降低， 達到 199. 417士 1. 665mmHg, Lb. planturm 對照組為 201. 151 士0. 0856mmHg, PBS 緩衝液對照組為 200. 202 士0. 23ImmHg ；隨著試驗時間的增力Π，至第15d停藥，重組植物乳酸桿菌Lb. planturmffang 組大鼠血壓與Lb. planturm對照組和PBS緩衝液對照組相比，呈顯著下降趨勢，且於第15天達 到最低，為 165. 439士2. 696mmHg(P < 0. 01)，而 Lb. planturm 對照組(199. 316士3. 574mmHg)與 PBS緩衝液對照組(200. 662士0. 342mmHg)相比，血壓雖有降低，但差異不顯著。第15天停藥後，各組大鼠於第19d、24d分別測定血壓情況，結果表明，停藥後 重組植物乳酸桿菌Lb. planturm Wang組大鼠和Lb. planturm對照組大鼠血壓呈上升趨 勢，PBS對照組血壓無變化；至24d，重組植物乳酸桿菌Lb. planturm Wang組大鼠血壓為 183. 338 士0. 535mmHg (P < 0. 05)，顯著低於 Lb. planturm 對照組(200. 937 士0. 447)和 PBS 緩衝液對照組(201. 030 士0. 456mmHg)。
權利要求
一種ACE抑制肽基因，簡稱ACEIPn，其特徵在於是將n個ACE抑制肽基因用精氨酸串聯，並根據乳酸菌偏愛密碼子設計的基因序列，其中n為3 10的整數。
2.根據權利要求1所述的一種ACE抑制肽基因，其特徵在於所述的ACE抑制肽基因可以重複。
3.根據權利要求1所述的一種ACE抑制肽基因，其特徵在於其鹼基序列如序列表 SEQID No. 1、2、3 或 4 所示。
4.一種重組質粒pW425et-ACEIPn，其特徵在於它是插入了 ACEIPn的大腸桿菌-乳酸 菌穿梭表達載體pW425et。
5.具有降血壓功能的重組乳酸桿菌，其特徵在於它轉化了重組質粒pW425et-ACEIPn 的乳酸桿菌。
6.根據權利要求5所述的具有降血壓功能的重組乳酸桿菌，其特徵在於乳酸桿菌為 植物乳酸桿菌。
7.具有降血壓功能的重組乳酸桿菌製備方法，它包括1)人工合成ACE抑制肽基因序列ACEIPn，上下遊酶切位點分別為SacI和Kpn I ；2)將ACEIPn插入大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達載體pW425et中，構建大腸桿菌-乳酸菌 穿梭表達重組質粒pW425et-ACEIPn ；3)將重組質粒pW425et-ACEIPn轉化至乳酸桿菌中；4)將重組乳酸桿菌接種於液體MRS培養基中，37°C，靜止厭氧培養。
全文摘要
本發明公開了一種具有降血壓功能的重組乳酸桿菌及其製備方法，根據乳酸菌偏愛密碼子，將若干個ACE抑制肽基因序列用精氨酸串連，上下遊分別加入Sac I和Kpn I酶切位點，人工合成ACEIPn，構建大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達的重組質粒pW425et-ACEIPn，將重組質粒轉化至乳酸桿菌中，經口服定植於腸道內，能夠持續穩定地表達降血壓肽，患者無需天天服藥。重組乳酸桿菌表達的降血壓肽對血壓正常者無降壓作用，而且不被腸道蛋白酶所作用，吸收率高，具有「降壓效果顯著、安全性高、無毒副作用」等優勢，乳酸桿菌具有很多營養和保健功能，為高血壓的防治提供了新策略，其製備方法和生產工藝相對簡便，利於規模化生產。
文檔編號C12R1/25GK101892238SQ20101020044
公開日2010年11月24日 申請日期2010年6月13日 優先權日2010年6月13日
發明者杜芳, 楊桂連, 王春鳳 申請人:王春鳳