用cyld抑制劑治療中耳炎及其它病狀的組合物和方法

2023-06-03 15:45:51 4

用cyld抑制劑治療中耳炎及其它病狀的組合物和方法
【專利摘要】本發明部分地基於我們對於包括去泛素化酶CYLD的分子途徑的研究。因此，本發明尤其特徵性描述了表達CYLD或其生物活性變體(例如，包括催化結構域的變體)的核酸構建體、抑制CYLD的負調節劑(例如，PDE4B或JNK2)的表達的核酸、調整下遊CYLD靶標(例如，Akt，通過抑制或促進下遊靶標的表達)的表達的核酸、包含這些類型的構建體中的一種或多種的組合物(例如，藥物組合物)、包括一種或多種本文所述的組合物和使用說明書的試劑盒、識別上調CYLD、下調CYLD的負調節劑或調整(例如，抑制)下遊CYLD靶標(例如，Akt)的治療劑(例如，消炎劑)的篩選方法和包括單獨或組合地施用上述核酸、蛋白生物治療劑和/或小分子以對付癌症、炎症和纖維化的各種治療方法。本文所述的組合物可用於製備藥物(例如，用於製備用以治療癌症、炎症、纖維化或一種或多種本文所述的更具體病狀的藥物)。
【專利說明】用CYLD抑制劑治療中耳炎及其它病狀的組合物和方法
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年4月10日提交的美國臨時申請61/622,486號的提交日的權 Mo
[0003] 關於聯邦資助的研究的聲明
[0004] 本發明在由國家衛生研究所（National Institutes of Health)頒發的許可編號 DC005843下在政府支持下完成。政府對本發明具有一定的權利。

【技術領域】
[0005] 本發明總體上涉及通過調整在受試者中的炎症反應，諸如響應病原體或化學刺激 劑引起的炎症反應而治療或預防醫學病狀的方法。更具體地，一方面，本發明涉及用於上調 編碼去泛素化酶CYLD(圓柱瘤蛋白（cylindromatosis))的基因的表達或所編碼酶的活性 的組合物和方法。在其它方面，本發明特徵性描述了調整影響CYLD或受CYLD影響的其它 細胞組分的組合物和方法。如下文進一步描述，所述組合物可包含兩種活性劑。

【背景技術】
[0006] 炎症是組織對有害刺激物如病原體、受損細胞或刺激劑以及對機械性創傷、毒素 和腫瘤形成的複雜生物反應。炎症作為宿主對外來物質入侵的防禦性反應而出現且分類成 急性炎症或慢性炎症。急性炎症為身體對有害刺激物的初始反應且通過增加血漿和白血球 從血液到損傷組織的移動來實現。級聯生化事件傳導了涉及局部血管系統、免疫系統和損 傷組織內的各種細胞的炎症反應且使其成熟。慢性（長期）炎症導致在炎症部位存在的細 胞類型中的漸進性轉變且以組織因炎症過程同時毀壞和癒合為特徵。
[0007] 過度炎症或炎症過程的延長可導致局部組織受損；感染後症候群，如在纖維化病 變中；和風溼性疾病，諸如系統性紅斑狼瘡和類風溼性關節炎；或甚至炎症反應誘發的疾 病,諸如各種各樣的糖尿病、動脈硬化、白內障、再灌注損傷和癌症。


【發明內容】

[0008] 本發明部分地基於我們對於包括去泛素化酶CYLD的分子途徑的研究。因此，本發 明特徵性描述了尤其是表達CYLD或其生物活性變體（例如，包括催化結構域的變體）的核 酸構建體、抑制CYLD的負調節劑（例如，PDE4B或JNK2)的表達的核酸、調整下遊CYLD靶 標（例如，Akt，通過抑制或促進下遊靶標的表達）的表達的核酸、包含這些類型的構建體中 的一種或多種的組合物（例如，醫藥組合物）、包括一種或多種本文所述的組合物和使用說 明書的試劑盒、識別上調CYLD、下調CYLD的負調節劑或調整（例如，抑制）下遊CYLD靶標 (例如，Akt)的治療劑（例如，消炎劑）的篩選方法和各種治療方法。代替如上所述的核酸 或除了如上所述的核酸之外，所述組合物可包含以下物質且本發明的治療方法可用以下物 質進行：增強CYLD的表達或活性、抑制CYLD的負調節劑的活性或調整（例如，阻遏）下遊 CYLD靶標（例如，Akt)的活性的蛋白生物治療劑或小分子。在所述治療劑以TOE4B為靶標 時，所述治療劑可為選擇性地抑制roE4B同種型的表達或活性的治療劑（與相對於例如另 一磷酸二酯酶如roE4A、PDE4C或TOE4D同種型而非選擇性地抑制TOE4B同種型相反）。我 們可互換地使用術語"治療劑"和"醫藥劑"。
[0009] 更具體地，本發明特徵性描述了包含單一活性劑的組合物以及包含兩種或多種活 性劑的組合物。雖然下文將進一步描述合適的製劑，但我們在此注意到所述組合物可配製 為藥物組合物或任何活性治療劑可在其中非常濃或另外不適合施用到患者的儲備溶液。例 如，本發明特徵性描述了包含作為單一活性醫藥劑或作為多種活性醫藥劑中的第一種的本 發明的核酸構建體（例如，如下核酸構建體，由其表達CYLD ;由其或通過其抑制TOE4B ;或 由其或通過其調整（例如，表達或抑制）Akt)的組合物。分子生物學領域現在已經全面發 展，且本領域的普通技術人員將熟悉可用以實現本文所述的結果的各種表達載體和系統。 可表達CYLD的核酸構建體例如可由許多質體或病毒載體形成。現在也熟知阻遏基因表達 的核酸構建體，其中所述核酸包括反義寡聚核苷酸、微RNAs和介導RNAi (例如，siRNA和 shRNA)的核酸。參見,例如題為"使用人造微RNA下調基因表達（Down-regulation of gene expression using artificial microRNAs)"的美國專利 8, 415, 526 號。所述組合物還可包 含作為單一活性醫藥劑或作為多種活性醫藥劑中的第一種的蛋白治療劑，諸如抑制TOE4B 或Akt的抗體或促進CYLD的活性、抑制PDE4B或調整Akt的小分子（化合物）。第二活性 劑可例如為消炎劑，所述消炎劑也為核酸、蛋白治療劑或小分子。所述第二藥劑可例如為類 固醇（例如，地塞米松（dexamethasone))、非類固醇消炎藥（例如，阿司匹林（aspirin)、布 洛芬（ibuprofen)或萘普生（naproxen))、免疫選擇性消炎衍生物（例如，7-mer SGP-T或 3_mer FEG)、長春西丁（vinpocetine)、咯利普蘭（rolipram)、羅氟司特（roflumilast)、西 洛司特（cilomilast)、Ro 20-1724或如在WO 2007/142929中所述的化合物。其它組合治 療劑包括以下各物中的兩種或多種：類固醇（例如，地塞米松）、非類固醇消炎藥（例如，阿 司匹林、布洛芬或萘普生）、免疫選擇性消炎衍生物（例如，7-mer SGP-T或3-mer FEG)、長 春西丁、咯利普蘭、羅氟司特、西洛司特、Ro 20-1724或如在WO 2007/142929中所述的化合 物。例如，在一個實施方式中，本發明特徵性描述了包含地塞米松和長春西丁的組合物（例 如,藥物組合物）。
[0010] 上述藥劑，不管是單獨施用、組合在單一製劑中，還是僅通過單獨的製劑施用到同 一患者，可用於本文所述的方法中以治療罹患各種病狀的患者，所述病狀包括其中認為炎 症起到成因性作用或其中炎症為常見病徵的病狀。因此，本發明特徵性描述了如下方法，其 包括向有需要的患者施用治療有效量的本文所述的藥物組合物的步驟。唯一或第一活性劑 可如上所述為核酸構建體、蛋白生物治療劑或小分子。在包含第二活性劑時，所述第二活 性劑可例如為消炎劑，其也為核酸，或在其它實施方式中，其為小分子，諸如類固醇（例如， 地塞米松）、非類固醇消炎藥（例如，阿司匹林、布洛芬或萘普生）、免疫選擇性消炎衍生物 (例如，7-mer SGP-T或3-mer FEG)、長春西丁、咯利普蘭、羅氟司特、西洛司特、Ro 20-1724 或如在WO 2007/142929中所述的化合物。可施用以治療如本文所述的病狀的其它組合治 療劑包括以下各物中的兩種或多種：類固醇（例如，地塞米松）、非類固醇消炎藥（例如，阿 司匹林、布洛芬或萘普生）、免疫選擇性消炎衍生物（例如，7-mer SGP-T或3-mer FEG)、長 春西丁、咯利普蘭、羅氟司特、西洛司特、Ro 20-1724或如在WO 2007/142929中所述的化合 物。 toon] 本文所述的組合物可用於製備藥物（例如，用於製備用以治療癌症、炎症、纖維化 或本文更具體描述的病狀中的任一種或多種的藥物）。因此，本發明的另一實施方式包括如 本文所述的組合物在製造用於治療如本文所述的病狀的藥物中的用途。
[0012] 可治療的病狀包括癌症、炎症和纖維化，其可影響許多不同的器官或器官系統。 在特定的實施方式中，用如本文所述的組合物治療的病狀可與在耳（單或雙）、鼻或喉嚨 中的炎症或粘液生產過剩相關，並且還可影響鼻道、在呼吸系統內的另一區域或組織（例 如，肺或支氣管樹）或竇腔或從竇腔延伸的通道。例如，所述病狀可為間質性肺病、人類纖 維化肺病（例如，特發性肺纖維化（IPF)、囊性纖維化、呼吸窘迫症候群（成人（ARDS)或 嬰兒）、肺病中的腫瘤基質、全身性硬化、Hermansky-Pudlak症候群（HPS)、煤礦工人塵肺 (CWP)、慢性肺動脈高血壓、AIDS相關的肺動脈高血壓等、哮喘、慢性支氣管炎、慢性阻塞性 肺病（COPD)、咳嗽（例如，嗜酸性咳嗽）、肺纖維化、鼻炎（例如，過敏性鼻炎）、竇炎或中耳 炎。在其它實施方式中，用如本文所述的組合物治療的病狀可為人類腎病。例如，患者可具 有腎病症候群、阿爾波特氏症候群（Alport's syndrome)、HIV相關的腎病、多囊性腎病、法 布裡病（Fabry's disease)、糖尿病性或其它腎病、腎小球性腎炎（例如，慢性腎小球性腎 炎）或與全身性狼瘡相關的腎炎。如所提到的，本發明的組合物可有效抵抗纖維化，包括 在肝（肝纖維化）、心臟（心肌纖維化）和生殖系統（子宮內膜纖維化）中的纖維化病狀。 在涉及到肝時，可治療的病狀還包括肝炎（不管是由病毒劑、自身免疫疾病、還是由濫用藥 品引起）、肝性脂肪變性和肝硬化。在其它實施方式中，用如本文所述的組合物治療的病狀 可為心血管疾病，包括動脈再狹窄和動脈粥樣硬化或心肌的再灌注損傷。在其它實施方式 中，用如本文所述的組合物治療的病狀可為癌症，且本發明的組合物可用以阻止腫瘤生長 和/或轉移。可服從治療的特定癌症包括硬皮病、在Li-Fraumeni症候群中的膠質母細胞 瘤、散發性膠質母細胞瘤、骨髓性白血病、急性髓性白血病、脊髓發育不良症候群、骨髓增生 性症候群，癌症如乳癌、肺癌、結腸癌（例如，Lynch症候群）、前列腺癌或婦科癌症（例如， 卵巢或子宮癌）和皮膚癌（例如，黑素瘤或卡波西肉瘤（Kaposi's sarcoma))。除了皮膚 癌或惡性增殖性皮膚病之外，本發明的組合物可用於治療嗜酸粒細胞肉芽腫、其它良性皮 膚病如特異性皮炎（一種溼疹）和蕁麻疹（urticaria)(通常稱為蕁麻疹（Hives))和疤 痕。在另一實施方式中，本發明的組合物和方法可應用到表現出組織變形的患者，該組織變 形通常被理解為響應在周圍或慢性刺激中的改變而出現的良性改變。例如，在患者呼吸道 內的細胞和組織可響應煙氣（例如，從菸草產品如雪茄或香菸吸入的煙氣）而表現出組織 變形。雖然本發明不受此限制，但在這種情況下，刺激劑可促使加襯氣管的粘液分泌纖毛 假復層柱狀呼吸上皮細胞被復層扁平上皮替代。如所提到的，本發明的組合物可有效抵抗 炎性病狀，包括影響胃腸道的那些病狀。這些病狀包括炎性腸病（例如，潰瘍性結腸炎或克 羅恩氏病（Crohn's disease))，且本發明的組合物也可用於治療胃酸的分泌亢進。在其它 實施方式中，用如本文所述的組合物治療的病狀可為神經病症或對神經系統（例如，外周 或中樞神經系統）的損傷。例如，所述病狀可為腦的再灌注損傷、抑鬱症、記憶障礙、單極 性抑鬱症、帕金森病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓氏病、脊髓創傷、顱腦損傷、神經原性炎症或 疼痛。日益證明神經降解性病症和損傷具有重要的炎性組分，且任何所述病症或損傷都可 用本文所述的組合物治療。在其它實施方式中，用如本文所述的組合物治療的病狀可為自 身免疫病症，諸如多發性硬化、類風溼性關節炎、Grave氏眼病、牛皮癬或尿崩症。也可治療 移植排斥和移植抗宿主病。在其它實施方式中，用如本文所述的組合物治療的病狀可為與 細菌或病毒病原體相關的感染疾病。例如，所述病狀可為由鏈球菌（streptococcus)屬的 細菌（例如，肺炎鏈球菌（S. pneumoniae),有時稱為肺炎球菌（pneumococcus)或產膿鏈球 菌（S. pyogenes))、不可分型流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae) (NTHi)或綠膿桿菌 (Pseudomas aeruginosa)引起的感染疾病。其它可治療的感染疾病與病毒（例如，呼吸道 合胞病毒或流感病毒）相關。還可治療漢森氏病（Hansen's disease)，細菌、真菌或病毒誘 發的膿毒症或膿毒性休克（內毒素休克）。在其它實施方式中，用如本文所述的組合物治 療的病狀可影響生殖或泌尿生殖組織或器官。例如，所述患者可為罹患與生殖器官的炎症 相關的醫學病狀（例如，前列腺炎、盆腔炎或引起生殖組織或器官的炎症的感染疾病）的患 者。在其它實施方式中，用如本文所述的組合物治療的病狀可影響骨骼肌肉系統。例如，患 者可罹患炎症性關節炎、骨關節炎、骨質疏鬆、炎症和細胞因子介導的慢性組織變性、肌肉 耗損、惡病質或關節強硬性脊椎炎。在其它實施方式中，用如本文所述的組合物治療的病狀 可為藥物誘發的麥角中毒、過敏性結膜炎、春季結膜炎、肥胖症或胰腺炎。
[0013] 涉及治療性或預防性治療的本發明方法中的任一種可包括識別需要治療的患者 的步驟（例如，通過進行診斷性試驗或測定）。例如，醫師或其它保健提供者可識別顯示炎 症病徵如溫度升高、發紅、腫脹和功能喪失（例如，在如本文所述的組織、器官或系統中）的 患者。所述患者還可能訴苦疼痛或僵硬。在所述病狀包括異常細胞增殖的情況下，醫師或 其它保健提供者可用適當診斷工具（例如，癌症生物標誌物和成像劑）類似地評定患者。 因為本發明涵蓋獸醫應用，所以所述患者可為人類或另一哺乳動物，諸如馴化寵物（例如， 貓或狗）、家畜、馬或被關（例如，在動物園中）的動物。我們可互換地使用術語"患者"和 "受試者"。本文所述的方法可適用於任何年齡的受試者。例如，在所述患者為人類的情況 下，所述人類可為嬰兒或兒童。
[0014] 在一個實施方式中，本發明特徵性描述了治療罹患與在耳（單或雙（例如，中耳 炎））、鼻、鼻道、在呼吸系統內的另一組織或器官（例如，肺或支氣管樹）或竇腔或從竇腔 延伸的管道、口腔和/或喉嚨中的炎症或粘液生產過剩相關的醫學病狀的患者的方法。因 此，所述病狀可定義為與下呼吸道和/或上呼吸道相關的病狀。所述方法可通過向所述患 者施用治療有效量的本文所述的藥物組合物來進行。"有效量"是指引起臨床有益反應的 治療劑或醫藥劑的量。如上所述，所述方法涵蓋包括嬰兒和兒童的多種受試者的治療。下 調Akt基因的表達的藥劑可為抑制Akt基因的核酸（例如，反義寡聚核苷酸、微RNA或介導 MAi的核酸）。在一個實施方式中，抑制所編碼激酶的活性的所述藥劑可為表達使Akt去 泛素化的酶（例如，酶CYLD)的核酸構建體。在另一實施方式中，抑制所編碼激酶的活性的 所述藥劑可為VQD-002、哌立福新（perifosine)或米替福新（miltefosine)。如所提到的， 所述藥物組合物可配製成適合耳局部或鼻施用。
