一種利用酶切延伸增加讀長的測序方法

2023-06-22 07:48:41 4

專利名稱：一種利用酶切延伸增加讀長的測序方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，更具體地說，涉及一種利用酶切延伸增加讀長的測序方法。
背景技術：
新一代測序技術(next-generation sequencing, NGS)主要包括焦磷酸測序法 (sequencing by pyrosequencing),合成法測序(sequencing by synthesis, SBS)禾口連接法測序(sequencing by ligation, SBL)。其中，連接法測序具有準確率高，成本低的優點，適用於轉錄本及比較基因組學研究，特別是單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)的檢測。現有的一種連接測序法是利用內切酶酶切延伸進行測序的，如圖1所示，該方法的步驟包括(1)、利用帶有酶切識別位點的雙鏈寡核苷酸接頭一與核酸片段連接，得到待測核酸片段；O)、以識別酶切識別位點的限制性內切酶對待測核酸片段進行酶切，得到其中一條鏈帶有突出末端的雙鏈產物；(3)、在雙鏈產物上連接一組對應特定位置帶有螢光標記的雙連結頭二，得到連接產物；通過檢測連接產物的螢光信號獲取該特定位置對應的核苷酸序列信息；其中，雙連結頭二帶有突出末端；每個雙連結頭二帶有酶切識別位點；根據酶切識別位點與酶切位點之間的核苷酸個數，所述突出末端預先計算好一個或數個核苷酸；(4)、分離步驟(3)中的連接產物，得到分離產物；(5)、利用能識別步驟(3)中所帶酶切識別位點的酶對分離產物進行酶切，得到帶有酶切識別位點的一組片段；(6)、重複步驟C3)至(5)的操作，直至測得待測核酸片段上能測的所有核苷酸序列；其中最後一次重複操作時，可以忽略步驟(5)。在上述連接測序法中，利用帶有螢光標記的雙鏈寡核苷酸接頭作為檢測探針，以接頭上所帶酶切識別位點位置的變更來實現和控制測序位置的延伸推進。由於雙鏈寡核苷酸接頭核苷酸個數以及所使用的限制性內切酶識別位點與酶切位點之間的核苷酸個數限制，所能檢測得到的核苷酸序列最多只能等於酶切識別位點與酶切位點之間的核苷酸個數，其讀長受限制。因此，迫切需要一種新的利用酶切延伸增加讀長的測序方法，使測序的讀長不受限制，能讀取待測核酸片段上所需的核苷酸序列。

發明內容
本發明的目的在於提供一種利用酶切延伸增加讀長的測序方法，旨在解決現有技術中酶切延伸方法的讀長受限的問題。
為了實現發明目的，所述利用酶切延伸增加讀長的測序方法包括以下步驟A.將第一 anchor結合於原待測核酸片段的接頭一上；B.在第一 anchor延伸末端連接螢光探針，檢測其螢光信號，更換螢光探針並重複連接和檢測操作，得到第一 anchor延伸末端後M個核苷酸的序列信息；C.利用內切酶將步驟B中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到帶有待測序片段的酶切產物；D.酶切產物連接接頭二得新待測核酸片段，結合第二 anchor於接頭二上；E.在第二 anchor延伸末端連接螢光探針，檢測其螢光信號，更換螢光探針並重複連接和檢測操作，得到第二 anchor延伸末端後N個核苷酸的序列信息；F.重複步驟C至E的操作，直至測得原待測核酸片段中所需的核苷酸序列信息；其中，M、N均為正整數。其中，步驟A中所述第一 anchor帶有至少一個酶切識別位點。進一步的，所述步驟C包括以下步驟Cl.將螢光探針與第一 anchor洗脫，重置第一 anchor並進行鏈延伸，與原待測核酸片段形成雙鏈核酸分子；C2.內切酶通過識別第一 anchor上所帶的酶切識別位點進行酶切，將步驟B中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得帶有待測序片段的酶切產物。其中，步驟C可以包括以下步驟Cl』 .在第一 anchor的另一端連接雙鏈的接頭三，該接頭三帶有至少一個酶切識別位點；C2』.利用內切酶識別接頭三所帶的酶切識別位點，將步驟B中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到帶有待測序片段的酶切產物。其中，所述步驟A中第一 anchor的一端是封閉的。進一步的，在步驟C前還包括步驟C0.對第一 anchor的另一端進行活化，使其能夠用於連接和延伸。其中，上述步驟中第一 anchor帶有至少一個特異性殘基。進一步的，所述步驟B包括以下步驟Bi.在帶有特異性殘基的第一 anchor延伸末端連接螢光探針，檢測其螢光信號， 得到對應位置的核苷酸序列信息；B2.以特異性切割劑切割特異性殘基，將螢光探針及第一 anchor洗脫，重置第一 anchor ；B3.在第一 anchor延伸末端重複螢光探針的連接和檢測操作，得到第一 anchor延伸末端後M個核苷酸的序列信息。其中，步驟D中所述接頭二為平末端接頭、突出末端接頭、分叉型接頭或帶莖環結構的接頭。其中，步驟D包括以下步驟Dl.酶切產物連接接頭二，得到帶有接頭二的雙鏈核酸片段；D2.將帶有接頭二的雙鏈核酸片段變性解離，得新待測核酸片段；D3.將第二 anchor結合於新待測核酸片段的接頭二上。
其中，所述第一 anchor和第二 anchor可以是相同或者不同的。進一步的，所述第二 anchor可以帶有至少一個酶切識別位點。進一步的，所述第二 anchor還可以帶有至少一個特異性殘基。其中，上述步驟中的原待測核酸片段固定於固相載體表面。其中，步驟B中所述M的數值範圍優選為1 9，更優選為1 6。其中，步驟E中所述N的數值範圍優選為1 9，更優選為1 6。由上可知，本發明所述利用酶切延伸增加讀長的測序方法，利用內切酶將原待測核酸片段上已經得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，然後再連接新的接頭，用於錨定新的anchor並進行後續的測序反應，從而延長了測序反應的讀長，且本發明的酶切延伸測序方法的讀長不受限制。


圖1是現有技術中一種利用內切酶酶切延伸測序的連接測序法示意圖；圖2是本發明一個實施例中利用酶切延伸增加讀長的測序方法的方法流程圖；圖3是本發明一個實施例中所用第一 anchor的結構示意圖；圖4是本發明一個實施例中利用圖3所示的第一 anchor得到其延伸末端後M位核苷酸序列信息的方法流程圖；圖5是本發明一個具體實施方式
中第一 anchor的結構示意圖；圖6是本發明一個具體實施方式
中利用圖5所示的第一 anchor得到其延伸末端後M位核苷酸序列信息的方法流程圖；圖7是本發明另一個具體實施方式
中第一 anchor的結構示意圖；圖8是本發明一個具體實施方式
