編碼豬鏈球菌毒性特徵的dna序列及衍生的多肽的抗體的製作方法
2023-06-03 14:37:01
專利名稱：：編碼豬鏈球菌毒性特徵的dna序列及衍生的多肽的抗體的製作方法
技術領域：
：本發明涉及人和獸預防醫學領域，特別是涉及由豬鏈球菌(Streptococcussuis)之致病性菌株引起感染的診斷和預防領域。自1983年來，小豬在差不多斷奶時感染豬鏈球菌血清2型已在荷蘭成為一個越來越嚴重的問題。疾病的特徵是出現腦膜炎、關節炎、膿毒血症以致死亡(Clifton-Hadley，1983，ref.6;Vechtetal.，1985，ref.44;Windson1977，ref，50)。據估計，5-10%的飼養場有這樣的問題。估計死亡率為2.5%，在受影響的飼養場中平均發病率為2-5%。現有治療和預防措施的作用很有限。因此所造成經濟損失是很大的。該病是一種動物傳染病。人也是該病的感染對象，有導致膿毒血症和腦膜炎危險並可能造成持久性後遺症;已報導了一例死亡病例(ArendsandZanen1988，ref，2)。人類病例與皮膚受傷進而與被感染豬肉接觸有關。特別是豬飼養場和屠宰場工作人員即屬於危險人群。有證據表明，自1983年以來，荷蘭豬飼養場中該發病率升高是由於進口廠攜帶2型豬鏈球菌的種畜。帶菌動物常常是在扁桃體內隱藏有鏈球菌的健康成年豬。感染通過這些帶菌豬傳染給敏感動物，特別是處在斷奶期的小豬。對已患病或死亡動物的診斷是基於從臨床標本和器官材料中分離並檢出2型豬鏈球菌。確定帶菌者是基於使用選擇培養基對咽拭子或扁桃體活檢組織作細菌學檢查(VanLeengoedetal.，-1987，ref.27)。在診斷學試驗的基礎上確定帶菌個體，進而有可能建立控制方案。然而為檢查帶菌個體須處理大量樣品，故消費許多時間;而且由於汙染菌的過度生長而出現假陰性結果。最後，對實驗數據的整理分析需要有大量的實踐經驗。再者，診斷和在診斷的基礎上進行的可能的控制將因2型豬鏈球菌菌種內不同菌株在致病性上的差異而進一步複雜化。如果2型豬鏈球菌的毒性菌株確實與無毒性菌株有結構上的差異，也許有可能對控制程序內的帶菌個體進行結構試驗，但目前的診斷技術還不能作出這種區分。因此，有針對性的控制仍不可能實現。毒性差異本身取決於是否存在毒性因子。早在1984年，Arends和Zanen(ref.1)已描述了感染人體之菌株中的「溶菌酶陽性」蛋白質。在動物實驗中發現，「溶菌酶陽性」菌株(D-282)對無菌豬是有致病性的，相反「溶菌酶陰性」菌株(T-15)則對其無致病性(Vechtetal.1989，ref.43)。菌株D-282的「溶菌酶陽性蛋白質」可能與「胞壁質酶釋放蛋白質」(MRP)相同。荷蘭和其他一些國家的豬養殖業均呈錐體結構，即頂部是小數量的繁殖場，動物從這裡提供給飼養場。最終由這些飼養場提供給大量增肥養殖場，再從這裡將動物產品送到屠宰場。在診斷的基礎上建立的控制戰略(確認各場、清除陽性帶菌個體、進口要求)應須針對該錐體中高處的場所。疫苗也應能在錐體中的較低場中使用。此外，診斷豬鏈球菌感染的工具和方法在人類醫學中可能是有價值的。本發明的目的是以迄今更為有效方式，提供一種一方面可能用於檢驗豬鏈球菌感染，另一方面又可預防這種感染的方法和工具。該目的是通過使用來自編碼豬鏈球菌之毒性特徵的基因的DNA序列而實現的。在這裡，毒性特徵應理解為一個多肽，其存在與生物體-在這種情況下是指豬鏈球菌，特別是2型豬鏈球菌-的毒性有關。已發現了兩個分別編碼定名為MRP(胞壁質酶釋放蛋白質)和EF(細胞外因子)，並且似乎與毒性特徵有關(即毒性因子)之兩種蛋白質的2型豬鏈球菌毒性菌株的基因。MRP和EP均為高分子量蛋白質。MRP(136KD)是一種與細胞外膜有關並可在胞壁質酶作用下由細胞壁釋放的蛋白質。EP(110KD)是一種從細菌體內分泌到生長培養基中的細胞外蛋白質。根據本發明，已基於這些基因和其表達產物建立了能夠區分毒性和非毒性菌株的診斷方法。迄今為止，已在由所說的基因表達一種或兩種蛋白質的基礎上，發現了2型豬鏈球菌的三個不同的表型即MRP+EF+表型、MRP+EF-表型和MRP-EF-表型。發現從有臨床病症的豬器官中分離的菌株中，有77%(n＝111)具有MRP+EF+表型，而從無可疑感染之正常屠宰豬扁桃體中分離的菌株，有86%(n＝42)屬於MRP+EF+表型。MRP+EF-表型最常見於有2型豬鏈球菌感染的病人(74%，n＝27)(參見圖21)。為此有可能確定豬鏈球菌毒性菌株的帶菌者並進而開發相應疫苗。使用該疫苗，例如可建立在豬養殖場使用的控制2型豬鏈球菌感染的方法。因此本發明涉及除編碼特異性高分子量多肽外，還編碼作為豬鏈球菌毒性特徵之90-120KDa多肽的DNA序列和其等價序列及其部分，該下文中所稱的ef基因具有如圖1A所示的2型豬鏈球菌菌株D-282的核苷酸序列。已確定了編碼EF之整個區域的核苷酸序列及其側翼序列。對ef基因之序列(圖1A)的分析，提供了編碼843個胺基酸之多肽(計算的分子量為(90，014)的2529核苷酸開放讀碼(openreadingframe)。產生了抗110KDaEF的單克隆抗體，此抗體可識別所有38個有MRP+EF-表型之菌株的培養物上清液中的高分子量蛋白質。這表明110KDaEP和高分子量蛋白質的某些抗原決定基是相同的。發現所有91個帶MRP+EF+表型的菌株都不產生這些高分子量蛋白質。同時發現基於編碼110KDaEF之基因的DNA探針可與編碼MRP+EF-菌株之高分子量蛋白質的基因雜交。這表明110KDaEF和高分子量蛋白質相關，提示來自帶MRP+EF-表型之菌株的ef基因的至少一部分與來自MRP+EF+表型菌株的ef基因相同。這裡將蛋白質EF的較高分子量對應物稱為EF＊，並將其編碼基因稱為ef＊基因。相應的核苷酸和胺基酸序列示於圖1B中。本發明涉及編碼135-136KDa多肽之基因的DNA序列，其等價序列和其部分，所說的多肽也是豬鏈球菌的毒性特徵，其基因-下文中稱為mrp基因-具有豬鏈球菌血清2型菌株D-282的如圖2所示的核苷酸序列。已確定了編碼MRP之完整區域的核苷酸序列及其側翼序列。對mrp基因序列(圖2)的分析顯示了編碼1256胺基酸多肽(計算的分子量為135，794)的3768核苷酸開放讀碼。本文中，等價序列應理解為基本上與所示序列相同但可能表現出少許差異的序列，如由定點突變或經取代、缺失、插入或加入等修飾作用造成的差異;同樣，等價序列也理解為不管核苷酸序列有什麼差異，但仍能與所示序列或其互補物雜交的序列，以及由之產生的序列，即是說儘管核苷酸有差異但仍能編碼同一胺基酸序列。本發明還涉及在調節序列存在下，含有上述ef基因和/或mrp基因序列的重組多核苷酸。這種類型的重組體，正如病毒載體、質粒或細菌一樣，可用於在理想環境中表達該基因或其相關部分，例如產生用於診斷毒性豬鏈球菌感染或用於控制毒性菌株感染的免疫原性肽。含有衍生於編碼豬鏈球菌毒性特徵之基因的上述序列的多核苷酸探針也構成本發明的一部分。這種類型的探針具體是與上述的一個或兩個基因的核苷酸序列相對應的。適用的探針一般至少有10個核苷酸長。可用探針直接檢測豬鏈球菌毒性菌株序列的存在。作為診斷方法和預防方法的一部分，也可用探針作為擴增多肽(如在聚合酶鏈反應中)的引物。發現適當的多肽探針是含有來自mrp基因之序列1100-1934的至少10個核苷酸，較好至少15個核苷酸，至多835個或至多532個核苷酸的部分序列。發現另一個適用的多肽探針含有來自ef＊基因之序列2890-3306的10-417個，較好15-360個核苷酸的部分序列。其中每個探針都能有效地區分開豬鏈球菌的致病性和非致病性菌株。也可將基於mrp的探針和基於ef＊的探針聯合使用，作為更有效力的診斷工具。本發明還涉及衍生於上述多肽序列的多肽。該類型的多肽可由所說基因編碼，或者是通過表達所說的序列得到的，並且基本上相當於豬鏈球菌毒性特徵性蛋白質或其部分。例如，該類型的多肽可在免疫學試驗中用作抗原，在免疫動物時用作免疫原，或在生產用於診斷目的的抗體時用作免疫原。以這種方式產生的抗體也構成本發明的一部分。這種類型的抗體可以是單克隆或多克隆的，並且可提供標誌物(酶、放射性核素、發光物質或複合物形成劑);抗體也可與固相載體結合。本發明還涉及檢驗豬鏈球菌致病菌株感染的方法，其中使用了上述的一個或多個多核苷酸探針、多肽和/或抗體。「感染」在本文中是指有疾病症狀(狹意感染)和無疫病症狀(廣意感染，或汙染)的情況下存在病原生物體。在進行免疫檢驗時，如檢測樣品或臨床材料中豬鏈球菌抗原和/或抗體的存在時，例如可在微量滴定板上使用已由ef/ef＊基因或其部分衍生的多肽(110KDa)，和/或已產生的抗該多肽的抗體。另外，也可使用衍生於mrp基因或其部分的多肽(136KDa)。可使用已知的程序完成診斷方法。如酶聯免疫吸附法(ELISA)和雙抗體夾心(DAS)-ELISA法。可藉助診斷試劑盒實踐上述方法。本發明的診斷試劑盒分別含有至少一種相當於或衍生於ef/ef＊基因或mrp基因之序列或其部分的多核苷酸或多肽，或者含有已產生之抗衍生於所說ef/ef＊和mrp序列之一的多肽的抗體。其中也可聯合使用探針及其他診斷劑，特別是ef＊診斷劑和mrp診斷劑，或者聯合使用進行PCR的各引物。試劑盒還可含有完成診斷所需的其他組份，如標記物質、染料等試劑，濾紙、平皿等載體，培養基和標定劑以及診斷操作手冊。本發明還涉及保護動物免於豬鏈球菌感染的方法，該方法中使用了上述的多核苷酸、多肽或抗體。當使用抗體時，該方法為被動免疫，即直接提供抗病原生物體的抗體;因為衍生於EF、EF＊和MRP的抗體是針對大多數毒性豬鏈球菌的，所以這種方法對於預防或控制感染為一種有效的方法，特別是在被保護動物本身不能產生足夠的抗體時，例如在感染已經發生或感染發生在幼小動物的情況下。對豬的另一種形式的被動免疫是通過母豬的初乳給小豬提供抗體。在這種情況下，是在母豬妊娠期間，即小豬出生前用一種或兩種肽對其進行主動免疫。當使用多肽或多核苷酸(也可選擇以重組生物體形式的)時，該方法是一種主動免疫法，即藉助直接使用的、或以待表達之基因形式使用的免疫原性多肽來刺激被保護動物產生抗體。另一種免疫方法是給動物使用負責中和毒性的活性多肽。這種形式的多肽已不再有致病性，而只保留了免疫原性特徵。例如，已藉助缺失作用對原始ef/ef＊或mrp基因進行了修飾，然後表達該基因以得到這樣的多肽。用於保護動物免於遭受豬鏈球菌感染的疫苗，即含有上述多核苷酸、多肽或抗體的疫苗也構成本發明的一部分。本發明的特定疫苗是含有並不或並不完全引起相當於EF和MRP之至少一種多肽表達的豬鏈球菌的疫苗。該材料可來源於一種無毒性或較少毒性的可能的活菌株，或者可由之形成。已在體內藉助就特定毒性因子(MRP和EF)來說帶有2型豬鏈球菌的無菌小豬研究了涉及2型豬鏈球菌之致病性的毒性因子的作用。以血液學、細菌學和(組織)病理學分析技術監測動物實驗結果。圖1Aef基因的核苷酸序列和相鄰序列以及由之衍生的EF胺基酸序列。並標出了推測的核糖體結合位點、推測之啟動子的-35和-10區域，以及帶互補對稱性的區域。信號肽酶的可能裂解位點在核苷酸498-499之間。在圖1A中，SEQIDNO1序列類型核苷酸及相應蛋白質序列長度4376鹼基對鏈型單鏈拓樸學線性分子類型基因組DNA原始來源生物體Ⅱ型豬鏈球菌(致病性的)性質細胞外蛋白因子(EF)基因特性從bp66到71啟動子-35區域從bp89到94啟動子-10區域從bp153到158啟動子-35區域從bp176到181啟動子-10區域從bp350到356核糖體結合位點從bp361到498信號肽從bp499到2890成熟肽從bp4186到4198和bp4203到4215雙對稱性區域從bp4243到4257和bp4263到4276雙對稱性區域圖1B編碼菌株1890的2型豬鏈球菌ef＊基因之片段的核苷酸序列和推導的1類EF＊蛋白質的胺基酸序列。指出了推測的核糖體結合位點、推斷之啟動子序列的-35和-10位域、重複區域R1-R11、以及推測的終止信號。在編碼110KDaEF蛋白質的基因中沒有核苷酸2859和5228之間的區域。