促進分化的方法

2023-06-11 19:30:46

促進分化的方法
【專利摘要】本發明提供了通過抑制USP1、UAF1、和/或ID(例如ID1、ID2、和/或ID3)促進細胞命運變化，特別是腫瘤細胞分化的方法。
【專利說明】促進分化的方法
[0001]對相關申請的交叉引用
[0002]本申請依據35USC§ 119要求2011年9月15日提交的美國臨時申請號61/535，336的優先權，通過提及將其內容完整收錄。
[0003]序列表
[0004]本申請含有序列表，其已經經由EFS-Web以ASCII形式提交，並且在此通過提及完整收錄。所述ASCII拷貝(在2012年9月14日創建)命名為P4745R1W0.txt，並且大小為49，096 字節。
發明領域
[0005]本文中提供了通過抑制USPUUAF1、和/或ID (例如ID1、ID2、和/或ID3)來促進細胞命運變化，特別是腫瘤細胞分化的方法。
[0006]發明背景
[0007]鹼性-螺旋-環-螺旋(bHLH)轉錄因子構成人基因組中第三大公認的轉錄因子家族(Tupler等，2001)，並且是經由稱作E框的結合DNA元件進行發育和分化的必需調節物(Massari和Murre, 2000)。I類bHLH同二聚體廣泛表達，並且促進抗增殖基因諸如CDKN1A、CDKN2A、和CDKN2B的表達(Yokota和Mori, 2002)。II類bHLH蛋白顯示更受限的表達，並且與I類蛋白形成異二聚體以驅動組織特異性基因諸如IGHO和SP7/0STERIX (Lassar等，1991 ；ffeintraub等，1994)。經由組織特異性和抗增殖基因的組合誘導,bHLH轉錄因子充當譜系定型的整合物。
[0008]bHLH蛋白的DNA結合受限於與DNA結合蛋白抑制劑，或ID的異二聚化。ID家族由具有重疊的空間和時間表達概況的四個成員，即ID1、ID2、ID3、和ID4組成(Lasorella等，2001)。所有四種ID以類似的親和力結合各種bHLH蛋白以調苄基因表達(Prabhu等，1997)。ID在轉錄上由眾多生長因子，包括骨形態發生蛋白、血小板衍生的生長因子、表皮生長因子，以及由T細胞受體配體誘導(Yokota和Mori, 2002)。IDU ID2、和ID3，而非ID4受到K48關聯的多泛素化(polyubiquitination)及隨後26S蛋白酶體的降解。因此，ID在大多數組織中是短壽命的(Bounpheng等，1999)。泛在表達的APC/Cdhl複合物是一種決定ID穩定性和豐度的E3泛素連接酶(Lasorella等，2006),但是ID蛋白在一些背景中是穩定的。
[0009]I D對於哺乳動物發育是至關重要的；兩種或更多種ID基因的破壞導致胚胎致死性(Lyden等，1999)。比較而言，轉基因小鼠中ID蛋白的過表達產生胚胎惡性(Kim等，1999)。類似地，在範圍為胰腺癌至成神經細胞瘤的一大批脫分化的原發性人惡性中觀察到升高的ID蛋白水平(Perk等，2005)。報告了工程化ID抑制性HLH蛋白使成神經細胞瘤腫瘤分化(Ciarapica等，2009)。雖然ID蛋白在正常成年分化組織中是缺乏的，但是它們在增殖組織，包括胚胎和成年幹細胞群體中是充足的，這提示了 ID可以維持「乾性(sternness)」 (Yokota和Mori, 2002)。需要更多工作來闡明ID基因在癌症幹細胞生物學中的作用。[0010]發明概述
[0011]本文中提供了 USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或ID拮抗劑(例如ID1、ID2、和/或ID3)的篩選和/或鑑定方法及使用USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或ID拮抗劑(例如IDl、ID2、和/或ID3)來促進細胞命運變化和/或細胞周期停滯的方法。
[0012]本文中提供了篩選和/或鑑定促進細胞命運變化的USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或ID拮抗劑的方法,所述方法包括:比較(i)參照細胞命運與(ii)候選細胞命運,其中所述參照細胞命運是參照細胞的細胞命運，其中所述候選細胞命運是在存在USPl候選拮抗齊U、UAFl候選拮抗劑、和/或ID候選拮抗劑的情況中所述參照細胞的細胞命運，其中所述USPl候選拮抗劑結合USPl，其中所述UAFl候選拮抗劑結合UAFljP /或所述ID候選拮抗劑結合ID，由此所述參照細胞命運和所述候選細胞命運之間的細胞命運差異將所述USPl候選拮抗劑和/或所述ID候選拮抗劑鑑定為促進細胞命運變化。
[0013]本文中還提供了篩選和/或鑑定誘導細胞周期停滯的USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或ID拮抗劑的方法，所述方法包括:(i)在存在USPl候選拮抗劑、UAFl候選拮抗劑、和/或ID候選拮抗劑的情況中接觸參照細胞，其中所述USPl候選拮抗劑結合USP1，其中所述UAFl候選拮抗劑結合UAFljP /或所述ID候選拮抗劑結合ID，由此細胞周期停滯將所述USPl候選拮抗劑和/或ID候選拮抗劑鑑定為誘導細胞周期停滯。
[0014]在任何篩選方法的一些實施方案中，所述USPl候選拮抗劑、UAFl候選拮抗劑、和/或所述ID候選拮抗劑是USPl候選拮抗劑。在任何篩選方法的一些實施方案中，所述USPl候選拮抗劑、UAFl候選拮抗劑、和/或所述ID候選拮抗劑是ID候選拮抗劑。在一些實施方案中，所述ID候選拮抗劑是IDl候選拮抗劑、ID2候選拮抗劑、和/或ID3候選拮抗劑。在任何篩選方法的一些實施方案中，所述USPl候選拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或所述ID候選拮抗劑是UAFl候選拮抗劑。
[0015]在任何篩選方法的一些實施方案中，所述參照細胞命運是幹細胞命運。在一些實施方案中，所述幹細胞命運是間充質幹細胞命運。在任何篩選方法的一些實施方案中，所述候選細胞命運是成骨細胞細胞命運、軟骨細胞細胞命運、或脂肪細胞細胞命運。在一些實施方案中，所述候選細胞命運是成骨細胞細胞命運。
[0016]在任何篩選方法的一些實施方案中，所述USPl候選拮抗劑、UAFl候選拮抗劑、和/或所述ID候選拮抗劑是抗體、結合多肽、結合小分子、或多核苷酸。
[0017]本文中進一步提供了促進細胞的細胞命運變化的方法，其包括使所述細胞與有效量的USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或ID拮抗劑接觸。本文中還提供了誘導細胞周期停滯的方法，其包括使所述細胞與有效量的USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或ID拮抗劑接觸。在一些實施方案中，所述細胞是具有幹細胞命運(例如間充質幹細胞命運)的細胞。
[0018]本文中提供了治療疾病或病症的方法，其包括對個體施用有效量的USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或ID拮抗劑。