中利用圖7所示的第一 anchor得到其延伸末端後M位核苷酸序列信息的方法流程圖；圖9是本發明一個實施例中得到帶有待測序片段的酶切產物的方法流程圖；圖10是本發明另一個實施例中得到帶有待測序片段的酶切產物的方法流程圖；圖11是本發明一個實施例中接頭二的結構示意圖；圖12是本發明另一個實施例中接頭二的結構示意圖；圖13是本發明另一個實施例中所用的接頭二的結構示意圖；圖14是本發明另一個實施例中所用的接頭二的結構示意圖；圖15是本發明另一個實施例中所用的接頭二的具體結構示意圖；圖16是本發明一個實施例中得到第二 anchor延伸末端後N個核苷酸的序列信息的方法流程圖；圖17是本發明另一個實施例中得到第二 anchor延伸末端後N個核苷酸的序列信息的方法示意圖；圖18是本發明一個實施例中利用酶切延伸增加讀長的測序方法示意圖。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。
本發明提供了一種利用酶切延伸增加讀長的測序方法，包括以下步驟首先將錨定引物第一 anchor與原待測核酸片段上的接頭一錨定結合，利用標記位置不同的螢光探針，重複連接螢光探針、採集螢光信號、洗脫螢光探針、更換螢光探針後再連接的步驟，並根據所連接的螢光探針種類的不同，讀取原待測核酸片段中第一 anchor延伸末端後M個核苷酸的序列信息；然後利用內切酶進行酶切，將之前已經讀取過的核苷酸序列部分或完全切除，保留帶有待測序核苷酸序列的新待測核酸片段，並使之與新的接頭連接，進而錨定新的anchor，然後通過在新的anchor的延伸末端連接不同的螢光探針，讀取新的anchor的延伸末端後N個核苷酸的序列信息。之後重複上述內切酶酶切、更換新的接頭、錨定新的 anchor、連接新的螢光探針和檢測螢光信號讀取核苷酸序列信息的步驟，從而獲得原待測核酸片段中所需的核苷酸序列信息。利用本發明的酶切延伸測序方法進行測序，讀長不受限制。其中，上述步驟中的原待測核酸片段與新待測核酸片段是相對的，原待測核酸片段是指最初始的待測核酸片段，其上帶有接頭以及待測序的核酸片段；而新待測核酸片段是指經過酶切之後的待測序片段連接新的接頭而形成的待測核酸片段。本發明中所述螢光探針分為不同組別類型，同組類型中不同螢光標記對應同一特定位置的不同核苷酸序列，而不同組類型的螢光探針螢光標記對應的特定位置不同。每次連接反應中，加入同一組類型的螢光探針，根據所採集的螢光信號，可以讀取該組螢光探針標記特定位置對應的核苷酸序列信息。本發明中所述的各種anchor是用於與待測核酸片段上的各種接頭進行錨定結合的單鏈寡核苷酸；其中所述anchor的一端是延伸末端，另一端可以是封閉的，也可以是不封閉的，封閉的優勢在於避免anchor相互之間的自連現象的發生，保證anchor與螢光探針的定向連接。本發明所述延伸末端，是指能夠用於繼續連接並進行核苷酸鏈延伸的末端，其可位於anchor的3，端，也可位於anchor的5，端。本發明所述酶切識別位點，是指能夠被酶特異性識別並利用其進行酶切反應的核苷酸序列，該序列的核苷酸個數無具體限制，可根據實際需要進行相應的調整。圖2示出了本發明一個實施例中利用酶切延伸增加讀長的測序方法流程，該方法包括Si.將第一 anchor結合於原待測核酸片段的接頭一上；S2.在第一 anchor延伸末端連接螢光探針，檢測其螢光信號，更換螢光探針並重複連接和檢測操作，得到第一 anchor延伸末端後M個核苷酸的序列信息；S3.利用內切酶將步驟S2中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到帶有待測序片段的酶切產物；S4.酶切產物連接接頭二得到新待測核酸片段，將第二 anchor結合於接頭二上；S5.在第二 anchor延伸末端連接螢光探針，檢測其螢光信號，更換螢光探針並重複連接和檢測操作，得到第二 anchor延伸末端後N個核苷酸的序列信息；S6.重複步驟S3至S5的操作，直至測得原待測核酸片段中所能獲取的核苷酸序列 fn息ο針對本技術方案，需要說明的是
步驟Sl中所述的原待測核酸片段，至少其兩端帶有接頭，為使操作便利，優選將其中一端接頭與固相載體連接，所述用於連接的固相載體可以使不同材質和不同形狀的剛性物質，其材質包括但不限於玻璃、矽、陶瓷、塑料和金屬；其形狀包括但不限於板層形、 平板形、圓片形和球形；對於固相載體，本發明優選磁珠以及玻片。本步驟中所述第一 anchor是根據鹼基互補配對原則，與原待測核酸片段上的接頭一進行錨定結合的錨定引物，用於在步驟S2中連接螢光探針。除此之外，第一 anchor還可以根據具體需要，進行不同的設計。在本發明的一個實施方案中，第一 anchor與原待測核酸片段一端的接頭一通過鹼基互補配對進行錨定結合。該方案中，第一 anchor可以不進行封閉處理，以降低第一 anchor的合成成本；也可以在第一 anchor的一端進行封閉處理，避免第一 anchor相互之間發生自連，保證第一 anchor與螢光探針的定向連接。將第一 anchor的一端進行封閉，可以是第一 anchor的3，端，也可以是5，端，經過封閉處理既可以控制連接的方向，又可以避免第一 anchor之間相互連接。在本步驟的一個具體實施方式
中，將第一 anchor的3』端進行封閉，封閉的方法包括但不限於雙脫氧、氨基化反應、醯胺化，第一 anchor被封閉的3』端無法繼續連接，即第一 anchor的連接只能發生在5』端；而在本步驟的另一個具體實施方式
中，將第一 anchor的5』端進行封閉，封閉的方法包括但不限於去磷酸化或醯胺化，即第一 anchor的連接只能發生在3』端。在本發明的另一個實施方案中，第一 anchor帶有至少一個特異性殘基，所述特異性殘基是指其本身或其所帶的化學鍵能被特異性切割的殘基，它能使其所在的核苷酸片段由於被切割而更易於洗脫。用於切割特異性殘基的物質稱為特異性切割劑。所述特異性殘基包括但不限於脫氧尿嘧啶核苷酸(de0Xy-UraCil，dU)、脫氧肌苷(deoxy Inosine,dI)、帶有硫代磷酸酯鍵的核苷酸和切口酶的酶切識別位點。其相應的特異性切割劑包括但不限於尿嘧啶-DNA糖基化酶⑴racil-DNA Glycocasylase，UDG酶)、大腸桿菌核酸內切酶V、帶有 Ag、Hg、Cu、Mn、Zn或Cd離子的化合物和切口酶。所述切口酶，是指能識別雙鏈核酸分子中一條核苷酸鏈所攜帶的酶切識別位點，而在帶有該酶切識別位點的核苷酸鏈上進行酶切形成切口的II型限制酶；本發明所述切口酶，包括但不限於Nt.Alw I內切酶、Nt. BsmA I內切酶、Nt. BspQ I內切酶、Nt. BstNB I內切酶。本實施方案的第一 anchor設計方式可以使得在後續的洗脫更換過程中更加便利。在本發明的另一個實施方案中，第一 anchor帶有至少一個酶切識別位點，該酶切識別位點可被直接利用於部分或完全切除步驟S2中所讀取過的核苷酸序列，使得整個發明技術方案步驟簡化，操作簡便。