在編碼Ⅳ類和Ⅴ類EF＊蛋白質的基因中沒有核苷酸3423和4456之間的區域。在圖1B中，SEQIDNO2序列類型核苷酸及相應蛋白質序列長度6744鹼基對序列類型單鏈拓樸學線性分子類型基因組DNA原始來源生物體Ⅱ型豬鏈球菌(非致病性的)性質細胞外因子相關蛋白質(EF＊)基因特徵從bp66到71啟動子-35區域從bp86到94啟動子-10區域從bp153到158啟動子-35區域從bp176到181啟動子-10區域從bp350到356核糖體結合位點從bp361到498信號肽從bp499和5826成熟肽從bp2869、3097、3292、3520、4087、4381、4609、4837、5065、5293、5521重複單位R1-R11的起始點從bp2932、3160、3355、3583、4150、4444、4672、4900、5128、5356、5584重複序列Asn-Pro-Asn-Leu起始點從bp6554到6566和bp6571到6583雙對稱性區域從bp6611到6625和6631到6644雙對稱性區域圖2.含2型豬鏈球菌mrp基因炎4.6KbEooRI-HindIII片段的核苷酸序列和由之衍生的MRP胺基酸序列。指出了可能的核糖體結合位點、推測之啟動子序列的-35和-10區域、mrp基因後面的互補對稱性區域、推測的信號肽的切割位點、富脯氨酸區域、重複胺基酸序列和外膜固著區域。在圖2中，SEQIDNO3序列類型核苷酸及相應蛋白質序列長度4118鹼基對鏈型單鏈拓樸學線性分子類型基因組DNA原始來源生物體Ⅱ型豬鏈球菌(致病性的)性質胞壁質酶釋放蛋白(MRP)基因特徵從bp4到9啟動子-35區域從bp29到34啟動子-10區域從bp40到45啟動子-35區域從bp63到68啟動子-10區域從bp147到152核糖體結合位點從bp159到299信號肽從bp300到3926成熟肽從bp2757到3014富脯氨酸區域從bp3015到3176、3423到3584及3585到3743重複單位從bp3825到3926膜固著序列從bp4069到4080和bp4087到4098雙對稱性區域圖3亞克隆到質粒載體pKUN19(10)中的、含ef片段的限制性酶切圖。方框內是開放讀碼。限制性位點B-BamHI;Bg-BglII;E-EcoRI;K-KpnI;N-NarI;P-PstI;S-SnaBI;Sa-SalI;Sp-SpeI。圖4圖解說明編碼110KDaEF蛋白質的基因和其側翼區。110KDaEF蛋白質由開放讀碼1(ORF1)編碼。ORF1的3′端與ORF2的5′端重迭。ORF2和ORF3被TAA終止密碼子分開。指出了有意義的限制性酶切位點。圖5圖解說明5個不同類ef＊基因和ef基因的PstI-SnaBI片段。箭頭指示重複的胺基酸單位。橫線標示存在可不同菌株中的區域。間隙標示在不同的菌株中缺少的區域。圖6靠近Ⅳ和Ⅴ(A)類ef＊基因中及ef基因(B)中缺少之片段的末端的核苷酸序列。最上面和中間的序代表側接缺少片段之左和右側端的區域。下面的序列顯示見於Ⅳ和Ⅴ類ef＊基因(A)和ef基因(B)中的接合點。直接重複序列示於方框中。黑體核苷酸標示轉譯三聯子的第一個鹼基。序號是指Ⅰ類ef＊基因中的核苷酸位置(圖1A)。圖7推斷的MRP陽性重組噬菌體之DNA插入段的限制圖。粗線指示存在於所有這些克隆中的DNA區。限制性位點E-EcoRI;H-HindIII;X-XbaI;K-KpnI;S-SacI。DNA插入段的B部分被亞克隆到質粒載體pKUN19(24)中。圖8對由重組質粒和重組噬菌體編碼之蛋白質(已用抗MRP的單克隆抗體分離出來)的Western印跡分析。泳道1陰性對照;從MRP陰性豬鏈球菌菌株之細胞壁中提取的蛋白質。泳道2含有從菌株D282之細胞壁中提取之蛋白質的粗MRP製劑。泳道3pMR7-1。泳道4pMR7-2。泳道5pMR9-1。泳道6pMR9-2。泳道7pMR10-1。泳道8pMR10-2。泳道9帶控制插入子的λGEM11。泳道10λ克隆7。泳道11λ克隆9。泳道12λ克隆10。泳疲乏13λ克隆11。圖9用抗MRP/EF兔K191血清(1∶500稀釋的)探查之原生質體上清液(PPS)、培養物上清液(Cult.Sup.)和膜囊泡(Membr)部分的Western印跡。各泳道名稱均由編號的菌株命名表示。圖10用兔抗MRP/EF血清(K191)、抗MRP血清和抗EF血清(1∶500稀釋的)探查的選擇之豬鏈球菌2型菌株細胞培養物上清液的Western印跡。PAb揭示了三個豬鏈球菌2型表型MRP+EF+、MRP+EF-和MRP-EF-。各泳道命名即相應菌株名稱。參考菌株1(D-282)和菌株3至9(MRP+EF+)是從患豬鏈球菌性腦膜炎和豬體內分離的。參考菌株2(T-15)和菌株10、12、16和17是從健康豬的扁桃體中分離的。菌株22、23、24、25、26、28和29是從病人體內分離的。圖11MRP的水親和性圖形。水平線上方和下面的序列分別代表疏水和親水區域。圖12MRP和幾種革蘭氏陽性菌之細胞包膜相關蛋白質C未端胺基酸序列間的同源性。豬鏈球菌MRP與化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的M6蛋白質(20)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)之蛋白質A(16)、G群鏈球菌之蛋白質G(10)、化膿鏈球菌之AP4(13)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)之LP(46)、變異鏈球菌(S.mutans)炎WAP4(11)、化膿鏈球菌之T6和金黃色葡萄球菌之Fn-Bp(39)的胺基酸序列相比較。圖13MRP中重複單位之胺基酸序列的比較。同源區括在方框內。圖14用作探針的mrp和ef基因的片段。各圖上方是用於產生探針之限制性位點的定位。用作探針的片段以實心縱線標示。實心縱線左邊是探針縮寫符號。箭頭指示各基因的開放讀碼(ORF)。圖14amrp基因的探針。SacI和HindIII位點尚未完全證實，但它們是通過亞克隆mrp基因的片段而產生的。圖14bef基因的探針。圖14cef＊基因的探針。開放縱線標示不是ef基因部分的ef基因的插入段序列。實施例1編碼致病性豬鏈球菌2型菌株110KDa細胞外蛋白質之基因的克隆及核苷酸序列分析材料和方法細菌菌株和生長條件使用大腸桿菌菌株JM101(29)和LE392(33)作為重組質粒和噬菌體的宿主。用2型豬鏈球菌的致病性MRP+EF+菌株D282(43)分離染色體DNA。大腸桿菌菌株生長在LB肉湯(Luriabroth)(30)中。必要時加入終濃度為50μg/ml的氨苄青黴素。豬鏈球菌菌株生長於Todd-Hewitt培養液(Oxoid，Ltd.，London，England)中。DNA文庫的構建和免疫學篩選按克隆載體製造者(Promega，Madison，USA)推薦的方法在λGEM-11中構建豬鏈球菌2型菌株D282的DNA文庫。將重組噬菌體鋪敷在大腸桿菌菌株LE392平皿上並於37℃下保溫16小時。將硝酸纖維素濾膜(SchleicherandSchuell，Inc.，Dassel，Germany)放在噬斑上，並將平皿繼續在37℃下保溫2小時。用抗EF的單克隆抗體(Mabs)顯示產生EF的重組體(實施例4)。按Sambrook等人(28)所述方法用連接了鹼性磷酸酶的抗小鼠血清(ZymedLaboratories，Inc.SanFrancisco，USA)檢測結合的抗體。經幾次單個噬斑分離和免疫學篩選法純化選擇的EF陰性克隆。十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯醯胺電泳(PAGE)和Western印跡分析用SDS凝膠電泳法分離蛋白質，其中使用4%的堆積膠和6%的分離膠。將分離的蛋白質轉移到置於半乾(SemiDry)轉移小室(Bio-RadLaboratories，Richmond，USA)中的硝化纖維素膜上。使用多克隆抗體(Pab，實施例4)或抗EF的Mabs並與磷性磷酸酶結合的抗兔或抗小鼠血清(ZymedLaboratories)顯現特異性蛋白質。DNA操作和核苷酸序列分析按常規分子生物學技術(28)將分離的片段(亞)克隆到質粒載體pKUN19(24)中。用購自Promega(Madison，USA)的Erase-a-Base系統造成連續單向性缺失。用雙脫氧鏈終止法(37)測定DNA序列。用軟體接口裝置PCGENE(Intelli-geneticCorp.，MountainView，CA)和WisconsinGCG(UniversityofWisconsin)分析DNA和蛋白質序列。結果ef基因的克隆。從2型豬鏈球菌的菌株D282中分離染色體DNA，構建DNA文庫。用限制性酶Sau3A部分消化該DNA，並克隆到噬菌體λGEM11置換載體中。該文庫中每微克DNA大約含有5×105個重組體。使用抗EF單克隆抗體(Mab)檢驗重組噬菌體的2，000個噬斑中是否存在EF的抗原決定基。其中兩個噬斑為陰性。用Western印跡法分析由噬斑中洗脫的蛋白質，以研究兩個選擇的重組噬菌體的EF表達。兩重組體均編碼與豬鏈球菌分泌的EF共遷移並被抗EFMabs識別的蛋白質。因此兩重組噬菌體都含有EF的完整遺傳信息。使用限制性酶分析法定位重組的噬菌體上的遺傳信息，兩個克隆都有一個大約13Kb的DNA區域。將此共同DNA區域的部分亞克隆到質粒pKUN19中(圖3)並用Western印跡法分析由重組質粒表達的蛋白質。含有6.8KbKpnI-SalI片段的質粒(pEF2-19，圖3)編碼一分子量與EF相同，且可被抗EFMabs識別的蛋白質。但含有5.8KbEcoRV-SalI或5.3KbBglII-SalI片段的質粒則不表達EF。這些數據表明，EcoRV和BglII位點是在EF表達所需的區域內。ef基因的核苷酸序列。檢測含有EF編碼區之片段的核苷酸序列。結果顯示該序列(圖1A)中存在三個分別編碼含843胺基酸、201胺基酸和197胺基酸之多肽的主要開放讀碼(ORF)，即ORF1(從核苷酸361到2890)、ORF2(從核苷酸2856到3459)和ORF3(從核苷酸3462到4053)。ORF1含有一個推測的ATG起始密碼子，其前面是一個與幾種類型革蘭氏陽性細菌之核糖體結合位點相似的序列(17)。相反，在ORF2和3的上遊既沒見有起始密碼子，也波找到核糖體結合位點。ORF1的3′端與ORF2的5′互相重迭，儘管它們是在不同的讀碼中。ORF2和3被一單個的TAA終止密碼子分隔開。發現了ORF1兩個推測的啟動子序列的上遊區與常見於革蘭氏陽性菌中啟動子的-35和-10相符序列(consensussequence)相似(圖1A)。ORF3的下遊，存在著兩個外延的雙對稱性區域。因為兩區域均含有一段處在可能的柄一環結構之末端的胸苷殘基，所以這些潛在的轉錄終止子可能是不依賴於P因子(34、40)的。由於序列數據沒有明顯揭示ORF2和ORF3上遊或其中的轉錄和轉譯信號，故不能肯定這些ORF均表達蛋白質。另一種可能性是整個已測定了序列的區域中只含有一個大的開放讀碼。如果只存在兩處序列錯誤即會出現這種情況在區域2856至2892中有+1鹼基對移碼，並且在位置3459處終止密碼子中有一處錯誤。但這種可能性被測定來自三個另外的、獨立選擇之克隆的ef基因的序列得以排除了。使用最初克隆的片段作雜交探針，以從染色體中分離3個克隆。這些片段的核苷酸序列與圖1A中所示者相同。EF的胺基酸序列。因為只有ORF1前面接有適當的表達/起始信號，所以該ORF可能編碼EF。這一點通過將下述兩個片段亞克隆到質粒PKUN19中得以證實一個是含有整個ORF1和ORF2的SpeI-SnaBI片段;一個是含有ORFS1和ORF2的5′端的SpeI-NarI片段(圖3)。以Western印跡法分析由重組質粒表達的該蛋白質。