羅勒多糖在製備治療抗腫瘤轉移的藥品中的應用的製作方法

2023-06-03 14:36:36 3

專利名稱：羅勒多糖在製備治療抗腫瘤轉移的藥品中的應用的製作方法
技術領域：
本發明具體涉及的是羅勒多糖在製備治療抗腫瘤轉移的藥品中的應用，屬於中藥治療腫瘤轉移的技術領域。
背景技術：
癌症是世界性嚴重危害人類健康和生命的常見病。腫瘤轉移又是腫瘤惡性行為之一，是導致手術，放化療失敗的原因。為了能夠根治惡性腫瘤，除有效治療原發病灶外，控制腫瘤轉移是關鍵問題。但目前用中藥提取物治療腫瘤轉移的藥物比較少見，如中國專利於2001年2月14日分開的公開號為1283464的「一種高分子抗腫瘤轉移藥物及其製備方法」的專利，中國專利於2002年8月28日分開的公開號為1365972的「吲哚類衍生物及其抗腫瘤用途」的專利，均是用化學合成的方法得到的，毒性比較大，效果不明顯。因此，迫切需要一種有效的純中藥製劑的抗腫瘤轉移藥物，探索和開發此類藥物已成為該項研究領域研究的熱點。

發明內容本發明的目的在於提供一種純中藥製劑在製備治療抗腫瘤轉移藥物的應用。
本發明公開了羅勒多糖在製備治療抗腫瘤轉移的藥品中的應用。
本發明的羅勒多糖是從植物羅勒(Ocimum basilicum Lim)單味藥中提取分離得到的。
本發明的用羅勒多糖製備的治療腫瘤轉移的藥品，可以製成膠囊、針劑或丸劑。
羅勒為一種草本生植物，為唇形料植物(Ocimum basilicum Lim)。
羅勒多糖是從植物羅勒提取分離出來的，屬於總多糖，純品為淺棕色微甜的顆粒，易溶於水，不溶於乙醇等有機溶媒，分子量為30000-60000。
羅勒多糖其中的一種提取分離方法如下①將羅勒藥材用粉碎機粉碎。②將粉碎的羅勒粉，用85％的乙醇脫脂2次，為脫脂羅勒粉。③將脫脂羅勒粉加入適量的水，水煎2次，過濾、合併兩次提取液，放入濃縮罐中進行濃縮，使其相對密度達到1.08-1.10，然後將濃縮液冷卻至0-4℃，加入5倍量95％的乙醇靜置沉澱48小時，收集沉澱物得到粗品羅勒多糖。④再將粗品羅勒多糖加水溶解，過濾，濾液進行濃縮，使其濃縮液相對密度為達到1.08-1.10，冷卻至0-4℃後，濃縮液加入5倍量95％的乙醇靜置沉澱48小時，收集沉澱物，脫水真空乾燥後即得到精品羅勒多糖。
精品羅勒多糖進行無菌化處理後，加水溶解後，製成羅勒多糖的針劑。
精品羅勒多糖進行無菌化處理後，按常規的製藥方法，可以製成膠囊、丸劑或片劑。
以下為本發明的藥品在藥效學研究和臨床研究的結果。
(一)本發明的藥物抗腫瘤轉移作用藥效學研究1.抗自發轉移①本發明的藥物對lewis肺癌自發肺轉移模型的影響從荷瘤小鼠上剝離並選取生長良好的瘤塊，按瘤塊(g)生理鹽水(ml)為1∶3的比例勻漿，在C57BL/6小鼠腋窩皮下接種腫瘤勻漿液0.2ml/只。接種24小時後，小鼠隨機分5組，開始給藥，一組生理鹽水對照組(生理鹽水0.4ml/只)，本藥物分三個劑量組(2.5g生藥/kg、1.25g生藥/kg、0.625g生藥/kg)，絲裂黴素組(4-6mg/人/只)灌胃給藥容量為0.4ml/只，1次/日，共21天；絲裂黴素組(2mg注射前用生理鹽水稀釋至5ml，腹腔注射，劑量為0.05ml/只，用藥5天)。第21天頸椎脫臼處死動物，稱小鼠體重，瘤重和肺重Bouin氏液固定，解剖鏡下計數肺部正反面及肺葉間的轉移瘤灶，做病理組織切片觀察，最後用Mann-Whitney U-Test的方法檢驗肺轉移結節數的組間差異。以上實驗共重複三批，每批動物同一性別，結果見表1。