[0015] 上調CYLD的表達的所述藥劑可為磷酸二酯酶4 (PDE4(例如，PDE4B))的抑制劑或 c-jun N-末端激酶2 (JNK2)的抑制劑。在任何情況下（即，在本發明的任何方面或實施方 式中），所述TOE4的抑制劑可對TOE4B具有特異性。例如，所述抑制劑可為抑制TOE4B、但 不顯著抑制TOE4D的抑制劑。為了選擇性地抑制TOE4B，可施用抑制TOE4B基因表達的核 酸（例如，核酸構建體）。所述核酸在本領域中已知且包括反義寡聚核苷酸、微RNA和介導 RNAi (例如，siRNA和shRNA)的核酸。TOE4的有用化學抑制劑包括咯利普蘭、羅氟司特和西 洛司特。其它有用的抑制劑為在WO 2007/142929(其全部內容通過引用結合到本文中來） 中描述的那些。這些抑制劑包括被取代的苯或包含一個或兩個環氮的被取代的6元雜芳基 環，所述取代包括醚、硫醚或胺基團，其中在所述醚、硫醚或胺上的烷基為齒烷基。所述滷烷 基可為氟甲基、二氟甲基或三氟甲基。
[0016] 上調CYLD的表達的所述藥劑為JNK2的抑制劑。例如，所述JNK2抑制劑可為JNK 相互作用蛋白（JIP)或其肽片段，任選與細胞滲透肽TAT (如例如在Kaoud等（ACS Chem. Biol. 6:658?666, 2011)中所述）或2, 4-二氨基嘧啶（如例如在Song等（Med. Chem. Commun 3:238?243, 2012)中所述）相連。所述JNK2的抑制劑還可為抑制JNK2基因表達 的核酸。在希望用核酸構建體抑制靶標的任何情況下，不管是JNK2,還是本文所述的另一目 標，都可使用反義寡聚核苷酸、微RNA或介導RNAi (例如，siRNA和shRNA)的核酸。
[0017] 在需要用於治療影響耳或鼻的病狀的藥物組合物的任何方法中，可將所述組合物 配製成適合耳局部或鼻施用。
[0018] 在另一實施方式中，本發明特徵性描述了治療罹患與生殖器官的炎症相關的醫學 病狀（例如，前列腺炎、盆腔炎或引起生殖組織或器官的炎症的感染疾病）的患者的方法。 所述方法可通過向所述患者施用治療有效量的包含上調圓柱瘤蛋白（CYLD)基因的表達或 所編碼的去泛素化酶的活性的藥劑的藥物組合物來進行。所述藥劑可為上述的那些。或者 或另外，該患者群體還可用治療有效量的包含下調Akt基因的表達或抑制所編碼激酶的活 性的藥劑的藥物組合物治療。
[0019] 在另一實施方式中，本發明特徵性描述了治療罹患自身免疫性疾病、尤其是牛皮 癬或類風溼性關節炎的患者的方法。所述方法包括向所述患者施用治療有效量的包含上調 圓柱瘤蛋白（CYLD)基因的表達或所編碼去泛素化酶的活性的藥劑的藥物組合物。在這些 方法中，在上文和本文中的其它地方描述的任何藥劑都可配製成適合施用。因為牛皮癬影 響皮膚，所以旨在治療該病狀的製劑可為局部的。另外，且如所提到的，這些方法可使用抑 制TOE4B、但不顯著抑制另一 TOE4-家族成員（例如，TOE4D)的TOE4抑制劑進行。這些選 擇性抑制劑可為使用本領域已知的方法設計以產生序列特異性靶向分子（例如，反義寡聚 核苷酸、微RNA和介導RNAi (例如，siRNA和shRNA)的核酸）的核酸（例如，核酸構建體）。 在另一實施方式中，上調CYLD基因表達的藥劑可以是JNK2的抑制劑。
[0020] 在另一實施方式中，本發明特徵性描述了通過向罹患自身免疫性疾病、尤其是牛 皮癬或類風溼性關節炎的患者施用治療有效量的包含下調Akt基因的表達或抑制所編碼 激酶的活性的藥劑的藥物組合物來治療所述患者的方法。
[0021] 在另一實施方式中，本發明特徵性描述了通過施用TOE4B的選擇性抑制劑（例如， 核酸，經由序列特異性相互作用，特異性地抑制TOE4B的表達，或化合物治療劑）治療多種 病狀的方法。在一些實施方式中，如本文所述的可治療病狀可急性存在，且本文所述的組合 物和方法可急性應用（例如，經最方便地以數天或數周測量的時間）。在其它實施方式中， 所述病狀可為慢性的，且本文所述的組合物和方法可慢性應用（即，經最方便地以數月或 數年測量的時間）。
[0022] 在另一實施方式中，本發明特徵性描述了識別治療劑的方法。所述方法可通過包 括以下步驟來進行：（a)提供測試藥劑；(b)將所述藥劑暴露於TOE4B且同時或單獨地暴露 於另一種I 3DE (例如，PDE4D);和（c)測定編碼TOE4B和另一種PDE (例如，PDE4D)的基因的 表達水平和/或所編碼磷酸二酯酶的活性水平。抑制TOE4B的表達或活性、但不顯著抑制 所測定的另一種Η)Ε(例如，PDE4D)的表達或活性的藥劑為用於治療癌症、炎症或纖維化的 潛在治療劑，且更特定地用於本文提到的任何患者群體（例如，患有中耳炎或影響耳、鼻、 喉嚨或呼吸系統的其它炎症有關病狀的患者）的潛在治療劑。
[0023] 我們在本文中提到指定藥劑的生物活性變體。例如，本發明的核酸構建體（例如， 編碼CYLD的構建體）可包括作為天然存在基因的生物活性變體的序列。這些變體可藉助 於一個或多個核苷酸的刪除、添加或替換而不同於它們天然存在的對應物。因此，編碼CYLD 的基因的生物活性變體可為其編碼例如催化結構域的片段或可為替換突變體。替換突變體 可在編碼與未改變的序列相同的胺基酸殘基的密碼子內的第三位置處不同，且所述序列可 被密碼子優化。類似地，在所述藥劑為多肽的情況下，生物活性變體的序列可比其天然存在 的對應物短、比其長或以其它方式與其不同（例如，藉助於替換一個或多個胺基酸殘基）。 藥劑在可用於本發明的組合物和方法中時為生物活性的。其不必在所有或甚至大多數方面 與天然對應物相同。為了便於閱讀，我們並沒有在每一機會下重複短語"或其生物活性變 體"。應理解，在如本文所述可使用天然存在的藥劑的情況下，也可使用其生物活性變體。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1圖示在小鼠和人類中作為肺纖維化的負調節劑的CYLD。圖Ia為顯示來自肺 炎鏈球菌感染（插入：X 400) 2周後的Cyld+/+和Cyld/-小鼠的肺組織的H&E和Masson三 色（Trichrome)染色的顯微照片的畫面。比例尺對應於200 μ m。圖Ib為圖示與內部對照 物相比較I型和ΠΙ型膠原蛋白（C0L1A2和C0L3A1)、CTGF和1型纖溶酶原激活物抑制劑 (PAI-I)的mRNA表達的相對量的條形圖。在肺炎鏈球菌感染2周後的Cyld+/+和Cyld-/-小 鼠的肺組織中測量甘油醛3-磷酸脫氫酶。*P〈0. 05值為平均值土標準偏差（η = 3)。使 用不配對學生t檢驗以與Cyld+/+相比較。圖Ic為對照物（Con)和人類患者的肺纖維化 組織（纖維化肺）的H&E、Masson三色和抗-CYLD染色的顯微照片的畫面。肺纖維化組織 在肺切除術期間從患有肺纖維化的患者獲得，且正常對照組織在手術期間從具有氣胸的患 者獲得。載玻片表示5種（對照）人類肺組織和10種（纖維化）人類肺組織。比例尺： 200 μ m。
[0025] 圖2圖示CYLD經由抑制TGF-β -信號傳導而防止了肺纖維化的發展。在圖2a的 免疫印跡中，用siRNA-對照物（SiCon)或siCYLD轉染的上皮細胞通過用所指示的抗體進 行免疫印跡來分析。圖2b為其中在用TNF-a (l〇ng mr1)刺激的siCon-或siCYLD-轉染 細胞中顯示NF-κ B-啟動子活性的條形圖。圖2c為圖示在用TGF-β激發的siRNA-對照物 (siCon)或siCYLD-轉染細胞中的SBE-啟動子和PAI-I-啟動子活性的一對條形圖。圖2d 為圖示在用TGF- β刺激的siCon-或siCYLD-轉染細胞中與甘油醛3-磷酸脫氫酶相比較的 PAI-ImRNA表達的相對量的條形圖。圖2e為顯示在用各種量的siCYLD或WT-CYLD轉染並 用TGF-β刺激的A549細胞中的SBE-啟動子活性的一對條形圖。圖2f為圖示在用TGF-β 刺激的siCYLD或WT-CYLD-轉染的人類原代支氣管上皮NHBE細胞中的SBE-啟動子活性的 條形圖。圖2g為圖示在來自用TGF-β刺激的Cyld+/+和Cyld-/-小鼠的小鼠 MEF中的 SBE-啟動子活性的條形圖。圖2h為圖示在氣管內接種TGF-β (25?IOOng/小鼠）6小時後 在Cyld+/+和Cyld-/-小鼠的肺組織中與甘油醛3-磷酸脫氫酶相比較的PAI-I和CTGF的 mRNA表達的相對量的一對條形圖。在（b?h)中的*P〈0. 05值為平均值土標準偏差（η = 3)。使用學生t-檢驗進行統計數據分析。圖2i為在有或沒有腹腔內接種SB431542(10mg/ kg體重）的情況下在肺炎鏈球菌感染2周後來自Cyld-/-小鼠的肺組織的H&E和Masson 三色染色的一系列顯微照片。比例尺：200 μ m。
[0026] 圖3圖示CYLD經由降低Smad3蛋白的穩定性而抑制TGF-β -信號。圖3a為圖示 在用對照載體或組成性活化的（C/A)-T β RI共轉染的SiCon-或iCYLD-轉染的T β II-缺 陷的DR26細胞中的SBE-啟動子活性的條形圖。圖3b為圖示在用對照載體或WT-Smad3共 轉染的siCON-或siCYLD-轉染的T β I-缺陷的RlB細胞中的SBE-啟動子活性的條形圖。 圖3c為圖示在用對照載體或WT-Smad3共轉染的siCON-或siCYLD-轉染的Smad3-/-MEF 細胞中的SBE-啟動子活性的條形圖。圖3d為圖示用TGF-β處理並通過用所指示的抗體 免疫印跡分析的用siCYLD或WT-CYLD轉染的細胞的一對免疫印跡。在圖3e和圖3f中的 免疫印跡中，來自Cyld+/+和Cyld-/-小鼠的MEF細胞和肺組織通過用所指示的抗體進行 免疫印跡來分析。在圖3g的顯微照片的畫面中，來自對照物的肺組織（Con)和肺部纖維 化患者的肺組織（纖維化肺）相對Smad3染色（左畫面，X 100 ;右畫面，X 400)。比例尺： 200μπι。在圖3h的條形圖中，具有Flag-WT-Smad3(右畫面）或沒有Flag-WT-Smad3(左畫 面）的用WT-CYLD轉染的細胞通過用所指示的抗體進行免疫印跡來分析。圖3i為圖示在 用siCON或siCYLD轉染並用TGF-β刺激的A549細胞中與甘油醛3-磷酸脫氫酶相比較的 PAI-UCTGF和Smad3的mRNA表達的相對量的一系列條形圖。在圖3j的免疫印跡中，將用對 照載體或WT-CYLD轉染的細胞用MG132 (20 μ M)處理並通過用所指示的抗體進行免疫印跡 來分析。在圖3k的條形圖中，將用WT-CYLD轉染的細胞用MG-132預處理，且在TGF-β -處 理後，得到與甘油醛3-磷酸脫氫酶相比較的PAI-ImRNA表達的相對量。在a、b、c、i和k中 的*P〈0. 05、#P>0. 05值為平均值土標準偏差（η = 3)。使用學生t-檢驗進行統計數據分 析。
[0027] 圖4圖示CYLD以GSK3P -CHIP-依賴性方式可能經由Akt降低了 Smad3蛋白的 穩定性。圖4a為圖示用所指示的抗體對用WT-CYLD或DUB-缺陷突變體（H/N-CYLD或C/ S-CYLD)轉染的細胞的免疫印跡。圖4b為顯示在用TGF-β刺激的用WT-CYLD、H/N-CYLD或 C/S-CYLD轉染的細胞中的SBE-啟動子活性的條形圖。圖4c為圖示用所指示的抗體得到的 用siCon或siCHIP與WT-CYLD或H/N-CYLD共轉染的細胞的免疫印跡。圖4d為顯示在用 TGF- β刺激的用SiCon或siCHIP與WT-CYLD共轉染的細胞中的SBE-啟動子活性的條形圖。 圖4e的條形圖顯示在用TGF-β刺激的用siCon或siCHIP與WT-CYLD共轉染的細胞中與甘 油醛3-磷酸脫氫酶相比較的PAI-ImRNA表達的相對量。在圖4f中，將用對照載體、WT-CYLD 或DUB-缺陷的H/N-CYLD轉染的細胞用媒介對照物或GSK3 β -抑制劑SB216763 (5 μ M) 處理12小時並通過用所指示的抗體進行免疫印跡來分析。在圖4g中，將用對照載體或 WT-CYLD轉染的細胞用GSK3 β -抑制劑（5 μ M)預處理2小時，接著TGF- β -刺激，且隨後 測定SBE-啟動子活性。在圖4h中，將重組GSK3 β蛋白（His-GSK3 β )用GST或重組CHIP 蛋白（GST-CHIP)體外溫育。將CHIP用瓊脂糖4B珠粒捕獲（pull down)並相對於His免疫 印跡以檢測GSK3。在圖4i中，將在用Myc-CHIP和HA-GSK30共轉染細胞中的HA-GSK33 用HA探針捕獲並通過用抗-Myc抗體進行免疫印跡來分析。在圖4j中，將A549細胞用肺 炎鏈球菌處理歷時如在該圖中所指示的各種時間，且細胞溶解產物通過用所指示的抗體進 行免疫印跡來分析。在圖4k中，將來自Cyld+/+和Cyld-/-小鼠的MEF細胞用肺炎鏈球菌 處理30分鐘，且細胞溶解產物通過用所指示的抗體進行免疫印跡來分析。在圖41中，將WT 小鼠用肺炎鏈球菌氣管內接種歷時如在該圖中所指示的各種時間，且來自肺組織的蛋白質 通過用所指示的抗體進行免疫印跡來分析。在圖4m中，將A549細胞用肺炎鏈球菌處理歷 時所指示的各種時間，且細胞溶解產物通過用所指示的抗體進行免疫印跡來分析。在b、d、 e和g中的*P〈〇. 05值為平均值土標準偏差（η = 3)。使用學生t-檢驗進行統計數據分 析。S.p.:肺炎鏈球菌。
[0028] 圖5圖示CYLD通過抑制Akt降低了 Smad3穩定性。（a)將來自Cyld+/+和 Cyld-/-小鼠的MEF細胞用siCon或siAktl/2轉染並通過用所指示的抗體進行免疫印跡 來分析。（b)在有或沒有siAkt共轉染且用TGF-β刺激的siCYLD-轉染的A549細胞中 測定SBE-啟動子活性。（c)在來自用Akt抑制劑預處理並用TGF-β刺激的Cyld+/+和 Cyld-/-小鼠的MEF中測定SBE-啟動子活性。（d)將來自Cyld+/+和Cyld-/-小鼠的MEF 細胞用Akt抑制劑（20 μ M)培育，且細胞溶解產物通過用所指示的抗體進行免疫印跡來分 析。（e)將細胞用Akt抑制劑（20 μ Μ)或LY294002 (20 μ Μ)溫育，且細胞溶解產物通過 用所指示的抗體進行免疫印跡來分析。（f)將來自用HA-CYLD和Flag-Akt轉染的細胞的 溶解產物用抗-CYLD抗體（上部畫面）或抗-Akt抗體（下部畫面）免疫沉澱，且相互作用 蛋白通過免疫印跡進行分析。（g)將A549細胞用肺炎鏈球菌處理歷時在該圖中所指示的 各種時間，用兔抗-CYLD抗體和/或小鼠抗-Akt抗體染色，且在CYLD和Akt之間的體內蛋 白-蛋白相互作用使用Duolink體內蛋白-蛋白相互作用檢測試劑盒（Olink)用二次近接 式探針、抗-兔MINUS和抗小鼠-PLUS檢測。比例尺：10 μ m。（h)將細胞用肺炎鏈球菌或 媒介對照物處理。在細胞溶解產物中的Akt用抗-Akt抗體捕獲且相對於CYLD和Akt進行 免疫印跡。在b、c中的*P〈0. 05值為平均值土標準偏差（η = 3)。使用學生t-檢驗進行 統計數據分析。S. p.:肺炎鏈球菌。