在大腸桿菌中兩重組質粒編碼被抗EF單克隆抗體識別的、並且與豬鏈球菌分泌的EF有相同分子量的蛋白質。因此可知ORF1編碼EF。但根據序列計算的ORF1產物的分子量(90，000)不同於根據SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳估測的EF的分子量(110，000)。由於EF全都無例外地見於豬鏈球菌培養物的上清液中，故預想該蛋白質的前面接有信號肽。推斷的EF胺基酸序列的前46個胺基酸確實具有典型信號肽的特徵。含有6個帶正電荷胺基酸之N末端部分後面是有21個胺基酸的疏水核心和推測的信號肽酶裂解位點(45)。推斷之胺基酸序列的水處理曲線(25)顯示，除信號肽外，EF蛋白質是親水的，而且並不含有延伸的疏水區域。發現推斷的EF胺基酸序列與EMBL資料庫中的蛋白質序列之間沒有明顯的相似性。雖然在ORF2和ORF3的上遊沒有發現適當的轉譯起始信號，但推測的ORF2和ORF3之胺基酸序列所顯示的某些性質不大會使人們產生這些讀碼未得以表達的見解。推斷的ORF2蛋白質的N末端顯示了兩個57氨基的高度重複單位(82%相同)。推定的ORF3蛋白質的C末端在功能上相似於幾個革蘭氏陽性菌細胞包膜定位的蛋白質的C末端(10、12、13、16、41)。疏水區的前面是保守序列Leu-Pro-X-Thr-Gly-Glu，且後面跟著一個親水區。這一相似性提示推定的ORF3蛋白質是與細胞包膜相關聯的。實施例2編碼非致病性豬鏈球菌2型菌株細胸外蛋白質之基因的克隆及核苷酸序列分析材料和方法細菌菌株及生長條件。用大腸桿菌菌株JM101(29)作為重組質粒的宿主。從病人體內分離17個2型鏈球菌的MRP+EF＊菌株，從屠宰的豬扁桃體中分離5個菌株、從患病豬的器官中分離7個菌株，並有兩個菌株來源不明(實施例4)。大腸桿菌菌株生長於LB肉湯(30)中。必要時加入終濃度為50μg/ml氨苄青黴素。豬鏈球菌菌株生長在Todd-Hewitt培養液(Oxid，Ltd.，London，England)中。基因組DNA及寡核苷酸。經在蛋白酶K/SDS溶液中溶解、用苯酚/氯仿提取並用乙醇沉澱以分離基因組DNA。用於聚合酶鏈反應(PCR)的寡核苷酸序列是5'-ATGTAATTGAATTCTCTTTTTAAGT-3'和5'-AAACGTCCGCAGACTTCTAGATTAAAAGC-3'。這些寡核苷酸相應於2型豬鏈球菌ef基因中的位置35至59和4308至4279。劃下線的序列為限制性酶EcoRI和XbaI的識別位點。DNA操作和核苷酸序列分板按實施例1中所述方法進行。SDS-PAGE和Western印跡分析按實施例1中所述方法進行。Southern雜交。按Sambrook等人所述方法(28)將DNA轉移到Gene-ScreenPlus膜(NewEnglandNuclearCorp，Dveieich，Germany)上。使用隨機引物標記試劑盒(BoehringerGmhH，Mannheim，Germany)，用[C32P)dCTP](3000Ci/mMol，AmershamCorp，ArlingtonHeights，USA)標記DNA探針。按Geen-ScreenPlus膜提供者推薦的方法使印跡與DNA探針雜交。雜交後用2×SSC(1×SSC是0.15MNaCl加0.015M檸檬酸三鈉，pH7.0)將濾膜於室溫下洗兩次，每次5分鐘，再用0.1XSSC加0.5%SDS的溶液於65℃下洗兩次，每次30分鐘。用聚合酶鏈反應(PCR)技術擴增基因組DNA片段。使用PCR技術擴增ef＊序列。用得自2型豬鏈球菌之不同MRP+EF＊菌株的基因組DNA作為模板(實施例4)。用瓊脂糖凝膠電泳法分離並用GeneClean(Biol101，LaJolla，USA)從凝膠中提取已擴增的DNA片段。用EcoRI和XbaI消化純化的片段並克隆到質粒PKUN19(24)中。為了排除PCR過程中產生的DNA序列錯誤，將6個獨立選擇的克隆混合後用於核苷酸序列分析。結果EF＊蛋白質的Western印跡。屬於MRP+EF＊表型之豬鏈球菌2型菌株的培養物上清液中含有可被抗EF單克隆抗體識別的蛋白質(實施例4，6)。這些蛋白質的分子量(MW)有所不同，並且都高於EF的分子量。將31個MRP+EF＊表型菌株分泌的蛋白質與由MRP+EF＊表型之菌株分泌的蛋白質相比較，發現了五類不同分子量的EF＊蛋白質。有三個菌株合成了約195KDa的EF＊蛋白質(Ⅰ類);18個菌株合成了約180KDa的EF＊(Ⅱ類);1個菌株合成了約175KDa的EF＊(Ⅲ類);5個菌株合成了約160KDa的EF＊(Ⅳ類);4個菌株合成了約155KDa的EF＊(Ⅴ類)。ef＊基因的Southern雜交。研究了編碼110KDaEF和EF＊蛋白質之基因間的相互關係。用限制性酶PstI消化不同的MRP+EF＊菌株(每類中各取兩個有代表性的)和MRP+EF+菌株D282的染色體DNA(43)。各不同的DNA均與含有完整ef基因的32P標記的EcoRV-SnaBI片段雜交(圖4，參見實施例1)。結果顯示，MRP+EF＊及MRP+EF＊菌株的DNA消化產物含有兩個與探針強雜交的PstI片段。這些數據表明，編碼110KDaEF和EF＊蛋白質的基因是密切相關的。在所有菌株中，最大雜交片段的長度都相同。相反，各菌株間最小雜交片段的長度則彼此不同。此外，最小雜交片段之長度的變異與不同菌株分泌之EF＊蛋白質的分子量變異密切相關。因為最小雜交片段位於ef基因的3′端(圖4，實施例1)，這些數據提示ef和ef＊基因不同主要是在它們的3′端。ef＊基因的克隆。使用PCR擴增含ef＊的DNA以得到編碼不同EF＊蛋白質的基因。使用5個不同之2型豬鏈球菌MRP+EF＊菌株(每類各取1個有代表性的菌株)的基因組DNA作為模板。用限制性酶EcoRI和XbaI消化已擴增的片段並克隆到大腸桿菌中。Ⅰ類ef＊基因。測定含完整Ⅰ類ef＊基因及其側翼區域的6.8KbEcoRI-XbaI片段的核苷酸序列。序列分析揭示了兩個開放讀碼(ORFs，圖1B)。第一個ORF(從核苷酸361到5827)和第二個ORF(從核苷酸5830到6421)分別編碼1822胺基酸和197胺基酸的多肽。根據其大小，預期第一個ORF編碼EF＊蛋白質(195KDa)。ORFs被單個TAA終止密碼子分隔開。第一個ORF含有一推斷的ATG起始密碼子，該密碼子的前面是相似於細菌核糖體結合位點的序列(17)。相反，第二個ORF前面既沒有適當的起始密碼子，也沒有推定的核糖體結合位點。在推定的EF＊蛋白質之胺基酸序列中，前46個胺基酸具有典型信號肽的特徵(45)。蛋白質成熟部分的C末端含有許多不完全的76胺基酸重複。在Ⅰ類EF＊蛋白質中存在有十個半重複單位(記為R1至R11，圖1B)。前4個重複單位是相鄰接的，後六個半重複單位也是相鄰的。但第四和第五個重複單位被113個胺基酸分開，且第五和第六個單位被22個胺基酸分開(圖5)。後五個半單位的胺基酸序列是高度保守的，而前五個單位是可變的。一個特定胺基酸序列，Asn-Pro-Asn-Leu保留在所有的重複單位中。發現Ⅰ類EF＊序列和EMBL資料庫中的任何蛋白質序列間都沒有明顯同源性。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ類ef＊基因。因為編碼各種EF＊蛋白質的基因間主要差異在於它們的3′端，所以測定了Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ類基因之小PstI片段的核苷酸序列。比較這些核苷酸序列，顯示各不同ef＊基因在該區域是高度同源的。但各ef＊基因在重複單位的數目和排列上彼此有所不同(圖5)、(51)。與Ⅰ類ef＊不同，Ⅱ和Ⅳ類ef＊基因缺少R9和R10區域;Ⅲ類缺少R6、R7和R9區域，且Ⅳ類缺少R7、R8和R9區域。另外，Ⅳ和Ⅴ類ef＊基因缺少一個含有R4、R5及部分R3和R6區域的1，032bp片段。該區域的轉譯讀碼定位在保留了上述區域之缺失片段的3′端。在該1，032bp片段之左和右側端區域中的核苷酸序列顯示了9bp的直接重複(圖6A)。ef＊和ef基因間的同源性因為EF＊蛋白質可被抗110KDa蛋白質的Mab識別，並且ef＊基因可與ef探針產生強雜交，所以推想ef(實施例1)和ef＊基因是部分相同的。比較Ⅰ類ef和ef＊基因的核苷酸序列，顯示位在ef和ef＊編碼區之5′端的2，499個核苷酸是完全相同的。與編碼Ⅰ類EF＊蛋白質的基因不同，編碼110KDaEF蛋白質的基因缺少一個2，368bp的片段。由於這一缺失而改變了讀碼，並且使位在2，368bp片段之3′端的區域在ef和ef＊基因中以不同的讀碼被轉譯。因此，110KDaEF蛋白質將不含有重複的胺基酸單位。分析2，368bp片段之左和右側端區域上的核苷酸序列，顯示了10bp的直接重複(含有1處錯配)(圖6B)。據此，推測編碼110KDaEF蛋白質的基因可能是特異性缺失ef＊基因內2，368片段的結果。這將意味著非致病性的豬鏈球菌菌株可變成致病性的菌株。實施例3編碼2型豬鏈球菌136KDa表面蛋白質(MRP)之基因的克隆和核苷酸序列材料和方法細菌菌株和生長條件。用大腸桿菌菌株JM101(SupE，thi，(lac-proAB-)[F′traD36，lacIqZ△M15]29)作為重組質粒DNA的宿主。用大腸桿菌菌株LE392[F，hsdR574(rK-，mK+)，SupE44，SupF58，lacY1，或△(laclZY)6，galK2，galT22，melB1，trpR55](33)作為重組噬菌體的宿主。從2型豬鏈球菌的致病性MRP+EF+菌株D282(43)中分離染色體DNA。大腸桿菌菌株生長在LB培養基(30)上。固體LB培養基含有1.5%瓊脂。需要時可加入終濃度達50μg/ml的氨苄青黴素。豬鏈球菌菌株生長在Todd-Hewitt培養基(OxoidLtd.)中。Southern雜交按實施例2中所述方法進行。DNA文庫的構建和免疫學篩選按實施例1中所述方法進行，只是其中以MRP代替了EF。SDS-PAGE和Western印跡分析按實施例1中所述方法進行，只是其中以MR代替了EF。核苷酸序列分析按實施例1所述方法進行。結果文庫的構建和篩選。用限制性酶Sau3A部分消化從2型豬鏈球菌菌株D282中分離的染色體DNA。然後在噬菌體λGEM11置換載體中構建DNA文庫，得到大約5×105個重組體/μgDNA。用抗MRP的MAb篩選，1，400個重組噬菌體，以確定MRP抗原決定基的存在。得到5個呈陽性反應的噬斑。免疫反應性重組體的特徵。用Western印跡法分析從噬斑中洗脫的蛋白質，以研究5個選擇的重組噬菌體對MRP的表達。所有5個重組體都編碼可被抗MRP之MAb識別的蛋白質。但這些蛋白質的分子量(MW)比MRP低。有兩個克隆編碼約70KDa的蛋白質(克隆10和11);兩個克隆編碼約80KDa的蛋白質(克隆9和12)，一個克隆編碼約90KDa的蛋白質(克隆7)。因此，可以認為這5個重組體都不含MRP的完整遺傳信息。用限制性酶切分析法比較5個重組體的DNA插入段。所有克隆都有一個大約17Kb的DNA區域(圖7A)。但該DNA插段在3′和5′端有所不同。插段3′端長度的變異與剪短之MRP蛋白質的MW變異有著密切地關聯(參見圖7A)。這種相互關係表明MRP編碼序列是定位在DNA插段的3′端。另外將衍生於克隆7、9和10之DNA插段3′端的片段(圖7B)克隆到質粒載體pKUN19(24)中也進一步證實了這一點。這些構建體編碼的剪短形式的MRP蛋白質與重組噬菌體編碼的剪短之MRP蛋白質沒有明確可見的區別(圖8)。從這些構建體中缺失0.7KbEcoRI-KpnI片段將終止剪截之MRP蛋白質的表達。這一點提示mrp的表達是由0.7KbEcoRI-KpnI片段起始的。完整mrp基因的克隆。使32P標記的pMR7-2的KpnI-SacI片段與用EcoRI或KpnI消化的2型豬鏈球菌菌株D282之染色體DNA雜交(圖7B)，得到完整的MRP基因。