表1 本發明的藥物對Lewis肺癌自發轉移模型的影響(X±S)批號組別 鼠數(只) 體重(g) 肺重(g) 肺結節數 轉移率％第生理鹽水組 1021.25±1.10 0.171±0.202 16.1±3.84 100大劑量組 1018.67±2.65 0.116±0.027 2.6±2.7**80一中劑量組 1017.28±2.04 0.180±0.079 1.9±1.5**80小劑量組 1019.97±1.37 0.176±0.018 9.9±5.3**100批絲裂黴素組 1021.02±1.94 0.152±0.023 16.2±8.4 100第生理鹽水組 1122.53±1.62 0.172±0.035 18.73±7.68100大劑量組 1021.92±1.35 0.166±0.016 2.90±3.73**60二中劑量組 1022.06±1.25 0.187±0.024 2.56±3.21**80小劑量組 9 22.71±1.06 0 176±0.026 3.20±1.62**100批絲裂黴素組 1021.04±1.20 0.151±0.011 6.40±5.76 100第生理鹽水組 1024.91±0.97 0.165±0.098 5.2±4.0 90大劑量組 8 21.88±2.17 0.175±0.025 1.25±2.76*25三中劑量組 8 22.61±1.76 0.158±0.092 0.5±1.07*25小劑量組 8 23.11±1.86 0.152+0.009 0.88±2.10*37.5批絲裂黴素組 8 21.65±1.47 0.14±0.014 1.29±2.56*42.8注*與生理鹽水對照組比*p＜0.05，**p＜0.01.
由結果可知，三批實驗中，本發明的藥物均可使肺轉移結節數明顯少於生理鹽水對照組(p＜0.01，p＜0.05)並且呈現出明顯的量效關係，第一、第二批實驗本發明的藥物大、中劑量及第三批實驗本發明的藥物大、中、小劑量組肺轉移率也均小於生理鹽水對照組，因此證明中藥本發明的藥物對Lewis肺癌自發轉移具有非常顯著的對抗作用。
病理切片證實，肺轉移瘤灶為Lewis肺癌。
②本發明的藥物對小鼠子宮頸癌U14脾內移植後肝轉移模型的影響表2 對小鼠子宮頸癌U14脾內移植肝內自發轉移的影響(％，X±S)
注與生理鹽水對照組比*p＜0.05，**p＜0.01.
抽取U14腹水瘤，臺盼藍排斥法計數活細胞數，用無血清的RPMI-1640培養液調整癌細胞濃度為108/ml備用，用0.25％戊巴比妥納0.4---0.6ml/只腹腔注射麻醉小鼠。在小鼠的右側腹部(脾區)消毒後，剪開約1cm的小口，剝露脾臟並固定，用4號針頭在脾臟的一端包膜下緩慢地注入0.01ml癌細胞懸液，將脾臟退回腹腔內，縫合切口。24小時後隨機分組，分組及給藥同上。第14天處死小鼠，切取肝、脾、肺、腎等器官及腹腔內部分淋巴結(包括幽門、腎門處淋巴結)，Bouin氏液固定，HE染色，組織學觀察來確定各器官及淋巴結是否有U14癌的轉移灶，肝轉移程度的組織學分級標準0級無轉移；1級肝內有1-2個200-500um的小轉移灶；2級肝內有3-5個小轉移灶或1-2個500-1000um的較大轉移灶；3級；肝內存在廣泛轉移灶。以上試驗重複3批，每批動物同一性別。結果見表2。
由以上結果可知，三批實驗中，本發明的藥物均可使肝內轉移結節數明顯少於生理鹽水對照組(p＜0.05，p＜0.01)，並且第一批實驗大中小劑量組和第二三批實驗大、中劑量組使轉移率也均小於生理鹽水對照組，肝轉移程度組織分級上，本發明的藥物組遠較生理鹽水對照組和絲裂黴素較輕。以上結果證明，本發明的藥物對小鼠子宮頸癌U14脾內移植後肝轉移的自發轉移具有非常顯著的對抗作用。
2.本發明的藥物抗血道轉移①本發明的藥物對黑色素瘤B16-F10人工肺轉移小鼠模型的影響取生長良好的小鼠B16-F10實體瘤製成細胞懸液，以PBS衝洗3遍，過200目篩網得到單細胞，用PBS調整單細胞懸液為106/ml濃度，用4號針頭給C57BL/6小鼠尾靜脈注射瘤液0.2ml/只。24小時後小鼠隨機分5組。分組及給藥劑量同上。第20天頸椎脫臼處死小鼠，稱小鼠體重，肺重，解剖鏡下計數肺轉移瘤灶，用Mann-Whitney U-Test方法進行統計學檢驗，Bouin氏液固定後，病理組織學切片觀察。試驗重複三批，每批動物同一性別，結果見表3。
