一種以重組蛋白為標籤的表達純化系統的製作方法

2023-06-06 18:43:31 1

專利名稱：一種以重組蛋白為標籤的表達純化系統的製作方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及一種蛋白表達純化系統，尤其是一種以重組蛋白為 標籤的表達純化系統，該表達純化系統能夠提高目的蛋白產率、實施監測蛋白表達效果、純 化過程。
背景技術：
已知蛋白質的生產、分離和純化在生命科學研究和多肽類藥物生產中具有重要的 地位。尋找使得蛋白質的產量提高、使得生產過程和純化過程變的可視可控的良好方法，是 本領域研究人員的研究重點之一。目前廣泛應用的是成熟的原核表達系統所用的標籤有麥 芽糖結合蛋白標籤(MBP)，穀胱甘肽轉移酶(GST)標籤、組氨酸His標籤等，這些標籤在提 高蛋白的溶解度、幫助蛋白摺疊方面顯示了一定的作用。該表達純化系統主要操作方法包 括設計重組蛋白的融合片段，構建帶有目的片段的載體，轉入大腸桿菌表達，粗分離，層析 純化和跑蛋白電泳驗證。但是，實踐表明，目前的技術仍存在如下問題對蛋白是否表達、表達量如何、是否 形成包含體沉澱、是否存在斷表達等情況並不能有一個直觀的了解；同時在蛋白純化時，對 目的蛋白的走向一無所知，只能從峰值判斷是否有蛋白流過；整個過程在暗箱中完成，需要 花費大量的財力和物力去檢驗等等。因此現有技術的蛋白純化體系中使用的標籤尚無法實 時指示目標蛋白在表達、純化中的情況，蛋白純化實驗周期長，可控性弱。

發明內容
本發明的目的是為解決目前蛋白表達純化中遇到的問題，提供一種以重組蛋白為 標籤的表達純化系統。該表達純化系統能夠提高蛋白表達效率、實時跟蹤蛋白表達純化情 況。具體而言，本發明提供一種基於螢光蛋白的雙標籤「夾心法」蛋白表達純化系統。本發明採用新型螢光蛋白和His短肽為標籤構建了一個雙標籤「夾心法」蛋白表 達系統，其特徵是將目的蛋白的兩端接上標籤，在N端連接一個新型蛋白sGFP標籤，在C端 連接上一個組氨酸His短肽，並在螢光蛋白標籤兩端和目的蛋白片段兩端加有多核苷酸酶 切位點，蛋白全長融合表達。本發明同時可以根據需要在目的蛋白與標籤之間加入蛋白酶 切位點，His標籤可以根據純化需要縮短或延長。本發明中，將目的蛋白接上不同標籤後進行融合表達表達，用親和層析進行純化， 其中螢光蛋白(superfold Green Fluorescence Protein, sGFP)為標籤一,組氨酸His 接 頭為標籤二，構建成「夾心法」蛋白表達純化系統。本發明中，在目的蛋白N端接上螢光蛋白sGFP，在目的蛋白C端接上His6的短肽 和一個終止密碼子，重組蛋白進行全長融合表達，並用Ni柱親和層析純化。本發明中，在目的蛋白與sGFP間，在目的蛋白與His短肽間具有多核苷酸序列酶 切位點。
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本發明中，在目的蛋白與sGFP間，在目的蛋白與Hi s短肽間具有可插入的蛋白酶 切位點。本發明中，Hi s短肽接頭具有不同的胺基酸個數。本發明所述的載體表達的融合蛋白N端是一個新型螢光蛋白sGFP，該螢光蛋白自 身性質穩定，溶解度高，且能夠幫助其C端的融合蛋白進行正確的摺疊和表達，提高目的蛋 白的可溶性，適合作為蛋白融合標籤。同時，在可見光下sGFP激發綠光，因此在蛋白表達和 純化時能夠對全過程可視化監控，僅通過肉眼監視蛋白的表達效率、斷裂程度及純化流程。本發明中，提供了具有該雙標籤「夾心法」重組蛋白片段載體pT7Hi s，其中，重組蛋 白片段載體pT7His上有宿主體所識別的開放可讀框orf，AMP抗性標記進行篩選，限制性內 切酶位點 BamHI，Ndel, Xhol, Ecol, SamI, Hindlll,以及一段 His 短肽基因。