[0029] 圖6圖示CYLD使K63-多聚泛素化Akt去泛素化以降低Smad3。（a)將來自用 HA-Ub WT、Flag-Akt WT、Flag-WT-CYLD 或 Flag-H/N-CYLD 共轉染的 A549 細胞的溶解產 物用抗-Akt抗體免疫沉澱且通過用所指示的抗體進行免疫印跡來分析。（b)將細胞用 Flag-Akt、HA-CYLD或siCYLD共轉染且用肺炎鏈球菌處理。Akt用Flag探針捕獲且相對於 泛素（Ub)、Akt和CYLD免疫印跡。（c)將用對照載體或Flag-WT-CYLD轉染的細胞用肺炎鏈 球菌處理，且細胞溶解產物用抗-Aktl抗體免疫沉澱並通過用所指示的抗體進行免疫印跡 來分析。（d)將使用siCYLD的CYLD-貧化細胞用肺炎鏈球菌處理，且在細胞溶解產物中的 Akt用抗-Akt抗體捕獲並相對於Ub、Akt和CYLD進行免疫印跡。（e)將來自用Flag-Akt WT、 Flag-WT-CYLD、HA-Ub WT、HA-Ub K63或HA-Ub K48共轉染的A549細胞的溶解產物用抗-Akt 抗體免疫沉澱且通過用所指示的抗體進行免疫印跡來分析。（f)將重組Aktl (His-rAktl) 在體外去泛素化測定緩衝液（BostonBiochem)中在有或沒有重組CYLD (GST-rCYLD)的情況 下用重組K63泛素（His-rUb-K63)溫育並通過用所指示的抗體進行免疫印跡來分析。（g) 將來自Cyld+/+和Cyld-/-小鼠的MEF細胞用Flag-Akt和HA-Ub K63共轉染，且用肺炎球 菌處理。在細胞溶解產物中的Akt用Flag探針捕獲且相對於Ub和Akt進行免疫印跡。（h) 將來自用 HA-Ub K63、Flag-Akt WT 或 Flag-Akt KR 突變體（K8R、K14R、K20R 或 K30R)共轉 染的細胞的溶解產物用抗-Flag探針進行免疫沉澱且通過用所指示的抗體進行免疫印跡 來分析。⑴在用TGF-β刺激的用WT-CYLD、Akt WT、Akt K14R或Akt K20R共轉染的A549 細胞中測定SBE-啟動子活性。在i中的*P〈0. 05、#P>0. 05值為平均值土標準偏差（η = 3)。使用學生t-檢驗進行統計數據分析。S.p.:肺炎鏈球菌。
[0030] 圖7為圖示CYLD在肺纖維化中的關鍵作用的圖解模型。一方面，在嚴重細菌感 染（例如，肺炎鏈球菌感染）後的肺損傷之後，胞外基質產生和組織恢復過程經由Smad3的 T β RII/I-介導的激活和GSK3 β -CHIP-介導的Smad3降解的Akt-依賴性抑制二者來引發。 另一方面，由肺炎鏈球菌誘發的CYLD通過使K63-多聚泛素化Akt去泛素化而抑制Akt,這 又引起GSK3 0的激活且促進了 CHIP-介導的Smad3降解，由此減弱了過度纖維化反應並預 防了肺纖維化（a)。Cyld的缺陷引起增強的Akt激活，這又引起抑制GSK3 0和CHIP-介導 的Smad3降解，由此促進了過度纖維化反應和組織纖維化（b)。ECM :胞外基質；T β RII/I : TGF-β受體II和I。

【具體實施方式】
[0031] 在過去的數十年間已經對於研發消炎劑花費了巨大的努力，大多數策略集中在直 接靶向正途徑（例如，包括I K B激酶（IKK)的那些）以阻遏炎症。雖然這些藥劑常顯示合 理的功效，但它們還展示出顯著的不良作用，諸如增加患者對感染的易感性和誘發細胞凋 亡。這些作用妨礙了進一步的臨床研發。因為在研發用於長期治療炎症病症而沒有顯著副 作用的療法方面的成功較為有限，所以仍然需要治療炎症及其它免疫有關疾病的方法。
[0032] 我們現在發現通過包括藥理學抑制炎症自己的負調節劑的各種策略而上調 CYLD(炎症的關鍵負調節劑）的表達為治療在許多病理學病狀中不想要的炎症提供了新方 法。此外，我們預期本文所述的策略不會引起在靶向於炎症的正調節劑時常見到的嚴重不 良反應。因此，本發明方法的一個優勢可以為維持患者的防禦反應。
[0033] 靶向CYLD :近來研究已經識別出CYLD(圓柱瘤蛋白）為細菌誘發炎症的關鍵的可 誘發負反饋調節劑（Sun, Nature Rev. Immunol.呈:501 ?511，2008 和 Wang 等，Cell. Mol. Immunol. 2:131?135, 2012)。CYLD為一種去泛素化酶，已經顯示其通過從多種特異性底物 中除去賴氨酸63-連接的多聚泛素鏈而充當包括TRAF6、NEMO和Akt的各種信號途徑的負 調節劑（Lim等，Nature Commun. 771，2012 ;Sun, Cell Death Differ. 17:25 ?34, 2010)。 CYLD的表達在生理條件下相對較低，但在呼吸系統中的細菌感染時顯著上調（Jono等， T. Biol. Chem. 279:36171 ?36174, 2004 :Lim 等，PLoS One 2, el032, 2007 ;和 Yoshida 等， T.Biol. Chem. 280:4111?41121，2005)。相比之下，也已經報導了 CYLD在腫瘤中的低表 達（Massoumi, Future Oncol. 285 ?297, 2011 ;和 Espinosa 等，Cancer Cell 18:268 ? 281，2010)。CYLD基因的結構（包括其序列和內含子-外顯子邊界）和所編碼去泛素化酶的 結構和功能是充分了解的。參見，例如Reiley等（J. Biol. Chem.55161?55167, 2004)。
[0034] 已經在呼吸性細菌感染、特別是由不可分型流感嗜血桿菌（NTHi)引起的感染中 廣泛研究了 CYLD，並且我們在如下所述的一些研究中使用了該模型系統。NTHi及其它助激 動劑可在感染組織中協同地誘發嚴重炎症，且CYLD負調節了在感染期間誘發的許多途徑。 例如，CYLD為在NF κ B的下調中涉及到的去泛素化酶。其含有結合到泛素且將其從目標蛋 白分開的泛素羧基-端水解酶。泛素，一種在所有真核細胞中存在的小調節蛋白，附著到其 它蛋白，引起它們的激活或降解。
[0035] 上調在受試者或生物體中CYLD的表達或活性可通過向受試者施用有效量的藥物 組合物來完成，該藥物組合物包含作為唯一活性成分或作為多種活性成分中的一種的上調 圓柱瘤蛋白（CYLD)基因的表達或所編碼的去泛素化酶的活性的藥劑。所述上調可通過施 用表達CYLD或下調CYLD的負調節劑（諸如，磷酸二酯酶4(PDE4(例如，TOE4B)或c-jun N-末端激酶2 (JNK2))的表達或活性的核酸構建體來完成。基因和/或蛋白質表達或活性 的降低在臨床有益的程度上減輕或預防了如本文所述的醫學病狀或其病徵或症狀。
[0036] 如上所述，可使用多種表達載體中的任一種來承載CYLD-編碼、TOE4B-抑制、 JNK2-抑制或Akt-調整核酸序列。該載體可例如為質粒、粘粒或病毒載體。表達可使用 標準控制元件如啟動子調節，其可能允許組成性活化或可誘發的表達。該啟動子也可為驅 動組織特異性表達的啟動子。除了該啟動子之外，該表達載體還可含有含有在宿主細胞中 (例如，在患者體內的受影響細胞中）核酸的表達所需要的另外元件中的任一種或所有的 轉錄單元或表達盒。典型的表達盒含有可操作性連接到編碼所要產物的核酸序列以及例如 轉錄本的有效聚腺苷酸化、轉錄終止、核糖體結合位點或翻譯終止所需要的信號的啟動子。 該構建體或盒的另外元件可包括增強子和外源性拼接的內含子信號。在本發明的情況下可 使用將核苷酸序列引入宿主細胞的熟知程序中的任一種。這些程序包括使用磷酸鈣轉染、 聚凝胺、原生質體融合、電穿孔、脂質體、顯微注射、裸DNA、質粒載體、病毒載體（附加型和 整合型兩種），和將克隆基因組DNA、cDNA、合成DNA或其它外來基因材料引入宿主細胞的 其它熟知方法中的任一種（參見，例如Sambrook等，〃Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 〃 第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ;和 Ausubel 等，''Current Protocols in Molecular Biology〃，John Wiley&Sons, New York, 1987 和定期更新）。可 選擇組織特異性啟動子以驅動在受本文所述的病狀之一影響的組織或細胞類型（例如，呼 吸系統、神經系統、心血管系統、生殖或生殖泌尿系統、胃腸系統、皮膚、結締組織或耳鼻喉 或竇）中的表達。
[0037] 關於將特異性結合併抑制TOE4B、JNK2或Akt的包括抗體的蛋白生物治療劑的制 造，存在類似的資料資源。在本發明組合物和方法中使用的抗-PDE4B、抗-JNK2或抗-Akt 抗體可為四聚抗體（例如，IgG (例如IgGl))、單鏈抗體、Fab片段或F (ab'）2片段。該抗體 也可為人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體。在本領域中熟知這些和類似改性的構造。
[0038] 不僅本發明的抗癌、消炎和抗纖維化策略適用於許多醫學病狀，而且我們還預期 它們可以使用而不會有在靶向於炎症的正調節劑時常見到的嚴重不良作用。
[0039] 本發明化合物中的任一種可沒有（S卩，它們可排除）調整炎症的正調節劑的藥劑。 類似地，本發明方法中的任一種（特定地，治療方法）可排除其中患者用調整炎症的正調 節劑的藥劑治療的步驟。例如，本發明的組合物可沒有類固醇（例如，糖皮質激素），沒有 NF κ B的抑制劑（例如，吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC))和/或沒有磷酸酶PAC-I的抑制 齊[J，且本發明的治療方法可沒有如下步驟，其中將類固醇、NFk B和/或PAC-I的抑制劑施 用到受試者。
[0040] 在諸如OM的感染性疾病中，細菌誘發的炎症是為了根除病原體的必要身體反應。 然而，如果不受控制的話，過度和/或延長的炎症由於由此引起的嚴重組織損壞而對宿主 有害。因此，必須緊密地調節炎症。
[0041] 在一個實施方式中，所述上調通過向有需要的受試者或患者引入上調CYLD的表 達的以表達CYLD的核酸構建體或其生物活性變體（例如，其生物活性片段或其替換突變 體）形式的藥劑來實現。
[0042] 靶向TOE4或JNK2 :在另一實施方式中，本發明提供了通過經由施用磷酸二酯酶 4(PDE4)的抑制劑或c-jun N-末端激酶2(JNK2)的抑制劑上調CYLD來治療炎性病狀的方 法。又一方面，該TOE4的抑制劑為對同種型TOE4B具有特異性（或選擇性）的抑制劑，例 如將抑制Η)Ε4Β (例如，PDE4B1、TOE4B2、TOE4B3或TOE4B4)、而不會在任何顯著程度上抑 制另一同種型（例如，TOE4D，諸如TOE4D1?TOE4D9)的抑制劑。本領域的普通技術人員 將理解在各種磷酸二酯酶之間的結構和功能差別且關於該家族可查閱許多出版物（例如， Halpin, Int. J. of COPD 3(4) :543 ?561，2008)。
[0043] 本發明人已經確定磷酸二酯酶4 (PDE4)經由抑制CYLD (0M炎症的關鍵負調節劑） 而在介導炎症中起關鍵作用，且因此提供了緊密調節炎症和用於其的治療劑的目標的重要 見解。在哺乳動物中PDE超家族包含11個亞族，即TOEl?TOE11。它們充當細胞反應的重 要正調節劑和負調節劑。至今，在臨床上已經成功地研發了作為藥物的許多PDE抑制劑，例 如用於勃起功能障礙的Viagra? (靶向TOE5)和用於哮喘和COro的羅氟司特（靶向TOE4)。 然而，可用的非特異性TOE4抑制劑（靶向所有四種亞族成員A?D)由於它們對TOE4D的 抑制而展示出無法忍受的不良作用，例如嘔吐。此外，PDE4D的抑制導致生長受損。因此， 識別Η)Ε4Β，而不是TOE4D為用於炎症的關鍵調節劑和治療目標提供了對於選擇性且特異 性地靶向TOE4B、而不是TOE4D的更可耐受的消炎劑、用於治療炎性疾病的治療目標。
[0044] 已知可用的TOE4B抑制劑的實例包括咯利普蘭、羅氟司特和西洛司特。羅氟司特 例如為TOE4B的強效且更特異性的抑制劑，且目前臨床上可用於治療哮喘和C0PD。
[0045] 其它有用的抑制劑為在WO 2007/142929(其全部內容通過引用結合到本文中來） 中描述的那些。這些抑制劑包括被取代的苯或包含一個或兩個環氮的被取代的6元雜芳基 環，該取代包括醚、硫醚或胺基團，其中在該醚、硫醚或胺上的烷基為滷烷基。該滷烷基可為 氟甲基、二氟甲基或三氟甲基。
[0046] 另外，研究已經顯示兩種主要的MAP激酶JNK家族成員JNKl和JNK2在包括中耳 的各種人類組織中泛表達，而JNK3在神經元中選擇性地表達。傳統上認為JNKl和JNK2在 功能上是多餘的，但近代研究顯示它們被選擇性地激活且起到不同的功能性作用。然而，在 該選擇性激活下面的機制尚不明確。本發明人已經發現Η)Ε4(特別是TOE4B)選擇性地激 活JNK2,而不激活JNKl。識別JNK2、而不是JNKl在通過抑制CYLD介導PDE4B-介導的炎症 中的作用提供了用選擇性JNK2抑制劑處理的另一治療目標，從而阻遏OM炎症，且使由JNKl 的並存抑制引起的不良副作用如細胞生長最小化。
[0047] 如所提到的，TOE4的抑制劑可為抑制TOE4B、但不顯著抑制另一 TOE4-家族成員 (例如，PDE4D)的抑制劑。為了選擇性地抑制TOE4B，可施用抑制TOE4B基因表達的核酸（例 如，核酸構建體）。該核酸在本領域中已知且包括反義寡聚核苷酸、微RNA和介導RNAi (例 如，siRNA和shRNA)的核酸。
[0048] 在本發明的組合物和方法中上調CYLD的表達的藥劑可為JNK2的抑制劑。例如， 該JNK2的抑制劑可為JNK相互作用蛋白（JIP)或其肽片段，任選與細胞滲透肽TAT (如例 如在Kaoud等（ACS Chem. Biol. 6:658?666, 2011)中所述）或2, 4-二氨基嘧啶（如例如 在Song等（Med Chem. Commun 2:238?243, 2012)中所述）相連。JNK2的抑制劑還可為抑 制JNK2基因表達的核酸。
[0049] 在本發明的組合物包含小分子（化合物）時，所述組合物可包含該分子或化合物 或其"可藥用的鹽"。我們使用該術語以指代保持它們的生物效應且並不屬於生物學或另外 不合需要的如本文所述的化合物的鹽。所述可藥用的鹼加成鹽可由無機鹼和有機鹼製備。 衍生自無機鹼的鹽包括（僅舉例而言）鈉、鉀、鋰、銨、鈣和鎂鹽。衍生自有機鹼的鹽包括但 不限於以下各物的鹽：伯胺、仲胺和叔胺，諸如烷基胺、二烷基胺、三烷基胺、被取代的烷基 胺、二（被取代的烷基）胺、三（被取代的烷基）胺、烯基胺、二烯基胺、三烯基胺、被取代的 烯基胺、二（被取代的烯基）胺、三（被取代的烯基）胺、環烷基胺、二（環烷基）胺、三（環 烷基）胺、被取代的環烷基胺、二取代的環烷基胺、三取代的環烷基胺、環烯基胺、二（環烯 基）胺、三（環烯基）胺、被取代的環烯基胺、二取代的環烯基胺、三取代的環烯基胺、芳基 胺、二芳基胺等。該鹽也可為酸加成鹽。
[0050] 本發明特徵性描述了治療罹患與炎症相關的醫學病狀的患者（或受試者）的方 法。該方法包括向該患者施用治療有效量的包含下調Akt基因的表達或抑制所編碼激酶的 活性的藥劑的藥物組合物。該病狀包括但不限於：（1)生殖器官的炎症（例如，前列腺炎、 盆腔炎或引起生殖器官的炎症的感染疾病）；（2)自身免疫性疾病，尤其是牛皮癬或類風溼 性關節炎；或（3)上或下呼吸道疾病或病狀，諸如中耳炎、鼻炎、竇炎或引起耳、鼻、鼻道或 喉嚨的炎症的感染疾病。
[0051] 如上所述，該方法涵蓋了包括嬰兒和兒童的多種受試者的治療。下調Akt基因的 表達的藥劑可為抑制Akt基因的核酸（例如，反義寡聚核苷酸、微RNA或介導RNAi的核 酸）。在一個實施方式中，抑制所編碼激酶的活性的該藥劑可為表達使Akt去泛素化的酶 (例如，酶CYLD)的核酸構建體。在另一實施方式中，抑制所編碼激酶的活性的該藥劑可為 VQD-002、哌立福新或米替福新。如所提到的，在耳病的情況下，該藥物組合物可配製用於耳 局部施用。