[0019]在一些實施方案中，基於一種或多種選自下組的基因的升高的表達水平選擇所述個體進行治療:CD90、CD105、CD106、USP1、UAF1、和ID(例如ID1、ID2、或ID3)(例如與內部參照(例如CD144)相比)或基於一種或多種選自下組的基因的低表達水平，不選擇所述個體進行治療:CD90、CD105、CD106、USPU UAFlJP ID(例如 ID1、ID2、或 ID3)(例如與內部參照(例如CD144)相比)。在一些實施方案中，基於一種或多種選自下組的基因的低表達水平，選擇所述個體進行治療:p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘連蛋白、SPPl/骨橋蛋白、BGLAP/骨鈣蛋白、和鹼性磷酸酶(ALP)(例如與內部參照(例如CD144)相比)或基於一種或多種選自下組的基因的升高的表達水平，不選擇所述個體進行治療:p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘連蛋白、SPPl/骨橋蛋白、BGLAP/骨鈣蛋白、和鹼性磷酸酶(ALP)(例如與內部參照(例如CD 144)相比)。
[0020]在一些實施方案中，基於一種或多種選自下組的基因的升高的表達水平，所述個體可能響應治療:p21、RUNX2、0STERIX、SPARC/骨粘連蛋白、SPPl/骨橋蛋白、BGLAP/骨鈣蛋白、和鹼性磷酸酶(ALP)(例如與內部參照(例如CD144)相比)(例如從治療開始時、期間、或之前的時間點至後來的時間點)或者基於一種或多種選自下組的基因的降低的或無顯著變化的表達水平，所述個體可能不響應治療:p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘連蛋白、SPPl/骨橋蛋白、BGLAP/骨鈣蛋白、和鹼性磷酸酶(ALP)(例如與內部參照(例如CD144)相比)(例如從治療開始時、期間、或之前的時間點至後來的時間點)。
[0021]在任何方法的一些實施方案中，USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或ID拮抗劑誘導細胞周期停滯。在任何方法的一些實施方案中，USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或ID拮抗劑能夠促進細胞命運變化。
[0022]在任何方法的一些實施方案中，促進細胞命運變化以一種或多種選自下組的基因的降低的表達水平指示:CD90、CD105、CD106、USP1、UAF1、和ID (例如ID1、ID2、或ID3)(例如與內部參照(例如CD144)相比)。在任何方法的一些實施方案中，促進細胞命運變化以一種或多種選自下組的基因的升高的表達水平指示:p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘連蛋白、SPPl/骨橋蛋白、BGLAP/骨鈣蛋白、和鹼性磷酸酶(ALP)。在一些實施方案中，與內部參照(例如CD144)相比，一種或多種基因的表達水平是升高的。
[0023]在任何方法的一些實施方案中，疾病或病症包括具有幹細胞命運(例如間充質幹細胞命運)的細胞。在任何方法的一些實施方案中，細胞表達一種或多種選自下組的基因:CD90、CD105、CD106、USPU UAF1、和 ID(例如 IDU ID2、或 ID3)。在一些實施方案中，與內部參照(例如CD144)相比，一種或多種基因的表達水平是升高的。在任何方法的一些實施方案中，細胞沒有顯著表達(例如不表達或與內部參照(例如CD144)相比以低水平表達)一種或多種選自下組的基因:p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘連蛋白、SPPl/骨橋蛋白、BGLAP/骨鈣蛋白、和鹼性磷酸酶(ALP)。
[0024]在任何方法的一些實施方案中，所述疾病或病症是癌症。在一些實施方案中，所述癌症是骨肉瘤。在一些實施方案中，所述癌症表達一種或多種選自下組的基因:CD90、CD105、CD106、USP1、UAFlJP ID (例如IDU ID2、或ID3)。在一些實施方案中，與內部參照(例如CD144)相比，一種或多種基因的表達水平是升高的。
[0025]在任何方法的一些實施方案中，所述USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或所述ID拮抗劑是USPl拮抗劑。在任何方法的一些實施方案中，所述USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或所述ID拮抗劑是ID拮抗劑。在一些實施方案中，其中所述ID拮抗劑是IDl拮抗劑、ID2拮抗劑、和/或ID3拮抗劑。在任何方法的一些實施方案中，所述USPl拮抗劑、UAFl拮抗齊U、和/或所述ID拮抗劑是UAFl拮抗劑。
[0026]在任何方法的一些實施方案中，所述USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或所述ID拮抗劑是抗體、結合多肽、結合小分子、或多核苷酸。在一些實施方案中，所述USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或所述ID拮抗劑是抗體。在一些實施方案中,抗體是單克隆抗體。在一些實施方案中，抗體是人抗體、人源化抗體、或嵌合抗體。在一些實施方案中，抗體是抗體片段，且抗體片段結合USPl、UAFJP /或ID。
[0027]附圖簡述
[0028]本專利或申請文件含有至少一幅以彩色製成的圖。具有彩圖的本專利或專利申請公開文本的拷貝會在請求並支付必要費用後由該局提供。
[0029]圖1:USP1使ID蛋白脫泛素化(deubiquitinate)及穩定化。(A)僅用載體(CTL)、野生型USPl (WT)、或無催化活性USP1C90S轉染的293T細胞的Western印跡(WB)分析。將細胞用25mg/ml環己醯亞胺(CHX)處理指定的時間(左側小圖)。通過密度測定法量化ID2(右側小圖)。(B)用有Flag標籤的ID1、ID2、ID3、或IkBa，和空載體(CTL)、野生型USP1、或USP1C90S共轉染293T細胞。在指示的情況中，將細胞用IOmM MG-132處理4小時。(C)用有HA標籤的泛素共轉染的293T細胞中USPl或USP1C90S和WDR48對ID2_Flag的脫泛素化。(D)將 USPl-Flag、USPlC90S_Flag、WDR48_Flag、和泛素化的 ID2_Flag 從 293T 提取物分開親和純化，然後，在體外脫泛素化測定法中組合在一起6小時。NEM，N-乙基馬來醯亞胺。
[0030]圖2 =USPl作為ID2脫泛素化酶的鑑定和USP1-1D2結合界面的定位。(A)用有Flag標籤的脫泛素酶(DUB)或空載體㈠轉染的293T的Western印跡(WB)分析。在指示的情況中，將細胞用IOmM MG-132處理4小時。(B)將有Flag標籤的DUB從用ID2共轉染並用IOmM MG-132處理6小時的293T細胞免疫沉澱(IP)。(C)將293T細胞中表達的USPl突變體免疫沉澱，並且針對共表達的ID2進行印跡。(D)用野生型(WT)或突變體USPl轉染的293T細胞中的內源ID2的Western印跡分析。