步驟Sl中所述接頭一為原待測核酸片段一端上的一段已知序列，用於使第一 anchor錨定結合到原待測核酸片段上。該接頭一可以是得到待測序的樣品之後進行測序文庫構建過程中自行設計合成連接上去的，也可以是得到的待測序樣品本身已經帶有的。步驟S2中，所述第一 anchor的延伸末端，是指在第一 anchor後能夠繼續連接並進行核苷酸鏈延伸的末端。根據步驟Sl中所述第一 anchor的不同設計結構，步驟S2可以採用不同的實現方式。在本發明的一個實施方案中，第一 anchor帶有特異性殘基，在本實施方案中的一個具體實施例中，第一 anchor的結構如圖3所示，圖中所示X為A、G、C或T，Y代表特異性殘基，η為正整數。另外，圖中Y的個數以及Y在X中的位置可變，當存在多個Y時，Y與Y 之間並不一定是以圖3中所示的相連的形式存在，可分別散布在第一 anchor的不同位置。 上述的第一 anchor可以使得步驟S2中螢光探針的洗脫以及更換的實現更加簡便。利用該結構的第一 anchor實現步驟S2的方法如圖4所示，包括以下步驟S21.在帶有特異性殘基的第一 anchor延伸末端連接螢光探針，檢測其螢光信號， 得到對應位置的核苷酸序列信息；S22.以特異性切割劑切割特異性殘基，將螢光探針及第一 anchor洗脫，重置第一 anchor ；S23.在第一 anchor延伸末端重複螢光探針的連接和檢測操作，得到第一 anchor 延伸末端後M個核苷酸的序列信息。需要說明的是，在該技術方案中，步驟S21中所述第一 anchor帶有的特異性殘基及其相應的特異性切割劑可以包括多種。在本發明的一個優選實施例中，如圖5所示，第一 anchor帶有的特異性殘基為dU 鹼基，其對應的特異性切割劑為UDG酶。利用如圖5所示結構的第一 anchor，步驟S2可以通過圖6所示的方法實現，該方法包括以下步驟S21』.在帶有dU鹼基的第一 anchor延伸末端連接螢光探針，檢測其螢光信號，得到對應位置的核苷酸序列信息；S22』.以UDG酶識別dU鹼基並進行酶切，將螢光探針及第一 anchor洗脫，重置第一 anchor ；S23，.在第一 anchor延伸末端重複螢光探針的連接和檢測操作，得到第一 anchor 延伸末端後M個核苷酸的序列信息。以該技術方案實現步驟S2，其優勢在於，第一 anchor帶有dU鹼基，可以直接利用特異性識別酶切dU鹼基的UDG酶對第一 anchor進行切割，形成短片段，從而使得步驟S2 中螢光探針的洗脫以及更換的實現更加簡便。在本發明的另一個優選實施例中，如圖7所示，第一 anchor所帶的特異性殘基為切口酶Nt. Alw I的酶切識別鹼基。利用如圖7所示結構的第一 anchor，步驟S2可以通過如圖8所示的方法實現，該方法包括以下步驟S21」.在帶有切口酶酶切識別位點的第一 anchor延伸末端連接螢光探針，檢測其螢光信號，得到對應位置的核苷酸序列信息；S22」.以切口酶識別切口酶酶切識別位點並進行酶切，將螢光探針洗脫；S23」.在第一 anchor延伸末端重複螢光探針的連接和檢測操作，得到第一 anchor 延伸末端後M個核苷酸的序列信息。以該技術方案實現步驟S2，其優勢在於，在更換螢光標記對應鹼基位置不同的螢光探針時，可以利用第一 anchor上所攜帶的切口酶酶切識別位點，通過相應的切口酶直接將原來連接的螢光探針與第一 anchor之間的連接打斷，從而輕鬆將原來連接的螢光探針洗掉，連接新的螢光探針，避免將第一 anchor洗脫之後又重置，簡化操作步驟，同時節省試劑的成本。其中，上述步驟中所述M為正整數，其數值範圍由本發明所使用的連接酶決定，優選為1 9，更優選為1 6。在本發明的一個實施方案中，利用T4連接酶實現本發明所述的酶切延伸測序法，M的數值優選為1 6 ；在本發明的另一個實施方案中，利用Tth連接酶實現本發明所述的酶切延伸測序法，M的數值範圍可優選為1 9。在上述優選範圍內， 本發明的酶切延伸測序法不僅能夠增加測序讀長，測序讀長不受限制，還能進一步提高測序過程中的螢光探針與anchor連接的準確性，進而提高核苷酸序列信息讀取的準確性。其中，當利用T4連接酶，將螢光探針連接在anchor的3』端或者5』端時，螢光探針與anchor 發生連接的那一端的6個鹼基需與相應的待測序片段完全互補配對，才能實現連接；當利用Tth連接酶，將螢光探針連接在anchor的3』端或5』端時，分別要求螢光探針與anchor 連接的那一端的8個或9個鹼基與相應的待測序片段完全互補配對，才能實現連接。上述步驟中所使用的螢光探針分為不同組別類型，同組類型中不同螢光標記對應同一特定位置的不同核苷酸序列信息，而不同組類型的螢光探針螢光標記對應的特定位置不同。每次連接反應中，加入同一組類型的螢光探針，根據所採集的螢光信號，可以得到該組螢光探針標記特定位置對應的核苷酸序列信息；而通過第一 anchor的雜交結合-螢光探針的連接-採集螢光信號-螢光探針的洗脫這些操作的重複，可以準確的得到第一 anchor 延伸末端後M個核苷酸的序列信息。在步驟S2結束之後，原待測核酸片段上保留了結合的第一 anchor和螢光探針。為了便於步驟S3中的內切酶進行酶切，可將第一 anchor延伸末端重新活化，然後加入四種核苷酸，利用DNA聚合酶，沿著第一 anchor延伸末端的方向，將固定於固相載體上的原待測核酸片段形成完整的雙鏈核酸分子。步驟S3中所述內切酶，是指能識別雙鏈核酸分子上所帶有的特異性酶切識別鹼基序列，然後在距離酶切識別位點一定數量鹼基的位置進行雙鏈核酸切割的酶。在本發明中，可以使用酶切之後能得到平末端的內切酶，優選使用酶切之後能得到粘性突出末端的內切酶，其選用原則遵循通過識別酶切識別位點，能將步驟S2中已經獲取的核苷酸序列全部或部分切除的內切酶即可。在選用內切酶時，優選最適反應溫度在37°C左右的內切酶，最適反應溫度過高的內切酶容易導致在酶切過程中雙鏈的變性解離，從而導致後續螢光探針的連接受阻；優選對甲基化不敏感的內切酶，以便能持續的酶切和獲取待測核酸片段的核苷酸序列；優選酶切識別位點與酶切位點之間核苷酸個數在4以上的，使得每次酶切之後向前延伸測序的長度更長。本發明所用的內切酶可以是II型內切酶，包括但不限於Acu I.Alw I.Bbs I.Bbv
I、BccI、BceA I、BciV I、BfuA I、Bmr I、Bpm I、Bsa I、BseR I、Bsg I、BsmA I、BsmB I、 BsmF I、BspM I、BspQ I、BtgZ I、Ear I、Eci I、Fau I、Fok I、Hga I、Hph I、HpyA V、Mbo