由以上結果可知，三批實驗中，本發明的藥物均可使肺內轉移結節數明顯少於生理鹽水對照組(p＜0.05，p＜0.01＝。此結果證明本發明的藥物對黑色素瘤B16-F10人工肺轉移這種血道轉移模型，具有明顯的對抗作用。
從病理組織切片也證實，肺結節為B16-F10轉移瘤。
表3 藥物對黑色素瘤B16-F10人工肺轉移小鼠模型的影響(X±S)批號組別鼠數(只) 體重(g) 肺重(g) 肺結節數 轉移率％第生理鹽水組 10 18.10±2.91 0.223±0.154 10.21±6.17 70大劑量組917.16±2.88 0.168±0.095 4.11±8.27*77.8一中劑量組916.92±2.03 0.186±0.127 6.89±14.28*44.4小劑量組918.44±1.50 0.146±0.07 4.78±8.91*66.7批絲裂黴素組 918.47±1.11 0.266±0.202 16.02±2.91 77.8第生理鹽水組 824.89±1.89 0.171±0.026 4.75±6.34 50大劑量組823.63±2.69 0.170±0.017 1.88±3.48**25二中劑量組823.05±2.09 0.165±0.016 6.50±6.61**75小劑量組823.43±1.31 0.155±0.008 1.75±2.43**50批絲裂黴素組 824.16±2.17 0.154±0.017 3.75±6.96 25第生理鹽水組 822.06±1.87 0.196±0.018 12.15±7.21 80大劑量組821.78±1.49 0.166±0.015 2.14±3.78**80三中劑量組819.25±1.44 0.145±0.013 3.23±5.86**80小劑量組818.65±1.58 0.155±0.016 4.55.±6.21*60批絲裂黴素組 819.02±1.66 0.179±0.012 7.85±9.14 70注與生理鹽水對照組比*p＜0.05，**p＜0.01.
②本發明的藥物對肝癌H22人工肺轉移小鼠模型的影響取生長良好的腹水型H22肝癌小鼠，抽取腹水，以PBS衝洗3遍，調整細胞濃度為106/ml，用4號針頭給昆明種小鼠尾靜脈注射瘤液0.2ml/只，24小時後小鼠隨機分5組，分組及給藥劑量同上。第15天頸椎脫臼處死動物，稱小鼠體重，肺重，Bouin氏液固定後解剖鏡下計數肺轉移瘤灶，用Mann-Whitney U-Test方法進行統計學檢驗，肺做病理組織學切片觀察。實驗重複三批，每批動物同一性別，結果見表4。
由以上結果可知，三批實驗中，本發明的藥物均可使肺轉移瘤灶數明顯少於生理鹽水對照組(p＜0.05，p＜0.01)而且從各種肺切片上也可清晰的比較出差別，此結果證明，本發明的藥物對肝癌H22人工肺轉移這種血道轉移模型具明顯的對抗作用。從病理組織切片上證實肺結節為H22轉移瘤。
表4 本發明的藥物對肝癌H22人工肺轉移小鼠模型的影響(X±S)批號組別鼠數(只)體重(g) 肺重(g) 肺結節數轉移率％第生理鹽水組 1021.02±5.00 0.172±0.026 19.50±47.75 90大劑量組1020.27±3.39 0.169±0.027 3.8±5.01**80一中劑量組1022.49±3.72 0.174±0.035 8.30±9.16*40小劑量組1021.93±3.80 0.159±0.029 10.50±11.75 60批絲裂黴素組 1020.83±3.12 0.174±0.028 18.30±20.33 90第生理鹽水組 1022.29±2.97 0.160±0.019 21.30±28.28 100大劑量組1022.16±4.15 0.152±0.023 