7KbEcoRI片段和7KbKpnI片段都與探針雜交。基於其大小，預期EcoRI片含有完整的mrp基因，又因為mrp的表達是從0.7KbEcoRI-KpnI片段開始的，所以預期KpnI片段只包含基因的3′端。從EcoRI和KpnI消化的染色體DNA中分離大小範圍為6-8Kb的片段，並連接到pKUN19的EcoRIKpnI位點中，然後用此連接混合物轉化大腸桿菌JM101。所得到的50個選擇的重組克隆中，有13個帶有與MRP探針雜交的KpnI片段。所有這些重組體克隆都含有帶7KbKpnI插的質粒(pMR-C)。相反，所得的2，500個帶EcoRI片段的選擇的重組克隆都不與探針雜交。因為預期7KbEcoRI片段含量完整的mrp基因，故這一發現表明MRP的表達在大腸桿菌中是有毒性的。然而，可通過強行克隆手段，使mrp基因的5′端(分離自pMR7-2)與該基因的3′端(分離自pMR-C)結合，以構建攜帶完整mrp基因的質粒(pMR11)。與pKUN19的拷貝數相比，該質粒的拷貝數似乎顯著減少了，大約減少20倍。低拷貝數可能會使MRP在大腸桿菌中高水平表達的毒性作用減低到可耐受的水平。用Western印跡法分析由含有pMR11的大腸桿菌細胞產生的蛋白質。正如所期望的那樣，這些細胞產生了與MRP共遷移的並可被抗MRP多克隆抗體(PAbs)識別的136KDa蛋白質。mrp基因的核苷酸序列。檢測含有完整mrp基因及其測翼區域之4。6kbEcoRI-HindIII片段的核苷酸序列。如圖2所示，序列分析揭示了編碼含1，256個胺基酸(計算的MW為135，794)之多肽的3，768個核苷酸的開放讀碼。推斷的ATG起始密碼子的前面是與幾種類型革蘭氏陽性菌中的核糖體結合位點相似的序列(17)。mrp上遊的核苷酸序列相似於常見於革蘭氏陽性菌中之啟動子的-35和-10相符序列。在mrp基因的下遊，可檢測到顯示延伸之雙對稱性的區域。在相應mRNA中潛在的髮夾結構有一個被6bp環分離開的12bp柄(按照Tinoco等人(40)的規則計算，△G＝-15.9Kcal/mol)。由於該雙對稱性區域後面沒有富胸苷區，所以這個潛在的轉錄終止信號似乎是P因子依賴性的(34)。MRP的胺基酸序列。MRP是一種細胞包膜相關蛋白質，而且必須易位越過胞漿膜。因此成熟蛋白質必須含有信號肽。MRP的前47個胺基酸確實有典型信號肽的特徵。包含7個帶正電殘基的N末端部分後面按著一個21胺基酸的疏水核心，再後是一個推測的信號肽酶裂解位點(45，圖2中垂直箭頭)。切掉信號肽可得到MW為131，094的成熟肽，此與根據SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳估測的MRP的MW(136KDa)很接近(實施例4)。在蛋白質的C末端(圖11)鑑定了第二個20胺基酸的疏水區。如果這個區域與其他革蘭氏陽性菌的包膜相關蛋白質(10、11、12、13、16、20、38、39、46)相類似，它便很可能是細胞膜固著結構。假定的細胞膜固著結構側翼的兩個區域，即一個短的高帶電荷區域和一個含Leu-Pro-X-Thr-Gly-Glu胺基酸序列的區域，在革蘭氏陽性菌的表面蛋白質中也是高度保守的(圖12)。推測胺基酸序列Leu-Pro-X-Thr-Gly-Glu與細胞壁結合有關。在MRP序列中鑑定另外幾個區域。MRP的成熟形式是以824胺基酸的獨特N末端序列開始的。這個區域的後面是一段富脯氨酸殘基的胺基酸序列86個胺基酸中有26個是脯氨酸殘基。該區域的後面是三個54胺基酸的重複單位(圖13)。第一個單位和第二個單位間被77個胺基酸分開，但第二和第三個單位相鄰接的。第一和第二個單位的序列高度保守，而第三個是可變的。第三個重複單位後面是包膜固著序列。MRP序列和EMBL資料庫之蛋白質序列間幾乎沒有同源性。但MRP的一個亞序列，即胺基酸殘基619-985與金黃色葡萄球菌的粘連蛋白結合蛋白質的序列(39)具有某些相似性(在377個胺基酸的序列中有17.2%完全相同)。實施例4對與2型豬鏈球菌之毒性有關的兩種蛋白質的鑑定材料和方法鏈球菌分離物。從三個不同的來源得到180個2型豬鏈球菌菌株。其中110個菌株得自荷蘭的AnimalHealthServices。這些菌株是在常規診斷程序中從患病豬的器官中分離的。另外42個菌株是在健康豬被宰殺時從其扁桃體中分離的。還有27個從受到豬鏈球菌感染的病人身上分離的。另外42個菌株是在健康豬被宰殺時從其扁桃體中分離的。還27個從受到豬鏈球菌感染的病人身上分離的。扁桃體和人菌株由J.P.Arends，StreeklaboratoriumvoordeVolksgezondheidvoorGronigenenDrente，Groningen，theNetherlands提供。所有菌株都按以前描述的生物化學和血清學方法(44)作為2型豬鏈球菌分型。菌株1(即D282)以前已確定是對新生無菌豬有毒性的並且產生了MRP，而菌株2則無毒性並且不產生MRP(43)。因此，使用菌株1(MRP+)和(MRP-)作為參考菌株。培養條件。使1天齡菌落的的各細菌菌株生長在含有6%馬血清的Columbia血清瓊脂基質(代號CM331;Oxoid，Ltd.)上，並在Todd-Hewitt培養液(代號CM189;Oxoid)中於37℃保溫過夜。從過夜培養物中得到早期靜止生長期培養物，在Todd-Hewitt培養液中稀釋10倍，並於37℃保溫4小時。細胞分級分離。分別由180個菌株製備兩個細胞分離部分(原生質體上清液和培養物上清液)。由180個菌株中隨機選擇23個菌株，從其中製備另外兩個細胞分離部分(原生質體和膜囊泡)。分別從患病豬和健康豬體內、以及病人體內分離23個菌株。從在Toodd-Heiwitt培養液內生長的早期靜止生長期培養物分離四個細胞部分。按VanderVossen等人所述方灑(47)分離原生質體。在Eppendorf離心機中離心後，收集原生質體和餘留的上清液。按Driessen等人所述方法(9)分離膜囊泡。以4，000×9將液體培養物離心15分鐘，收集培養物上清部分。抗原和抗血清的製備。將菌株D282的靜止生長期培養物離心後收穫上清液。過濾(PM30型濾膜;AmiconCorp.，Danvers，Mass.)濃縮到濃度為3mg/ml，並對Tris緩衝鹽水(50mM，pH7.5)透析一次。用該產物作為抗原，以在兔體內產生多克隆體(PAb)，在小鼠體內產生單克隆抗體(MAb)。經肌肉內或皮下接種2mg在等體積費氏不完全佐劑中乳化的蛋白質以免疫兔。第2天重複接種沒有佐劑的抗原。5周後經靜脈內注射同樣劑量抗體，但不加佐劑以進行加強接種。6周後，給兔放血。用一隻兔(兔K191)的血清作為探針進行Western印跡分析。在BALB/C小鼠體內產生抗EF蛋白質的MAb。經腹腔內注射0.5ml含有25μg在等體積費氏不完全佐劑中乳化的蛋白質抗原，以免疫小鼠;3周重複上述程序。5周後，用同樣劑量的抗原，但不加佐劑給小鼠進行靜脈內加強接種。按VanZijderveld等人所述方法(52)製備雜交瘤細胞系。10-14天後，用酶聯免疫吸附法檢驗雜交瘤細胞是否產生抗EF抗體。然後在菌株D-282之培養物上清液的Western印跡上檢驗雜交瘤培養物上清液(1∶2稀釋)中的抗EFMAb。用結合了鹼性磷酸酶的抗小鼠免疫球蛋白顯現在硝化纖維素濾膜上MAb與110KDa蛋白質的結合。在微量滴定板中經有限稀釋將陽性細胞克隆兩次。按以前所述方法(52)，使用所得單克隆細胞系在姥鮫烷預處理的雌性BALB/C小鼠體內產生腹水液。篩選雜交瘤培養物上清液的間接酶聯免疫吸附試驗。於37℃下，用含有濃縮、透析並在磷酸鹽緩衝鹽水(pH7.2;每毫升0.075毫克蛋白質)中稀釋的菌株D-282之培養物上清液(見上文)的溶液將聚苯乙烯微量溶定板(Greiner，Niirtingen，Germany)包被16小時，並將這些製備物於37℃下保溫16小時。加入20倍稀釋的雜交瘤培養物上清液並按述方法(52)檢驗之。將結合的抗體與已連接了棘根過氧化物酶(HRPO，Nordic，Tilburg，TheNetherlands)的抗小鼠免疫球蛋白(1∶500稀釋的)一起保溫。電泳和Western吸印試驗。在6%或12%聚丙烯醯胺凝膠上用Laemmli所述的SDS-PAGE方法(26)分析各個細胞分離部分。電泳後，用銀著染蛋白質(32)。為了進行Western印跡分析，使用MultiphorⅡNovaBlot系統(PharmaciaLKB，Vppsala，Sweden)將蛋白質電轉印到硝酸纖維素膜上。用1∶500稀釋的兔K191PAb或1∶300稀釋的小鼠MAb探查這些印跡。用已連接了鹼性磷酸酶的抗兔免疫球蛋白顯現已結合的PAb。用1∶1，000稀釋的連接了鹼性磷酸酶(Zymed)的抗小鼠免疫球蛋白顯現結合的MAb。結果得自23個選擇之菌株的四個細胞部分的蛋白質分布圖。從23個被檢菌株製備屬於各被研究組(患病豬、健康豬和病人)之兩份豬鏈球菌分離物中的原生質體上清液和膜囊泡部分，分析其蛋白質分布圖形發現兩者幾乎完全相同。相反，培養物和原生質體上清液的蛋白質分布圖則明顯不同。患病豬分離物的蛋白質分布圖包含兩條不存於大部分健康豬分離物之蛋白質分布圖中的蛋白質帶。其中一條帶代表了被鑑定為MRP的136KDa蛋白質(43)。在SDS-PAGE分析中，含有6%聚丙烯醯胺的分離膠揭示了培養物和原生質體上清液(菌株1、5、24和26)中都有MRP。第二條帶代表了110KDa蛋白質;因為這種蛋白質只在培養上清中檢測到，故將其指定為EF。MRP和EF兩者均存在於毒性參考菌株1(＝D-282)的培養物上清中，但不存於非毒性參考菌株2(＝T-15)的所有細胞組分中。從患病豬分離的8個菌株均含有MRP和EF。從健康豬體內分離的8個菌株中，有6個缺乏這些蛋白質。從病人體內分離的7個菌株中，有6個含有MRP，但這6個中只有3個也同時含有EF。當使用抗培養物上清液的兔K191PAb作為探針進行免疫印跡分析時，在2型豬鏈球菌菌株的細胞組分中清楚地檢測到了MRP和EF。菌株1、5、24和26的原生質體上清液、培養物上清液和膜囊泡中都含有136KDaMRP(圖9)。因為MRP是原生質體上清液的主要成分，所以這種蛋白質必然定位在細菌的細胞包膜中。菌株1和5的培養物上清液也含有110KDaEF。菌株24和26含有MRP但不含EF;菌株2和13既不含MRP，也不含EF。基於培養物上清中MRP和EF的存在，區分了2型豬鏈球菌的下列三個表型MRP+EF+、MRP+EF-和MRP-EF-(圖10)。在高於150KDa之不同分子量處的蛋白質帶都與兔K191血清反應，並顯現於菌株17、24、25、26和28之培養物上清液的Western印跡中。因為除菌株25之培養物上清液中的以外，這些蛋白質也可被抗EFMAb識別，所以110KDaEF可能與這些蛋白質有關。用小鼠抗EFMAb探查Western印跡，顯示所有帶有MRP+EF-表型的菌株都在其培養物上清液中含有較高分子量蛋白質。另外，所有呈MRP+EF+表型的菌株都不含這些蛋白質。用兔K191血清探查表明，在包括菌株25的12個MRP-EF-菌株培養物清中存在有高分子量蛋白質。用抗EFMAb所作免疫印跡分析顯示這些蛋白質與EF無關。當在12%板凝膠上用SDS-PAGE分析四個細胞部分時，末檢出與毒性有關聯的低分子量蛋白質。180個菌株之培養物和原生質體上清液的蛋白質分布圖。使用6%板凝膠分析所有180個2型豬鏈球菌菌株是否在培養物和原生質體上清中出現這三個表型。從病豬器官中分離的菌株80%有MRP+EF+表型(表1)。表1從病豬、宰殺的健康豬和病人體內分離的180個鏈球菌菌株中普遍呈現MRP和EF表型2型豬鏈從下列來源分離之菌株的數目(%)球菌表型病豬的器官健康豬的扁桃體病人MRP+EF+86(77)1(2)4(15)MRP+EF-13(12)5(12)20(74)MRP-EF-12(11)36(86)3(11)相反，從健康豬的扁桃體中分離的菌株只有2%具有這種表型;這些菌株中86%是MRP-EF-。