[0052] 中耳炎為服從如本文所述的治療的病狀。在一個實施方式中，本發明提供了治療 罹患與耳、鼻、鼻道或喉嚨的炎症相關的醫學病狀的患者的方法，且包括向該患者施用治療 有效量的包含上調圓柱瘤蛋白（CYLD)基因的表達或所編碼去泛素化酶CYLD的活性的藥劑 的藥物組合物。該方法可引起炎症或另一症狀降低。例如，在治療中耳炎中，本發明方法還 可降低中耳的黏膜增厚和中耳黏膜中的多形核中性粒細胞（PMN)浸潤。
[0053] 服從如本文所述的治療的病狀包括引起中耳炎、鼻炎、竇炎的上呼吸道感染或導 致耳、鼻、鼻道（或其部分）、喉嚨或肺的炎症的感染疾病。該感染疾病可與細菌或病毒病原 體（例如，鏈球菌屬的細菌（例如，肺炎鏈球菌，有時稱作肺炎球菌，或產膿鏈球菌）或病毒 (例如，呼吸道合胞病毒或流感病毒）相關。
[0054] 在一個特定的實施方式中，該病狀為中耳炎（OM)，其為中耳的感染，常由用不可分 型的流感嗜血桿菌（NTHi)的感染引起。中耳炎為最常見的兒童細菌感染並且為兒童的傳 導性聽力損失的主要原因。在美國，每年有2450萬就診者因 OM而到醫師診室就診。為了 護理0M，每年花費超過50億美元。約10%的急性OM發展成慢性0M，這是美國兒童的傳導 性聽力損失的主要原因。因為OM導致在說話和語言開發的關鍵期間的聽力損失，由於頻繁 中耳感染而具有早期聽力損傷的兒童隨後可能罹患說話和語言障礙。儘管顯然需要預防措 施，但研發用於OM的高效疫苗仍然是一項挑戰。此外，OM的不當抗生素治療明顯具有增加 的抗生素抗性。由於OM的高度流行、其長期後遺症和總體社會成本，NIH/NIDCD已經將OM 指定為重要的研究領域。
[0055] 目前，由於對於OM的分子致病原因了解不足，尚沒有可用於治療OM的有效治療 齊[J。炎症是OM的一個特徵。然而，尚沒有可用於治療在OM中的過度炎性反應的不良結果 的有效治療劑，包括消炎劑，且至今，在很大程度上不知道在OM中如何緊密調節炎症。
[0056] 本發明現在提供了對於在OM中的炎性反應的負反饋調節的見解，且提供了上調 作為炎症的關鍵負調節劑的CYLD的表達以調整或降低在OM患者中的過度或延長的炎性反 應，由此預防或抑制由炎性過程引起的其它組織損壞的方法。
[0057] 另外，識別作為在OM中的炎症的關鍵調節劑和特異性治療目標的TOE4B在OM的 治療中提供了新的及現有藥物的獨特目標，同時避免了消炎的先前目標的不良作用。另外， 在OM的治療中臨床有用的TOE4抑制劑羅氟司特等的耳局部施用通過使由全身性施用引起 的副作用最小化也是有利的。
[0058] 在需要用於治療影響耳的病狀的藥物組合物的任何方法中，可將該組合物配製成 用於耳局部施用。
[0059] OM病理不限於由不可分型的流感嗜血桿菌（NTHi)所誘發的；實際上，我們的資料 顯示TOE4在調節通過肺炎鏈球菌（另一主要OM病原體）誘發的OM和由LPS和TNF- α誘 發的炎症中也起到關鍵作用。因此，本發明也適用於這些病理和臨床情形。
[0060] 呼吸相關病狀。肺損傷代表了全世界發病率和死亡率的一個主要原因。諸如感染 劑和苛性化學物的有害刺激物引發了複雜且動態系列的宿主傷口癒合反應。在嚴重肺炎鏈 球菌感染的早期，肺炎球菌溶血素誘發了急性肺損傷（ALI)和致死。作為關鍵宿主反應，1 型纖溶酶原激活物抑制劑（PAI-I)由肺炎鏈球菌上調，其通過預防肺泡出血1而預防ALI。 諸如上調的PAI-I產生的適當宿主反應因此對於修復受損的肺組織和恢復其功能是關鍵 的。然而，如果不受控制，過度的PAI-I將經由胞外基質在組織中的增強積聚而對組織重塑 過程具有不良作用。因此，在整個宿主傷口癒合過程期間必須緊密且動態地調節PAI-I表 達。我們先前發現去泛素化酶CYLD通過阻遏其Ρ38ΜΡΚ-依賴性表達而在預防PAI-I的 過度產生中具有關鍵作用。然而，在致命的肺炎鏈球菌感染期間，肺炎球菌溶血素的過度 釋放引起嚴重的肺損傷，其壓倒了可用的PAI-I的保護作用，由此引起致死。有趣的是，在 Cyld-缺陷小鼠中的CYLD缺陷引起了 PAI-I的過度產生，因此提供了對於致死的有效預防。 因此，我們先前的研究證明CYLD為在感染早期期間對於宿主存活的關鍵負調節劑，因為與 野生型（WT)小鼠相比較，Cyld-缺陷小鼠具有高得多的存活率。因為不受控制且過度的傷 口癒合反應如過度的PAI-I產生可引起肺纖維化，所以我們假設經受致命的肺炎鏈球菌感 染而存活的Cyld-缺陷小鼠可發展肺纖維化，且在細菌感染的晚期期間，CYLD因此可充當 傷口癒合過程的關鍵調節劑。在如下所述的研究中，我們顯示CYLD通過抑制轉化生長因 子-β (TGF-β)-信號傳導而充當了對於損傷誘發的纖維化反應的關鍵負調節劑。我們進 一步顯示CYLD通過以糖原合酶激酶3-β (GSK3i3)-Hsc70-相互作用蛋白（CHIP)依賴性方 式降低Smad3蛋白的穩定性而抑制了 TGF-β信號傳導。有趣的是，CYLD通過使K63-多聚 泛素化Akt直接去泛素化而降低了 Smad3穩定性。這些研究帶來了對於CYLD在調節纖維 化中的新穎作用的新的見解且支持了方法針對識別用於治療這些疾病的新治療目標。
[0061] 肺損傷（不管是由感染誘發，還是由苛性化學品誘發）引發了一系列複雜的傷口 癒合反應。如果不受控制，這些反應則可引起肺纖維化疾病和功能喪失。因此，必須緊密調 節肺損傷的消退。緊密控制肺損傷的消散的關鍵調節蛋白還有待識別。我們已經顯示在用 肺炎鏈球菌感染之後，去泛素化酶CYLD的損失引起小鼠的肺纖維化的發展。CYLD通過以 Hsc70-相互作用蛋白的E3連接酶羧基端點依賴性方式降低Smad3的穩定性而抑制了轉化 生長因子-β -信號傳導並預防了肺纖維化。此外，CYLD通過使K63-多聚泛素化Akt去泛 素化而降低了 Smad3穩定性。總之，我們的結果揭露CYLD通過使Akt去泛素化而緊密調節 肺損傷的消散並預防纖維化的作用。這些研究可有助於研發用於預防肺纖維化的新治療策 略。
[0062] 肺損傷代表全世界發病率和死亡率的一個主要原因。諸如感染劑和苛性化學物 的有害刺激物引發了複雜且動態系列的宿主傷口癒合反應。在嚴重肺炎鏈球菌感染的早 期期間，肺炎球菌溶血素誘發了急性肺損傷（ALI)和致死。作為關鍵宿主反應，1型纖溶酶 原激活物抑制劑（PAI-I)由肺炎鏈球菌上調，其通過預防肺泡出血而預防ALI。諸如上調 的PAI-I產生的適當宿主反應因此對於修復受損的肺組織和恢復其功能是關鍵的。然而， 如果不受控制，過度的PAI-I將經由胞外基質在組織中的增強積聚而對組織重塑過程具有 不良作用。因此，在整個宿主傷口癒合過程期間必須緊密且動態地調節PAI-I表達。我們 先前發現去泛素化酶CYLD通過阻遏其P38MAPK-依賴性表達而在預防PAI-I的過度產生 中具有關鍵作用。然而，在致命的肺炎鏈球菌感染期間，肺炎球菌溶血素的過度釋放引起 嚴重的肺損傷，其壓倒了可用的PAI-I的保護作用，由此引起致死。有趣的是，在Cyld-缺 陷小鼠中的CYLD缺陷引起PAI-I的過度產生，因此提供了對於致死的有效預防。因此，我 們先前的研究證明在感染的早期期間CYLD為宿主存活率的關鍵負調節劑，因為與野生型 (WT)小鼠相比較，Cyld-缺陷小鼠具有高得多的存活率。因為不受控制且過度的傷口癒合 反應如過度的PAI-I產生可引起纖維化，所以我們假設經受致命的肺炎鏈球菌感染而存活 的Cyld-缺陷小鼠可發展出肺纖維化，且在細菌感染的晚期期間，CYLD因此可充當傷口愈 合過程的關鍵調節劑。在此，我們顯示CYLD通過抑制轉化生長因子-β (TGF-β)-信號傳 導而充當用於損傷誘發的纖維化反應的關鍵負調節劑。我們進一步顯示CYLD經由以糖原 合酶激酶3-β (GSK3i3)-Hsc70-相互作用蛋白（CHIP)依賴性方式降低Smad3蛋白的穩定 性而抑制TGF-β信號傳導。有趣的是，CYLD通過使K63-多聚泛素化Akt(也稱作蛋白激 酶B或PKB)直接去泛素化而降低Smad3穩定性。這些研究發現了 CYLD在調節纖維化中的 獨特作用且允許識別用於治療這些疾病的新治療劑。
[0063] 可根據本發明治療的其它呼吸疾病、性狀（trait)和病狀包括但不限於C0PD、哮 喘、嗜酸性咳嗽、支氣管炎、結節病、肺纖維化、鼻炎、竇炎和/或與在受試者或生物體中的 過度炎性活性相關的其它疾病狀態。
[0064] 服從治療的其它病狀：本發明預期並涵蓋通過施用包含TOE4B的選擇性抑制劑 (例如，核酸，經由序列特異性相互作用，特別地抑制PDE4B的表達）的如本文所述的組合物 而治療多種病狀的方法。可治療的病狀包括癌症、炎症和纖維化。在特定的實施方式中，用 如本文所述的組合物治療的病狀可與在耳（單或雙）、鼻或喉嚨中的炎症或粘液生產過剩 相關，並且還可影響鼻道、在呼吸系統內的另一區域或組織（例如，肺或支氣管樹）或竇腔 或從竇腔延伸的通道。例如，該病狀可為間質性肺病、人類纖維化肺病（例如，特發性肺纖 維化（IPF)、囊性纖維化、呼吸窘迫症候群（成人（ARDS)或嬰兒）、肺病中的腫瘤基質、全身 性硬化、Hermansky-Pudlak症候群（HPS)、煤礦工人塵肺（CWP)、慢性肺動脈高血壓、AIDS相 關的肺動脈高血壓等、哮喘、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺病（COPD)、咳嗽（例如，嗜酸性咳 嗽）、肺纖維化、鼻炎（例如，過敏性鼻炎）、竇炎或中耳炎。在其它實施方式中，用如本文所 述的組合物治療的病狀可為人類腎病。例如，患者可具有腎病症候群、阿爾波特氏症候群、 HIV相關的腎病、多囊性腎病、法布裡病、糖尿病性或其它腎病、腎小球性腎炎（例如，慢性 腎小球性腎炎）或與全身性狼瘡相關的腎炎。如所提到的，本發明的組合物可有效抵抗纖 維化，包括在肝（肝纖維化）、心臟（心肌纖維化）和生殖系統（子宮內膜纖維化）中的纖 維化病狀。在涉及到肝時，可治療的病狀還包括肝炎（不管是由病毒藥劑、自身免疫疾病、 還是由濫用藥品引起）、肝性脂肪變性和肝硬化。在其它實施方式中，用如本文所述的組合 物治療的病狀可為心血管疾病，包括動脈再狹窄和動脈粥樣硬化或心肌的再灌注損傷。在 其它實施方式中，用如本文所述的組合物治療的病狀可為癌症，且本發明的組合物可用以 阻止腫瘤生長和/或轉移。可服從治療的特定癌症包括硬皮病、在Li-Fraumeni症候群中的 膠質母細胞瘤、散發性膠質母細胞瘤、骨髓性白血病、急性髓性白血病、脊髓發育不良綜合 徵、骨髓增生性症候群，癌症如乳癌、肺癌、結腸癌（例如，Lynch症候群）、前列腺癌或婦科 癌症（例如，卵巢或子宮癌）和皮膚癌（例如，黑素瘤或卡波西肉瘤）。除了皮膚癌或惡性 增殖性皮膚病之外，本發明的組合物可用於治療嗜酸粒細胞肉芽腫、其它良性皮膚病如特 異性皮炎（一種溼疹）和蕁麻疹（通常稱為蕁麻診Olives))和疤痕。在另一實施方式中， 本發明的組合物和方法可施用到表現出組織變形的患者，該組織變形通常被理解為響應在 周圍或慢性刺激中的改變而出現的良性改變。例如，在患者呼吸道內的細胞和組織可響應 煙氣（例如，從菸草產品如雪茄或香菸吸入的煙氣）而表現出組織變形。雖然本發明不受此 限制，但在這種情況下，刺激劑可促使加襯氣管的粘液分泌纖毛假復層柱狀呼吸上皮細胞 被復層扁平上皮替代。如所提到的，本發明的組合物可有效抵抗炎性病狀，包括影響胃腸道 的那些病狀。這些病狀包括炎性腸病（例如，潰瘍性結腸炎或克羅恩氏病），且本發明的組 合物也可用於治療胃酸的分泌亢進。在其它實施方式中，用如本文所述的組合物治療的病 狀可為神經病症或對神經系統（例如，外周或中樞神經系統）的損傷。例如，該病狀可為腦 的再灌注損傷、抑鬱症、記憶障礙、單極性抑鬱症、帕金森病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓氏病、 脊髓創傷、顱腦損傷、神經原性炎症或疼痛。日益證明神經降解性病徵和損傷具有重要的炎 性組分，且該病症或損傷可用如本文所述的組合物治療。在其它實施方式中，用如本文所述 的組合物治療的病狀可為自身免疫病症，諸如多發性硬化、類風溼性關節炎、Grave氏眼病、 牛皮癬或尿崩症。也可治療移植排斥和移植抗宿主病。在其它實施方式中，用如本文所述 的組合物治療的病狀可為與細菌或病毒病原體相關的感染疾病。例如，該病狀可為由鏈球 菌屬的細菌（例如，肺炎鏈球菌，有時稱為肺炎球菌或產膿鏈球菌）、不可分型流感嗜血杆 菌（NTHi)或綠膿桿菌引起的感染疾病。其它可治療的感染疾病與病毒（例如，呼吸道合胞 病毒或流感病毒）相關。還可治療漢森氏病、細菌、真菌或病毒誘發的膿毒症或膿毒性休克 (內毒素休克）。在其它實施方式中，用如本文所述的組合物治療的病狀可影響生殖或泌尿 生殖組織或器官。例如，該患者可為罹患與生殖器官的炎症相關的醫學病狀（例如，前列腺 炎、盆腔炎或引起生殖組織或器官的炎症的感染疾病）的患者。在其它實施方式中，用如本 文所述的組合物治療的病狀可影響骨骼肌肉系統。例如，患者可罹患炎症性關節炎、骨關節 炎、骨質疏鬆、炎症和細胞因子介導的慢性組織變性、肌肉耗損、惡病質或關節強硬性脊椎 炎。在其它實施方式中，用如本文所述的組合物治療的病狀可為藥物誘發的麥角中毒、過敏 性結膜炎、春季結膜炎、肥胖症或胰腺炎。
[0065] 在一個實施方式中，本發明特徵性描述了治療罹患與生殖器官的炎症相關的醫學 病狀（例如，前列腺炎、盆腔炎或引起生殖生殖器官的炎症的感染疾病）的患者的方法。所 述方法可通過對該患者施用治療有效量的包含上調圓柱瘤蛋白（CYLD)基因的表達或所編 碼去泛素化酶的活性的藥劑的藥物組合物來進行。所述藥劑可為上述的那些。或者或另 夕卜，該患者群體也可用治療有效量的包含下調Akt基因的表達或抑制所編碼激酶的活性的 藥劑的藥物組合物治療。
[0066] 另一方面，本發明特徵性描述了治療罹患自身免疫性疾病、尤其是牛皮癬或類風 溼性關節炎的患者的方法。所述方法包括對該患者施用治療有效量的包含上調圓柱瘤蛋白 (CYLD)基因的表達或所編碼去泛素化酶的活性的藥劑的藥物組合物。在這些方法中，在上 文和本文中的其它地方描述的任何藥劑都可配製成適合施用。因為牛皮癬影響皮膚，所以 旨在治療該病狀的製劑可為局部的。另外，且如所提到的，這些方法可使用抑制TOE4B、但不 顯著抑制另一 Η)Ε4-家族成員（例如，TOE4D)的TOE4抑制劑進行。這些選擇性抑制劑可 為使用本領域已知的方法設計以產生序列特異性靶向分子（例如，反義寡聚核苷酸、微RNA 和介導RNAi (例如，siRNA和shRNA)的核酸）的核酸（例如，核酸構建體）。在另一實施方 式中，上調CYLD的表達的藥劑可為JNK2的抑制劑。
[0067] 在另一實施方式中，本發明特徵性描述了通過對罹患自身免疫性疾病、尤其是牛 皮癬或類風溼性關節炎的患者施用治療有效量的包含下調Akt基因的表達或抑制所編碼 激酶的活性的藥劑的藥物組合物來治療該患者的方法。
[0068] 在另一實施方式中，本發明特徵性描述了治療肥胖症的患者的方法。所述方法可 包括對該患者施用治療有效量的包含上調圓柱瘤蛋白（CYLD)基因的表達或所編碼去泛素 化酶的活性的藥劑的藥物組合物的步驟。可用於治療肥胖症的藥劑包括本文所述的那些藥 劑中的任一種。例如，這些方法可使用抑制TOE4B、但不顯著抑制另一 TOE4-家族成員（例 如，TOE4D)的TOE4抑制劑進行。例如，可設計反義寡聚核苷酸、微RNA或介導RNAi (例如， siRNA或shRNA)的核酸。在另一實施方式中，上調CYLD的表達的該藥劑可為JNK2的抑制 齊U。在另一實施方式中，可施用治療有效量的包含下調Akt基因的表達或抑制所編碼激酶 的活性的藥劑的藥物組合物。