II、MlyI、Mnl I、Ple I、Sap I、SfaN I、BpuE I、Mme I 和 NmeAIII，其中優選 Acu I、Bbv I,BceA I,Bpm I,BseR I,BspM I,Fok I,Hga I,Mbo II 和 Mnl I ；所用的內切酶也可以是 III型內切酶，包括但不限於Ecop 1和Ecop 15 1。步驟S3中，用於被內切酶進行識別的酶切識別位點，可以通過第一 anchor帶入， 也可以通過其他方法帶入。根據酶切識別位點來源的不同，步驟S3也可以通過不同的方法實現。在本發明中的一個實施方案中，酶切識別位點直接由第一 anchor帶入，即第一 anchor帶有至少一個酶切識別位點。
利用第一 anchor上所帶有的酶切識別位點，可以有多種不同的方式實現步驟S3。 在本方案的一個具體實施方式
中，步驟S3可以直接利用內切酶識別第一 anchor上所帶的酶切識別位點，將步驟S2中已經得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到帶有待測序片段的酶切產物。利用該實施方式實現步驟S3的優勢在於，在步驟S2得到第一 anchor延伸末端後 M個核苷酸的序列信息之後，利用第一 anchor上所帶有的酶切識別位點直接進行酶切，可以簡化操作步驟。在本方案的另一個具體實施方式
中，利用第一 anchor上所帶有的酶切識別位點， 步驟S3還可以通過如圖9所示的方法實現，該方法包括如下步驟S31.將螢光探針與第一 anchor洗脫，重置第一 anchor並進行鏈延伸，與原待測核酸片段形成雙鏈核酸分子；S32.內切酶通過識別第一 anchor上所帶的酶切識別位點，將步驟S2中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到帶有待測序片段的酶切產物。利用該技術方案實現步驟S3的優勢在於，首先利用第一 anchor的延伸末端進行鏈延伸，與原待測核酸片段延伸形成雙鏈核酸分子，能夠保證酶切產物保持雙鏈狀態，便於後續接頭的連接。在本實施方案的一個優選實施例中，原待測核酸片段通過5』端連接固定於微珠上，而結合於接頭一的第一 anchor上帶有酶切識別位點序列5』 . . . CTGAAG. . . 3』，步驟S3 中利用II型內切酶Acu I識別該酶切識別位點並進行酶切，得到待測序片段3』端帶有兩個突出核苷酸的酶切產物。在本實施方案的另一個優選實施例中，原待測核酸片段通過5』端連接固定於微珠上，而結合於接頭一的第一 anchor上帶有酶切識別位點序列5』. . . GCAGC. . . 3』，步驟S3中利用π型內切酶I識別該酶切識別位點並進行酶切，得到待測序片段3』端帶有兩個突出核苷酸的酶切產物。在本實施方案的另一個優選實施例中，原待測核酸片段通過5』端連接固定於微珠上，而結合於接頭一的第一 anchor上帶有酶切識別位點序列5』. . . GAGTC. . . 3』，步驟S3中利用II型內切酶Mly I識別該酶切識別位點並進行酶切，得到待測序片段3』端帶有平末端的酶切產物。在本實施方案的一個優選實施例中，原待測核酸片段通過3』端連接固定於微珠上，而結合於接頭一的第一 anchor上帶有酶切識別位點序列5』. . . CATCC. . . 3』，步驟S3中利用i^ok I酶識別該酶切識別位點並進行酶切，得到待測序片段5』端帶有4個突出核苷酸的酶切產物。在本實施方案的一個具體實施例中，原待測核酸片段通過5』端連接固定於微珠上，而結合於接頭一的第一 anchor上帶有酶切識別位點序列5』 . . . CAGCAG. . . 3』，步驟S3 中利用III型內切酶Ecopl5I酶識別該酶切識別位點並進行酶切，得到待測序片段3』端帶有兩個突出核苷酸的酶切產物。在本發明的另一個實施方案中，酶切識別位點通過在第一 anchor的另一端連接帶有至少一個酶切識別位點的接頭三帶入。利用接頭三，步驟S3可以通過如圖10所示的方法實現，該方法包括以下步驟
S31』.在第一 anchor的另一端連接雙鏈的接頭三，該接頭三帶有至少一個酶切識別位點；S32』 .利用內切酶識別接頭三所帶的酶切識別位點，將步驟B中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到帶有待測序片段的酶切產物。需要說明的是，所述第一 anchor的另一端，是相對步驟S 1中第一 anchor已經用於延伸的末端而言的；若第一 anchor的另一端在步驟S3之前是被封閉的，那麼在步驟S3 之前需要先進行活化；活化的方法可以利用現有技術中的任一種，只需將另一端中可用於連接的基團暴露出來即可，如在本發明的一個優選的具體實施方式
中，第一 anchor本身帶有特異性殘基，可直接利用特異性切割劑切割特異性殘基完成活化。所述接頭三，是帶有至少一個酶切識別位點的核酸分子，用於引入內切酶的酶切識別位點，以便於後續步驟中，通過內切酶將已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除。利用該技術方案實現步驟S3的優勢為適用性廣，對原待測核酸片段無特殊要求，無論原待測核酸片段上結合的第一 anchor 是否帶有酶切識別位點，均可通過該技術方案實現。需要進一步說明的是，接頭三可以選用相應帶有不同末端的接頭，包括但不限於平末端接頭、突出末端接頭、分叉型接頭和帶莖環結構的接頭。本發明中優選使用突出末端接頭、分叉型接頭和帶莖環結構的接頭，這些結構的接頭在連接過程中可以避免出現多個接頭之間自連的現象。針對上述不同的實現方案，接頭三上所述用於酶切的內切酶酶切識別位點可以是上述內切酶所對應的任意一種，只需在設計合成時將酶切識別位點與酶切位點之間的核苷酸預先計算好，使得酶切之後恰好將步驟S2中已經讀取過序列信息的核苷酸部分或完全切除即可，因此在本發明中可以選用不同的酶切識別位點及其相應的內切酶實現對步驟S2中已得到序列信息的核苷酸的切除。在此需要說明的是本發明中所述平末端接頭是指接頭雙鏈之間的核苷酸數量相等且完全互補的雙連結頭。本發明中所述突出末端接頭，是指雙鏈核酸分子中的至少一端帶有突出核苷酸序列，而其餘核苷酸則完全互補的雙鏈核酸接頭。突出末端接頭可為單突出末端(圖11)，也可以是含有兩個突出末端的雙突出末端，這兩個突出末端可在一條核苷酸鏈上(圖12a)或在不同的核苷酸鏈上(圖12b)。本發明中所述分叉型接頭包括互補區和分叉區，其基本結構如圖13所示，互補區雙鏈的核苷酸互補配對，配對的核苷酸對數不限。互補區末端可為平末端或突出末端。該分叉型接頭的互補區帶有至少一個酶切識別位點。在本實施例的具體實施方式