本發明中，採用限制性內切酶技術，其能夠在特定的核苷酸序列處切開位點，幫助 加入或去除所需要的片段。在螢光蛋白片段的兩側設計了多核苷酸酶切位點，能夠幫助對 螢光蛋白的替換。本發明將sGFP螢光蛋白的DNA序列加入到所述載體的左端，使其能夠優 先表達具有發光性能的螢光蛋白，使得整個表達純化系統在第一時間達到可視化的效果。本發明在目的片段兩側設計了多個核苷酸酶切位點，可以根據需要接入不同目的 蛋白的片段，且便於對目的蛋白片段的替換，在商業生產上能夠進行大規模的批量操作。本發明中，所述的His標籤放在了重組蛋白全長片段的末端，即C端，使得只有當 該重組蛋白全長表達時，才能夠具有His標籤；而那些斷表達的蛋白則不具有His標籤，於 是可以通過鎳柱親和層析得到分離，並在流出液中根據顏色判斷重組蛋白斷表達情況。本發明中，可以根據需要縮短或延長Hi s短肽的胺基酸個數，從而優化分離純化 的效果。本發明中，在將目的蛋白組裝進載體的同時在其C端設計了蛋白酶切位點，在表 達純化後將螢光蛋白標籤切除，最終獲得無大分子量標籤的蛋白產品，能滿足商業生產目 的的完整、沒有任何接頭的蛋白產品。本發明在目的蛋白的基因片段N端接上新型螢光蛋白標籤sGFP，在螢光蛋白標籤 與目的蛋白間加入蛋白酶切位點。sGFP亮度高，理化性質穩定，使得操作者能夠通過顏色判 斷目的蛋白是否表達，其表達程度如何，在純化過程中實時示綜目的蛋白的走向，根據顏色 收集有目的蛋白的洗脫液，不用經過電泳步驟即可進行後續實驗，降低實驗操作難度和實 驗經費。sGFP同時也能幫助其C端融合蛋白的摺疊，對於低表達、易沉澱的蛋白能夠提高其 摺疊效率和溶解性。蛋白酶切位點能夠將大分子螢光蛋白標籤去除，獲得沒有標籤的完整 目的蛋白，提高商業化的適用率。在目的蛋白片段C端接上His標籤，用於鎳柱的親和層析 系統，便於重組蛋白的純化。當含有目的蛋白的樣品上柱時，斷表達的蛋白由於不具有His 標籤使得段表達蛋白不能上柱，在流出液中因有螢光蛋白標籤故能指示指示蛋白的斷裂表 達情況。本發明在該載體系統中設計了多個核苷酸酶切位點，方便不同的用戶選用熟悉或 者偏好的酶進行重組加工，因此對大量不同目的蛋白的替換方便，適用於大規模研究和生 產。本發明的有益效果是1)螢光蛋白亮度高，而且穩定，有利於可視化。2)螢光蛋白性質穩定，助摺疊，能夠提高目的蛋白增溶性。
3)雙標籤「夾心法」設計指示蛋白的斷裂表達情況。4)His接頭長度根據純化條件可任意調整。5)多核苷酸酶切位點設計便於目的蛋白替換，操作便捷。6)實時監控，節省時間和經費。7)蛋白酶切位點有助於商業化生產目的蛋白。8)表達純化系統成熟，易於大規模推廣。9)可規模化、產業化，成批操作，帶來可觀經濟效益。下面是結合附圖和實驗例本對本實驗新型進一步說明。


圖1是本發明的載體構建示意圖，顯示了重組蛋白的全長DNA片段內容，其中，灰 色豎線表示限制性核苷酸酶切位點，白色表示螢光蛋白標籤的DNA片段，左側灰色方向表 示蛋白酶切位點的短肽，深灰色圓形表示目的蛋白的DNA片段，右側灰色方形為His標籤的 DNA片段。圖2是具有該雙標籤「夾心法」重組蛋白片段載體pT7His的標準示意圖，其中，重組蛋白片段載體pT7His上有宿主體所識別的開放可讀框orf，AMP抗性標 記進行篩選，限制性內切酶位點BamHI, Ndel，Xhol，Ecol，SamI，Hindlll，以及一段His短
肽基因。圖3是將構建完成的載體轉入大腸桿菌中進行篩選，取正確克隆在自動誘導培養 基中進行表達實例。圖4為帶有螢光標籤的蛋白在收菌、粗分離過程中能夠全流程的進行示綜，其中，從左至右為離心收菌、重懸菌體、離心沉澱和離心上清。圖5和圖6為層析柱分離純化時標籤目的蛋白實時走向的示意圖，其中，圖5中深灰色部分表示掛柱的目的蛋白，顯示目的蛋白在流程中進行的環 節，蛋白斷表達情況和蛋白的實際表達量；圖6中左一為上樣前；左二為不掛柱的流出液， 無亮色，可以判斷該蛋白斷表達情況較低；右二為NiC清洗的流出液，說明雙標籤重組蛋白 掛柱效果好；右一為NiB洗脫後的樣品。圖7是用DEAE離子交換柱梯度洗脫時的示綜效果和洗脫結果。圖8是使用該雙標籤「夾心法」系統的TEV酶的酶活測定結果。