[0069] 本發明的化合物可用於預防或治療多種人類或其它動物，包括哺乳動物和非哺乳 動物的病症，主要包括炎性病症及其它免疫有關疾病。預期本發明的活性分子如選擇性地 抑制TOE4B表達的核酸可在使用前併入任何合適的載體中。活性分子的劑量、施用模式和 合適載體的使用將取決於預定的受體和目標病症。根據本發明的抑制劑的用於獸醫用途和 用於人類醫療用途兩者的製劑通常包含與可藥用的載體相關的所述抑制劑。
[0070] 根據本發明的活性成分為用以上調CYLD的化合物且可為以下各物中的一種或多 種：（I) TOE4抑制劑（特別地，PDE4B抑制劑）；（2) JNK2的抑制劑；（3) Akt抑制劑；其可為核 酸（諸如反義寡聚核苷酸、微RNA和介導RNAi的核酸）或有機小分子化合物。如果需要， 本發明的活性劑則可在單一製劑中與其它治療化合物組合。
[0071] 製劑和劑量：本發明的藥物組合物的治療有效量將取決於許多因素。例如，患者的 人種、年齡和體重、需要治療的精確病狀及其嚴重性和製劑的性質為本領域的技術人員所 考慮並理解的所有因素。施用量還可能取決於其它變量，諸如所遞送的活性醫藥劑的相對 生物功效、在製劑中的賦形劑的存在和類型及施用路徑。並且，應該理解初始施用劑量可增 加到超出上述上限以快速地達到所要的血液水平或組織水平，或該初始劑量可小於最佳劑 量且日劑量可在治療過程期間根據特定的情形而逐漸增加。如果需要，日劑量則也可分成 多個劑量以便施用，例如每日施用2?4次。最終指定的治療有效量將按照主治醫師或獸 醫的判斷而不同。對於可在本發明中使用的治療劑，其中的至少一些在本領域中已知，在本 文所述的病狀的情況下施用的量可根據預先成功使用的量來指導。在治療癌症、炎症、纖維 化或本文所述的任何特定病狀的治療用途中，藥物組合物將以足以獲得並維持活性劑在經 歷將是有效的治療的動物中的濃度（即，量、血液水平或組織水平）的劑量經口、腸胃外和 /或局部地施用。通常，該活性劑的劑量的有效量將在約0. 1?約l〇〇mg/kg體重/天的範 圍內，更優選在約I. 0?約50mg/kg體重/天的範圍內。
[0072] 如下文進一步描述地，本文所述的治療劑可與一種或多種可藥用的載體、稀釋劑 或賦形劑組合，它們在與製劑的其它成分相容及不損害所治療的患者的意義上是"可用 的"。
[0073] 所述製劑可以以劑量單位形式（有時也稱作"單位劑型"）方便地存在且可通 過在製藥領域中熟知的任何方法製備。通常，一些製劑可通過使醫藥劑與液態載體或 細分散的固態載體或兩者結合且隨後如果需要的話，則將產物成型為所要的製劑來制 備。用於施用的組合物可通過醫藥領域中熟知、例如描述在雷明頓藥物學（Remington's Pharmaceutical Sciences), (Gennaro, Α·編），Mack Pub. (1990)中的任何方法製備。單位 劑型可根據所治療的病狀、施用路徑和患者的年齡、重量和病狀而包含作為非限制性實例 的0. 5mg?Ig的如本文所述的治療劑。典型的單位劑量製劑為含有日劑量或亞劑量或其 適當部分的活性成分的那些。
[0074] 本發明的藥物組合物應該配製成與其預定施用路徑相容。施用路徑的實例包括經 口或腸胃外施用，例如靜脈內、皮內、吸入、經皮（局部）、經黏膜、耳局部和直腸施用。用於 腸胃外、皮內或皮下施用的溶液或混懸劑可包含以下組分：無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽 水溶液、固定油類、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑，諸如苄醇或對羥基苯 甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；緩衝劑，諸 如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；和用於調節張力的試劑，諸如氯化鈉或右旋糖。pH可用諸如 鹽酸或氫氧化鈉的酸或鹼調節。
[0075] 醫藥製劑可適合通過任何適當的路徑，例如通過經口（包括頰或舌下）、直腸、鼻、 局部（包括頰、舌下或經皮）、陰道或腸胃外（包括皮下、肌肉內、靜脈內或皮內）路徑施用。 所述製劑可通過在製藥領域已知的任何方法製備，例如通過使活性成分與載體或賦形劑結 合來製備。例如，但並未想要限制本發明，關於認為可使用本發明的化合物的某些病狀和病 症，某些路徑將比其它路徑更優選。
[0076] 適合口服的醫藥製劑可提供為離散單位，諸如膠囊或片劑；粉末劑或顆粒劑；溶 液或混懸劑，其各自具有水性和非水性液體；可食用的泡沫體或氣泡體；或水包油液體乳 液或油包水液體乳液。例如，為了以片劑或膠囊形式口服，可將活性藥物組分與諸如乙醇、 甘油、水等經口無毒的可藥用的惰性載體組合。通常，粉末劑通過將化合物粉碎成合適的細 小尺寸並將其與諸如可食用的碳水化合物如澱粉或甘露糖醇的適當藥用載體混合來製備。 也可存在調味劑、防腐劑、分散劑和著色劑。
[0077] 膠囊可通過製備粉末、液體或懸浮液混合物並將其用明膠或其它適當的殼材料封 裝而製得。在封裝之前可將諸如膠體氧化矽、滑石粉、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣或固態聚乙二醇 的助流劑和潤滑劑加到該混合物中。當攝取膠囊時，還可加入諸如瓊脂、碳酸鈣或碳酸鈉的 崩解或增溶劑以改善藥物的利用率。此外，當希望或需要時，也可將合適的粘合劑、潤滑劑、 崩解劑和著色劑併入該混合物中。合適粘合劑的實例包括澱粉、明膠、諸如葡萄糖或β_乳 糖的天然糖、玉米甜味劑、諸如阿拉伯膠、黃蓍膠或海藻酸鈉的天然和合成樹膠、羧甲基纖 維素、聚乙二醇、石蠟等。
[0078] 可用於這些劑型的潤滑劑例如包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸 鈉、氯化鈉等。崩解劑包括而不限於澱粉、甲基纖維素、瓊脂、斑脫土、黃原膠等。
[0079] 片劑可例如通過製備粉末混合物、將其制粒或段塞（slugging)、加入潤滑劑和崩 解劑和壓製成片劑來配製。粉末混合物可通過混合適當粉碎的化合物與如上所述的稀釋劑 或基質來製備。任選的成分包括粘合劑，諸如羧甲基纖維素、海藻酸鹽、明膠或聚乙烯基吡 咯烷酮；溶解延遲劑，諸如石蠟；再吸收加速劑，諸如季鹽；和/或吸收劑，諸如斑脫土、高嶺 土或磷酸二鈣。該粉末混合物可用諸如糊漿、澱粉糊、阿卡迪亞膠漿或纖維素或聚合材料的 溶液溼式制粒並推動使其穿過篩子。作為制粒的替代，可使粉末混合物穿過壓片機且結果 為分成顆粒劑的不完全形成的段塞塊（slug)。顆粒劑可藉助於加入硬脂酸、硬脂酸鹽、滑石 粉或礦物油而潤滑以防止粘到片劑形成模。隨後將潤滑的混合物壓縮成片劑。本發明的化 合物也可與易流動的惰性載體組合併在不經歷制粒或段塞步驟的情況下直接壓縮成片劑。 可提供由蟲膠封閉塗層、糖或聚合材料的塗層和石蠟的拋光塗層組成的透明或不透明的保 護塗層。可將染料加到這些塗層中以區分不同的單位劑量。
[0080] 在適當的情況下，可將用於口服的劑量單位製劑微封裝。該製劑也可製備成例如 通過在聚合物、石蠟等中塗布或嵌入微粒材料而延長或減緩釋放。
[0081] 諸如溶液、糊漿和酏劑的口服流體可以以劑量單位形式製備，使得指定的量含有 預定量的化合物。糊漿可例如通過將化合物溶解在合適調味的水溶液中來製備，而酏劑經 由使用無毒的醇媒劑來製備。混懸劑可通常通過將化合物分散在無毒媒劑中來配製。也可 加入增溶劑和乳化劑，諸如乙氧化異十八醇和聚氧乙烯山梨糖醇醚；防腐劑；調味添加劑， 諸如洋薄荷油或天然甜味劑、糖精或其它人工甜味劑；等。
[0082] 所述醫藥溶液製劑的合適包裝可為旨在用於腸胃外用途的所有批准的容器，諸如 塑料和玻璃容器、備用的注射器等。在一個實施方式中，該容器為密封的玻璃容器，諸如小 瓶或安瓿。氣密玻璃小瓶為密封的玻璃容器的一個實例。根據本發明的一個實施方式，提 供了在密封玻璃容器中的包含可生理學上使用的溶劑中的本發明化合物且具有利於穩定 性的適當PH的無菌可注射溶液。本發明化合物的酸式鹽可比其游離鹼配對物更易溶於水 溶液中，但當將酸式鹽加到水溶液中時，溶液的pH可能太低而不適合施用。因此，具有高於 pH 4. 5的pH的溶液製劑可在施用之前與pH大於7的稀釋溶液組合，使得所施用的組合制 劑的pH為pH 4. 5以上。在一個實施方式中，該稀釋溶液包含可藥用的鹼,諸如氫氧化鈉,且 所施用的組合製劑的pH為pH 5. 0?7. 0。在使溶液穿過殺菌過濾器之前可將諸如例如先 前規定種類的助增溶劑、張力調節劑、穩定劑和防腐劑的一種或多種其它組分加到溶液中。 [0083] 可將適合局部施用的醫藥製劑配製為軟膏、乳膏、混懸液、洗劑、粉末劑、溶液、糊 齊IJ、凝膠劑、噴霧劑、氣溶膠或油劑。
[0084] 為了治療眼睛或例如口或皮膚的其它外部組織，可將製劑施用為局部軟膏或乳 膏。當配製為軟膏時，活性成分可與石蠟或水可混溶的軟膏基質一起使用。或者，活性成分 可與水包油軟膏基質或油包水基質一起配製在乳膏中。適合局部施用到眼睛的醫藥製劑包 括滴眼劑，其中活性成分溶解或懸浮在合適載體、特別是水性溶劑中。
[0085] 適合在口中局部施用的醫藥製劑包括錠劑、軟錠劑和嗽口水。
[0086] 適合鼻施用的醫藥製劑包括具有例如在20?500微米範圍內的粒度的粗粉，其中 載體為固體。該粉末以接受鼻煙，即通過從保持緊挨著鼻的粉末的容器經鼻道迅速吸入的 方式施用。適合作為鼻噴霧劑或作為滴鼻劑施用的製劑包含活性成分的水性或油性溶液， 其中載體為液體。
[0087] 適合通過吸入施用的醫藥製劑包括細粒粉劑或煙霧劑，其可藉助於各種類型的計 入劑量加壓氣溶膠、噴霧器或吹入器產生。
[0088] 另外，本發明的組合物還可以用於本發明化合物的直腸施用的栓劑形式。這些組 合物可通過將藥物與合適的無刺激性的賦形劑混合來製備，該賦形劑在常溫下為固體，而 在直腸溫度下為液體，且因此將在直腸中熔融以釋放藥物。這類材料例如包括可可脂和聚 乙二醇。適合直腸施用的醫藥製劑可提供為栓劑或灌腸劑。
[0089] 適合陰道施用的醫藥製劑可提供為子宮託、棉塞、乳膏、凝膠劑、糊劑、泡沫體或噴 霧製劑。
[0090] 適合腸胃外施用的醫藥製劑包括水性和非水性無菌注射溶液，其可含有抗氧化 齊IJ、緩衝劑、抑菌劑和使製劑與預定受體的血液等滲的溶質；和可包含懸浮劑和增稠劑的水 性和非水性無菌混懸劑。所述製劑可存在於單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿和 小瓶，且可儲存在僅需要在使用前一刻加入無菌液體載體如注射用水的冷凍乾燥（凍幹） 條件下。
[0091] 臨時注射溶液和混懸劑可由無菌粉末劑、顆粒劑和片劑製備。
[0092] 除了上文特定提到的成分之外，所述製劑還可包含考慮所討論的製劑類型而在本 領域中常規的其它試劑。例如，適合口服的製劑可包含調味或著色劑。
[0093] 新治療劑的識別。另一方面，本發明提供了識別推定的醫藥劑（例如，抗癌劑、消 炎劑或抗纖維化劑）的方法。所述方法包括步驟：(a)提供測試藥劑；(b)將該藥劑暴露 於TOE4B且同時或單獨地暴露於另一 Η)Ε(例如，PDE4D);和（c)測定編碼TOE4B和另一 I3DE (例如，PDE4D)的基因的表達水平和/或所編碼磷酸二酯酶的表達或活性的水平。抑制 PDE4B的表達或活性、但不顯著抑制另一所測定的TOE(例如，TOE4D)的表達或活性的藥劑 為用於治療癌症、炎症或纖維化或本文所述或據發現另外受益於TOE4B抑制的消炎作用的 任何醫學病狀的推定抗癌、消炎或抗纖維化劑。在另一測定中，可進行以下步驟，包括：(a) 提供測試藥劑；(b)將該藥劑暴露於表達Akt的細胞；和（c)測定編碼Akt的基因的表達水 平、所編碼蛋白的去泛素化程度或其活性。調整（例如，抑制）Akt的表達、去泛素化程度或 活性的藥劑為推定的抗癌、消炎或抗纖維化劑。
[0094] 實施例
[0095] 實施例1.抑制TOE4上調了 CYLD表達
[0096] 已經將磷酸二酯酶（PDE)視為治療目標。實際上，已經成功地研發了作為有效治 療劑的許多PDE抑制劑（例如，通過靶向TOE5用於治療勃起功能障礙的VIAGRA?和通過 靶向TOE4用於治療哮喘和COro的羅氟司特）。由於這個原因，我們起初設法確定PDE是否 充當CYLD的關鍵負調節劑。因為TOEl和TOE4在中耳（ME)中選擇性地表達，所以我們首先 評價了特異性I 3DEl和TOE4抑制劑對由主要OM細菌性病原體NTHi誘發的CYLD上調的作 用。有趣的是，使用一般TOE4抑制劑咯利普蘭和R 〇20-1724的TOE4的藥理學抑制在在常規 和空氣-液體界面培養條件兩者下培養的人類中耳上皮細胞HMEEC、肺上皮細胞A549和人 類原代支氣管上皮NHBE中在mRNA水平和蛋白水平兩者下明顯地增強了 NTHi-誘發的CYLD 上調。類似的結果還從用四種其它常用的臨床NTHi株（1479、2019、3198和9274)處理的 細胞中見到。類似地，咯利普蘭在如通過使用CYLD-特異性抗體進行實時定量PCR(Q-PCR) 和免疫螢光（IF)染色所評定在OM的公認的小鼠模型的中耳黏膜中也在mRNA水平和蛋白 水平下增強了 CYLD的上調。相比之下，PDEl特異性抑制劑沒有展示出對CYLD上調的作用。 這些數據表明TOE4充當了用於CYLD的關鍵負調節劑。
[0097] 實施例2. TOE4的抑制導致了 NTHi-誘發的炎症的阻遏。
[0098] 我們緊接著確定TOE4抑制是否阻遏了 NTHi-誘發的炎症。正如所料，在通過Q-PCR 和ELISA評定的細胞中（具體地，在中耳上皮HMEEC、肺上皮A549和原代NHBE細胞中）， TOE4抑制劑咯利普蘭在mRNA和蛋白水平下強力地抑制了 NTHi-誘發的NF- κ B激活和包 括 IL-I β、IL-8 和 TNF-α 的促炎介質（proinf lammatory mediator)的上調。一致地，在 小鼠的中耳中，咯利普蘭也抑制了 NTHi-誘發的促炎介質上調。
[0099] 如通過在NTHi-接種的小鼠中的耳局部檢驗所評定的，咯利普蘭的腹膜內（i. p.) 施用也抑制了 NTHi-誘發的OM的典型耳局部病變，包括鼓膜充血和腫脹及在大泡（bulla) 內的粘液流出物積聚。此外，如通過進行組織病理學分析所評定的，其還抑制在中耳黏膜中 作為OM的關鍵特徵性病變的中耳黏膜增厚和多形核中性粒細胞（PMN)浸潤。
[0100] 儘管顯示了抑制roE4增強CYLD的上調並阻遏NTHi誘發的炎症，但是尚不明確抑 制TOE4是通過上調CYLD還是通過抑制炎症的正調節劑（例如，IKK β )來阻遏炎症。我們 發現TOE4抑制劑咯利普蘭在CYLD用SiRNA CYLD消耗的HMEEC、Α549及原代NHBE細胞中 不再抑制NTHi-誘發的促炎標誌物IL-I β、IL-8和TNF- α的上調。類似地，咯利普蘭也 未能在CYLD-缺陷細胞中抑制NTHi-誘發的這些細胞因子的mRNA表達。此外，在小鼠 OM 模型中也證實了類似的結果。此外，咯利普蘭（通過腹膜內施用）不再抑制NTHi-誘發的 IL-I β和MIP-2 (人類IL-8的小鼠同源物）的上調和在中耳黏膜中的中耳黏膜增厚和PMN 浸潤。這些數據表明抑制TOE4通過上調CYLD來阻遏炎症。
[0101] 我們緊接著確定Η)Ε4抑制劑是否也可以經由直接抑制IKK β (NF-κ B依賴性炎症 的關鍵的正調節劑）來阻遏炎症。咯利普蘭並不顯著抑制通過過度表達組成性活化形式的 IKK β或野生型p65 (NF- K B的關鍵亞單元）誘發的NF- K β激活。