11.20±14.69*80二中劑量組1021.24±4.65 0.158±0.039 13.40±13.67*90小劑量組1023.68±6.56 0.172±0.047 16.00±30.90 80批絲裂黴素組 1021.84±4.48 0.178±0.036 20.45±18.32 100第生理鹽水組 1022.83±1.93 0.140±0.012 26.90±18.71 100大劑量組1022.53±2.07 0.140±0.014 6.67±4.36**100三中劑量組1020.92±2.54 0.142±0.062 10.10±8.56*100小劑量組1021.26±1.79 0.168±0.068 22.30±17.21 90批絲裂黴素組 1022.12±2.13 0.171±0.071 23.48±18.52 100注與生理鹽水對照組比*p＜0.05**p＜0.013.本發明的藥物抗淋巴道轉移中藥本發明的藥物對肝癌H22淋巴道轉移小鼠模型的影響取生長良好的腹水型H22肝癌小鼠，抽取腹水，以PBS衝洗3遍，調整瘤細胞濃度為2×106/ml，用4號針頭給昆明種小鼠右足趾爪墊接種瘤液0.05ml/只，24小時後小鼠隨機分5組，分組及給藥劑量同上，灌胃給藥共20天，絲裂黴素與局部給藥(後肢皮下)給藥0.02ml/只，連續用藥5天。第21天頸椎脫臼處死動物，稱小鼠體重，肺重，Bouin氏液固定後解剖鏡下計數肺轉移瘤灶，用Mann-Whitney U-Test方法進行統計學檢驗，肺做病理組織學切片觀察，並觀察全身淋巴轉移情況。實驗重複三批，每批動物同一性別，結果見表5。
由三批實驗結果可知，本發明的藥物對肝癌H22爪墊移植的淋巴道轉移這種血道轉移模型具明顯的對抗作用，使肺轉移結節數明顯少於生理鹽水對照組(P＜0.01＝，使淋巴道轉移控制在一級淋巴，所以本發明的藥物對肝癌H22淋巴道轉移也具明顯對抗作用。
表5 本發明的藥物對肝癌H22淋巴道轉移小鼠模型的影響(X±S)批號 組別 鼠數體重(g) 肺重(g) 肺轉移轉移率％ 淋巴轉(只) 灶瘤數 移級數第 生理鹽水組 12 24.56±3.45 0.243±0.088 26.08±6.36 100 III大劑量組10 24.96±2.50 0.192±0.013 5.38±4.27**100 I一 中劑量組11 25.28±3.46 0.244±0.081 8.63±4.74**100 I小劑量組10 25.89±4.04 0.210±0.059 8.37±5.28**100 II批 絲裂黴素組 10 21.86±3.10 0.251±0.078 19.1610.21100 III第 生理鹽水組 12 24.56±3.45 0.241±0.086 18.91±10.4 100 III大劑量組10 25.04±2.16 0.181±0.014 6.14±5.12**70 I二 中劑量組11 23.29±3.46 0.192±0.016 7.109±4.54**90 I小劑量組10 24.12±3.12 0.213±0.06 9.18±6.12**100 II批 絲裂黴素組 11 22.58±2.71 0.235±0.07 16.14±9.18 100 II第 生理鹽水組 10 23.12±2.89 0.182±0.063 18.49±10.4 100 III大劑量組12 22.14±3.21 0.121±0.03 4.15±5.10**100 I三 中劑量組12 22.86±5.42 0.135±0.02 5.86±3.20**100 II小劑量組11 23.14±4.11 0.152±0.02 8.24±6.58**100 II批 絲裂黴素組 11 22.45±3.02 0.199±0.06 12.57±11.8 100 III注與生理鹽水對照組比*p＜0.05，**p＜0.01.