從病人中分離的菌株只有15%有MRP+EF+表型。在被檢的2型豬鏈球菌菌株中，有遠比豬菌株(12%)多的人菌株(74%)呈MRP+EF-表型;89%的人菌株是MRP+。未檢測到MRP-EF+表型。實施例52型豬鏈球菌在新生無菌豬中的毒性材料和方法豬。經剖腹產手術從四隻母豬得到52隻屬於GreatYorkshire和DatchLandrace雜交的無菌新生豬。兩實驗中所用的母豬都是姐妹關係。將豬分成12組，每組包括4或5隻。各組分別關在無菌不鏽鋼恆溫箱(43)內。接種物。從三個來源得到分屬於MRP+EF+、MRP+EF-和MRP-EF-表型的10份2型豬鏈球菌菌株患腦膜炎的豬、屠宰場的健康豬和病人(表2)。按前述方法(44)對菌株進行生物化學和血清學分型。將菌株放在含15%甘油的營養素培養液中在玻璃珠上作為貯備懸浮液於-70℃下保存。生長在含6%馬血之Columbia血液瓊脂基質(代號CM331，Oxoid)上的1天令各菌株菌落於37℃下在Todd-Hewitt培養液(代號M189，Oxoid)中保溫過夜。在Todd-Hewitt培養液中稀釋過夜培養物(1∶10)得到早期靜止生長期培養物並於37℃保溫4小時。約4小時後，當600mm處光密度為0.5時停止保溫。然後將大約含有1-3×109CFV/ml的培養物以4000×9離心15分鐘。分析上清液中的MRP和EF。洗滌離心沉澱物並懸浮在磷酸緩衝鹽水(PBS)、136.89mMNaCl、2.68mMKCl、8.1mMNa2HPO4、2.79mMKH2PO4溶液(pH7.2)中(A600＝1)，然後用作接種物。使用從患萎縮性鼻炎豬的鼻腔中分離的支氣管炎博德特氏菌(BordetellaBronchiseptica)菌株92932誘發豬產生豬鏈球菌感染(23，43)。菌株保存在Dorset雞卵培養基上。將得自羊血瓊脂基質的48小時菌落培養在心腦浸液中以製備接種物。37℃保溫18小時後，該培養基中含有大約109CFU/ml。在PBS中稀釋此心腦浸液即製得所需接種物。電泳和Western吸印。用MRP/EF表型的豬鏈球菌菌株作接種物，並於檢測實驗結束時回收之分離物的MRP/EF表型。用Caemmli所述的SDS-PAGE(26)(6%聚丙烯醯胺)和Western吸印法分析從所有豬的鼻咽部、被感染病的發炎組織如腦膜和關節中所得分離物的細胞培養物上清液。電泳後用銀著染蛋白質(32)。為進行Western印跡分析，使用MultiphorⅡNovaBlot系統並按照製造廠(PharmaciaLKB)推薦的方法將蛋白質電吸印到硝酸纖維素膜上。將濾膜與分別作1∶200稀釋的小鼠抗MRP單克隆抗體(MAb)(11.3mg/ml)和抗EFMAb(8.4mg/ml)的1∶1混合物，或與1∶500稀釋的多克隆抗MRP/EF兔血清(K191)(8.2mg/ml)(實施例4和6)一起保溫。然後使濾膜與1∶1000稀釋的結合了鹼性磷酸酶(AP)的抗小鼠免疫球蛋白質或1∶3000稀釋的與AP結合的抗兔免疫球蛋白G(r+K)(Zymed)一起保溫。加入溶於磷酸緩衝液(100mMNaCl、5mMMgCl2、100mM二乙胺;pH9.5)中的底物溴氯吲基磷酸(Sigma，St.Louis，Mo.)一氮蘭四唑(Kerck，Darmstad，Germany)顯現已結合的抗體。實驗設計研究工作包括兩次實驗，間隔期為5個月。使用一次性塑料注射器經鼻內注射給5天令無菌豬接種加在腦心浸液中的支氣管炎博德特氏菌菌株92932的懸浮液。實驗Ⅰ中的接種物含有0.84×107CFU，實驗Ⅱ為1.0×107CFU。接種後(pi)兩天，用10個2型豬鏈球菌菌株之一對無菌保溫中的豬作相似接種(表2)。這些菌株接種物的平均(±SD)量為1.4(+0.60)×106CFU。所有接種都是在呼吸的吸氣期向每個鼻孔內注入0.5ml細菌懸浮液。兩次實驗中都用菌株3(MRP+EF+)作陽性對照、並用菌株12(MRP-EF-)作陰性對照(參見結果部分)。當病情發展到致死程度或實驗結束時(接種後3至4周)殺死豬並進行屍檢。1、菌株3是在對豬常規診斷過程中從患腦膜炎豬體內分離的。菌株10、12、16和18是在屠宰時從健康豬扁桃體中分離的。菌株22(No.830544)、24(No.740113)25(No.821021)和28(No.760366)是從2型豬鏈球菌性腦膜病人中分離的。(括弧內的編號是指J.P.Arends和H.C.Zanen(2)等人給出編號)。2、×106CFU病情監測。每天檢查豬的臨床病徵，如發熱、中樞神經系統(CNS)和肢體功能失調。經顱靜脈腔穿刺收集各頭豬的血液樣品，每周三次。用電導計數器(ContravesA.G.，Zurich，Switzerland)計數白血細胞(18)。對吉姆染色(Giemsa-Stained)的血塗片作分類計數後計算嗜中性白細胞數。每天收集鼻咽拭子標本和糞便，並直接塗敷在含有6%馬血的Columbia瓊脂上。將單種培養物的懸浮液與適當的高價免疫兔血清(DLO-CentralVeterinaryInstitute，Lelystad，NL)混合，以其進行玻片凝集試驗，進一步證實2型豬鏈球菌和支氣管炎博德特氏菌的存在。殺死豬後檢查病理學改變。按以前所述方法(43)對CNS、漿膜、肝、脾和扁桃體的組織標本進行細菌學和組織學檢查。結果電泳和Western印跡試驗。在接種前用免疫印跡法分析豬鏈球菌菌株的培養物上清液時，鑑別了三種表型。菌株3、10和22屬於MRP+EF+表型;菌株17、24和28為MRP+EF-表型，且菌株12、16、18和25屬於MRP-EF-表型。兔多克隆抗體(PAb)識別MRP+EF-菌株之培養物上清中大於150KDa的蛋白質。另外也可用抗EFMAb檢測到這些高分子量蛋白質，這表明110KDaEF和分子量遠大於150KDa的蛋白質有共同的抗原決定基。在SDS-PAGE和Western印跡分析中，用作接種物之豬鏈球菌菌株的表型與在實驗結束時從被感染豬之扁桃體和發炎組織中收集的分離物表型完全相同。表3在接種2型豬鏈球菌(分屬三種表型的10個菌株)的豬中觀察到的三個疾病參數的出現頻率豬鏈球發熱T＞40℃血液中PML特異性非特異性菌表型的出現率1三個參數的病徵2病徵3百分率(＞10%/L)MRP+EF+40785721MRP+EF-51605MRP-EF-03001、記錄的陽性數/記錄的總數2、跛行和神經功能紊亂如共濟失調、環行運動、角弓反張及足橫置。3、抑鬱、食欲不振及躺臥。疾病的臨床徵象。兩次實驗中，所有接種MRP+EF+表型菌株的豬，從接種後第2天直腸體溫不斷上升，在4至8天時高達41.8℃。接種MRP+EF-表型菌株的十頭豬，在接種後2至22天之間直腸體溫於24至96小時的短時間升高至40℃以上。MRP+EF+組中發燒的發生率最高(40%)(表3)。MRP+EF+組中多形白細胞(PML)增多的出現率最高(表3)。根據接種三種表型菌株之豬血液樣品中FML計數的對數值來進行毒性分析。結果發現接種前3天三組間的PML幾何均數沒有明顯差異。從接種後第1天開始，接種MRP+EF+表型菌株的豬血液樣品中的PML平均數明顯高於MRP+EF+組或MRP-EF-組(P＜0.01)。接種後第20天，MRP+EF+和MRP+EF-組中的平均數彼此間無明顯差異，但這些平均數與MRP-EF-組中的平均數則差異顯著(P＜0.01)。接種MRP+EF+表型菌株的豬發病率為100%。從第2天開始，可觀察到抑鬱、躺臥、食欲不振及發燒等全身性疾病的非特異性徵象。在繼後的若干天裡，接種豬即出現更為特異的病症，如共濟失調、環行運動、角弓反張、躺臥並行走搖晃以及跛足。MRP+EF+組中特異性病徵的出現率為57%(表3)。實驗過程中有九頭豬死亡，並在疾病末晚期有三頭豬被殺死。因此這些組中的死亡率為12/18(67%)。九頭接種了MRP+EF-表型菌株的豬出現發燒或粒細胞增多，或顯示出其他非特異性病徵，但沒有顯示特異性臨床徵象，如神經功能紊亂或跛行。MRP-EF-組中的豬則沒有顯現臨床病徵(表3)。病理學發現概括在表3中。在接種MRP+EF+表型菌株的豬中檢查了CNS、漿膜及關節的嚴重性和多發性炎症。觀察了呈現各種形式的肺炎和支氣管炎。與接種MRP-EF-表型菌株的豬(22%)式接種MRP+EF+表型菌株的豬(11%)相比，作為主動免疫反應的徵象--脾臟白髓中B細胞區域的濾泡形成及T細胞區域中的母細胞生成更常見於接種MRP+EF-表型菌株的豬中(50%)(表4)。有些接種MRP+EF+表型菌株的豬在生發中心出現淋巴細胞溶解，而在白髓周圍的邊緣區出現炎症，這些都是小動物之急性敗血症的徵象(42)。扁桃體中的活性濾泡也更常見於接種MRP+EF-或MRP-EF-表型菌株的豬中。1、累及大腦、小腦、腦橋、中腦和延髓，包括其中一個或多個不同的部位。2、累及腕骨、掌骨、跗骨、跗間骨、膝、肘、肩和髖部關節，包括其中一個或多個不同的關節。細菌學發現。從接種後第1天開始到實驗結束止，每天從所有豬的鼻咽部及糞便拭子標本中分離鏈球菌菌株和支氣管炎博德特氏菌。另外還在接種後6天從接種菌株16的豬(實驗Ⅰ)並在接種後19天從接種菌株24的豬(實驗Ⅱ)分離芽孢桿菌。保持其它的豬沒有汙染菌。屍檢時，2型豬鏈球菌大多數是從示有病理改變的器官和組織(CNS、漿膜及關節)中分離的(表5)。支氣管炎博德特氏菌只有從肺和扁桃體中分離到。從所有的豬扁桃體中也可同時分離出豬鏈球菌及支氣管炎博德特氏菌這兩種細菌。實施例6用酶聯免疫吸附法分辨毒性和非毒性2型豬鏈球菌材料和方法細菌。檢驗了從下列三個來源得到的179個2型豬鏈球菌菌株得自常規診斷過程中發現的患病毒豬的器官、得自宰殺之健康豬的扁桃體，以及得自患有2型豬鏈球菌感染的病人。在初期研究中使用Western吸印技術檢測培養物上清中的MRP和EF，並基於這些結果將菌株分成三種表型MRP+EF+、MRP+EF-和MRP-EF-(實施例4)。另外試驗的是豬鏈球菌血清型1至22的22個菌株(15)，22個其他的鏈球菌菌株、15個不同菌種的22個細菌菌株，以及1種酵母菌(DLO-CentralVeterinaryInstitute，Lelystad)(表6)。培養條件和抗原製備。將在含6%馬血的Colurnbia血液瓊脂基質(代號CM331，OxoidLtd.)上生長過夜之細菌的1天令菌落接種到Todd-Hewitt培養液(代號CM189，Oxoid)上。37℃生長過夜後，將培養物以4，000×9離心15分鐘。各菌株之20小時培養物在600nm處的光密度為0.60至1.04不等。有的菌種密度較低，它們是支氣管炎博德特氏菌(0.23)、小球菌屬(0.08至0.15)、馬腸鏈球菌(Streptococcusequinus)(0.36)、新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)(0.05)。在兩次DAS-ELISA試驗中，使用未處理之培養物上清的兩倍系列稀釋液作為試驗樣品。用超濾法(PM30型濾膜，AmiconCorporation)對2型豬鏈球菌菌株D-282(MRP+EF+)的培養物進行濃縮並部分純化之。用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(136.89mMNaCl、2.68mMKCl、8.1mMNa2HPO4、2.79mMKH2PO4，pH7.2)稀釋到蛋白質終濃度為75μg/ml。用該產物作為在直接競爭性ELSA中選擇不同單克隆抗體並在間接ELISA中篩選雜交瘤培養物上清液的包被抗原。多克隆和單克隆抗體的製備。按實施例4中所述方法製備兔(Ra)抗MRP和EF(RaK191)的多克隆抗體(PAb)以及抗EF的三中不同的單克隆抗體(MAb)。基本上按製備識別EF之MAb的方法製備識別MRP的MAb。在雌性BALB/C小鼠中產生抗體及免疫程序已在上面實施例4中述及。按前述方法(52)製備雜交瘤細胞系。10至14天後，用間接ELISA檢測雜交瘤培養物上清液中的抗MRP抗體(詳見下文)。