[0031]圖3:USP1在骨肉瘤中過表達，並且與ID2蛋白表達相關聯。㈧來自正常的和患病的組織的原代人骨活組織檢查中的USPlmRNA表達的盒須圖。(B)原代人成骨細胞和骨肉瘤腫瘤樣品中USPl和ID2蛋白表達的Western印跡(WB)分析。(C和D) (B)的樣品中USPl (C)和ID2 (D)表達的RT-PCR量化。棒表示一式三份觀察結果的均值土SD。(E和F)在用ID2表達載體(頂部小圖)或ID2shRNA (底部小圖)轉染的293T細胞中(E)或在原代人骨肉瘤活組織檢查中(F) ID2的免疫組織化學檢測。(G)在來自原代骨肉瘤組織的連續切片中USPl和ID2的免疫組織化學染色。用同種型對照抗體進行對照染色。
[0032]圖4 =USPl在物理上銜接及穩定化骨肉瘤中的ID蛋白。(A)用USPl或對照(CTL)shRNA及空載體(CTL)或shRNA抗性USPl (野生型[WT]或USPl突變體C90S)共轉染的U2-0S細胞的Western印跡(WB)分析。(B)如在(A)中一樣處理並且用E框驅動的螢光素酶報告物共轉染的U2-0S細胞的螢光素酶活性。棒表示一式三份觀察結果的均值土SD。(C)將U2-0S細胞用shRNA轉染，並在指示的情況中用IOmM MG-132處理4小時。(D)將U2-0S細胞用ID2-Flag、HA-泛素、和CTL或USPlshRNA任一共轉染。在指示的情況中，將細胞用IOmM MG-132處理4小時。自SDS/熱變性的細胞裂解物免疫沉澱ID2_Flag。(E和F)自U2-0S細胞免疫沉澱USPl (E)或ID2(F)。用非特異性IgG進行對照免疫沉澱。星號(*)表示一條由抗ID2抗體識別的、未知身份的帶。
[0033]圖5 =USPl調節多發性骨肉瘤細胞系中的ID蛋白。㈧培養的原代人成骨細胞和人骨肉瘤細胞系的Western印跡(WB)分析。(B)將骨肉瘤細胞系用IOmM MG-132處理4小時。(C)用對照(CTL)或USPlshRNA轉染骨肉瘤細胞系。(D)將骨肉瘤細胞用空載體或WDR48轉染，或者用IOmM MG-132處理4小時。(E)自HOS細胞免疫沉澱USPl。用非特異性IgG進行對照免疫沉澱。(F)對USP1+/+(WT)和USP1+DT40細胞的分析。(G)Wl^PUSPlvTrMO細胞中USPlmRNA的實時RT-PCR量化。棒代表一式三份觀察結果的均值土 s.d.。(H)將WT和USP1+DT40細胞用IOmM MG-132處理2小時。(I)將USP1+DT40細胞用空載體(CTL)、USPl野生型(WT)、或USP1C90S轉染，並且與USP1+DT40細胞比較。Un，未轉染。
[0034]圖6 =USPl在骨肉瘤中經由ID蛋白調節細胞周期。(A)如在圖4A中一樣處理的U2-0S細胞的Western印跡(WB)分析。(B)在培養5天後計數如在(A)中一樣處理的U2-0S細胞的長出。(C)經碘化丙啶染色的、如在(A)中一樣處理的U2-0S細胞的細胞周期狀態。
(D)用指定的shRNA和對照或CDKNlA/p21siRNA轉染的U2-0S細胞。(E)如在⑶中一樣處理的細胞中S期細胞的量化。(F)用指定的shRNA和shRNA抗性USPl (shRes USPI)、IDl、ID2、和ID3，或對照表達載體轉染的U2-0S細胞。(G)如在(F)中一樣處理的U2-0S細胞中S期細胞的量化。棒代表一式三份觀察結果的均值土SD。
[0035]圖7 =USPl經由ID蛋白調節增殖和細胞周期停滯。(A)將U2-0S細胞用對照(CTL)或USPlshRNA轉染3天，以等同密度分配，並在後續幾天計數活細胞。(B)用shRNA和(在指示的情況中)shRNA抗性USPl (野生型或突變體)共轉染的U2-0S細胞。(C)⑶中處於細胞周期S期的細胞的百分比。(D)將骨肉瘤細胞用shRNA轉染，並且在第8天時計數細胞。(E)如在㈧中一樣處理並且用碘化丙啶(PI)染色的U2-0S細胞的DNA含量。(F)將U2-0S細胞用指定的shRNA及用對照或p21siRNA轉染。(G)將(F)中的細胞用碘化丙啶染色，並通過流式細胞術分析。棒代表S期的細胞的均值百分比。(H)將U2-0S細胞用指定的shRNA轉染。(1-K)通過實時RT-PCR(I)和PI染色後的流式細胞術(J，K)評估(H)中的細胞。(L)將U2-0S細胞用shRNA和對照或p53siRNA轉染。在指示的情況中，將細胞用IOmM依託泊苷處理I小時。棒代表一式三份觀察結果的均值土s.d.。
[0036]圖8 =USPl在骨肉瘤中促進幹細胞身份的保留。㈧用CTL或USPlshRNA轉染的U2-0S細胞的Western印跡(WB)分析。(B)將(A)中的細胞染色，並通過螢光顯微術分析。(C)在具有多西環素(doxycycline，DOX)誘導性shUSPl的143B細胞的異種移植物中針對USPl或ID2的免疫組織化學染色。(D)如(C)中所描述的143B異種移植物的腫瘤體積的量化。棒代表10個異種移植物的均值土SD。(E和F)來自(C)中的143B異種移植物的USP1、ID2、骨粘連蛋白(ON)、RUNX2(RX2)、OSTERIX(OSX)、和骨橋蛋白(OP)mRNA 水平(E)和ALP活性(F)的RT-PCR量化。棒代表一式三份觀察結果的均值土SD。(G)用蘇木精和伊紅(H&E)或三色染料對來自(C)的代表性異種移植物腫瘤染色。比例尺棒，100mm。
[0037]圖9:在骨肉瘤細胞系中消減USPl誘導幹標誌物的損失並且啟動成骨程序。(A)將骨肉瘤細胞用對照(CTL)、USP1、或ID shRNA連續轉染。在11天後通過流式細胞術測定指定的間充質幹細胞標誌物的表面表達。(B)通過實時RT-PCR對(A)中的細胞分析RUNX2、OSTERIX(OSX)、和骨粘連蛋白基因表達。(C)通過對硝基酚磷酸(pNPP)切割對(A)中的細胞評估鹼性磷酸酶活性。(D)用多西環素誘導性CTL或USPlshRNA轉導的143B細胞的Western印跡(WB)分析。在指示的情況中，將細胞用3mg/ml多西環素(DOX)處理4天。
(E)在多西環素處理5天後143BshUSPl異種移植物腫瘤的切片中通過原位雜交得到的骨鈣蛋白基因表達的明視野和暗視野顯微術。比例尺棒，100mm。(F)對照和含有USPlshRNA的143B異種移植物腫瘤中USPl基因表達的實時RT-PCR分析。棒代表一式三份觀察結果的均值土 s.d.。
[0038]圖10 =USPl和ID調節間充質幹細胞分化。㈧在成骨分化培養基(ODM)中，或在非分化培養基(Un)中培養的hMSC的Western印跡(WB)分析。(B)將hMSC用ID2、USPl野生型(WT)、USP1C90S、或空載體(CTL)轉導，並在ODM中培養9天。(C和D)對⑶中的hMSC評估ALP活性(C)和骨粘連蛋白、RUNX2、和OSTERIX mRNA(D)。棒代表一式三份觀察結果的均值土SD。(E)用茜素紅對(B)中的hMSC染色以顯現鈣沉積。比例尺棒，100mm。(F)培養指定的天數後對(B)中的hMSC計數。棒代表一式三份觀察結果的均值土SD。