二、本發明的藥物抗肺癌、肝癌作用臨床研究本發明的藥物治療惡性腫瘤的臨床觀察(山東省腫瘤防治研究院內四科)自1999年8月，開始使用本發明的丸劑藥物抗腫瘤臨床觀察。採用隨機分組的方法，共觀察42例，其中治療組22例，對照組20例，均為住院病人，肺癌患者均有病理學或細胞學診斷。現總結如下1.臨床資料治療組22例，男性18例，女性4例，年齡31-70歲。肺癌21例，(小細胞未分化癌3例，腺癌8例，鱗狀細胞癌7例)，肝癌1例。平均年齡56.9歲，KPS記分60分以上。對照組20例，男性15例，女性5例，年齡30-69歲，平均年齡55.2歲。肺癌18例(小細胞未分化癌3例，腺癌9例，鱗狀細胞癌6例。)2.治療方法對照組單獨化療。小細胞未分化肺部給予PDD20/日，靜滴，第1-5天VP-16.01/日，靜滴，第1-5天；3周重複。非小細胞肺癌VDS 4mg，靜注，第1天第8天；mmc6mg，靜注，第1-5天；3周重複。肝癌行肝動脈介入治療，用藥ADM、5-Fu、PDD，4周重複。治療且在上化療方案基礎上口服本發明的丸劑藥物，每次1.5g，每日三次，連服3個月為一療程。
3.結果(1)治療組一年生存率77.2％，較對照組40％高，經卡方檢驗，P＜0.05，兩組有明顯差異，說明治療組優於對照組。
(2)治療各項免疫功能CD3、CD4、CD8、CD4/CD8治療後有所上升，NK細胞治療後有升高趨勢，但經t檢驗無統計學意義。對照組NK細胞治療後下降，P＜0.05，有顯著差異。治療組CD3、CD8治療後指標與對照組相比P＜0.01，有明顯差異；治療組CD4與對照組治療後CD4相比，P＜0.05，有差異。證明本發明的藥物對免疫功能有一定的增強作用。
(3)治療組血色素、白細胞、血治療前後無明顯變化。紅細胞治療組前後相比，P＜0.05，有差異，說明本發明的藥物對紅細胞有一定的影響。對照組的白細胞治療前後，P＜0.01，有明顯下降。血色素血小板紅細胞無明顯變化，證實對照組單用化療，對白細胞有抑制作用，而治療組，對白細胞有一定的保護作用。
(4)治療組未發現肝腎功能損害。兩組轉肽酶治療後有明顯差異，p＜0.01。可以表明本發明的藥物對肝腎功能無任何毒性，對照組肝功有一定損害。
(5)觀察凝血酶原時間兩組均未發現明顯變化。
(6)未發現消化道反應、過敏反應，對心臟及周圍神經未見毒副反應，無發熱現象。
根據以上結果，可以得出本發明的優點在於發掘了羅勒多糖治療抗腫瘤轉移的新領域；本發明的藥物安全無毒，療效顯著；原料來源豐富、價廉、並可製成各種劑型。
下面將描述本發明的幾個實施例，但本發明的內容完全不局限於此。
具體實施方式
實施例1①取羅勒藥材5KG，用粉碎機粉碎。②將粉碎的羅勒粉，加入8KG85％的乙醇脫脂，共2次，得到脫脂羅勒粉。③將脫脂羅勒粉加入10KG的無離子水，水煎2次，過濾、合併兩次提取液，放入濃縮罐中進行濃縮，使其相對密度達到1.10，然後將濃縮液冷卻至0-4℃，加入5倍量95％的乙醇靜置沉澱48小時，收集沉澱物得到粗品羅勒多糖。④再將粗品羅勒多糖加入1KG無離子水溶解，過濾，濾液進行濃縮，使其濃縮液相對密度為達到1.08，冷卻至0-4℃後，濃縮液加入5倍量95％的乙醇靜置沉澱48小時，收集沉澱物，脫水乾燥後即得到精品羅勒多糖。
實施例2取實施例1製備的精品羅勒多糖200g，殺菌處理後，加入5kg無菌水溶解，裝瓶配成2ml/支的針劑。
實施例3取實施例1製備的精品羅勒多糖200g，殺菌處理後，按每個0.3g，裝入膠囊，即製成成品。
權利要求
1.羅勒多糖在製備治療抗腫瘤轉移的藥品中的應用。
2.根據權利要求1所述的羅勒多糖在製備治療抗腫瘤轉移的藥品中的應用，其特徵在於羅勒多糖是從植物羅勒單味藥中提取分離得到的。
3.根據權利要求1或2所述的羅勒多糖在製備治療抗腫瘤轉移的藥品中的應用，其特徵在於藥品為膠囊、針劑或丸劑。
全文摘要
本發明具體涉及的是羅勒多糖在製備治療抗腫瘤轉移的藥品中的應用，屬於中藥治療腫瘤轉移的技術領域。本發明公開了羅勒多糖在製備治療抗腫瘤轉移的藥品中的應用，羅勒多糖是從植物羅勒(Ocimum basilicum Lim)單味藥中提取分離得到的，可以製成膠囊、針劑或丸劑。本發明的優點在於發掘了羅勒多糖治療抗腫瘤轉移的新領域；本發明的藥物安全無毒，療效顯著；原料來源豐富、價廉、並可製成各種劑型。
文檔編號A61K31/715GK1498625SQ0213577
公開日2004年5月26日 申請日期2002年11月8日 優先權日2002年11月8日
發明者夏麗英, 鄭廣娟, 周洪雷, 張丹, 劉鎧, 張靜, 聶克 申請人:山東中醫藥大學