中，接頭三優選互補區的3』末端為突出末端，且突出末端最後一個鹼基為T的T末端分叉接頭；或者優選互補區的3』末端帶有雙脫氧核苷酸的雙脫氧分叉接頭。本發明中所述帶莖環結構的接頭，如圖14所示。該接頭為單鏈核酸分子，該單鏈核酸分子包括第一互補配對區1、莖環區2和第二互補配對區3 (圖14a)，第一互補配對區1 能夠與第二互補配對區3互補配對，且它們形成的互補配對區包括至少一個限制性內切酶的酶切識別位點，而通過該酶切識別位點，特定的酶能夠將莖環區切開或切除，從而將單鏈核酸分子變成雙鏈核酸分子，以便於後續的操作；同時還至少包括一個用於後續步驟S3進行酶切的酶切識別位點。如圖14b所示，帶莖環結構的接頭還可帶有突出末端4，該突出末端可位於單鏈核酸分子的5』端或3』端。突出末端4的存在能夠進一步的防止接頭自連現象的發生。該突出末端優選為T。應當說明的是，上述實施方案僅是本發明中關於選用的酶切識別位點及其相應的內切酶的一些具體實施例，並不用以限制本發明的保護範圍，換用符合條件的其他酶切識別位點及相應的內切酶，同樣可實現本發明的目的。為得到帶有待測序片段的酶切產物，可以在步驟S3的酶切反應之後進行純化回收，而純化回收的方法可以利用現有技術中的多種方式實現。在本發明的一個實施例中，原待測核酸片段固定於玻片上，酶切之後直接以緩衝液衝洗即可實現有待測序片段的酶切產物與其他物質分離純化；在本發明的另一個具體實施例中，原待測核酸片段固定於磁珠上， 直接利用磁鐵吸附，以緩衝液輕微衝洗，即可實現帶有待測序片段的酶切產物與其他物質分離純化。步驟S4中，在連接接頭二之前，根據步驟S3中得到的酶切產物的不同以及後續使用的連接方法，可以選擇性的對酶切產物進行修飾處理，如末端補平；也可以直接利用酶切之後得到的突出末端進行接頭二的連接。在本發明的一個具體實施例中，根據步驟S3中利用第一 anchor上所帶內切酶的酶切識別位點，以i^ok I進行酶切，得到3』端帶有4個核苷酸序列突出末端的酶切產物。對酶切產物先進行末端補平處理，然後再連接接頭二。此實施方式的優勢在於可以避免由於過長的突出末端而使得接頭二合成的種類過多，從而降低接頭二的合成成本。在本發明的另一個具體實施例中，根據步驟S3中利用第一 anchor上所帶酶切識別位點為Acu I的酶切識別位點，以Acu I進行酶切，得到3』帶有2個核苷酸序列突出末端的酶切產物。針對該突出末端突出的核苷酸較少，只需合成42種接頭二即可實現連接， 因此直接利用酶切之後得到的突出末端進行接頭二的連接。此實施方式的優勢在於可以簡化操作步驟，直接加入接頭二進行反應即可。步驟S4中，所述接頭二，是用於與帶有待測序片段的酶切產物連接形成新待測核酸片段的雙鏈核酸分子。根據酶切產物末端以及選用的連接方式不同，接頭二可以選用相應帶有不同末端的接頭，包括但不限於平末端接頭、突出末端接頭、分叉型接頭和帶莖環結構的接頭。本發明中優選使用突出末端接頭、分叉型接頭和帶莖環結構的接頭，這些結構的接頭在連接過程中可以避免出現多個接頭之間自連的現象。在本發明的一個具體實施例中，接頭二選用平末端接頭，用於實現與經過末端補平修飾之後的酶切產物進行連接。在本發明的一個優選實施例中，酶切產物帶有突出末端，因此接頭二直接選用如圖11所示的突出末端接頭與酶切產物實現連接，該突出末端接頭的突出末端與酶切產物的突出末端相匹配。在本發明的一個具體實施例中，步驟S3中的內切酶為Acu I，此時，接頭二可具體採用如圖15所示的接頭。在本發明的另一個優選實施例中，接頭二採用如圖13所示的分叉型接頭實現與酶切產物的連接。在本實施例的具體實施方式
中，接頭二優選互補區的3』末端為突出末端， 且突出末端最後一個鹼基為T的T末端分叉接頭；或者優選互補區的3』末端帶有雙脫氧核苷酸的雙脫氧分叉接頭。在本發明的另一個優選實施例中，接頭二採用如圖14所示的帶莖環結構的接頭實現與酶切產物的連接。在本實施例的一個優選實施方式中，接頭二採用如圖14b所示的帶莖環結構的接頭實現接頭二與酶切產物的連接，進一步防止接頭自連現象的發生。應當說明的是，上述實施例僅是本發明對於接頭二選用的具體實施方式
，並不用以限制本發明的保護範圍。步驟S4中，為了便於後續第二 anchor與接頭二的互補配對能夠順利進行，可以對酶切產物與接頭二連接之後形成的雙鏈核酸連接產物進行處理，形成單鏈形式的新待測核酸片段。將雙鏈核酸連接產物上互補結合於待測序片段上的核苷酸以及酶切之後保留下來的核苷酸進行處理形成單鏈新待測核酸片段的方法，包括但不限於通過NaOH變性解離或升溫退火的方式進行清除。所述第二 anchor是能與接頭二錨定結合的單鏈核酸分子，用於在步驟S5中連接螢光探針；所述第二 anchor可以與第一 anchor相同或者不同。若第二 anchor與第一 anchor相同，則後續繼續酶切時可使用相同的內切酶進行操作，簡化反應試劑的種類，同時還能避免因新待測核酸片段中存在相同的內切酶序列，導致後續的酶切步驟得到非目標產物；若第二 anchor與第一 anchor不同，則可以在第二 anchor的合成中弓|入新的設計，滿足更多的實際需要。第二 anchor與第一 anchor的不同，可以是酶切識別位點的位置和種類不同，也可以是核苷酸數量的不同。第二 anchor根據需要可以進行其他處理。在本發明的一個具體實施例中，根據需要將第二 anchor的3』端或5』端進行封閉，用以控制連接方向，並避免第二 anchor相互之間的自連。在本實施例的一個具體實施方式
中，對3』端進行封閉的方法包括但不限於雙脫氧、氨基化反應、醯胺化，其無法繼續連接，控制第二 anchor的連接只發生在5』端；在本實施例的另一個具體實施方式
中，將第二 anchor的5』端進行封閉，通過5』端進行去磷酸化或醯胺化處理將其封閉，從而只保留3』端作為連接的末端。在本發明的另一個具體實施例中，第二 anchor帶有特異性殘基，可以使得後續螢光探針的更換以及洗脫更加簡便。在本發明的一個優選實施方式中，第二 anchor所帶的特異性殘基為dU鹼基，其核苷酸序列中引入數個dU鹼基，該結構的第二 anchor可以在後續測序的洗脫過程中直接切除dU鹼基形成不同的短片段，便於洗脫的實現。在本發明的另一個優選實施方式中，第二 anchor所帶的特異性殘基為帶有硫代磷酸酯鍵的鹼基，在其核苷酸序列中，以一個或多個硫代磷酸酯鍵(p-幻代替原有的P-O 鍵，可以直接利用帶有Ag、Hg、Cu、Mn、Zn和Cd離子的化合物切割P-S鍵實現第二 anchor 的洗脫。在本發明的另一個優選實施方式中，第二 anchor帶有兩個酶切識別位點，其中一個為用於切割雙鏈的限制性內切酶酶切識別位點，另一個為用於切割雙鏈中的一條單鏈形成切口的切口酶酶切識別位點。應當說明的是，上述實施例僅是本發明中第二 anchor的一些具體實施方式
，並不用以限制本發明的保護範圍。步驟S5中，得到第二 anchor延伸末端後N個核苷酸的序列信息通過如圖15所示的方法實現，該方法包括以下步驟S51.在第二 anchor延伸末端後連接螢光探針，檢測該螢光探針的螢光信號，得到相應位置的核苷酸序列信息；