[0039]圖11:USP1誘導ID依賴性NIH3T3細胞轉化。(A)用ID2、USPl野生型(WT)、USP1C90S、或空對照載體轉導的NIH3T3細胞的Western印跡(WB)分析。(B)將(A)中的細胞在軟瓊脂中培養，並且計數集落。棒代表一式三份觀察結果的均值土s.d.。(C)由用對照(CTL)、ID2、USP1野生型(WT)、或USP1C90S轉導的NIH3T3細胞形成的代表性集落。比例尺棒，100mm。⑶將(A)中的NIH3T3細胞在C.B-17SCID.bg小鼠(頂部小圖)或NCr裸鼠(底部小圖)中皮下植入，並且監測腫瘤體積。數據點代表10隻小鼠的均值土s.d。(E)在研究結束時來自㈧的C.B-17SCID.bg (頂部小圖)和NCr裸鼠(底部小圖)。(F)將空載體(CTL)或USPl轉導的NIH3T3細胞用對照(CTL)或ID shRNA序貫轉導。(G)將(F)中的細胞在軟瓊脂中培養，並且計數集落。棒代表一式三份觀察結果的均值土s.d.。
[0040]圖12:USP1是正常骨骼發生需要的。(△)12天齡舊？1+/+(訂)和舊？1_/_小鼠(頂部)和股骨(底部)的微計算機斷層攝影術。(B和C) (A)中小鼠的均值骨礦化密度(BMD) (B)和礦化骨體積(Minz.Vol.) (C)。棒代表每種基因型的四份股骨的均值土SD。(D)來自E18.5USP1+/+(WT)和USPl+小鼠的股骨幹骺端的Western印跡(WB)分析。(E)E18.5USP1+/+(WT)和USPl+胚胎的血清中的BALP。棒代表每種基因型的4份胚胎的均值+ SD0 [0041]圖13:USP1是正常小鼠骨骼發生需要的。㈧刪除外顯子3的USPl靶向策略，所述外顯子3編碼USPl的催化性半胱氨酸。黃色框代表外顯子。(B)E18.5USP1+/+(WT)和USPl+胚胎的微計算機斷層攝影術。(C)(b)中的小鼠的礦化骨體積(Minz.Vol.)。棒代表每種基因型的3隻小鼠的均值土s.d.。(D)P12USP1+/+(WT)和USPl+股骨的蘇木精和伊紅(H&E)染色切片。比例尺棒，100mm。(E)P12USP1+/+(WT)和USPl+股骨中每個骨針長度的類骨質區。棒代表每種基因型的3隻小鼠的均值土s.d.。(F)P12USP1+/+(WT)和USPl+股骨幹骺端的H&E，三色染料，和馮科薩(Von Kossa)染色。比例尺棒，100mm。(G)P12USP1+/+(WT)和USPlv-股骨中駐留破骨細胞的TRAP標記。比例尺棒，100mm。(H)P12USP1+/+(WT)和USPl+股骨切片中TRAP陽性細胞的計數。(I)ElS.5羊水中相對於肌酸酐標準化的脫氧吡啶諾林(deoxypyridinoline，DPD)水平。(J)P12USP1+/+(WT)和 USPlv-股骨幹骺端中的USPl和ID2表達。比例尺棒，100mm。
[0042]發明詳述
[0043]1.定義
[0044]術語「泛素特異性肽酶1」、「脫泛素化酶I」、和「USP1」在本文中指天然序列USPl多肽、多肽變體及天然序列多肽和多肽變體的片段(其在本文中進一步定義)。本文中描述的USP多肽可以是自多種來源，諸如自人組織類型或自另一種來源分離，或者通過重組或合成方法製備的USP多肽。
[0045]「天然序列USPl多肽」包括與從自然界衍生的相應USPl多肽具有相同胺基酸序列的多肽。在一個實施方案中，天然序列USPl多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:1。
[0046]「USP1多肽變體」或其變型意指與如本文中公開的任何天然序列USPl多肽序列具有至少約80%胺基酸序列同一性的USPl多肽，一般為活性USPl多肽，如本文中定義的。例如，此類USPl多肽變體包括如下的USPl多肽，其中一個或多個胺基酸殘基在天然胺基酸序列的N或C端是添加或刪除的。通常，USPl多肽變體與如本文中公開的天然序列USPl多肽序列會具有至少約80%胺基酸序列同一性，或者至少約81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99%胺基酸序列同一性。通常，USPl變體多肽的長度是至少約10個胺基酸，或者長度為至少約20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600 個胺基酸，或更多個。任選地，與天然USPl多肽序列相比，USPl變體多肽會具有不超過I處保守胺基酸替代，或者與天然USPl多肽序列相比不超過2、3、4、5、6、7、8、9、或10處保守胺基酸替代。
[0047]如本文中定義的，術語「USP1拮抗劑」指部分或完全阻斷、抑制、或中和由天然序列USPl介導的生物學活性的任何分子。在某些實施方案中，此類拮抗劑結合USPl。依照一個實施方案，拮抗劑是多肽。依照另一個實施方案，拮抗劑是抗USPl抗體。依照另一個實施方案，拮抗劑是小分子拮抗劑。依照另一個實施方案，拮抗劑是多核苷酸拮抗劑。
[0048]術語「WD重複域48」、「USP1關聯因子I」、和「UAF1」在本文中指天然序列UAFl多肽、多肽變體和天然序列多肽和多肽變體的片段(其在本文中進一步定義)。本文中描述的UAFl多肽可以是自多種來源，諸如自人組織類型或自另一種來源分離，或者通過重組或合成方法製備的UAFl多肽。
[0049]「天然序列UAFl多肽」包括與從自然界衍生的相應UAFl多肽具有相同胺基酸序列的多肽。在一個實施方案中，天然序列UAFl多肽包含胺基酸序列SEQ ID N0:40。
[0050]「UAF1多肽變體」或其變型意指與如本文中公開的任何天然序列UAFl多肽序列具有至少約80%胺基酸序列同一性的UAFl多肽，一般為活性UAFl多肽，如本文中定義的。例如，此類UAFl多肽變體包括如下的UAFl多肽，其中一個或多個胺基酸殘基在天然胺基酸序列的N或C端是添加或刪除的。通常，UAFl多肽變體與如本文中公開的天然序列UAFl多肽序列會具有至少約80%胺基酸序列同一性，或者至少約81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99%胺基酸序列同一性。通常，UAFl變體多肽的長度是至少約10個胺基酸，或者長度為至少約20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600 個胺基酸，或更多個。任選地，與天然UAFl多肽序列相比，UAFl變體多肽會具有不超過I處保守胺基酸替代，或者與天然UAFl多肽序列相比不超過2、3、4、5、6、7、8、9、或10處保守胺基酸替代。在任何ID多肽變體的一些實施方案中，ID多肽變體包含IDl多肽變體。在任何ID多肽變體的一些實施方案中，ID多肽變體包含ID2多肽變體。在任何ID多肽變體的一些實施方案中，ID多肽變體包含ID3多肽變體。
[0051]如本文中定義的，術語「UAF1拮抗劑」指部分或完全阻斷、抑制、或中和由天然序列UAFl介導的生物學活性的任何分子。在某些實施方案中，此類拮抗劑結合UAFl。依照一個實施方案，拮抗劑是多肽。依照另一個實施方案，拮抗劑是抗UAFl抗體。依照另一個實施方案，拮抗劑是小分子拮抗劑。依照另一個實施方案，拮抗劑是多核苷酸拮抗劑。
[0052]術語「DNA結合抑制劑」和「ID」在本文中指天然序列ID多肽、多肽變體和天然序列多肽和多肽變體的片段(其在本文中進一步定義)。本文中描述的ID多肽可以是自多種來源，諸如自人組織類型或自另一種來源分離，或者通過重組或合成方法製備的ID多肽。