然後在菌株D-282之培養物上清液的Western印跡上檢測雜交瘤培養物上清液(1∶2稀釋)中的抗MRP抗體。使用與磷性磷酸酶結合的抗小鼠免疫球蛋白及下述底物顯現與136KDa蛋白質結合的MAb。發現5份上清液為陽性。然後在微量滴定板中以有限稀釋法這些小孔的細胞克隆兩次。使用與抗MRP抗體呈陽性反應的5個細胞系和與抗EF抗體呈陽性反應的3個細胞系，在姥鮫烷預處理的雌性BALB/C小鼠中產生腹水液。使用硫酸銨沉澱法(50%飽和)從腹水液中純化抗MRP和EF的MAb，並對PBS透析。5份抗MRPMAb分別標示為MRP至MRP5，三份抗EFMAbs分別標示為EF1至EF3。所有MAb的免疫球蛋白同型都是IgG1，在加於PBS內的1%瓊脂糖凝膠中，與小鼠同型特異性抗血清(Nordic)進行雙向免疫擴散以檢測之。所有PAb和MAb均在-20℃下貯存。間接ELISA篩選雜交瘤培養物上清液。用濃縮並透析過的菌株D-282的培養物上清液(見上文所述)於37℃將聚苯乙烯微量滴定板(GreinerNurtingen，Germany)包被16小時。然後將其用PBS，PH7.2稀釋(7Sμg/ml蛋白質)。按VanZijderveld等人所述方法(52)向各小孔內加入兩倍稀釋的雜交瘤培養物上清液。洗平板後，加入已與辣根過氧化物酶(HRPO，Nordic)結合的抗小鼠免疫球蛋白(1∶500稀釋的)。37℃保溫1小時並洗5次後，加入底物以檢測已結合的HRPO-抗體結合物，其中底物是溶解於含有0.01MEDTA鈉鹽之0.01M磷酸鹽緩衝液(pH5.95)中的重結晶5-氨基水楊酸(5-AS)(Merck)的0.1%溶液(wt/vol)，且在使用前直接向其中加入了終濃度為0.005%(wt/vol)的過氧化氫。室溫下保溫2小時後，用TitertekMultiskan光度計(FlowLabs)測定450nm處吸光率。直接競爭性ELISA。用直接競爭性ELISA選擇MAb並用以發展MRP和EF雙抗體夾心(DAS)ELISA。用Wilson和Nakane所述的高碘酸方法(49)將純化的抗MRP和抗EFMAb及兔PAb連接到HRPO(BoehringerMannheim，Germany)上。結合了HRPO的免疫球蛋白在50%甘油中於-20℃下保存。在含有5%胎中血清和0.5%氯化鈉的PBS-Tw中製成結合物溶液。將一系列兩倍稀釋(範圍為1∶20到1∶10，240)的50μl未結合的抗MRPMAb加入已用在PBS(75μg/ml蛋白)中部分純化了的菌株D-282之培養物上清液包被的聚苯乙烯微量滴定ELISA板(Greiner)之各小孔內。然後將該板在37℃。下保溫30分鐘。為了使未結合的MAb與MAb結合物競爭，分別加入最適稀釋度的5份與HRPO結合的抗MRPMAb各50μl。於37℃保溫1小時後洗板，然後加入上述底物5-ASH2O2以檢測結合的HRPO-抗體。室溫下保溫2小時後讀出吸光率值。以只加入結合物之小孔顯示平均吸光率為A450＝50%時的最高稀釋度表示競爭效價。按照與檢測抗MRPMAb相似的競爭性ELISA方法檢測三種抗EFMAb的抗原決定基特異性。SDS-PAGE和Western吸印技術。在以6%聚丙烯醯胺凝膠用SDS-PAGE法分離22個不同血清型豬鏈球菌及其他微生物的培養物上清液(表6)。按照儀器製造前(PharmaciaLKB)推薦的方法使用MultiphorⅡNovaBlot系統將蛋白質電吸印到硝酸纖維素濾膜上。用1∶300倍稀釋的小鼠MAb探查印跡。用已與磷性磷酸酶(Zymed)結合的抗小鼠免疫球蛋白的1∶1000倍稀釋液顯現已結合的MAb。結果直接競爭性ELISA。對5個抗MRP克隆和3個抗EF克隆進行競爭試驗。某些抗MRP克隆則彼此相互競爭。有5個抗MRPMAb是針對至少3個不同的抗原決定基的第一個由MRP1和MRP2識別，第二個由MRP3識別，第三個由MRP4和MRP5識別。因為所有這三個抗EF克隆都參予競爭，所以它們可能是針對同一個抗原決定基。MRP雙抗體夾心ELISA。在使用MRP3作為俘獲抗體並以HRPO-MRP1作為結合物的MRPDAS-ELISA中，用加在0.05M碳酸鹽緩衝液(pH9.6)中的100μl每孔含2.3μgMRP3的包被液包被聚苯乙烯微量溶定ELISA板的各小孔。於37℃吸收16小時後，直接使用包被好的平板或將其保存於-20℃下備用。向小孔內加入在含有0.05%(W/V)Tween80中以1∶1至1∶280兩倍系統稀釋的各菌株的100μl培養物上清液。37℃保溫1小時後，用溶於自來水中的0.05%Tween80洗5次，再向小孔內加入100μl含有溶於PBS(pH7.2)之2.2μgHRPO結合的MRP1的溶液。使用棋盤滴定法檢測俘獲抗體及結合物的最適稀釋度。37℃保溫1小時後按上述方法加入底物5-ASH2O2。將A450≥0.2的小孔定為陽性。向各小孔內加入由100μl未稀釋之2型豬鏈球毒性菌株4005(MRP+EF+)培養物上清液組成的陽性對照物。另外還加入由100μl未稀釋的非毒性菌株T15(MRP-EF-)培養物上清液組成的陰性對照物。使用MRPDAS-ELISA方法試驗179個如以前用SDS-PAGE和Western印跡法檢測的分別屬於三種表型MRP+EF+、MRP+EF-和MRP-EF-的2型豬鏈球菌菌株。大多數菌株在ELIS中均記錄了如它們在Western印跡分析中的相同結果(表7)。在ELISA中，所有MRP+EF+菌株均為MRP陽性。有一個MRP+EF-菌株為假陰性。3個MRP-EF-菌株(6%)記錄為假陽性。MRPDAS-ELISA的敏感性(TP/TP+FN)(TP＝真實陽性，FN＝假陰性)為99%(131個菌株中有130個)，特異性(TN/TN+FP)(TN＝真實陰性，FP＝假陽性)為94%(48個菌株中有45個)，且預測值(TP/TP+FP)為98%(131個菌株中有130個)。MRPDAS-ELISA可很好地區分MRP陽性和MRP陰性2型豬鏈球菌菌株。表7在MRP和EFDAS-ELISAs中檢驗179個2型豬鏈球菌(3種表型)的結果MRPDASELISAEFDASELISA菌株數菌株數表型+-+-MRP+EF+92(100%)092(100%)0MRP+EF-38(97%)1(3%)039(100%)MRP-EF-3(6%)45(94%)048(100%)在完成MRPDAP-ELISA試驗後，記錄屬於2型豬鏈球菌三種表型之菌株培養物上清液的滴定曲線。從未稀釋的92個MRP+EF+分離物之培養物上清液測得的吸光率平均值(土標準差)為1.2259(±0.1165)，39個MRP+EF-分離物的平均吸光率為1.2129(±0.2076)，48個MRP-EF-分離物的平均吸光率為0.1180(±0.2546)。因此可憑視覺讀出溶定板的吸光率值而不必進行光度檢測即可區分出MPR陽性菌株(表型MRP+EF+或MRP+EF-)和MRP陽性菌株(表型MRP-EF-)。21個其它血清型豬鏈球菌參考菌株中，有18個菌株之培養物上清液的吸光率低於0.2。3種血清型為陽性並有下列吸光率值血清型3的未稀釋培養物上清液A450＝0.731;血清型5的培養物上清液A450＝0.587，血清型15(以前的Lancefield菌群T)的培養物上清液A450＝0.516。這些血清型在Western印跡分析中也呈陽性;在這些血清型的培養物上清液中MRP3顯然識別了分子量高於150KDa的蛋白質。列於表6中的所有其他微生物的吸光率均小於0.2。EF雙抗體夾心ELISA。在鑑別試驗樣品中特異性抗原的DASELISA試驗中，使用了兩種不同的MAbs，一種是作為俘獲抗體，另一種則作為結合物，而且如在MRPDAS-ELISA試驗中那樣，它們各自識別抗原上的不同抗原決定基。在Western印跡中，EF識別屬於MRP+EF-表型之所有菌株培養物上清液中的高分子量(＞150KDa)EF(實施例4)。因此用EF2作為俘獲抗體的ELISA不太可能區分開MRP+EF+和MRP+EF-菌株。此外，因為三種EFMAb彼此時封閉的，所以我們必須使用EF2作俘獲抗體，且使用多克隆兔血清(K191)作為結合物。有些ELISA試驗是使用EF1作為俘獲抗體並以EF2或EF3作為結合物，而且這些MAb確實是彼此完全封閉的。EFDAS-ELISA的試驗程序基本上同於前述的MRPDAS-ELISA。同100μl含有3.3μgEF2[溶於0.05M碳酸鹽緩衝液(pH9.6)中]的溶液包被ELISA微量溶定板的各小孔。吸收後，包被的溶定板可直接使用或在-20℃下保存備用。使用從1∶1到1∶1∶128兩倍系列稀釋的100μl培養物上清液。保溫並衝洗後，向各小孔內加入100μl溶於PBS(pH7.2)中的含2.7μg多克隆RaK191HRPO結合物的溶液。37℃保溫1小時後，用上述底物5-ASH2O2使平板各孔顯色。將A450≥0.4的孔定為陽性。各溶定板均使用上述的同樣對照。以EFDAS-ELISA方法檢驗179個有預定蛋白質分布圖形的豬鏈球菌2型菌株令人驚奇的是，在該ELISA中39個MRP+EF-菌株都沒有記錄為陽性，而所有92個MRP+EF+菌株則全是陽性(表7)。所有48個MRP-EF-菌株在該EFDAS-ELISA中都是陰性。因為沒有檢測出其他的假陽性或假陰性結果，所以EFDAS-ELISA顯然能可靠地分辨出高和低分子形式的EF，進而也能分辨開屬於MRP+EF-和MRP+EF-表型的2型豬鏈球菌菌株。完成EFDAS-ELISA試驗後，記錄屬於三種表型之2型豬鏈球菌菌株培養物上清液的溶定曲線。從未稀釋的93個MRP+EF-菌株培養物上清液測得的吸光率平均值(士標準差)為0.8204(±0.149)，39個MRP+EF-菌株的平均吸光率為0.1551(±0.046)，48個MRP-EF-菌株的平均吸光率為0.1061(±0.0371)。因此，同MRPDAS-ELISA一樣，可直接閱讀溶定板來區分EF陽性菌株(表型MRP+EF+)和EF陰性菌株(表型MRP+EF-或MRP-EF-)。在ELISA試驗中，21個除2型外之其他血清型的豬鏈球菌參考菌株都不是EF陰性。某些其他菌種具有陽性吸光率值鏈球菌Lancefield菌群G(A450＝0.445)、菌群L(A450＝0.348)、馬鏈球菌(A450＝0.671)以及金黃色葡萄球菌(A450＝0.718)。實施例7使用用聚合酶鏈反應(PCR)區分2型豬鏈球菌的致病性和非致病性菌株材料和方法細菌及生條件。選擇13個2型豬鏈球菌菌株來檢驗是否可用聚合酶鏈反應(PCR)方法(36)區分2型豬鏈球菌的三種類型。實施例4和5中已確定了三種菌株之MRP和EF蛋白質的致病性及表達。使菌株在含有6%馬血的Columbia血液瓊脂基質(代號CM331，Oxoid)上37℃生長過夜。將型豬鏈球菌菌落接種到10mlTodd-Hewitt培養液(代號CM189，Oxoid)中，並於37℃下生長過夜。DNA分離。按Maniatis等人(28)所述方法分離過夜培養物的DNA。將DNA用蒸餾水稀釋到10ng/μl，然後用於PCR。臨床標本。從宰殺後的母豬得到鼻拭子和扁桃體組織。將鼻拭子分離物接種到血液平皿上。按以前所述方法(27)從扁桃體中分離2型豬鏈球菌菌株。樣品分離。用稍加改動的Boom等人所述的方法(4)製備用於PCR的臨床標本將標本加到裝有900μlL6溶解緩衝液和40μl硅藻土溶液的Eppendorf管中[L6緩衝液100ml0.1MTSIS-HCl(pH6.4)+120g(異)硫氰酸胍(GusCN，Flukacatnr.50990)+22ml0.2MEDTA(pH8.0)+2.6gTritonx-100。硅藻土溶液是在50ml蒸餾水+500μl32%(W/V)HCl中加入10g硅藻土(JanssenChimicaCat.nr.17，346，80)]。使臨床標本在L6緩衝液中於暗處室溫下保溫過夜。在帶有Durapore膜(MultiscreenMAHVN45，Millipore)的微量溶定板各小孔中用移液管溶加150μl溶液。