[0102] 實施例3. TOE4B涉及在負調節NTHi-誘發的炎症中。
[0103] 我們緊接著設法確定具體涉及哪種TOE4亞族成員。TOE4由編碼咯利普蘭敏感性 PDE的四種亞族基因 TOE4A?D組成。TOE4通過催化或降解cAMP而發揮其細胞功能，cAMP 為響應刺激物（例如，細菌性病原體）而調節許多病理過程的最重要的第二信使之一。我 們確定在體外HMEEC細胞中和在小鼠體內的中耳黏膜中以及在原代呼吸道上皮NHBE和細 胞系A549中TOE4B通過NTHi在mRNA和蛋白水平下被選擇性地且明顯地上調。與這些結 果一致地，PDE4B酶活性也通過NTHi被上調。
[0104] 總之，這些數據表明PDE4B在調節NTHi-誘發的炎症中起重要作用。有趣的是， 臨床上可用的藥物羅氟司特在HMEEC細胞中在比咯利普蘭（10 μ M)低得多的濃度（低10 倍，1 μ Μ)下也明顯地阻遏NTHi-誘發的炎性反應，羅氟司特是已知的相對於TOE4D來說對 PDE4B更具選擇性的一種強效TOE4抑制劑。相比之下，與對TOE4B相比更具TOE4D選擇性 的抑制劑西洛司特對NTHi-誘發的炎症沒有展示出顯著的抑制作用。這些發現具有特定的 推進和臨床意義，因為目前臨床有用的通用TOE4抑制劑由於它們對TOE4D的抑制作用而具 有嚴重的不良作用。
[0105] 實施例4. JNK2途徑的參與情況。
[0106] 我們緊接著設法確定TOE4B如何經由抑制CYLD來介導NTHi-誘發的炎症。因為 MAP激酶（MAPK)在介導NTHi-誘發的宿主反應中起重要作用，所以我們確定了在使用對於 各種主要MPK具有特異性的抑制劑來調節CYLD的過程中MPK的參與情況。
[0107] 正如在體外HMEEC細胞中和在小鼠體內的中耳中所預期的，MPK JNK的抑制劑 (SP600125) (1 μ M)增強了由NTHi引起的CYLD上調且阻遏了炎症、而ERK或p38的抑制劑 則並非如此。有趣的是，PDE4抑制劑在已經用JNK抑制劑預先處理的HMEEC中不再進一步 增強NTHi-誘發的CYLD上調且不再進一步阻遏炎症。因為JNKl和JNK2代表了在中耳上 皮細胞中表達的兩種主要的同種型，我們緊接著確定涉及哪種同種型。TOE4抑制劑選擇性 抑制NTHi-誘發的JNK2激活；而不抑制JNKl，也不抑制其它MAPK。這些有趣的發現因此促 使我們進一步確定TOE4B是否經由JNK2的選擇性激活、而不是JNKl途徑來阻遏CYLD表達 並介導NTHi-誘發的炎症。此外，在CYLD-缺陷細胞中，JNK抑制劑也不再抑制NTHi-誘發 的炎症。這些數據表明TOE4經由JNK2途徑而負調節CYLD並介導炎症。
[0108] 實施例5.通用TOE4抑制劑的耳局部接種後施用。
[0109] 上述數據證明，當全身性預施用時，在小鼠 OM模型中，通用TOE4抑制劑咯利普蘭 上調了 CYLD並阻遏隨後的炎症。這些數據因此促使我們直接試驗接種後施用咯利普蘭在 臨床相關條件下對治療中耳炎症是否具有任何治療作用。當鼓膜病理性或因鼓膜置管插入 而手術性穿孔時，耳局部施用有效地起作用。因此，我們首先確定在NTHi接種後小鼠的中 耳中耳局部施用咯利普蘭是否會上調CYLD並阻遏炎症。有趣的是，在小鼠 OM模型中，耳局 部接種前和接種後施用咯利普蘭在體內均上調了 CYLD並阻遏了炎症。
[0110] 實施例6.體外使用SiRNA和KO細胞方法的TOE4B抑制。
[0111] 因為我們已經顯示羅氟司特（強效且更具TOE4B特異性的抑制劑）增強CYLD表 達且抑制NTHi-誘發的炎症，所以我們可以通過使用PDE4B特異性siRNA以及TOE4B敲除 (KO)細胞方法抑制TOE4B來直接確定TOE4B是否充當在體外抑制CYLD表達並介導NTHi-誘 發的炎症的關鍵調節劑。
[0112] 可使用Q-PCR和蛋白印跡法監測敲除效率或缺陷。可進行TOE4B測定以監測TOE4B 活性的抑制。它們對CYLD表達的影響可使用Q-PCR和蛋白印跡法評定，且對炎性反應的影 響可使用所述的螢光素酶報導體測定、Q-PCR和ELISA評定。除了 HMEEC細胞之外，我們可 以使用在常規和空氣-液體界面下培養的人類原代NHBE證實這些關鍵發現。此外，可使用 其它常見的NTHi臨床菌株1479、2019、3198和9274證實使用菌株12獲得的我們的發現的 通用性。
[0113] 實施例7. CYLD為肺纖維化的關鍵負調節劑。
[0114] 我們通過首先確定CYLD缺陷在由肺炎鏈球菌感染誘發的肺損傷小鼠模型中是否 導致肺纖維化發展來開始該研究。如在圖Ia中所示，經受ALI的大部分WT小鼠看起來完 全恢復，而沒有顯著的病理改變。相比之下，如通過進行H&E染色所評價的，Cyld-/-小鼠 展示出標誌性纖維化病理改變。另外，用三色染色的組織分析證明在肺炎鏈球菌接種的 Cyld-/-小鼠的肺中的顯著膠原蛋白沉澱（染藍色），而在WT小鼠中沒有顯著的膠原蛋白 沉澱。此外，Cyld-/-小鼠的肺炎鏈球菌接種肺也展示出超纖維化反應，與WT小鼠肺（圖 Ib)相比較，產生纖維的基因 I型和III型膠原蛋白（C0L1A2和C0L3A1)、結締組織生長因 子（CTGF)和PAI-I的表達增加。類似於致死量的肺炎鏈球菌，亞致死量的肺炎鏈球菌也展 示出纖維化作用，且與WT小鼠相比較，在Cyld-/-小鼠中，纖維化反應顯著增強。因此，顯 然，與感染的嚴重性無關，CYLD在緊密控制纖維化反應和預防纖維化方面具有關鍵作用。在 CYLD通過抑制P38MAPK-依賴性PAI-I表達1而充當PAI-I上調的負調節劑的基礎上，我們 首先確定CYLD是否也經由抑制P38MAPK信號傳導而抑制肺炎鏈球菌誘發的肺纖維化。有 趣的是，在這些Cyld-/-小鼠中，用p38-特異性抑制劑SB203580治療並不影響肺纖維化。 該出乎意料的發現因此促使我們集中在確定P38-非依賴性分子機制，CYLD通過該機制預 防細菌感染後肺纖維化的發展。
[0115] 在肺纖維化中所涉及的許多信號傳導途徑之中，TGF-β -Smad信號傳導對於調節 肺纖維化是關鍵性的，且已經顯示肺炎鏈球菌誘發TGF- β -信號傳導。因此，我們首先確定 肺炎鏈球菌是否誘發TGF- β -表達。在感染的晚期當纖維化發展時肺炎鏈球菌誘發TGF- β 表達，而在早期當誘發肺損傷時，其誘發迅速的Ρ38ΜΑΡΚ激活，接著在晚期失活。這些有趣 的結果可能很好地解釋使用特異性抑制劑的Ρ38抑制為何在Cyld-/-小鼠中不影響肺纖維 化，且還可能暗含著TGF- β -Smad在介導肺炎鏈球菌誘發的肺纖維化中的重要作用。
[0116] 為了進一步確定我們在小鼠模型中的發現的臨床關聯性，對在患有肺纖維化的人 類患者的肺中CYLD蛋白的表達水平進行了測量並將其與在正常對照中的CYLD蛋白的表 達水平相比較。如在圖Ic中所示，在患有纖維化的肺組織中的CYLD表達比在正常對照物 中的CYLD表達低得多。我們緊接著設法研究CYLD蛋白水平為何在患有纖維化的患者中較 低。因為發現TGF-β -表達在感染後期在組織損傷的恢復過程期間被上調，所以我們設法 確定TGF-β是否調節CYLD表達。實際上，在小鼠的肺組織中，CYLD的表達受到TGF-β抑 制。因此，合理的是提出TGF-β不僅可通過激活TGF-P-Smad信號傳導途徑（纖維化反應 的關鍵正調節劑）而促進組織纖維化，而且也可通過抑制CYLD (纖維化反應的負調節劑） 的表達而至少部分地促進組織纖維化。
[0117] 為了進一步評價我們的發現的通用性，我們緊接著設法確定在通過博來黴素誘發 的廣泛使用的肺纖維化模型中CYLD是否也充當化學誘發的肺纖維化的關鍵負調節劑。有 趣的是，與WT小鼠相比較，在Cyld-缺陷的小鼠中博來黴素誘發的肺纖維化也顯著增強。這 些數據因此表明經由抑制TGF-β -信號傳導實現的CYLD的抗纖維化作用可能對於由其它 有害刺激物誘發的組織纖維化也是通用的。
[0118] 實施例8. CYLD經由抑制TGF- β -信號傳導預防了肺纖維化。
[0119] 因為肺炎鏈球菌誘發TGF-β-信號傳導且TGF-β-信號傳導已知為在肺纖維 化的發展中所涉及的關鍵信號傳導途徑，所以我們使用包括短幹擾RNA(SiRNA)的各種 方法確定CYLD是否抑制TGF-β-信號傳導。正如所料，如先前所示（圖2a、圖2b)， siRNA-CYLD(siCYLD)在包括人類原代支氣管上皮NHBE細胞的許多細胞類型中有效地降低 了內源CYLD蛋白表達且大大增強了 TNF-α -誘發的NF-κ B-Luc活性激活。有趣的是，採用 siCYLD的CYLD敲除在人類肺上皮Α549和海拉細胞中明顯增強了 TGF- β -誘發的Smad-結 合元件（SBE)-依賴性啟動子的活性和TGF-α -響應性PAI-I啟動子活性以及PAI-I信使 RNA (圖2c、圖2d)。與這些結果一致地，siCYLD增強了 TGF-β-誘發的SBE-依賴性啟動子 活性，而過度表達WT-CYLD，以劑量依賴性方式抑制了 TGF-β -誘發的SBE-依賴性啟動子活 性（圖2e)。我們緊接著在人類原代支氣管上皮NHBE細胞中證實了該發現。如在圖2f中 所示，在NHBE細胞中，siCYLD增強了 TGF- β -誘發的SBE-Luc活性，而過度表達WT-CYLD抑 制了 TGF-β -誘發的SBE-Luc活性。與使用siCYLD獲得的結果相一致地，與WT MEF相比 較，在Cyld-/-小鼠胚胎成纖維（MEF)細胞中，CYLD缺陷也增強了 TGF- α -誘發的SBE-Luc 激活（圖2g)。此外，在小鼠肺組織中，CYLD缺陷也明顯地增強了包括PAI-I和CTGF的 TGF-調節的成纖維基因的誘發（圖2h)。我們從這些數據中推斷CYLD在體外和體內均負 調節TGF- β -信號傳導。我們通過使用SB431542 (TGF- β -信號傳導的特異性抑制劑）進 一步研究了 CYLD缺陷是否經由增強TGF- β -信號傳導而導致肺纖維化。實際上，如在圖2i 中所示，SB431542的全身性接種抑制了在肺炎鏈球菌接種的Cyld-/-肺中的肺纖維化，由 此證實CYLD缺陷經由增強TGF-β -信號傳導而在細菌感染後導致肺纖維化。
[0120] 實施例9 :CYLD經由降低Smad3穩定性抑制了 TGF- β -信號傳導。
[0121] 在識別了 CYLD為TGF- β -信號傳導和肺纖維化的負調節劑的情況下，我們緊接著 設法確定CYLD如何抑制TGF- β -信號傳導。TGF- β -配體結合至II型受體（Τ β RII)，其 動員了 I型受體（Τ β RI)並使I型受體（Τ β RI)磷酸化。激活的T β RI隨後使稱為受體激 活的Smad(R-Smad)如可結合到Co-Smad Smad4的Smad3的Smad子群憐酸化。R-Smad和 Co-Smad複合體隨後經歷了核移位以便目標基因調節。為了首先確定抑制TGF-β -信號傳 導的CYLD的水平，我們利用了分別來源於WT MvlLu細胞且缺乏功能性T β RII和T β RI的 可用的肺上皮細胞系DR26和R1B。如在圖3a中所示，siCYLD明顯地增強了在T β RII-缺陷 的DR26細胞中的組成性活化的（C/A) -T β RI-誘發的SBE-Luc活性，表明通過CYLD敲除實 現的TGF-β -信號傳導增強在T β RI的水平下或其下遊出現，而不依賴於T β RII。我們緊 接著通過評定在T β RI-缺陷的RlB細胞中siCYLD對WT-Smad3-誘發的SBE-Luc活性的影 響而確定CYLD是否在T β RI的水平下或其下遊對TGF- β -信號傳導發揮其抑制作用。CYLD 敲除明顯地增強了在RlB細胞中WT-Smad3-誘發的SBE-Luc激活，表明CYLD可在Smad3的 水平下或其下遊抑制TGF-β-信號傳導，而不依賴於T β RI (圖3b)。為了進一步確定CYLD 是否通過可能祀向Smad3而抑制TGF-β -信號傳導，我們緊接著評價了在Smad3-缺陷的 MEF細胞中CYLD敲除的影響。如在圖3c中所示，在缺乏Smad3的情況下，siCYLD並不增強 SBE-Luc活性。相比之下，在用WT-Smad3重構的細胞中，siCYLD明顯地增強了 SBE-Luc活 性，表明CYLD可在Smad3的水平下或其下遊抑制TGF-β -信號傳導。
[0122] 為了進一步確定CYLD如何經由Smad3抑制TGF-β-信號傳導，我們緊接著通過使 用針對磷酸化Smad3的抗體評價CYLD對Smad3激活的影響。有趣的是，CYLD敲除不僅增 加磷酸化Smad3,而且增加總Smad3,而過度表達WT-CYLD不僅抑制磷酸化smad3,而且抑制 總Smad3 (圖3d)。與WT對應物相比較，Smad3表達在Cyld-/-MEF和Cyld-/-小鼠肺兩者 中也更高，而另一 R-Smad Smad2表達不受CYLD缺陷影響（圖3f)。與這些結果一致地，與 正常對照物相比較，Smad3表達在患有肺纖維化的人類患者的肺中也較高（圖3g)。
[0123] 此外，過度表達WT-CYLD明顯地降低了內源Smad3和外源Smad3兩者的表達，但不 降低SmacM蛋白的表達（圖3h)，而對Smad3mRNA的水平沒有影響（圖3i)。有趣的是，用 MG132(特異性蛋白酶體抑制劑）處理逆轉了 WT-CYLD-誘發的Smad3蛋白水平（圖3j)和 TGF-β-誘發的PAI-I表達（圖3k)的降低。總起來說，這些數據表明CYLD通過以蛋白酶 體依賴方式降低Smad3蛋白的穩定性而抑制TGF-β -信號傳導。
[0124] 實施例10. CYLD經由Akt_GSK3 β -CHIP途徑降低Smad3穩定性。
[0125] 因為CYLD為已知的去泛素化酶（DUB)，我們研究了 CYLD-誘發的Smad3降解是否 取決於其去泛素化活性。我們首先評定了 DUB-缺陷的CYLD突變體對Smad3基準水平和 TGF-β -誘發的SBE啟動子活性的影響。如在圖4a中所示，與WT-CYLD相比較，DUB缺陷的 CYLD突變體（H/N-CYLD和C/S-CYLD)未能誘發Smad3降解。在TGF- β -誘發的SBE啟動子 活性中也觀察到類似的結果（圖4b)。這些數據表明CYLD以DUB活性依賴方式降低Smad3 穩定性。
[0126] 因為E3泛素連接酶在介導Smad3降解中具有關鍵作用且CYLD被稱為去泛素化 酶，所以我們假設CYLD可能經由調節E3泛素連接酶而降低Smad3穩定性。在已經顯示 CHIP的羧基端介導Smad3降解的基礎上，我們首先確定CHIP是否通過使用siCHIP而介導 CYLD-誘發的Smad3降解。首先證實在A549細胞中siCHIP在降低CHIP表達中的效率。如 在圖4c中所示，使用siCHIP的CHIP敲除在A549細胞中逆轉了 WT-CYLD-誘發的Smad3減 少。在TGF- β -誘發的SBE啟動子活性和PAI-I上調中也觀察到類似的結果（分別，圖4d、 圖4e)。我們緊接著通過進行共-免疫沉澱實驗檢驗了 CYLD是否與CHIP直接相互作用。 在CYLD和CHIP之間沒有觀察到直接物理相互作用，由此表明CYLD可能通過靶向CHIP的 上遊分子而調節CHIP依賴性Smad3穩定性。