[0053]「天然序列ID多肽」包括與從自然界衍生的相應ID多肽具有相同胺基酸序列的多肽。在任何天然序列ID多肽的一些實施方案中，天然序列ID多肽包含天然序列IDl同等型多肽SEQ ID NO: 2。在任何天然序列ID多肽的一些實施方案中，天然序列ID多肽包含天然序列IDl同等型b多肽SEQ ID NO:3。在任何天然序列ID多肽的一些實施方案中，天然序列ID多肽包含天然序列ID2多肽SEQ ID NO:4。在任何天然序列ID多肽的一些實施方案中，天然序列ID多肽包含天然序列ID3多肽SEQ ID NO:5。
[0054]「ID多肽變體」或其變型意指與如本文中公開的任何天然序列ID多肽序列具有至少約80%胺基酸序列同一性的ID多肽，一般為活性ID多肽，如本文中定義的。例如，此類ID多肽變體包括如下的ID多肽，其中一個或多個胺基酸殘基在天然胺基酸序列的N或C端是添加或刪除的。通常，ID多肽變體與如本文中公開的天然序列ID多肽序列會具有至少約80%胺基酸序列同一性，或者至少約81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99%胺基酸序列同一性。通常，ID變體多肽的長度是至少約10個胺基酸，或者長度為至少約20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600 個胺基酸，或更多個。任選地，與天然ID多肽序列相比，ID變體多肽會具有不超過I處保守胺基酸替代，或者與天然ID多肽序列相比不超過2、3、4、5、6、7、8、9、或10處保守胺基酸替代。
[0055]如本文中定義的，術語「ID拮抗劑」指部分或完全阻斷、抑制、或中和由天然序列ID介導的生物學活性的任何分子。在某些實施方案中，此類拮抗劑結合ID。依照一個實施方案，拮抗劑是多肽。依照另一個實施方案，拮抗劑是抗ID抗體。依照另一個實施方案，拮抗劑是小分子拮抗劑。依照另一個實施方案，拮抗劑是多核苷酸拮抗劑。在任何ID拮抗劑的一些實施方案中，ID拮抗劑是IDl拮抗劑。在任何ID拮抗劑的一些實施方案中，ID拮抗劑是ID2拮抗劑。在任何ID拮抗劑的一些實施方案中，所述ID拮抗劑是ID3拮抗劑。
[0056]「多核苷酸」或「核酸」在本文中可互換使用，指任何長度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經過修飾的核苷酸或鹼基、和/或其類似物，或者是可通過DNA或RNA聚合酶,或者通過合成反應摻入聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含經過修飾的核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在的話，對核苷酸結構的修飾可以在裝配聚合物之前或之後進行。核苷酸序列可以由非核苷酸組分中斷。多核苷酸可以在合成後進一步修飾，諸如通過與標記物綴合。其它類型的修飾包括例如「帽」，將一個或多個天然存在的核苷酸用類似物替代，核苷酸間修飾諸如例如具有不帶電荷連接(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷醯胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有帶電荷連接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修飾，含有懸垂模塊(pendant moiety)諸如例如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚L-賴氨酸等)的修飾、具有嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等)的修飾、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的修飾、含有燒化劑的修飾、具有經修飾連接(例如α端基異構核酸(anomeric nucleic acid)等)的修飾、以及未修飾形式的多核苷酸。另外，通常存在於糖類中的任何羥基可以用例如膦酸(phosphonate)基團、磷酸(phosphate)基團替換,用標準保護基團保護，或活化以製備與別的核苷酸的別的連接，或者可偶聯至固體或半固體支持物。可磷酸化或者用胺或1-20個碳原子的有機加帽基團模塊取代5』和3』末端0H。其它羥基也可衍生成標準保護基團。多核苷酸也可含有本領域普遍知道的核糖或脫氧核糖糖類的類似物形式，包括例如2』 -氧-甲基、2』 -氧-烯丙基、2』-氟-或2』 -疊氮-核糖，碳環糖類似物，α -端基異構糖,差向異構糖諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、批喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，無環類似物及脫鹼基核苷類似物諸如甲基核糖核苷。可用備選連接基團替換一個或多個磷酸二酯連接。這些備選連接基團包括但不限於以下實施方案，其中磷酸酯用P (O) S (「硫代酸酯」(thioate))、P (S) S (「二硫代酸酯」 (dithioate))、(O) NR2 ( 「醯胺酯」 (amidate))、P (O) R、P (O) OR，、CO 或 CH2 ( 「 甲縮醛」(formacetal))替代，其中R或R』各自獨立為H或者取代或未取代的烴基(1_20個C)，任選含有醚(-0-)連接、芳基、烯基、環烴基、環烯基或芳烴基(araldyl)。並非多核苷酸中的所有連接都必需是相同的。前述描述適用於本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
[0057]如本文中所使用的，「寡核苷酸」一般指短的、一般為單鏈的、一般為合成的多核苷酸，其一般地，但不是必須在長度上小於約200個核苷酸。術語「寡核苷酸」和「多核苷酸」並不互相排斥。上文關於多核苷酸的描述同樣且完全可適用於寡核苷酸。
[0058]術語「小分子」指具有約2000道爾頓或更小，優選約500道爾頓或更小的分子量的任何分子。
[0059]術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」、和「宿主細胞培養物」可互換使用，並且指已經導入外源核酸的細胞，包括此類細胞的後代。宿主細胞包括「轉化體」和「經轉化的細胞」，其包括原代的經轉化的細胞及自其衍生的後代而不考慮傳代的次數。後代在核酸內容物上可以與親本細胞不完全相同，而是可以含有突變。本文中包括具有與在初始轉化細胞中篩選或選擇的相同功能或生物學活性的突變體後代。
[0060]如本文中使用的，術語「載體」指能夠增殖與其連接的另一種核酸的核酸分子。該術語包括作為自身複製型核酸結構的載體及整合入接受其導入的宿主細胞的基因組中的載體。某些載體能夠指導與其可操作連接的核酸的表達。此類載體在本文中稱為「表達載體」。
[0061]「分離的」抗體指已經與其天然環境的組分分開的抗體。在一些實施方案中，抗體純化至大於95%或99%的純度，如通過例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或反相HPLC)測定的。關於用於評估抗體純度的方法的綜述，見例如 Flatman 等,J.Chromatogr.B848:79-87 (2007)。