具體實施例方式實施例1在根據所要研究或生產的目的蛋白DNA序列應用PCR技術在目的蛋白序列兩端加 上限制性酶切位點，並根據需要在N端加上蛋白酶切位點，用於去除接頭。結合圖2所示，將PCR後的目的蛋白片段插入到雙標籤「夾心法」載體系統中。將構建完成的載體轉入大腸桿菌中進行篩選，取正確克隆在自動誘導培養基中進 行表達。圖3所示，使用了該雙標籤「夾心法」系統後能對蛋白是否表達具有指示作用，其 中顯示了帶有螢光標籤的蛋白表達，呈亮色，從顏色可以看出有明顯的蛋白表達，而沒有熒 光標籤的表達系統，則不能推斷蛋白表達情況如何。
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結合圖4所示，本發明觀察了帶有螢光標籤的蛋白在收菌、粗分離過程的全流程， 結果顯示，離心後沉澱只有深色，已經沒有亮色，說明破菌完全。本發明所述的標籤在層析柱分離純化時能夠顯示目的蛋白實時走向(圖5和圖 6)，操作者根據顏色變化，能判斷出所掛柱的目的蛋白，了解目的蛋白在流程中進行的環 節，同時能夠有效的檢查蛋白斷表達情況，還可以從最終產品的顏色粗略估計目的蛋白的 實際表達量。還可以根據不掛柱的無亮色的流出液，判斷出蛋白斷表達情況較低；根據NiC 清洗的流出液，判斷出雙標籤重組蛋白掛柱效果好。用DEAE離子交換柱梯度洗脫時的示綜效果和洗脫結果顯示，在沒有紫外監控設 備的實驗條件下，可以根據每管中的顏色確定目的蛋白存在於哪幾管中以及濃度如何，顏 色越深表明該管蛋白濃度越高，可以相應地方便的收集其中的目的蛋白。本發明對使用該 雙標籤「夾心法」系統的TEV酶的酶活進行了測定，與傳統的MBP標籤相比，實驗結果顯示 本發明對蛋白酶酶活沒有影響。
權利要求
一種以重組蛋白為標籤的表達純化系統，其包括，將目的蛋白接上不同標籤後進行融合表達表達，用親和層析進行純化，其特徵是所述目的蛋白的兩端接有標籤，其N端連接螢光蛋白(sGFP)標籤，C端連接組氨酸His短肽標籤，構建成「夾心法」蛋白表達純化系統。
2.根據權利要求1所述的表達純化系統，其特徵是所述目的蛋白C端接有His6的短 肽和一個終止密碼子，重組蛋白進行全長融合表達，並用Ni柱親和層析純化。
3.根據權利要求1所述的表達純化系統，其特徵是在所述的目的蛋白與螢光蛋白 (sGFP)間，在所述的目的蛋白與His短肽間具有多核苷酸序列酶切位點。
4.根據權利要求1所述的表達純化系統，其特徵是在所述的目的蛋白與螢光蛋白 (sGFP)間，在所述的目的蛋白與His短肽間具有可插入的蛋白酶切位點。
5.根據權利要求1所述的表達純化系統，其特徵是所述的His短肽接頭具有不同氨 基酸個數。
全文摘要
本發明屬生物技術領域，涉及一種蛋白表達純化系統，尤其是一種以重組蛋白為標籤的表達純化系統。本發明的蛋白表達純化系統，是將目的蛋白的兩端，在N端連接一個新型螢光蛋白sGFP標籤，在C端連接上一個組氨酸His短肽，並加有多核苷酸酶切位點，蛋白全長融合表達。同時可以根據需要在目的蛋白與標籤之間加入蛋白酶切位點。該系統的目的蛋白表達效率能夠得到改進，提高目的蛋白產率，全長蛋白在可見光下為綠色，可以實施監測蛋白表達效果、純化過程；僅通過肉眼監視蛋白的表達效率、斷裂程度及純化流程。
文檔編號C12P21/02GK101921819SQ200910052999
公開日2010年12月22日 申請日期2009年6月12日 優先權日2009年6月12日
發明者丁澦, 劉瑞, 吳一峰, 吳旭冬, 吳迪, 周楊彬, 嶽志亮, 陸致晟, 陳聞濤 申請人:復旦大學