S52.將螢光探針去除，連接標記位置不同的螢光探針，檢測該螢光探針的螢光信號，得到該標記位置的核苷酸序列信息；S53.重複步驟S52的操作，直至得到第二 anchor延伸末端後N個核苷酸的序列信肩、ο上述技術方案利用標記位置不同的螢光探針之間的連接和更換，實現對第二 anchor延伸末端後N個核苷酸的序列信息的獲取。其中，步驟S52中所述螢光探針的去除可以有多種方式實現。在本步驟的一個具體實施方式
中，利用NaOH變性將螢光探針以及第二 anchor從新待測核酸片段上解離下來，然後將第二 anchor重新結合於接頭二上，進行後續標記位置不同的螢光探針的連接以及信號檢測操作。此實施方式簡單易行，不需要添加另外的試劑。在本步驟的另一個優選實施方式中，第二 anchor帶有數個dU鹼基，因此利用UDG 酶直接進行dU鹼基的切除，形成短片段，升溫變性解離，重新得到新待測核酸片段，然後將第二 anchor重新結合於接頭二上，進行後續標記位置不同的螢光探針的連接以及信號檢測操作。在本步驟的另一個優選實施方式中，第二 anchor的核苷酸序列中，幾個硫代磷酸鍵(P-S)代替原有的P-O鍵，因此直接利用帶有Ag、Hg、Cu、Mn、ai和Cd離子的化合物切割 P-S鍵實現第二 anchor以及螢光探針的去除。在本步驟的另一個優選實施方式中，第二 anchor延伸末端處帶有一個切口酶的酶切識別位點，因此直接利用切口酶將螢光探針與第二 anchor之間的連接去除，就可以在第二 anchor的延伸末端繼續連接標記位置不同的螢光探針，實現後續測序步驟的實施。此實施方式直接將螢光探針去除，而不需要對第二 anchor進行處理，既簡化操作，又降低試劑成本。上述優選實施方式利用特異性的物質將第二 anchor中的連接切除，形成短小片段，然後利用溫和條件即可去除螢光探針。其中，上述步驟中所述N為正整數，其數值範圍同樣由本發明所使用的連接酶決定，優選為1 9，更優選為1 6。在本發明的一個實施方案中，利用T4連接酶實現本發明所述的酶切延伸測序法，N的數值優選為1 6 ；在本發明的另一個實施方案中，利用Tth 連接酶實現本發明所述的酶切延伸測序法，N的數值範圍可優選為1 9。在上述優選範圍內，本發明的酶切延伸測序法不僅能夠增加測序讀長，測序讀長不受限制，還能進一步提高測序過程中的螢光探針與anchor連接的準確性，進而提高核苷酸序列信息讀取的準確性。 其中，當利用T4連接酶，將螢光探針連接在anchor的3，端或者5』端時，螢光探針與anchor 發生連接的那一端的6個鹼基需與相應的待測序片段完全互補配對，才能實現連接；當利用Tth連接酶，將螢光探針連接在anchor的3』端或5』端時，分別要求螢光探針與anchor 連接的那一端的8個或9個鹼基與相應的待測序片段完全互補配對，才能實現連接。圖16為步驟S5中一個具體實施例中得到第二 anchor延伸末端後N個核苷酸的序列信息的方法示意圖，該圖直觀的展現了得到第二 anchor延伸末端後N個核苷酸的序列信息的過程步驟51.讀取第二 anchor延伸末端後第1位核苷酸序列信息在T4連接酶的作用下，第二 anchor延伸末端後連接標記位置為第1位的螢光探針，然後採圖，收集螢光信號，根據得到的螢光信號確定第二 anchor延伸末端後第1位的核苷酸序列信息；步驟52.讀取第二 anchor延伸末端後第2位核苷酸序列信息利用第二 anchor 延伸末端處所帶的切口酶酶切識別位點，將螢光探針與第二 anchor之間的連接切掉，通過升溫變性解離將標記位置為第1位的螢光探針洗脫，然後換用標記位置為第2位的螢光探針連接到第二 anchor的延伸末端，採圖成像，收集螢光信號，根據得到的螢光信號確定第二 anchor延伸末端後第2位的核苷酸序列信息；步驟53.讀取後續核苷酸重複步驟52的操作，換用標記位置不同的螢光探針獲取相應位置的核苷酸序列信息，直至得到第二 anchor延伸末端後第6位核苷酸的序列信肩、ο上述實施方案中，利用第anchor延伸末端處帶有的切口酶酶切識別位點，直接實現標記位置不同的螢光探針的連接更換，從而實現獲聚第二 anchor延伸末端後6個核苷酸的序列信息。應當說明的是，上述實施例僅是實現步驟S5中得到第二 anchor延伸末端後N個核苷酸的序列信息的一些具體實施方案，並不用以限制本發明的保護範圍。例如改變其中N 的數值，如在本發明的另一個具體實施例中，取N = 4，同樣可以實現酶切延伸測序的目的。圖17為本發明一個實施例中利用酶切延伸增加讀長的測序方法示意圖，該圖直觀的展現了酶切延伸增加讀長的測序過程步驟1.第一 anchor雜交結合將第一 anchor通過鹼基互補配對雜交結合於原待測核酸片段的接頭一上，其中原待測核酸片段的5』端通過連接固定於磁珠表面；其中，第一 anchor帶有序列為序列5』. . . CTGAAG. . . 3』的酶切識別位點，且第一 anchor的核苷酸序列中帶有dU 。步驟2.獲取第一 anchor延伸末端後6個核苷酸的序列信息T4連接酶作用下， 在第一 anchor的延伸末端連接用於檢測的螢光探針，檢測螢光信號得到相應位置的核苷酸序列信息，並利用UDG酶切除dU鹼基以實現第一 anchor的重置和標記位置不同的螢光探針的更換檢測，採集相應探針的螢光信號圖，獲得第1至6位的核苷酸序列信息。步驟3.酶切為便於後續酶切的進行，當第一 anchor延伸末端後6個核苷酸的序列信息全部被讀取之後，首先在DNA聚合酶的作用下，將原待測核酸片段延伸形成完整的雙鏈核酸分子；然後利用Acu I酶特異性識別並酶切第一 anchor中所攜帶的酶切識別位點，將之前已經讀取過的第一 anchor延伸末端的6個核苷酸序列切除，得到3』端帶有兩個核苷酸突出末端的未測序片段；酶切反應之後，利用磁鐵吸附磁珠，將帶有未測序片段的酶切產物純化回收。步驟4.酶切產物連接接頭二並結合第二 anchor 利用其中一端帶有兩個核苷酸突出末端，一共為42 = 16種的接頭二，在T4連接酶的作用下，與酶切產物進行連接得到雙鏈連接產物；連接反應結束之後，將雙鏈連接產物變性解離形成單鏈，得到固定於磁珠上的新待測核酸片段；將第二 anchor通過鹼基互補配對結合於新待測核酸片段的接頭二上。其中，第二 anchor上同樣帶有序列為序列5』 . . . CTGAAG. . . 3』的酶切識別位點，且距離第二 anchor延伸末端處4個核苷酸位置處還帶有序列為5』 . . . GGATC. . . 3』的酶切識別位點。步驟5.獲取第二 anchor延伸末端後6個核苷酸的序列信息按照如圖15所示實施例的方法，利用切口酶Nt. Alw I切割螢光探針與第二 anchor之間的連接，實現不同標記位置螢光探針的更換，從而可以讀取不同位置的核苷酸序列信息，獲取第二 anchor延伸末端後6個核苷酸的序列信息。步驟6.重複步驟3、步驟4、步驟5中的操作，獲取一定數量(其數值範圍優選為 1 6)的核苷酸序列信息之後，通過酶切手段切除已經讀取過的核苷酸序列，並構建新的待測核酸片段，以此實現延伸測序的目的，直至得到原待測核酸片段上所需的全部核苷酸序列信息。