[0062]「分離的」核酸指已經與其天然環境的組分分開的核酸分子。分離的核酸包括通常含有核酸分子的細胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色體外或在與其天然染色體位置不同的染色體位置處存在。
[0063]本文中的術語「抗體」以最廣義使用，並且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們展現出期望的抗原結合活性。
[0064]術語「抗USPl抗體」和「結合USPl的抗體」指能夠以足夠親和力結合USP1，使得該抗體可作為診斷劑和/或治療劑用於靶向USPl的抗體。在一個實施方案中，根據例如通過放射免疫測定法(RIA)的測量，抗USPl抗體結合無關的、非USPl的蛋白質的程度小於該抗體對USPl的結合的約10%。在某些實施方案中，抗USPl抗體結合在來自不同物種的USPl中保守的USPl表位。
[0065]術語「抗ID抗體」和「結合ID的抗體」指能夠以足夠親和力結合ID，使得該抗體可作為診斷劑和/或治療劑用於靶向ID的抗體。在一個實施方案中，根據例如通過放射免疫測定法(RIA)的測量，抗ID抗體結合無關的、非ID的蛋白質的程度小於該抗體對ID的結合的約10%。在某些實施方案中，抗ID抗體結合在來自不同物種的ID中保守的ID表位。在任何抗ID抗體的一些實施方案中，ID抗體是抗IDl抗體。在任何抗ID抗體的一些實施方案中，ID抗體是抗ID2抗體。在任何抗ID抗體的一些實施方案中，ID抗體是抗ID3抗體。
[0066]「阻斷性」抗體或「拮抗性」抗體是抑制或降低其結合的抗原的生物學活性的抗體。優選的阻斷性抗體或拮抗性抗體實質性或完全抑制抗原的生物學活性。
[0067]「親和力」指分子(例如抗體)的單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間全部非共價相互作用總和的強度。除非另有指示，如本文中使用的，「結合親和力」指反映結合對的成員(例如抗體和抗原)之間1:1相互作用的內在結合親和力。分子X對其配偶體Y的親和力通常可以用解離常數(Kd)來表述。親和力可以通過本領域知道的常用方法來測量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用於測量結合親和力的具體的說明性和例示性的實施方案。
[0068]「親和力成熟的」抗體指在一個或多個高變區(HVR)中具有一處或多處改變的抗體，與不擁有此類改變的親本抗體相比，此類改變導致該抗體對抗原的親和力改善。
[0069]「抗體片段」指與完整抗體不同的分子，其包含完整抗體中結合完整抗體結合的抗原的部分。抗體片段的例子包括但不限於Fv、Fab、Fab』、Fab』 _SH、F(ab』)2 ;雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv);和由抗體片段形成的多特異性抗體。
[0070]與參照抗體「結合相同表位的抗體」指在競爭測定法中將參照抗體對其抗原的結合阻斷50%或更多的抗體，且相反，參照抗體在競爭測定法中將該抗體對其抗原的結合阻斷50%或更多。本文中提供了例示性的競爭測定法。
[0071]術語「嵌合」抗體指其中的重和/或輕鏈的一部分自特定的來源或物種衍生，而重和/或輕鏈的剩餘部分自不同來源或物種衍生的抗體。
[0072]抗體的「類」指其重鏈擁有的恆定域或恆定區的類型。抗體有5大類:IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，並且這些中的幾種可以進一步分成亞類(同種型)，例如，IgG1UgG2UgGyIgG4 JgA1、和IgA2。與不同類免疫球蛋白對應的重鏈恆定域分別稱作α、δ、ε、Y、和μ。
[0073]術語「全長抗體」、「完整抗體」、和「全抗體」在本文中可互換使用，指與天然抗體結構具有基本上類似的結構或者具有含有如本文中所限定的Fe區的重鏈的抗體。
[0074]如本文中使用的，術語「單克隆抗體」指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，SP構成群體的各個抗體是相同的和/或結合相同表位，除了例如含有天然存在的突變或在單克隆抗體製備物的生成期間發生的可能的變體抗體外，此類變體一般以極小量存在。與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體製備物不同，單克隆抗體製備物的每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。如此，修飾語「單克隆」指示抗體自一群基本上同質的抗體獲得的特性，而不應解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，可以通過多種技術來生成要依照本發明使用的單克隆抗體，包括但不限於雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法、和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的轉基因動物的方法，本文中描述了用於生成單克隆抗體的此類方法和其它例示性方法。
[0075]「人抗體」指擁有與由人或人細胞生成的或利用人抗體全集或其它人抗體編碼序列自非人來源衍生的抗體的胺基酸序列對應的胺基酸序列的抗體。人抗體的此定義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。
[0076]「人源化」抗體指包含來自非人HVR的胺基酸殘基和來自人FR的胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施方案中，人源化抗體會包含至少一個，通常兩個基本上整個可變域，其中所有或基本上所有HVR(例如，CDR)對應於非人抗體的那些，且所有或基本上所有FR對應於人抗體的那些。任選地，人源化抗體可以至少包含自人抗體衍生的抗體恆定區的一部分。抗體，例如非人抗體的「人源化形式」指已經經歷人源化的抗體。
[0077]「免疫綴合物」指與一種或多種異源分子，包括但不限於細胞毒劑綴合的抗體。
[0078]關於參考多肽序列的「百分比)胺基酸序列同一性」定義為對比序列並在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性後，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與參考多肽序列中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分率。為測定百分比胺基酸序列同一性目的的對比可以本領域技術範圍內的多種方式進行，例如使用公眾可得到的計算機軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。本領域技術人員可決定用於對比序列的適宜參數，包括對所比較序列全長獲得最大對比所需的任何算法。然而，為了本發明的目的，％胺基酸序列同一性值是使用序列比較電腦程式ALIGN-2獲得的。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech公司編寫，原始碼已經連同用戶文檔一起提交給美國版權局(USCopyright Office, Washington D.C.，20559),並以美國版權註冊號 TXU510087 註冊。公眾可自 Genentech 公司(South San Francisco, California)得到ALIGN-2程序，或者可以自原始碼編譯。ALIGN2程序應當編譯成在UNIX作業系統，包括數碼UNIX V4.0D上使用。所有序列比較參數由ALIGN-2程序設定且不變。