[0127] 鑑於已知的上遊信號傳導，在介導Smad3降解中涉及的分子，GSK3 0被顯示在 介導Smad3降解中具有重要作用。我們因此確定在介導CYLD-誘發的Smad3降解中是否 涉及GSK3 0。如在圖4f中所示，在A549細胞中，特異性GSK3 0抑制劑SB216763逆轉了 WT-CYLD-誘發的Smad3減少。在TGF-β -誘發的SBE啟動子活性中也觀察到類似的結果 (圖4g)，由此表明在通過CYLD介導Smad3穩定性的調節中涉及到GSK3 β。我們進一步進 行共免疫沉澱實驗以確定GSK3 β是否與CYLD直接相互作用。在GSK3 β和CYLD之間沒有 發現直接相互作用，表明在GSK30的遠上遊涉及另一信號傳導分子。有趣的是注意到在體 外和體內都發現GSK3 0與CHIP直接相互作用（圖4h、圖4i)。其它實驗證明GSK3 0磷酸 化通過肺炎鏈球菌誘發且通過CYLD缺陷增強（圖4j、圖4k)。因為已知GSK3 β的磷酸化 引起其激酶活性失活且CYLD缺陷增強GSK3 β磷酸化，我們預期CYLD可能通過抑制GSK3 β 磷酸化且因此促進GSK3 β -CHIP-介導的Smad3蛋白降解而誘發GSK3 β激酶活性。然而， GSK3 β如何調節CHIP-介導的Smad3蛋白降解仍然不明確。先前，已經報導Erk5MAPK依賴 Erk5激酶活性而調節CHIP的E3連接酶活性。因此，很可能GSK3 β可通過依賴GSK3 β激 酶活性結合CHIP而調節CHIP的Ε3連接酶活性。需要進一步研究來了解在CHIP Ε3連接 酶活性的GSK3 β -介導的調節下面的分子機制。
[0128] 我們緊接著設法確定在介導GSK3 β -依賴的Smad3蛋白降解中CYLD的直接分子 靶標。因為Akt被稱為GSK3i3的主要上遊調節劑，所以我們研究了 Akt是否介導CYLD-誘 發的Smad3降解。我們首先確定了肺炎鏈球菌是否誘發Akt的激活。如在圖4j中所示，肺 炎鏈球菌誘發了 Akt和GSK3 β的磷酸化，但不誘發p70S6K的磷酸化，p70S6K代表PI3K途 徑的另一下遊靶標，這表明Akt-GSK3i3通過肺炎鏈球菌特異性激活。與這些結果一致地， 肺炎鏈球菌也以時間依賴方式上調Smad3蛋白表達（圖4m)。該有意義的結果因此促使我 們通過首先檢驗Akt敲除對Smad3蛋白穩定性的影響來確定在介導CYLD-誘發的Smad3降 解中是否關鍵性地涉及Akt。
[0129] 實施例11. CYLD通過抑制Akt降低Smad3穩定性。
[0130] 我們發現Aktl和Akt2主要表達在Cyld+/+細胞和Cyld-/-細胞兩者中，而Akt3 並非如此。因此，我們確定了在這些細胞中Aktl和Akt2的敲除對Smad3蛋白水平的影響。 如在圖5a中所示，在WT和Cyld-缺陷的細胞中，Aktl/2的敲除顯著地降低了 Smad3蛋白 表達。與該結果一致地，Akt敲除也抑制了由CYLD敲除誘發的TGF- β -誘發的SBE啟動子 活性的增強（圖5b)。類似地，在Cyld-/-MEF中，增強的TGF- β -誘發的SBE啟動子活性也 受Akt-特異性抑制劑抑制（圖5c)。此外，在Aktl-/-細胞中TGF-β-誘發的PAI-ImRNA 表達也因 Aktl-缺陷而明顯降低，且在Aktl-/-細胞中，siCYLD不再增強TGF- β -誘發的 PAI-I表達。我們進一步證實Akt的激活是否確實經由Smad3誘發纖維化反應基因表達的 上調。Akt通過表達組成性活化的C/A-Akt實現的激活實際上在Smad3+/+細胞中誘發了 PAI-I和CTGF的表達，而在Smad3-/_細胞中並非如此。總之，這些數據提供了對於在介導 CYLD-依賴性Smad3降解中關鍵性涉及Akt的支援性證明。PI3K被稱為在Akt上遊的主要 信號傳導分子之一。我們因此通過評價PI3K和Akt抑制劑對Smad3蛋白表達的影響而確 定PI3K是否像Akt -樣在介導CYLD-依賴性Smad3降解中也涉及到。Akt抑制劑明顯地降 低了 Smad3蛋白表達，而PI3K抑制劑LY294002不降低Smad3蛋白表達（圖5d、圖5e)。這 些結果相當出乎意料，因為眾所周知PI3K和接著的PIP3對於Akt激活是完全限速性的（c completely rate-limiting)。因為在我們的研究中僅使用PI3K的化學抑制劑，所以我們 的數據並不完全排除在調節Akt-介導的Smad3調節中可能涉及PI3K。需要通過使用更具 體的方法進一步研究來確定Smad3的CYLD-Akt-介導的調節是否確實不依賴於PI3K。儘管 如此，這些數據表明CYLD經由負調節Akt而降低了 Smad3蛋白穩定性。
[0131] 為了進一步確定CYLD如何負調節Akt，我們首先通過進行共免疫沉澱實驗檢驗了 CYLD是否在物理上與Akt相互作用。在圖5f中的結果顯示在用HA-CYLD和Flag-Akt共 轉染的上皮細胞中，CYLD和Akt確實彼此物理結合。我們緊接著通過進行Duolink體內蛋 白-蛋白相互作用檢測測定和共免疫沉澱測定以確定內源CYLD是否與內源Akt直接相互 作用且這一直接相互作用在肺炎鏈球菌處理時是否進一步增加。如在圖5g、圖5h中所示， 內源CYLD確實與內源Akt直接相互作用且肺炎鏈球菌處理增加了它們的直接相互作用。總 之，這些數據表明CYLD通過抑制Akt降低了 Smad3穩定性和TGF- β -信號傳導。
[0132] 實施例12. CYLD使Κ63-泛素化Akt去泛素化以抑制Smad3。
[0133] 我們緊接著研究CYLD是否使Akt去泛素化。如在圖6a中所示，共表達WT-CYLD、 但非DUB突變體（H/N-CYLD)降低了 Akt多聚泛素化。另外，在上皮細胞中，siCYLD也明 顯地增強了肺炎鏈球菌誘發的Akt泛素化。我們隨後確定了在缺乏和存在CYLD的情況下 肺炎鏈球菌是否誘發內源Akt泛素化。如在圖6c、圖6d中所示，在缺乏肺炎鏈球菌的情 況下檢測到了內源Akt泛素化，且肺炎鏈球菌明顯地增強了內源Akt泛素化。有趣的是， WT-CYLD的表達大大降低了肺炎鏈球菌誘發的內源Akt泛素化，而CYLD敲除或CYLD缺陷 則增強了肺炎鏈球菌誘發的內源Akt泛素化。因為已經顯示Akt經歷K63多聚泛素化，我 們緊接著確定CYLD是否特定地使K63-多聚泛素化Akt去泛素化。如在圖6e中所示，共表 達WT-CYLD明顯地降低了 K63-多聚泛素化Akt，但不降低K48-多聚泛素化Akt。一致地， 在圖6f中的結果指示在無細胞體系中重組CYLD蛋白（GST-rCYLD)使K63-連接的多聚泛 素化的Akt (HisrAkt)在體外以劑量依賴方式直接去泛素化。此外，CYLD的缺陷也增強了 肺炎鏈球菌誘發的Akt的K63-多聚泛素化（圖6g)。合起來，這些數據提供了在無細胞體 系中在體外和在內源條件下在體內兩者中CYLD通過與K63-多聚泛素化Akt直接相互作用 並使K63-多聚泛素化Akt去泛素化而負調節Akt的強有力的證據。
[0134] 因為在Akt的普列克底物蛋白（pleckstrin)同源域中的K14賴氨酸對於介導其 功能是關鍵性的，所以我們緊接著確定K14賴氨酸突變成精氨酸（R)是否降低了 Akt的多 聚泛素化。實際上，與WT-Akt相比較，K14R、而不是K8R、K20R和K30R，明顯地降低了 Akt 的K63-連接的多聚泛素化（圖6h)。我們進一步確定在Akt中的K14殘基實際上對於介 導CYLD-誘發的TGF-β -信號傳導抑制在功能上是否為關鍵性的。如在圖6i中所示，表達 WT-CYLD顯著抑制了在用WT-Akt或K20R而不是用K14R共轉染的上皮細胞中的TGF- β -誘 發的SBE啟動子活性，由此證明在Akt的PH域中的Κ14在介導通過CYLD實現的TGF- β -信 號傳導抑制中的關鍵作用。先前顯示TNF受體相關因子6(TRAF6)充當用於Akt-K63多聚泛 素化的E3連接酶，並且CYLD使TRAF6去泛素化。因此，我們接著探索CYLD可經由使TRAF6 去泛素化而抑制Akt-介導的纖維化反應的可能性。使用siCYLD的CYLD敲除在TRAF6-貧 乏細胞中仍然增強了 TGF- β -誘發的纖維化反應，由此表明CYLD至少部分地通過與Akt直 接相互作用並使其去泛素化而抑制Akt-介導的纖維化反應。
[0135] 評論：在本發明研究中，我們提供了識別CYLD去泛素化酶作為預防肺炎鏈球菌 感染之後肺纖維化發展的關鍵負調節劑的證據。CYLD抑制了 TGF-β-信號傳導且由此經 由以GSK3 β -CHIP-依賴方式降低Smad3蛋白的穩定性而預防纖維化。此外，CYLD通過使 K63-多聚泛素化Akt直接去泛素化而降低Smad3蛋白穩定性，這又引起GSK3 0激活（圖 7a)。CYLD缺陷經由在肺損傷之後增強的Smad3-蛋白穩定性而產生增強的纖維化反應（圖 7b)。CYLD在感染的早期肺損傷階段通過經由特異性抑制p38信號傳導而抑制肺炎鏈球菌 誘發的PAI-I表達來促進細菌誘發的肺損傷並降低宿主存活率；且如在我們的當前研究中 所示，在感染的晚期組織重塑階段，CYLD通過經由降低Smad3穩定性而抑制TGF- β -Smad信 號傳導來預防肺纖維化的發展。因此，在肺損傷的整個傷口癒合過程期間，CYLD充當關鍵 的調節劑。
[0136] 先前，有證據表明TNF受體相關因子6(TRAF6)充當Akt-K63多聚泛素化的Ε3連接 酶，且CYLD使TRAF6去泛素化。在該研究中，我們提供了在Akt和CYLD之間的直接相互作 用的實驗證據，並且顯示CYLD在內源條件和外源條件兩者下都確實使Akt直接去泛素化。 可能的是CYLD可通過使TRAF6實際上去泛素化而抑制Akt-介導的纖維化反應。因此，我 們使用siTRAF6評價在TRAF6-貧乏細胞中siCYLD對TGF-β -誘發的纖維化反應的影響。 有趣的是，在TRAF6-貧乏細胞中，CYLD敲除仍然引起TGF- β -誘發的纖維化反應增強。盡 管如此，這些數據證明CYLD通過與Akt至少部分地直接相互作用並使其去泛素化而確實抑 制了 Akt-介導的纖維化反應。在此，我們提供了 CYLD經由抑制Akt、由此使CYLD經Akt連 接到Smad3而抑制肺炎鏈球菌誘發的Smad3-依賴性纖維化的強有力的證據。Akt的直接激 活是否經由Smad3誘發纖維化反應仍不明確。實際上，Akt通過表達組成性活化形式的C/ A-Akt直接激活Akt在Smad3+/+細胞中誘發了纖維化反應基因 PAI-I和CTGF的表達，而在 Smad3-/_細胞中並非如此。總起來說，顯然CYLD-依賴性Akt去泛素化的纖維化作用實際 上經由TGF-β -Smad3途徑特別地介導。
[0137] 在我們提供的實驗數據的基礎上，很明顯在由感染劑引起的肺損傷中在傷口癒合 反應中CYLD通過抑制TGF-β -信號傳導調節了肺纖維化。因為TGF-β -信號傳導在調節 組織纖維化反應中具有必要的作用，所以我們相信CYLD對於負調節由諸如苛性化學品的 其它有害刺激物誘發的纖維反應也是關鍵性的。因此，我們設法確定在由博來黴素誘發的 廣泛使用的肺纖維化模型中CYLD是否也充當化學誘發的肺纖維化的關鍵負調節劑。有趣 的是，在Cyld-缺陷小鼠中，CYLD缺陷明顯地增強了博來黴素誘發的肺纖維化。這些數據 因此表明CYLD在纖維化反應中的抑制作用不僅對於由感染劑誘發的組織纖維化、而且對 於由諸如苛性化學品的其它有害刺激物誘發的組織纖維化都可為通用的，只要是該纖維化 主要經由TGF-β -Smad信號傳導介導。
[0138] 方法。如下所述的方法可用於進行上述研究，且本領域的普通技術人員將認識到 這些方法中的一些或全部（例如,核酸構建體和介導RNAi的核酸的產生）可用於實踐如本 文陳述的發明。
[0139] 細胞培養和試劑。將Α549、海拉和ΗΕΚ293細胞保持在具有Earle氏平衡鹽溶液 (EMEM)和DMEM閃爍劑的F12-K、Eagle氏最低必需培養基中。將WT貂MvlLu細胞和兩種 突變體細胞系DR26和RlB細胞用補充有非必需胺基酸的EMEM保持。將來自Smad3-/-、 Cyld+/+和Cyld-/-小鼠的MEF保持在DMEM中。將人類原代支氣管上皮NHBE(Cambrex) 細胞保持在補充有支氣管上皮生長培養基single Quot的支氣管上皮生長培養基中。重 組TGF- β 1 (在上文指示為TGF- β )和TNF- α自R&D system購買；Akt抑制劑（1L6-羥甲 基-手性-肌醇-2 (R) -2-0-甲基-3-0-十八烷基-sn-丙三氧基碳酸酯）和SB203580得 自 Calbiochem ;SB431542 和博來黴素得自 Sigma ;MG132 得自 American Peptide。體外泛 素化和去泛素化測定試劑盒自Boston Biochem購買。Duolink體內蛋白-蛋白相互作用檢 測測定試劑盒得自 Olink Bioscience。重組His-Akt 和 His_GSK3i3 得自 Calbiochem。用 於TGF- β和總及磷酸化-p38MAPK的ELISA測定試劑盒分別從R&D system和Invitrogen 購買。
[0140] 實時定量RT-PCR分析。總RNA使用TRIzoI試劑按照生產商的說明書分離。由 總RNA合成互補DNA用MultiScribe逆轉錄酶進行。實時定量PCR使用ABI 7500序列 檢測系統（Applied Biosystems)進行。mRNA的相對量使用比較閾值循環法計算且使用 人類和小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶作為內源對照物進行標準化。小鼠 C0L1A2、C0L3A1、 CTGF 和 PAI-I 及人類 PAI-1、CHIP 和 Smad3 的引物序列如下。小鼠 CTGF :5' -GTAACCGGGGA GGGAAATTA-3' （SEQ ID N0:1)和 5'-ACAGCTGGACTCAGCCTCAT-3' （SEQ ID N0:2);小鼠 C0L1A2:5'-GACAAATGAATGGGGCAAG-3'（SEQIDN0:3)和5'-CAATGTCCAGAGGTGCMTG-3'（SEQ ID N0:4)；小 ? C0L3A1 ： 5'-CGAAGATGGCAAAGATGGAT-3' (SEQ ID NO: 5) 和 5' -GCCACTAGGACCCCTTTCTd (SEQ ID NO : 6)；小 鼠 PAI-I ： 5，-GTAGCACAGGCACTGCAAAA-3，（SEQ ID N0:7)和 5，-TGAGATGACAAAGGCTGTGG-3，（SEQ ID N0:8)；人類 PAI-I :5'-CCCTTTGCAGGATGGAACTA-3, (SEQ ID NO: 9) 和 5' -ATGGCAATGTGACTGGAACA-S'（SEQ ID NO: 10);人類 CHIP: 5'-CCCGGCCCCTATACATAGTT-3'（SEQ ID NO:ll)和 5'-CAGTCCAGAGTCCAACAGCA-3'（SEQ ID NO:12)。
[0141] 質粒、轉染和螢光素酶測定。先前描述了表達質粒Flag-WT-CYLD、HA-WT-CYLD、 Flag-H/N-CYLD、HA-C/S-CYLD、Flag-WT-Smad3、C/A-TPRI 和報導體質粒 SBE-Luc、 PAI-卜Luc 和 NF-kB-Luc。Flag-WT-Aktl、pRK5-HA-Ub WT、pRK5-HA-Ub K63 和 pRK5-HA_Ub K48得自Addgene，且Akt的K?R突變體使用QuickChange XL定點誘變試 劑盒（Stratagene)用WT-Aktl產生。所有瞬時轉染都使用TransIT-LTl試劑（Mirus)或 Lipofectamine (Invitrogen)根據生產商的說明書進行。