針對上述各技術方案，為進一步說明本發明所記載技術方案的技術效果及優越性，本發明給出具體的操作實施例本實施例以MTHFR基因的一段核酸片段兩端接上接頭作為原待測核酸片段(SEQ ID NO :5)，其中原待測核酸片段5』端的固定接頭通過鏈黴親和生物素的作用與磁珠結合， 原待測核酸片段3』端帶有接頭一序列。測序過程採用深圳華因康基因科技有限公司生產的Pstar II-Plus測序平臺進行，測序過程採集的螢光信號圖像數據採用與該測序平臺配套的Image Process by Base(IPB)數據處理軟體進行分析。一、第一 anchor錨定結合於原待測核酸片段的接頭一上第一 anchor (SEQ ID NO 1)與原待測核酸片段的接頭一之間通過鹼基互補配對雜交結合，其中原待測核酸片段通過鏈黴親和生物素的作用被固定於磁珠上，而磁珠本身被固定於玻片表面，第一 anchor延伸末端上帶有Acu I酶的酶切識別位點，該反應過程及體系為28°C,400y L 2XSSPE(saline sodium phosphate EDTA)緩衝液對固定於玻片表面的原待測核酸片段進行潤洗；加入第一anchor (15 μ Μ)，2 X SSPE 環境下升溫至 65°C，維持 30s ；降溫至42 °C，Imin 雜交；以磁鐵吸附磁珠，30°C，900 μ L清洗緩衝液進行清洗，將未反應的第一 anchor分
離清除。二、獲取第一 anchor延伸末端後6個核苷酸的序列信息1、連接螢光探針在T4連接酶的作用下，將螢光探針(3μΜ)連接到第一 anchor延伸末端之後，連接反應過程及體系為30°C，連接緩衝液對雜交分離的產物進行潤洗；加入0. 2U/yL T4連接酶，螢光探針(3 μ M)，連接緩衝液中，30°C，20min反應;連接反應結束之後，以磁鐵吸附磁珠，30°C，900 μ L清洗緩衝液進行清洗，將未反應的螢光探針與連接產物進行分離。2、採集螢光信號，讀取相應位置的核苷酸序列信息將連接有螢光探針的連接產物放入測序儀，在螢光顯微鏡下進行激發，採集螢光信號，根據螢光信號判斷讀取該位置的核苷酸序列。3、洗脫第一 anchor及螢光探針在讀取上一步驟中相應位置的核苷酸序列信息後，可以利用不同的方法進行洗脫。在本實施例中，利用NaOH直接變性解離，反應過程及體系為
測序反應體系中加入NaOH(0. 05M)，變性Imin ；以磁鐵吸附磁珠，30°C，900 μ L洗脫緩衝液進行清洗，將變性解離的第一 anchor 及螢光探針以及NaOH進行清洗分離。在本發明的另一個實施例中，利用UDG酶對第一 anchor中的dU鹼基進行切割形成小片段，然後將小片段直接洗脫，反應過程及體系為酶切緩衝液，20 μ L ；UDG酶，10 μ L ；洗脫緩衝液加至200 μ L ；37°C，5min 進行酶切；酶切結束後，以磁鐵吸附磁珠，加入900 μ L洗脫緩衝液進行洗脫分離，得到未接第一 anchor的原待測核酸片段。4、重複上述步驟，通過更換不同標記位置的螢光探針進行連接，從而讀取得到第一 anchor延伸末端後第1至6位的核苷酸序列信息。三、Acu I酶切，得到帶有未測序片段的酶切產物1、延伸形成雙鏈核酸分子為便於後續酶切的進行，當第一 anchor延伸末端後5位核苷酸序列信息全部被讀取之後，利用之前所述的NaOH變性解離方法除去螢光探針及第一 anchor，並重新結合第一 anchor於接頭一上，然後在DNA聚合酶的作用下，將原待測核酸片段延伸形成完整雙鏈核酸分子，延伸反應體系及過程為30°C條件下，以Klenow酶反應緩衝液潤洗第一 anchor與原待測核酸片段的結合物；加入0. 1 U/μ L 的 Klenow 酶，IXKlenow 酶反應緩衝液中，37°C，孵育 IOmin ；延伸反應結束後，以磁鐵吸附磁珠，300C，900 μ L清洗緩衝液進行清洗，將原待測核酸片段延伸形成的完整雙鏈核酸分子進行分離。2、AcuI 酶切得到雙鏈核酸分子後，以Acu I進行酶切，得到帶有待測序片段的酶切產物，酶切的反應體系及過程為300C，雙鏈核酸分子中加入 400 μ L IXNEBuffer 2，40 μ M SAM ；加入0. 05U/yL 的 Acu I 酶，37°C 孵育 2h;酶切反應結束後，以磁鐵吸附磁珠，30°C，900 μ L清洗緩衝液進行清洗，分離得到帶有待測序片段的酶切產物，其中帶有待測序片段的核苷酸鏈3』端帶有兩個核苷酸的突出末端。四、酶切產物連接接頭二，並結合第二 anchor1、酶切產物連接接頭二利用酶切產物所帶的突出末端，以如圖18所示結構的接頭二(SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 3)進行連接，其中突出末端的-X鹼基為A或G或C或T，接頭二是以種類一共為42 =16種接頭混合的形式加入連接反應中，連接反應的體系和過程為30°C條件下，在回收的酶切產物中加入IX連接緩衝液；加入濃度為10μΜ的16種接頭混合的接頭二，以及0. 2U/yL的Τ4連接酶，16°C 條件下孵育Ih ；連接反應結束後，以磁鐵吸附磁珠，30°C，900 μ L清洗緩衝液進行清洗，分離得到雙鏈核酸分子形式的新待測核酸片段。2、第二 anchor 的結合以NaOH變性解離的方法，將雙鏈核酸分子形式的新待測核酸片段轉變成帶有未測序片段的單鏈新待測核酸片段。第二 anchor (SEQ ID NO 4)與接頭二的雜交結合體系及過程為^°C，在單鏈新待測核酸片段中加入400 μ L 2 X SSPE，加入第二 anchor (10 μ Μ)， 60°C維持30s ；然後降溫至42°C，雜交孵育anin ；雜交結束之後，以磁鐵吸附磁珠，30°C，900 μ L清洗緩衝液進行清洗，將未反應的第二 anchor分離清除。五、獲取第二 anchor延伸末端後6個核苷酸的序列信息1、連接螢光探針在T4連接酶的作用下，將螢光探針(2. 5 μ Μ)連接到第二 anchor延伸末端之後， 連接反應過程及體系為30°C，新待測核酸片段中加入連接緩衝液；加入0. 2U/yL T4連接酶，螢光探針(2. 5 μ M)，連接緩衝液中，30°C，20min反應;連接反應結束之後，以磁鐵吸附磁珠，30°C，900 μ L清洗緩衝液進行清洗，將未反應的螢光探針與連接產物進行分離。2、採集螢光信號，讀取相應位置的核苷酸序列信息將連接有螢光探針的連接產物放入測序儀，在螢光顯微鏡下進行激發，採集螢光信號，根據螢光信號判斷讀取該位置的核苷酸序列。3、洗脫第二 anchor及螢光探針在讀取上一步驟中相應位置的核苷酸序列信息後，利用UDG酶對第二 anchor中的 dU鹼基進行切割形成小片段，然後將小片段直接洗脫，反應過程及體系為UDG酶酶切緩衝液，20 μ L ；UDG酶，10 μ L ；洗脫緩衝液加至200 μ L ；37°C，5min 進行酶切；酶切結束後，以磁鐵吸附磁珠，加入900 μ L洗脫緩衝液進行洗脫分離，得到未接第二 anchor的新待測核酸片段。