將微量溶定板放在真空歧管(MAVM09600，Millipore)上，樣品用200μlL2洗液[L2緩衝液是100ml0.1MTris-HCl(pH6.4)+120gGuSCN]洗5次，用200μl70%乙醇洗5次，並用200μl丙酮洗1次。在各次洗滌之間不得使濾膜變幹。用棉紙將微量溶定板底面吸乾，關在56℃下放置15分鐘使樣品完全乾燥。向各小孔內加入75μlPCR緩衝液(見下文)。將溶定板置於56℃下保溫15分鐘。再次將微量溶定板放在真空歧管上。其中Durapore板下面為一標準微量溶定板(Micronic)。施加真空抽吸，並在下面的微量溶定板中收集含有DNA的PCR緩衝液，而硅藻土仍留在Durapore濾膜上。PCR檢測法。PCR包括10ng純化的PNA或25μl臨床標本，總體積50μl。反應混合物含有10mMTris-HCl(pH9.0)、2mMMgCl2、50mMKCl、0.01%明膠、四種三磷酸脫氧核苷酸各0.2mM、四種引物各1μM、0.5單位Amplitaq聚合酶(PerkinElmerCetus，Norwalk，Conn.)，並用2滴石蠟油復蓋。大PerkinElmer熱循環器中進行25或40次DNA擴增循環94℃1分鐘、55℃1分鐘、72℃2分鐘。在含有溴乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠上分析10至20μl擴增的DNA。PCR引物。用於PCR的寡核苷酸序列是P15:1403-1425;5'-GGTATACCTTGCTGGTACCGTTC-3';16:1914-1934:5'-AGTCTCTACAGCTGTAGCTGG-3';P14:2890-2908:5'-GTTGAAAACAAAGCGTTCG-3';以及P-35:3229-3249:5'-CTTCGACAAAATGTCAGATTC-3'。寡核苷酸P-15和P-16相當於2型豬鏈球菌之mrp基因中所指出的位置(實施例3，圖2)。寡核苷酸P-34和P-35相當於在2型豬鏈球菌ef＊基因中指出的位置(實施例2，圖1A)。按照儀器生產廠商提供的操作方法在AppliedBiosystem381A型合成儀上合成引物。結果PCR的特異性。確定了mrp和ef＊基因(參見實施例3和2)內可用於鑑別2型豬鏈球菌之三種表型的兩個區域(分別稱為m-Ⅵ和e-Ⅴ)。(參見實施例8)。將基於m-Ⅵ區域(p-15和p-16)和e-V區域(p-34和p-35)的引物用於PCR中。引物p-15和p-16擴增了m-Ⅵ區域中的532bp片段。引物P-34和P-35擴增3e-Ⅴ區域中的360bp片段在用這些引物進行的PCR中使用了4個MRP+EF+、4個MRP+EF＊和5個MRP-EF-菌株的染色體DNA。經過25次循環後在瓊脂糖凝膠上分析已擴增的片段。從MRP+EF+菌株的DNA擴增了532bp片段。從MRP+EF＊菌株的DNA擴增了532bp片段及360bp片段。相反，從MRP-EF-菌株的DNA則既未擴增532bp片段，也未擴增360bp片段。這些資料顯示，該PCR技術可用於鑑別2型鏈球菌的三種表型。用Western吸印(實施例4)、ELISA(實施例6)、與DNA探針m-Ⅵ和e-Ⅴ的雜交實驗(實施例8)以及PCR技術檢測宰殺時從37頭母豬扁桃體中分離的82個2型豬鏈球菌菌株的表型。用這四種方法檢測，從其中36頭母豬分離的79個菌株分型完全相同。從1頭母豬分離的3個菌株用PCR和DNA雜交實驗被分為MRP+EF＊表型，用Western吸印和ELISA方法則被分為MRP-EF-表型。這些結果表明，PCR可代替其他方法用於確定2型豬鏈球菌菌株的表型。PCR的敏感性。用蒸餾水稀釋純化的MRP+EF＊豬鏈球菌2型菌株的染色體DNA，並直接用於PCR中。經42次PCR循環後，檢測到25毫微微克(fg)DNA。這一結果表明在經過PCR擴增後，可基於鏈球菌細胞含有1.75fgDNA這一數據(35)在瓊脂糖凝膠上檢測14個細胞的DNA。決定全部細胞檢驗PCR的敏感性。為此，在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS(pH7.2)137mMNaCl、2.7mMKCl、8.1mMNa2HPO4、2.8mMKH2PO4)中稀釋並製備用於上述PCR的MRP+EF＊細胞。進行PCR(40次循環)之前，在含有大約50個細胞的樣品中仍可檢測到已擴增的片段。PCR可直接用於臨床材料。將系列稀釋的2型豬鏈球菌細胞加到鼻拭子上。發現在進行PCR之前在含有大約50個細胞的樣品中仍可檢測到已擴增的片段。實施例8使用DNA探針鑑別致病性和非致病性2型豬鏈球菌菌株材料和方法細菌。分離13個2型豬鏈球菌菌株(4個MRP+EF+菌株，4個MRP+EF＊菌株和5個MRP-EF-菌株)，以檢驗是否可用mrp、ef和ef＊基因的區域來鑑別2型豬鏈球菌的三種表型。除菌株16外，這些被檢菌株在小豬的感染實驗中(實施例5)均顯示有致病性。從下列三個來源得到170個2型豬鏈球菌菌株自患病豬的器官(103個菌株)、宰殺的健康豬的扁桃體(40個菌株)以及從病人體內(27個菌株)。使用豬鏈球菌血清型1至22的參考菌株(15)、21個其他鏈球菌菌種和45個其他細菌的菌株(38個不同的的菌種，DLOCentralVeterinaryInstitute，表8)試驗mrp和ef探針的特異性。培養基。大腸桿菌JM101菌株生長在LB培養基30中。需要時加入青黴素至終濃度為50μg/ml。所有其他細菌菌株均在含有6%馬血Columbia血液瓊脂基質(代號CM331，Oxoid)上37℃生長過夜。將過夜生長的菌落加在10mlTodd-Heuitt培養液(代號CM189，Oxoid)中保溫並於37℃下生長過夜。DNA分離及操作。按Maniatis等人所述方法(28)進行染色體DNA分離和常規DNA操作。按下述步驟製取粗溶胞產物將過夜生長的培養物11S4000×9離心10分鐘，並將沉澱組分重新懸浮於500至1000μlTEG-溶菌酶緩衝液[25mMTris-HCl(pH8.0)、10mMEDTA、50mM葡萄糖和1mg/ml溶菌酶)中。25℃保溫30分鐘後，將此樣品用於點印跡分析。探針。使用質粒pMR11、pEF2-19和pEF17-7(參見實施例1、2、3)產生克隆到pKUN19(24)中的亞克隆。使用Gene-Clean藥盒(Bio101Inc.，LaJolla，USA)從製備性瓊脂糖凝膠中分離適當亞克隆的片段。然後使用隨機引發的標記藥盒(BoehringerGmbH)，按照生產商推薦的操作程序用2-32PdCTP(3000Ci/mMol，Amersham)標記純化的片段並將其用作探針。Southern雜交。將13個選擇的2型豬鏈球菌菌株的染色體DNA(1μgDNA)點在Gene-Screen尼龍膜(New-EnglandNuclearCorp.，Boston，USA)上。按照製造廠方推薦的方法將膜與32P標記的mrp和ef探針一起保溫。過夜雜交後，室溫下用2×SSC將濾膜洗兩次各5分鐘，再用0.1SSC加0.5%SDS於65℃下洗兩次每次30分鐘(1×SSC＝0.15MNaCl+0.015M檸檬酸鈉)。使用點印跡裝置(BethesdaResearchLaboratories)170個2型豬鏈球菌菌株、22個1-22型豬鏈球菌參考菌株組，以及其他鏈球菌菌種和其他細菌菌株組，各取20μlDNA或粗製溶胞產物樣品點在Zeta探針尼龍膜(Biorad)上。按製造商推薦的方法使膜與32P標記的mrp和ef探針一起保溫。過夜雜交後，於65℃下40mM磷酸鈉緩衝液(pH7.2)+5%SDS+1mMEDTA將膜洗兩次各30分鐘，並於65℃下用40mM磷酸鈉緩衝液(pH7，.2)+1%SDS+1mMEDTA洗兩次每次30分鐘。所有(預)雜交均在雜交烘箱(Hybaid)內進行。結果mrp探針。使2型豬鏈球菌之三種表型菌株的染色體DNA雜交到mrp基因的不同區域。使用六個不同的mrp探針(如圖14a中圖解所示)。EcoRI-SnaBI片段，即m-Ⅰ，含有整個mrp編碼區。m-Ⅱ、m-Ⅲ、m-Ⅳ和m-Ⅴ探針含有mrp基因的不同區域。MRP+EP+和MRP+EF＊菌株與所有的mrp探針強雜交。另外，m-Ⅰ、m-Ⅱ、m-Ⅳ和m-Ⅴ探針與5個MRP-EF-菌株中的4個強雜交。1個MRP-EF-菌株則不與任何一個mrp探針雜交。這些數據表明4個MRP-EF-菌株含有與菌株D-282之mrp基因同源的大區域，而菌株25缺乏完整的mrp基因。但這4個MRP-EF-菌株只與探針m-Ⅲ產生微弱雜交，這表明只有探針Ⅲ-Ⅲ的一個小部分與它們的DNA同源。探針m-Ⅵ是在除去探針m-Ⅲ的5′端385bp和3′端325bp後構建成的。5個MRP-EF-菌株完全不與探針m-Ⅵ雜交，表明這些菌株缺少與m-Ⅵ探針雜交的區域。因此，可以用探針m-Ⅵ來區分mRP+和MRP-菌株。ef和ef＊探針。三種表型之2型豬鏈球菌的染色體DNA與ef基因的不同區域雜交。使用了四個不同的ef探針(如圖14b中圖解所示)。所有MRP+EF+和MRP+EF＊菌株以及1個MRP-EF-菌株可與所有的ef探針雜交。相反地，4個MRP-EF-菌株都不與任何一個ef探針雜交。這些結果表明，上述這些MRP-EF-菌株中大多數缺少與ef基因同源的完整區域，而只有1個MRP-EF-菌株似乎包含與ef基因同源的完整區域。因此探針e-Ⅰ至e-Ⅳ都不能被用來區分三種類型。因為編碼EF＊蛋白質的基因含有不存在於編碼EF蛋白質的基因中的DNA片段，所以可選用這個額外DNA的一部分作為探針(圖14C，探針e-Ⅴ)。探針e-v可與所有的MRP+EF＊雜交。相反，MRP+EF+和MRP-EF-菌株都不與e-Ⅴ探針雜交。這些數據顯示，MRP+EF+和MRP-EF-菌株缺少與e-Ⅴ同源的區域。因此探針對MRP+EF＊菌株是特異的。因此，如果在互補雜交研究中所用m-Ⅵ和e-Ⅴ，便有可能鑑別2型豬鏈球菌的三種表型。如果2型豬鏈球菌菌株與探針m-Ⅵ和e-Ⅴ雜交，這些菌株應屬於MRP+EF＊表型;如果2型豬鏈球菌菌株與m-Ⅵ雜交但不與e-Ⅴ雜交，這些菌株即屬於MRP+EF+表型;最後如果菌株與m-Ⅵ和e-Ⅴ不雜交，則它們便屬於MRP-EF-表型。就170個其他2型豬鏈球菌菌株試驗mrp、ef和ef＊探針。88個菌株具有MRP+EF+表型，37個菌株具有MRP+EF＊表型，45個菌株具有MRP-EF-表型。與前述數據相一致，所有MRP+EF+菌株都與探針M-Ⅰ至M-Ⅵ及e-Ⅰ至e-Ⅳ雜交，但都不與探針e-Ⅴ雜交。再者，所有37個MRP+EF＊菌株都與所有的探針雜交。然而，45個MRP-EF-菌株中，只有兩個與探針m-Ⅵ和e-Ⅴ雜交，據此而錯誤地將其歸為MRP+EF＊菌株。因此，可以使用探針m-Ⅵ和e-Ⅴ以很高的可能性預測2型豬鏈球菌的表型(168/170;98.8%)。m-Ⅵ和e-Ⅴ探針的特異性。試驗豬鏈球菌血清型1至22的參考菌株與探針m-Ⅵ和e-Ⅴ的雜交情況。結果發現，豬鏈球菌2(菌株735)、4、5和14血清型菌株與m-Ⅵ探針雜交，而1/2、2、4、5、6、14和15血清型菌株與e-Ⅴ探針雜交。這些數據提示，mrp和ef基因對於豬鏈球菌血清2型不是特異的，但在幾種血清型菌株中卻存在同源序列。根據這些實驗數據，可將血清型2、4、5和15歸為MRP+EF＊表型菌株，而血清型1/2、6和15則應屬於MRP-EF-表型菌株。用探針m-Ⅰ、m-Ⅵ、e-Ⅲ和e-Ⅴ檢驗豬病原體及幾種常見細菌的染色體DNA。被檢的各菌種列於表8中。有些菌種(大腸桿菌、氧化克伯氏菌、肺炎克伯氏菌及鼠傷寒沙門氏菌)雖然可與探針m-1雜交，但都不與探針m-Ⅵ、e-Ⅲ和e-Ⅴ雜交。這些數據說明雖然在某些菌種中發現了部分mrp基因，但探針m-Ⅵ和e-Ⅴ是對豬鏈球菌特異的。因此，探針m-Ⅵ和e-Ⅴ具有潛在的診斷價值。