[0142] RNA-介導的幹擾。用於下調CYLD表達的RNA-介導的幹擾使用pSuper-CYLD進 行且 siCYLD 的序列為 5'-GATCCCCGAGCTACTGAGGACAGAAATTCAAGAGATTTCTGTCCTCAGTAGCTC TTTTTGGAAA-3'（SEQ ID NO: 13)。用於 Akt 和 CHIP 的人類和小鼠 siRNA 得自 Dharmacon， 且使用 siAkt 和 siCHIP 敲除 Akt 和 CHIP 用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)進行。革巴 向人類 AktU人類 CHIP、小鼠 Aktl 和小鼠 Akt2 的 siRNA 的 ON-TARGETplus SMARTpool 由 四種 siRNA 組成且 siRNA 的序列如下：人類 siAktl (5' -CAUCACACCACCUGACCAA-3'（SEQ ID N0:14)、5'-ACAAGGACGGGCACAUUAA-3' （SEQ ID N0:15)、5'CAAGGGCACUUUCGGCAAG-3' （SEQ ID N0:16)、5，-UCACAGCCCUGAAGUACUC-3，（SEQ ID N0:17);人類 CHIP(5，-CGCUGGU GGCCGUGUAUUA-3'（SEQ ID N0:18)、5'-GUGGAGGACUACUGAGGUU-3'（SEQ ID N0:19)、 5'-GAAGGAGGUUAUUGACGC A-3'（SEQ ID N0:20)、5'-UGGAAGAGUGCCAGCGAAA-3'（SEQ ID N0:21))；小 ? Aktl (5'-CUGCAGAACUCUAGGCAUC-3' (SEQ ID NO:22), 5'-GAUCAAGGAUGGUGCCACU-3' （SEQ ID N0:23)、5'-GAGGUUGCCCACACGCUUA-3' （SEQ ID N0:24)、5'-CGACGUAGCCAUUGUGAAG-3'（SEQ ID N0:25);小鼠 Akt2(5'-CCAUGAA UGACUUCGAUUA-3'（SEQ ID N0:26)、5'-GUACUUUGAUGACGAGUUC-3'（SEQ ID N0:27)、 5'-CCUGAACAAUUUCUCU⑶A-3'（SEQ ID N0:28)、5'-GAUGCGGGCUAUCCAGAUG-3'（SEQ ID NO:29))〇
[0143] 蛋白質印跡、免疫沉澱和泛素化實驗。蛋白質印跡、免疫沉澱和泛素化實驗如下 進行。蛋白質印跡使用全細胞提取物進行，將其在8%或10% SDS-PAGE凝膠上分離並轉 移到聚偏二氟乙烯膜。該膜用含有〇. 1%吐溫20 (PBS-T)和5% BSA的PBS溶液封閉。隨 後將該膜在一級抗體在5% BSA-PBS-T中的1:2, 000稀釋液中溫育。在PBS-T中洗滌三 次之後，將該膜用相應二級抗體在3%脫脂牛奶-PBS-T中的1:5, 000稀釋液中溫育。相 應蛋白通過使用增強的化學螢光檢測試劑根據生產商的說明書顯影。為了進行免疫沉澱 分析，將細胞溶解產物在4°C下用1 μ g -級抗體溫育過夜，接著用蛋白A/G-瓊脂糖珠粒 (Invitrogen)溫育2小時。隨後將免疫沉澱物懸浮在樣品緩衝劑中，在8% SDS-PAGE上分 離，轉移到聚偏二氟乙烯膜上，且通過如上所述的免疫印跡分析進行檢測。針對以下各物 的抗體自Cell Signaling購買：總-Akt、在T308和S473處的磷酸化-Akt、總Smad3、磷酸 化-Smad3、總p70S6K、在T389處的磷酸化-p70S6K、總GSK3 β、在S9處的磷酸化-GSK3 β、小 鼠 HA-Tag、His-Tag和小鼠和兔的抗-泛素；針對以下各物的抗體得自Santa Cruz :CYLD、 總-Aktl/2/3、山羊總-Aktl、Smad4、兔HA-Tag、小鼠泛素和肌動蛋白；FLAG和β -肌動蛋白 得自Sigma。
[0144] 體內蛋白-蛋白相互作用檢測測定。將A549細胞在組織培養載玻片上培養且用肺 炎鏈球菌或對照物溫育歷時在附圖中指示的時間。將細胞用2yg πιΓ1的一級小鼠抗-Akt 抗體和兔抗-CYLD抗體染色，且在Akt和CYLD之間的蛋白-蛋白相互作用根據生產商的說 明書（Duolink親近連接測定，01ink Bioscience)用二級親近探針、抗-兔MINUS和抗-小 鼠 PLUS使用Duolink體內蛋白-蛋白相互作用檢測測定試劑盒檢測。
[0145] 小鼠和動物實驗。Cyld-/-小鼠通過如下同源重組產生。設計靶向構建體以用 IRES-LacZ/MCl-Neo盒破壞外顯子2和3。將靶向質粒線性化且轉染到129/S的胚胎幹 細胞中。將同源重組的胚胎幹細胞注入囊胚中，隨後將囊胚轉移到寄母畜，以產生嵌合子 代。將產生的嵌合子代回交到C57BL/6J，且種系傳遞通過PCR用尾部DNA證實。Cyld基 因的純合敲除通過在MEF細胞和肺組織中通過RT-PCR進行的mRNA檢測和通過蛋白質印 跡分析進行CYLD蛋白檢測證實。對於在WT和Cyld-/-小鼠中肺炎鏈球菌誘發的嚴重感 染，將麻醉的小鼠用活肺炎鏈球菌（5x IO7CFU/小鼠）氣管內（i.t.)接種。在肺炎鏈球 菌感染2周後將經受住嚴重肺炎的小鼠處死以便組織病理學分析。對於TGF-β接種，將 麻醉的WT和Cyld-/-小鼠用TGF-M25?IOOng/小鼠）氣管內接種6小時，且隨後對肺 組織進行總mRNA和蛋白質提取。在使用化學抑制劑的實驗中，將SB431542(10mg kg_〇或 SB203580(20mg kg，或等體積的媒介對照在氣管內接種肺炎鏈球菌前1?2小時經腹膜 路徑施用。對於博來黴素誘發的纖維化模型，將動物用博來黴素（3單位/kg體重）氣管內 接種2周。隨後對肺組織進行組織分析及總mRNA和蛋白質提取。所有動物實驗都經在羅 切斯特大學（University of Rochester)和喬治亞州立大學（Georgia State University) 的實驗動物管理與使用委員會（Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC) 批准。
[0146] 將Cyld-/-小鼠和正常對照及肺纖維化患者用蘇木精和曙紅（H&E)染色，以顯現 肺炎症，且進行Masson三色染色以突出顯示組織纖維化。針對CYLD和Smad3的免疫組織 化學染色使用ABC染色系統（Santa Cruz)進行。簡單來說，將組織切片用Iyg-級抗體 或對照IgG溫育，接著用PBS洗滌三次。隨後將組織用1 μ g生物素化二級抗體溫育，接 著用AB酶試劑溫育。在洗滌三次之後，用過氧化物酶底物進行顯色反應。對照和來自患 者的纖維化肺組織在韓國全南國立大學（Chonnam National University)的機構審查委 員會（Institutional Review Board，IRB)的批准下自全南國立醫院（Chonnam National Hospital)獲得。
[0147] 實施例13. PDE4B通過抑制MKP-I的表達而介導肺炎鏈球菌誘發的粘蛋白MUC5AC 表達，其進而引起增強的MAPK ERK激活。
[0148] 在證明了 TOE4在調節MUC5AC誘發中的關鍵作用（數據沒有示出）的情況下，我們 緊接著設法確定特別涉及哪種TOE4亞族成員。TOE4由編碼咯利普蘭-敏感性PDE的4種 亞族基因 TOE4A?D組成。我們首先確定TOE4是否通過肺炎鏈球菌上調。如使用Q-PCR所 評定，在人類中耳HMEEC細胞中，PDE4B通過肺炎鏈球菌明顯地上調，而TOE4A卻並非如此。 在小鼠的中耳黏膜中以及在人類原代NHBE細胞和呼吸道上皮細胞系A549中也觀察到類似 的結果。另外，如通過進行蛋白質印跡分析所評定的，在HMEEC細胞中觀察到了在蛋白水平 下由肺炎鏈球菌引起的TOE4B上調。與這些結果一致地，PDE4B酶活性也通過肺炎鏈球菌上 調。總之，這些數據表明TOE4B在調節肺炎鏈球菌誘發的粘蛋白MUC5AC上調中可能起重要 作用。為了進一步探索是否需要TOE4B，我們緊接著進行了 TOE4B的siRNA敲除。PDE4B的 小幹擾RNA(siRNA)購自Dharmacon (Lafayette, CO)。siRNA按照生產商的說明書且如先前 描述使用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Grand Island, NY)轉染到上皮細胞中（Ha 等， J. Immunol. 178:1736 ?1747, 2007 ;Ishinaga 等，Biochem. J. MI: 583 ?591，2009 ;Lim等， Cell Microbiol·!^: 2247 ?2256, 2008 ;Lim 等，PLoS One 2, el032, 2007)。我們首先確定 PDE4B-siRNA在降低PDE4B表達中的效率。PDE4B表達通過PDE4B-siRNA明顯地降低。緊 接著，我們確定H)E4B-siRNA的作用。在人類中耳上皮HMEEC細胞中，PDE4B-siRNA在mRNA 水平下明顯地抑制肺炎鏈球菌誘發的MUC5AC上調。另外，使用H)E4B-SiRNA的TOE4B敲除 顯著地增強了肺炎鏈球菌誘發的MKP-ImRNA表達。合起來，這些數據提供了 TOE4B經由抑 制MKP-I而在調節肺炎鏈球菌誘發的粘蛋白MUC5AC上調中起重要作用的直接證據。
【權利要求】
1. 一種治療罹患與耳、鼻、鼻道、喉嚨、肺或支氣管樹的炎症相關的醫學病狀的患者的 方法，所述方法包括向所述患者施用治療有效量的包含上調圓柱瘤蛋白（CYLD)基因的表 達或所編碼去泛素化酶的活性的藥劑的藥物組合物。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述醫學病狀為中耳炎、鼻炎、竇炎或引起耳、鼻、 鼻道、喉嚨或肺的炎症的感染疾病。
3. 根據權利要求1所述的方法，其中所述患者為嬰兒或兒童。
4. 根據權利要求1所述的方法，其中上調CYLD基因表達的所述藥劑為表達CYLD或其 生物活性變體的核酸構建體。
5. 根據權利要求1所述的方法，其中上調CYLD基因表達的所述藥劑為磷酸二酯酶 4(PDE4)的抑制劑或c-junN-末端激酶2(JNK2)的抑制劑。
6. 根據權利要求5所述的方法，其中上調CYLD基因表達的所述藥劑為TOE4的抑制劑。
7. 根據權利要求6所述的方法，其中所述TOE4的抑制劑為咯利普蘭、羅氟司特或西洛 司特。
8. 根據權利要求6所述的方法，其中所述TOE4的抑制劑為被取代的苯或包含一個或兩 個環氮的被取代的6元雜芳基環，所述取代包括醚、硫醚或胺基團，其中在所述醚、硫醚或 胺上的烷基為滷烷基。
9. 根據權利要求8所述的方法，其中所述滷烷基為氟甲基、二氟甲基或三氟甲基。
10. 根據權利要求5所述的方法，其中所述TOE4的抑制劑抑制TOE4B，但不顯著抑制 PDE4D。
11. 根據權利要求6或10所述的方法，其中所述TOE4的抑制劑為抑制TOE4B基因表達 的核酸。
12. 根據權利要求11所述的方法，其中所述核酸為反義寡聚核苷酸、微RNA或介導 RNAi的核酸。
13. 根據權利要求5所述的方法，其中上調CYLD基因表達的所述藥劑為JNK2的抑制 劑。
14. 根據權利要求13所述的方法，其中所述JNK2的抑制劑為任選連接細胞穿透肽TAT 或2, 4-二氨基嘧啶的JNK相互作用蛋白（JIP)或其肽片段。
15. 根據權利要求13所述的方法，其中所述JNK2的抑制劑為抑制JNK2基因表達的核 酸。
16. 根據權利要求1所述的方法，其中所述藥物組合物配製成適合耳局部施用。
17. -種治療罹患與耳、鼻、鼻道、喉嚨或肺的炎症相關的醫學病狀的患者的方法，所述 方法包括向所述患者施用治療有效量的包含下調Akt基因的表達或抑制所編碼激酶的活 性的藥劑的藥物組合物。
18. 根據權利要求17所述的方法，其中所述醫學病狀為中耳炎、鼻炎、竇炎或引起耳、 鼻、鼻道、喉嚨或肺的炎症的感染疾病。
19. 根據權利要求17所述的方法，其中所述患者為嬰兒或兒童。
20. 根據權利要求17所述的方法，其中下調所述Akt基因的表達的所述藥劑為抑制所 述Akt基因的核酸。
21. 根據權利要求20所述的方法，其中所述核酸為反義寡聚核苷酸、微RNA或介導 RNAi的核酸。
22. 根據權利要求17所述的方法，其中抑制所編碼激酶的活性的所述藥劑為表達使 Akt去泛素化的酶的核酸構建體。
23. 根據權利要求22所述的方法，其中所述酶為CYLD。
24. 根據權利要求17所述的方法，其中抑制所編碼激酶的活性的所述藥劑為VQD-002、 哌立福新或米替福新。
25. 根據權利要求17所述的方法，其中所述藥物組合物配製成適合耳局部施用。
26. -種治療罹患與生殖器官的炎症相關的醫學病狀的患者的方法，所述方法包括向 所述患者施用治療有效量的包含上調圓柱瘤蛋白（CYLD)基因的表達或所編碼去泛素化酶 的活性的藥劑的藥物組合物。
27. 根據權利要求26所述的方法，其中所述醫學病狀為前列腺炎、盆腔炎或引起生殖 器官的炎症的感染疾病。
28. -種治療罹患與生殖器官的炎症相關的醫學病狀的患者的方法，所述方法包括向 所述患者施用治療有效量的包含下調Akt基因的表達或抑制所編碼激酶的活性的藥劑的 藥物組合物。
29. -種治療罹患自身免疫性疾病的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治療 有效量的包含上調圓柱瘤蛋白（CYLD)基因的表達或所編碼去泛素化酶的活性的藥劑的藥 物組合物，其中所述自身免疫疾病為牛皮癬或類風溼性關節炎。
30. -種治療罹患自身免疫性疾病的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治療 有效量的包含下調Akt基因的表達或抑制所編碼激酶的活性的藥劑的藥物組合物。
31. -種治療肥胖症患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治療有效量的包含上 調圓柱瘤蛋白（CYLD)基因的表達或所編碼去泛素化酶的活性的藥劑的藥物組合物。
32. -種治療肥胖症患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治療有效量的包含下 調Akt基因的表達或抑制所編碼激酶的活性的藥劑的藥物組合物。
33. -種識別治療劑的方法，所述方法包括： (a) 提供測試藥劑； (b) 將所述藥劑暴露於TOE4B和TOE4D;和 (c) 測定編碼TOE4B和TOE4D的基因的表達水平和/或所編碼磷酸二酯酶的活性水平， 其中抑制TOE4B的表達或活性、但不顯著抑制TOE4D的表達或活性的藥劑為用於癌症、炎症 或纖維化的治療的潛在治療劑。
34. -種治療罹患癌症、炎性疾病或纖維化的患者的方法，所述方法包括向所述患者施 用治療有效量的包含抑制TOE4B的表達、但不顯著抑制TOE4D的表達的核酸的藥物組合物。
35. 根據權利要求34所述的方法，其中所述核酸為反義寡聚核苷酸、微RNA或介導 RNAi的核酸。
【文檔編號】A61P29/00GK104379180SQ201380029324
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年4月9日 優先權日:2012年4月10日
【發明者】李建東 申請人:喬治亞州立大學研究基金會公司