4、重複上述步驟，通過更換不同標記位置的螢光探針進行連接，從而讀取得到第二 anchor延伸末端後第1至6位的核苷酸序列信息。六、獲取後續核苷酸序列信息重複步驟三至步驟五的操作，通過酶切手段切除已經讀取過的核苷酸序列，並構建新的待測核酸片段，以此實現延伸測序的目的，直至得到原待測核酸片段上所能讀取的全部核苷酸序列信息。對於測序所得的螢光信號圖像數據，利用IPB處理軟體以生物信息學方法進行分析，得到的分析結果顯示前100個base讀取準確率為99. 99% (Q30)，100 200個kise 的讀取準確率為99. 85% (Q20)，200 300個kise的讀取準確率為99% (Q20)，該300個 base的讀取準確率平均值為99. 82% (Q20) 0因此，根據上述數據，在該實施例中本發明所記載的技術方案進行連接測序達到的高質量讀長為300bp。以本發明所記載的技術方案進行連接測序，理論上應當可以將待測核酸片段所有的核苷酸序列信息讀取出來。但通過所述實施例中得到的數據，其高質量的讀長僅為 300bp，其原因可能是由於在不斷循環的酶切與連接操作中，內切酶的酶切能力以及連接酶的連接能力有所下降而導致。因此，若對於內切酶的酶切能力以及連接酶的連接能力進行加強，利用本發明所記載的技術方案進行連接測序的話，可以達到更長的讀長。應當說明的是，本發明利用酶切延伸增加讀長的測序方法典型的應用但不限於核苷酸測序中，任何其他類似的應用均應包含在本發明的保護範圍之內。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種利用酶切延伸增加讀長的測序方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟A.將第一anchor結合於原待測核酸片段的接頭一上；B.在第一anchor延伸末端連接螢光探針，檢測其螢光信號，更換螢光探針並重複連接和檢測操作，得到第一 anchor延伸末端後M個核苷酸的序列信息；C.利用內切酶將步驟B中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到帶有待測序片段的酶切產物；D.酶切產物連接接頭二得新待測核酸片段，結合第二anchor於接頭二上；E.在第二anchor延伸末端連接螢光探針，檢測其螢光信號，更換螢光探針並重複連接和檢測操作，得到第二 anchr延伸末端後N個核苷酸的序列信息；F.重複步驟C至E的操作，得到原待測核酸片段中所需的核苷酸序列信息；其中，M、N均為正整數。
2.根據權利要求1所述的利用酶切延伸增加讀長的測序方法，其特徵在於，步驟A中所述第一 anchor帶有至少一個酶切識別位點。
3.根據權利要求2所述的利用酶切延伸增加讀長的測序方法，其特徵在於，所述步驟C 包括以下步驟Cl.將螢光探針與第一 anchor洗脫，重置第一 anchor並進行鏈延伸，與原待測核酸片段形成雙鏈核酸分子；C2.內切酶通過識別第一 anchor上所帶的酶切識別位點進行酶切，將步驟B中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得帶有待測序片段的酶切產物。
4.根據權利要求1所述的利用酶切延伸增加讀長的測序方法，其特徵在於，步驟C包括以下步驟Cl』 .在第一 anchor的另一端連接雙鏈的接頭三，該接頭三帶有至少一個酶切識別位佔.C2』.利用內切酶識別接頭三所帶的酶切識別位點，將步驟B中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到帶有待測序片段的酶切產物。
5.根據權利要求4所述的利用酶切延伸增加讀長的測序方法，其特徵在於，步驟Cl，中所述接頭三為平末端接頭、突出末端接頭、分叉型接頭或帶莖環結構的接頭。
6.根據權利要求1所述的利用酶切延伸增加讀長的測序方法，所述步驟A中第一 anchor的一端是封閉的。
7.根據權利要求6所述的利用酶切延伸增加讀長的測序方法，其特徵在於，在步驟C前還包括步驟CO.對第一 anchor的另一端進行活化，使其能夠用於連接和延伸。
8.根據權利要求1至7中任一項所述的利用酶切延伸增加讀長的測序方法，其特徵在於，所述第一 anchor帶有至少一個特異性殘基。
9.根據權利要求8所述的利用酶切延伸增加讀長的測序方法，其特徵在於，所述步驟B 包括以下步驟Bi.在帶有特異性殘基的第一 anchor延伸末端連接螢光探針，檢測其螢光信號，得到對應位置的核苷酸序列信息；B2.以特異性切割劑切割特異性殘基，將螢光探針及第一 anchor洗脫，重置第一anchor ；B3.在第一 anchor延伸末端重複螢光探針的連接和檢測操作，得到第一 anchor延伸末端後M個核苷酸的序列信息。
10.根據權利要求1所述的利用酶切延伸增加讀長的測序方法，其特徵在於，步驟D中所述接頭二為平末端接頭、突出末端接頭、分叉型接頭或帶莖環結構的接頭。
11.根據權利要求1所述的利用酶切延伸增加讀長的測序方法，其特徵在於，所述第一 anchor禾口第二 anchor相同或不同。
12.根據權利要求11所述的利用酶切延伸增加讀長的測序方法，其特徵在於，所述第二 anchor帶有至少一個酶切識別位點。
13.根據權利要求11所述的利用酶切延伸增加讀長的測序方法，其特徵在於，所述第二 anchor帶有至少一個特異性殘基。
14.根據權利要求1至7、10至13中任一項權利要求所述的利用酶切延伸增加讀長的測序方法，其特徵在於，步驟A中所述原待測核酸片段固定於固相載體表面。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，提供了一種利用酶切延伸增加讀長的測序方法。本發明所述利用酶切延伸增加讀長的測序方法，首先將第一anchor結合於原待測核酸片段的接頭一上，使用連接測序法讀取第一anchor延伸末端後的M個核苷酸的序列信息；然後利用內切酶識別相應的酶切識別位點將已讀取序列信息的核苷酸部分或完全切除，在酶切回收的待測序片段上連接新的接頭二，然後在接頭二上錨定結合第二anchor，並在第二anchor延伸末端連接螢光探針，向前延伸讀取核苷酸序列信息；通過重複上述操作，得到原待測核酸片段所需的核苷酸序列信息，從而利用酶切延伸進行測序的方法實現延長測序的讀長且使讀長不受限制的目的。
文檔編號C12Q1/68GK102559918SQ201210047900
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月28日 優先權日2012年2月28日
發明者盛司潼 申請人:盛司潼