表2實驗設計豬鏈球菌豬鏈球菌豬鏈球菌豬鏈球菌被接種豬菌株數表型分離的來源1接種劑量2的數目3MRP+EF+豬腦膜1.8453MRP+EF+豬腦膜1.96410MRP+EF+豬扁桃體1.52522MRP+EF+人2.93417MRP+EF-豬扁桃體1.26424MRP+EF-人1.22428MRP+EF-人1.23412MRP-EF-豬扁桃體1.05512MRP-EF-豬扁桃體0.98416MRP-EF-豬扁桃體0.70418MRP-EF-豬扁桃體1.10425MRP-EF-人0.974表4.接種2型鏈球菌(三種表型的10個菌株)的豬的各種組織中檢查出的病理損傷有病理損傷的豬的數目組織和病理損傷表型MRP+EF+表型MRP+EF-表型MRP-EF-(被檢數＝18)(被檢數＝12)(被檢數＝22)CNS腦膜炎11200腦炎11010脈絡膜炎700腦軟化500漿膜/關節心包/心外膜炎1111胸膜炎510腹膜炎1460多關節炎21500肺低位支氣管肺炎111間質性肺炎755纖維蛋白性肺炎300支氣管炎/223細支氣管周炎肝門靜脈周和/或1183小葉內病灶脾活性白髓265活性紅髓402扁桃體活性濾泡3912腺管滲出156表5.從接種2型豬鏈球菌(三種表型的10個菌株)的豬的各種組織中分離鏈球菌屍檢時從中分離豬鏈球菌的豬的數目組織表型MRP+EF+表型MRP+EF-表型MRP-EF-(被檢數＝18)(被檢數＝12)(被檢數＝22)CNS1400漿膜920關節1320肺6(9)10(2)12(8)11括弧內的數字表示同時也分離出支氣管炎博德特氏菌的豬數。表6.微生物一覽表菌群微生物微生物A人化膿鏈球菌其他菌種(Streptococcuspyogeneshumanis)B無乳鏈球菌金黃色葡萄球菌(Streptococcusagalactiae)(Staphylococcusaureus)C馬鏈球菌表皮葡萄球菌(Streptococcusequi)(Staphylococcusepidermidis)豬類馬鏈球菌豬葡萄球菌(Streptococcusequisimilisporcine)(Staphylococcushyicus)停乳鏈球菌綠色氣球菌(Streptococcusdysgalactiae)(Aerococcusviridans)獸瘟鏈球菌化膿放線菌(Streptococcuszooepidemicus)(Actinomycespyogenes)糞腸球菌大腸桿菌(3X)(Enterococcusfaecalis)(Escherichiacoli)尿腸球菌氧化克來伯氏桿菌(Enterococcusfaecium)(Klebsiellaoxytoca)液化腸球菌肺炎克來伯氏桿菌(Enterococcusliquefaciens)(Klebsiellapneumoniae)牛鏈球菌(2X)小球菌菌株3551(Streptococcusbovis)(Micrococcusluteus)產酶鏈球菌藤黃小球菌(Streptococcuszymogenes)(Micrococcus)E鏈球菌E菌群出血敗血性巴斯德氏菌(StreptococcusgroupE)(Pasteurellamultocida)G鏈球菌G菌群(2X)普通變形桿菌(StreptococcusgroupG)(Proteusvulgaris)L鏈球菌L菌群(2X)鼠傷寒沙門氏菌(StreptococcusgroupL)(Salmonellatyphimurium)P鏈球菌P菌群液化沙雷氏菌(Streptococcusgroupp)(Serratialiquefaciens)Q鏈球菌Q菌群(StreptococcusgroupQ)乳脂鏈球菌Ⅲ(StrepococcusmilleriⅢ)酵母血鏈球菌勞倫隱球菌(Streptococcussanguis)(Cryptococcuslaurentii)乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)表8.用於試驗探針特異性的其他菌種一覽表球菌(Streptococcusspecies)無乳鏈球菌馬鏈球菌(S.agalactiae)(S.equi)豬類馬鏈球菌獸瘟鏈球菌(S.equisimilisporcine)(S.zooepidemicus)停乳鏈球菌糞腸球菌(S.dysgalactiae)(Enterococcusfaecalis)液化腸球菌產酶腸球菌(E.Liquefaciens)(E.Zymogenes)尿腸球菌鏈球菌菌群E(E.faecium)(S.groupE)乳脂鏈球菌Ⅲ乳房鏈球菌(SimilleriⅣ)(S.uburis)人化膿鏈球菌牛鏈球菌(S.pyogeneshumanis)(S.bovis)動物鏈球菌G鏈球菌菌群G(S.animaleG)(S.groupG)鏈球菌菌群L生物型Ⅰ鏈球菌菌群L生物型Ⅱ(S.groupLbiotype1)(S.groupLbiotypeⅡ)鏈球菌菌群P鏈球菌菌群Q(S.groupP)(S.groupQ)血鏈球菌(S.sanguis)其他細菌胸膜肺炎放線桿菌綠色放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)(Actinobacillusviridans)豬放線桿菌親水氣單胞菌(Actinobacillussuis)(Aeromonashydrophila)化膿放線菌地衣型芽胞桿菌(Actinomycespyogenes)(Bacillaslicheniformis)蠟樣芽胞桿菌支氣管炎博德特氏菌(Bacilluscereus)(Boreletellabronchiseptica)枯草芽胞桿菌豬布魯氏桿菌生物型Ⅱ(Bacillussubtilis)(BrucellasuisbiotypeⅡ)豬布魯氏桿菌生物型Ⅰ糞彎曲桿菌(BrucellasuisbiotypeⅠ)(campylobacterfaecalis)大腸彎曲桿菌白色念珠菌(Campylobactercoli)(Candidaalbicans)空腸彎曲桿菌紅斑丹毒絲菌(Campylobacterjejuni)(Erysipelothrixrhusiopathiae)產氣夾膜桿菌A無毒性的(ClostridiumperfringensAnon-toxic)產氣夾膜桿菌A有毒性的氧化克伯氏菌(ClostridiumperfringensAtoxic)(Klebsiellaoxytoca)大腸桿菌單核細胞增多性李斯特氏菌(Escherichiacoli)(Listeriamonocytogenes)豬寄生嗜血桿菌藤黃小球菌(Haemophilusparasuis)(Micrococcusluteus)肺炎克伯氏菌豬肺炎支原體(Klebsiellapneumoniae)(Mycoplasmahyopneumoniae)小球菌菌株3551豬關節液支原體(Micrococcusstrain3551)(Mycoplasmahyosynoviae)鳥結核分支桿菌血清變異2出血敗血性巴斯德氏菌(Mycobacteriumaviumserovar2)(Pasteurellamulltocida)豬鼻支原體鼠傷寒沙門氏菌(Mycoplasmahyorhinis)(Salmonellatyphimurium)綠膿假單胞菌金黃色葡萄球菌(Pseudomonasaeruginosa)(Staphylococcusaureus)普通巴斯德氏菌豬葡萄球菌(pasteurellavulgaris)(Staphylococcushyicus)液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)小腸結炎耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica)參考資料1.Arends，J.P.，andH.C.Zanen.1984.Proc.9thLancefieldInt.Symp.StreptococciStreptococcalDis.，p.343.2.Arends，J.P.，andH.C.Zanen.1988.MeningitiscausedbyStreptoccussuisinhumans.Rev.Infect.Dis.，10131-137.3.Arends，J.P.，N.Hartwig，M.Rudolphy，andH.C.Zanen.1984.CarrierrateofStreptococcussuiscapsulartype2inpalatinetonsilsofslaughteredpigs.J.Clin.Microbiol.20945-947.4.Boom，R.，C.J.A.Sol，M.M.M.Salimans，C.L.Jansen，P.M.W.WertheimvanDillen，andJ.vanderNoordaa.1990.Rapidandsimplemethodforpurificationofnucleicacids.J.Clin.Microbiol.28495-503.5.Breton，J.，W.R.Mitchell，andS.Rosendal.1986.Streptococcussuisinslaughterpigsandabbatoirworkers.Can.J.Vet.Res.，50338-341.6.Clifton-Hadley，F.A.1983.Streptococcussuistype2infections.Br.Vet.J.1391-5.7.Clifton-Hadley，F.A.，T.J.L.Alexander，M.R.Enright，andJ.Guise.1984.MonitoringherdsforStreptococcussuistype2bysamplingtonsilsofslaughterpigs.Vet.Rec.115562-564.8.Clifton-Hadley，F.A.，T.J.L.Alexander，I.Upton，andW.P.H.Duffus.1984.FurtherstudiesonthesubclinicalcarrierstateofStreptococcussuistype2inpigs.Vet.Rec.，114513-518.9.Driessen，A.M.J.，W.deVrij，andW.N.Konings.1985.Incorporationofbeefheartcytochromecoxidaseasaproton-motive-forcegeneratingmechanisminbacterialmembranevesicles.Prcc.Natl.Acad.Sci.USA827555-7559.10.Fahnestock，S.R.，P.Alexander.J.NagleandD.Filpula.1987.Geneforanimmunoglobulin-bindingproteinfromagroupGStreptococcus.J.Bacteriol.167870-880.11.Ferretti，J.J.，R.R.B.Russell，andM.L.Dao.1989.Sequenceanalysisofthewall-associatedproteinprecursorofStreptococcusmutansantigenA.Mol.Microbiol.3469-478.12.Fischetti，V.A.，V.Pancholi，andO.Schneewind.1990.ConservationofahexapeptidesequenceintheanchorregionofsurfaceproteinsfromGram-positivecocci.Mol.Microbiol.41603-1605.13.Frithz，E.，L-O.HedenandG.L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