[0079]在採用ALIGN-2來比較胺基酸序列的情況中，給定胺基酸序列A相對於(to)、與(with)、或針對(against)給定胺基酸序列B的％胺基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對於、與、或針對給定胺基酸序列B的某一％胺基酸序列同一性的給定胺基酸序列A)如下計算:
[0080]分數X/Y 乘 100
[0081]其中X是由序列對比程序ALIGN-2在該程序的A和B對比中評分為相同匹配的胺基酸殘基數，且其中Y是B中的胺基酸殘基總數。可以領會，若胺基酸序列A的長度與胺基酸序列B的長度不相等，則A相對於B的％胺基酸序列同一性將不等於B相對於A的％胺基酸序列同一性。除非另有具體說明，本文中所使用的所有％胺基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2電腦程式獲得的。
[0082]「有效量」指在必需的劑量和時間段上有效實現期望的治療或預防結果的量。
[0083]本發明物質/分子、激動劑或拮抗劑的「治療有效量」可根據諸如個體的疾病狀態、年齡、性別和重量及該物質/分子、激動劑或拮抗劑在個體中引發期望應答的能力等因素而變化。治療有效量還指物質/分子、激動劑或拮抗劑的治療有益效果勝過任何有毒或有害效果的量。「預防有效量」指在必需的劑量和時間段上有效實現期望的預防結果的量。通常而非必然，由於預防劑量是在疾病之前或在疾病的早期用於受試者的，因此預防有效量將低於治療有效量。
[0084]術語「藥物配製劑」指其形式容許其中含有的活性成分的生物學活性是有效的，且不含對會施用該配製劑的受試者產生不可接受的毒性的別的成分的製劑。
[0085]「藥學可接受載體」指藥物配製劑中除了活性成分外對受試者無毒的成分。藥學可接受載體包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑、或防腐劑。
[0086]如本文中使用的，「治療/處理」(及其語法變型)指試圖改變所治療個體的自然進程的臨床幹預，可以是為了預防或在臨床病理學的進程中進行。治療的期望效果包括但不限於預防疾病的發生或復發、緩解症狀、削弱疾病的任何直接或間接病理學後果、預防轉移、減緩疾病進展的速率、改善或減輕疾病狀態、及免除或改善預後。在一些實施方案中，使用本發明的抗體來延遲疾病的形成或減緩疾病的進展。
[0087]術語「抗癌療法」指在治療癌症中有用的療法。抗癌治療劑的例子包括但不限於例如化療劑、生長抑制劑、細胞毒劑、放射療法中所使用的藥劑、抗血管發生劑、凋亡劑、抗微管蛋白劑、和其它治療癌症的藥劑，抗CD20抗體、血小板衍生生長因子抑制劑(例如Gleevec?(Imatinib Mesylate))、C0X-2 抑制劑(例如 celecoxib)、幹擾素、細胞因子、結合一種或多種以下靶物的拮抗劑(例如中和性抗體)O3DGFR-β、BlyS, APRIL、BCMA受體、TRAIL/Apo2)、和其它生物活性和有機化學劑，等。本發明還包括它們的組合。
[0088]術語「細胞毒劑」在用於本文時指抑制或防止細胞的功能和/或引起細胞破壞的物質。該術語意圖包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化療劑，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿黴素(adriamycin)、長春花生物鹼類(vinca alkaloids)(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅黴素(daunorubicin)或其它嵌入劑、酶及其片段、諸如溶核酶、抗生素、和毒素，諸如小分子毒素或者細菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體；及下文披露的各種抗腫瘤藥或抗癌藥。下文記載了其它細胞毒劑。殺腫瘤藥引起腫瘤細胞的破壞。
[0089]「化療劑」指可用於治療癌症的化學化合物。化療劑的實例包括烷化劑類(alkylating agents)，諸如塞替派(thiotepa)和環憐酸胺(cyclophosphamide)
(CYTOXAN? );磺酸烷基酯類(alkyl sulfonates)，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙唳類(aziridines),諸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和烏瑞替派(uredopa)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylameIamines)，
【權利要求】
1.一種篩選和/或鑑定促進細胞命運變化的USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或ID拮抗劑的方法，所述方法包括:比較(i)參照細胞命運與(ii)候選細胞命運，其中所述參照細胞命運是參照細胞的細胞命運，其中所述候選細胞命運是在存在USPl候選拮抗劑、UAFl候選拮抗劑、和/或ID候選拮抗劑的情況中所述參照細胞的細胞命運，其中所述USPl候選拮抗劑結合USPl，其中所述UAFl候選拮抗劑結合UAFljP /或所述ID候選拮抗劑結合ID，由此所述參照細胞命運和所述候選細胞命運之間的細胞命運差異將所述USPl候選拮抗劑和/或所述ID候選拮抗劑鑑定為促進細胞命運的變化。
2.權利要求1的方 法，其中所述USPl候選拮抗劑、UAFl候選拮抗劑、和/或所述ID候選拮抗劑是USPl候選拮抗劑。
3.權利要求1的方法，其中所述USPl候選拮抗劑、UAFl候選拮抗劑、和/或所述ID候選拮抗劑是ID候選拮抗劑。
4.權利要求3的方法，其中所述ID候選拮抗劑是IDl候選拮抗劑、ID2候選拮抗劑、和/或ID3候選拮抗劑。
5.權利要求1的方法，其中所述USPl候選拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或所述ID候選拮抗劑是UAFl候選拮抗劑。
6.權利要求1-5中任一項的方法，其中所述參照細胞命運是幹細胞命運。
7.權利要求6的方法，其中所述幹細胞命運是間充質幹細胞命運。
8.權利要求1-7中任一項的方法，其中所述候選細胞命運是成骨細胞細胞命運、軟骨細胞細胞命運、或脂肪細胞細胞命運。
9.權利要求8的方法，其中所述候選細胞命運是成骨細胞細胞命運。
10.權利要求1-9中任一項的方法，其中所述USPl候選拮抗劑、UAFl候選拮抗劑、和/或所述ID候選拮抗劑是抗體、結合多肽、結合小分子、或多核苷酸。
11.一種促進細胞的細胞命運變化的方法，其包括使所述細胞與有效量的USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或ID拮抗劑接觸。
12.—種誘導細胞周期停滯的方法，其包括使所述細胞與有效量的USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或ID拮抗劑接觸。
13.權利要求11-12中任一項的方法，其中所述細胞是具有幹細胞命運(例如間充質幹細胞命運)的細胞。
14.一種治療疾病或病症的方法，其包括對個體施用有效量的USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或ID拮抗劑。
15.權利要求14的方法，其中基於一種或多種選自下組的基因的升高的表達水平選擇所述個體進行治療:CD90、CD105、CD106、USP1、UAF1、和ID (例如ID1、ID2、或ID3)(例如與內部參照(例如CD144)相比)或者基於一種或多種選自下組的基因的低表達水平不選擇所述個體進行治療:CD90、CD105、CD106、USP1、UAF1、和ID (例如ID1、ID2、或ID3)(例如與內部參照(例如CD144)相比)。
16.權利要求14-15中任一項的方法,其中基於一種或多種選自下組的基因的低表達水平選擇所述個體進行治療:p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘連蛋白、SPPl/骨橋蛋白、BGLAP/骨鈣蛋白、和鹼性磷酸酶(ALP)(例如與內部參照(例如CD144)相比)或基於一種或多種選自下組的基因的升高的表達水平不選擇所述個體進行治療:p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘連蛋白、SPPl/骨橋蛋白、BGLAP/骨鈣蛋白、和鹼性磷酸酶(ALP)(例如與內部參照(例如CD 144)相比)。
17.權利要求14-16中任一項的方法，其中基於一種或多種選自下組的基因的升高的表達水平，所述個體可能響應治療:p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘連蛋白、SPPl/骨橋蛋白、BGLAP/骨鈣蛋白、和鹼性磷酸酶(ALP)(例如與內部參照(例如CD144)相比)(例如從治療開始時、期間、或之前的時間點至後來的時間點)或者基於一種或多種選自下組的基因的降低的或無顯著變化的表達水平，所述個體可能不響應治療:p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘連蛋白、SPPl/骨橋蛋白、BGLAP/骨鈣蛋白、和鹼性磷酸酶(ALP)(例如與內部參照(例如CD144)相比)(例如從治療開始時、期間、或之前的時間點至後來的時間點)。
18.權利要求14-17中任一項的方法，其中所述USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或ID拮抗劑誘導細胞周期停滯。
19.權利要求14-18中任一項的方法，其中所述USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或ID拮抗劑能夠促進細胞命運變化。
20.權利要求11-13和19中任一項的方法，其中促進細胞命運變化以一種或多種選自下組的基因的降低的表達水平指示:CD90、CD105、CD106、USP1、UAF1、和ID(例如ID1、ID2、或ID3)(例如與內部參照(例如CD 144)相比)。
21.權利要求11-13和19-20中任一項的方法，其中促進細胞命運變化以一種或多種選自下組的基因的升高的表達水平指示:p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘連蛋白、SPPl/骨橋蛋白、BGLAP/骨鈣蛋白、和鹼性磷酸酶(ALP)。
22.權利要求21的方法，其中與內部參照(例如CD144)相比，一種或多種基因的表達水平是升高的。
23.權利要求14-22中任一項的方法，其中所述疾病或病症包含具有幹細胞命運(例如間充質幹細胞命運)的細胞。
24.權利要求11-13和23中任一項的方法,其中所述細胞表達一種或多種選自下組的基因:CD90、CD105、CD106、USP1、UAFlJP ID (例如 IDU ID2、或 ID3)。
25.權利要求19的方法，其中與內部參照(例如CD144)相比，一種或多種基因的表達水平是升高的。
26.權利要求11-13和23-25中任一項的方法，其中所述細胞沒有顯著表達(例如不表達或與內部參照(例如CD144)相比以低水平表達)一種或多種選自下組的基因:p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘連蛋白、SPPl/骨橋蛋白、BGLAP/骨鈣蛋白、和鹼性磷酸酶(ALP)。
27.權利要求14-26中任一項的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
28.權利要求27的方法，其中所述癌症是骨肉瘤。
29.權利要求27-28的方法，其中所述癌症表達一種或多種選自下組的基因:⑶90、CD105、CD106、USP1、UAFlJP ID (例如 IDU ID2、或 ID3)。
30.權利要求29的方法，其中與內部參照(例如CD144)相比，一種或多種基因的表達水平是升高的。
31.權利要求1的方法，其中所述USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或所述ID拮抗劑是USPl拮抗劑。
32.權利要求1的方法，其中所述USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或所述ID拮抗劑是ID拮抗劑。
33.權利要求3的方法，其中所述ID拮抗劑是IDl候選拮抗劑、ID2候選拮抗劑、和/或ID3拮抗劑。
34.權利要求1的方法，其中所述USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或所述ID拮抗劑是UAFl拮抗劑。
35.權利要求11-34中任一項的方法，其中所述USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或所述ID拮抗劑是抗體、結合多肽、結合小分子、或多核苷酸。
36.權利要求35的方法，其中所述USPl拮抗劑、UAFl拮抗劑、和/或所述ID拮抗劑是抗體。
37.權利要求36的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
38.權利要求1的方法，其中所述抗體是人抗體、人源化抗體、或嵌合抗體。
39.權利要求1的方法，其中所述抗體是抗體片段，且所述抗體結合USPl、UAFjP/或ID0
【文檔編號】G01N33/50GK103930781SQ201280055836
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2012年9月14日 優先權日:2011年9月15日
【發明者】V.M.迪克西特, D.M.弗倫奇, H.L.米克, S.A.威廉斯 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司