一種製備重組人源血管內皮生長因子vegf165的方法

2023-06-07 08:02:26 1

一種製備重組人源血管內皮生長因子vegf165的方法
【專利摘要】本發明涉及製備重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165蛋白質的方法，包括步驟①構建用於表達不帶標籤的重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165的表達載體，②通過表達系統表達重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165，③分離和用陰離子交換柱純化重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165。本發明還涉及用於上述方法製備的重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165蛋白質的復性方法和純化方法。本發明所獲得的rh-VEGF165不含任何純化標籤同時也避免了使用腸激酶切除6×His-Tag及後續從rh-VEGF165中純化去除6×His-Tag標籤和腸激酶的步驟，大大簡化了rh-VEGF165的純化工藝，降低了生產成本，極大地方便了rh-VEGF165的工業化生產。
【專利說明】—種製備重組人源血管內皮生長因子VEGF165的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物工程領域，涉及重組人源血管內皮生長因子VEGF165蛋白的製備方法。
【背景技術】
[0002]血管內皮生長因子(Vascularendothelial growth factor, VEGF)又稱血管通透因子(Vascular permeability factor, VPF),是ー種特異性作用於內皮細胞的多功能因子，作為特異的內皮細胞有絲分裂素，它是最主要的血管生成因子。它不僅與胚胎發育、創傷修復、骨形成改建等生理性過程有夫，而且參與心血管疾病、缺血缺氧性疾病等病理性血管形成過程，尤其與腫瘤新生血管的形成、生長、浸潤、轉移等密切相關。
[0003]VEGF是高度保守的同源ニ聚體糖蛋白。由於mRNA不同的剪切方式，產生了VEGF121、VEGF145, VEGF165、VEGF185、VEGF206 等至少 5 種蛋白形式，其中 VEGF121、VEGF145.VEGF165是分泌型可溶性蛋白，能直接作用於血管內皮細胞促進其増殖，増加血管的通透性。VEGF165是人類組織中VEGF主要的基因產物，也是VEGF家族中最重要的血管生成調節因子。
[0004]隨著VEGF在癌症藥物研發中變得越來越重要，市場上對有生物活性的VEGF的需求也越來越大。由於VEGF在人體血液中含量不高，來源非常有限，導致其提取難度大、產量甚微，遠遠不能滿足需要，因此，利用基因重組技術大量生產有生物活性的VEGF勢在必行。
[0005]利用基因工程技木、以微生物為載體生產外源蛋白具有廣闊的應用前景。到目前為止，已經發展了多種蛋白表達系統。大腸桿菌表達系統是研究的最清楚的ー套原核表達系統，具有遺傳背景清楚、成本低、表達量高、表達產物分離純化相對簡單以及適於エ業化生產等優點，其應用非常廣泛。
[0006]但是常規的用大腸桿菌表達VEGF的系統中，rh-VEGF165通常含有標籤，標籤的加入影響了 rh-VEGF165的生物活性，而且由於需要用腸激酶切除標籤的步驟，使蛋白的提純步驟更加複雜，從而增加了生產成本。

【發明內容】

[0007]為解決上述問題，本申請構建了不含有標籤的rh-VEGF165表達系統，避免了純化標籤對rh-VEGF165生物活性的影響，本發明所獲得的rh-VEGF165蛋白生物活性為1.76ng/ml,同sigma公司最優級VEGF165的生物活性相當，說明本發明獲得的rh-VEGF165具有同天然VEGF165基本一致的蛋白構象。此外，本發明製備的rh-VEGF165用陰離子交換柱純化的效果明顯優於CM柱和鎳柱的純化效果，並且簡化了步驟，節省了成本。
[0008]本發明提供了一種製備並純化重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165的方法，該方法包括步驟①構建用於表達不帶標籤的重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165的表達載體！②利用所述表達載體通過表達系統表達重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165 ；和③分離並用陰離子交換柱純化所述表達系統中表達的重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF1650
[0009]上述技術方案構建了不含有標籤的rh_VEGF165表達系統，避免了純化標籤對rh-VEGF165生物活性的影響，同時用陰離子交換柱純化簡化了純化的步驟，節省了成本。
[0010]在一些實施方式中,所述表達系統包括大腸桿菌。
[0011]在一些實施方式中，所述方法進ー步包括復性步驟，所述復性步驟包括利用包涵體復性液復性重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165蛋白質的包涵體。
[0012]在一些實施方式中，所述包涵體復性液包含濃度大於等於2mM的GSSG和濃度大於等於ImM的DTT，並且DTT與GSSG的摩爾濃度的比例小於I。在一些實施方式中，所述包涵體復性液包含2mM至IOmM的GSSG和ImM至5mM DTT,並且DTT與GSSG的摩爾濃度的比例優選地大於等於1: 2.5並且小於等於1: 1.5。優選地，所述包涵體復性液包含2mM的GSSG 和 ImM DTT。
[0013]在一些實施方式中，步驟①中表達載體選擇pET_28a(其圖譜見圖1)，並且克隆rh-VEGF165基因的插入位點為Nco I和Xho I酶切位點。在一些實施方式中，克隆rh-VEGF165基因的上遊引物和下遊引物分別為TACATG CCATGG CACCCATGGC AGAAGGAG(下劃線為 NcoI 酶切位點)和 ATACCG CTCGAGTTATCACCGC CTCGGCTTGT C (下劃線為 XhoI 酶切位點)。
[0014]在一些實施方式中，步驟③中所述陰離子交換柱包括強陰離子交換柱和弱陰離子交換柱等。優選地，所述陰離子交換柱為弱陰離子交換柱。更優選地，所述陰離子交換柱為DEAE柱，並且進行DEAE柱純化之前僅進行一次透析。
[0015]本發明還提供了一種重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165的復性方法，所述重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165不帶任何表達標籤，所述復性方法包括利用包涵體復性液復性重組人源血管 內皮生長因子rh-VEGF165蛋白質的包涵體，其中，所述包涵體復性液包括濃度大於等於2mM的GSSG和濃度大於等於ImM的DTT，並且DTT與GSSG的摩爾濃度的比例小於1，優選地大於等於1: 2.5並且小於等於1: 1.5。
[0016]本發明還提供了一種重組人源血管內皮生長因子rh_VEGF165的純化方法，所述重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165不帶任何標籤，所述方法包括用陰離子交換柱純化重組人源血管內皮生長因子蛋白質。優選地，所述陰離子交換柱為DEAE柱，並且進行DEAE柱純化之前僅進行一次透析。
[0017]本發明所獲得的rh_VEGF165不含任何純化標籤，同時也避免了使用腸激酶切除6XHis-Tag及後續從rh-VEGF165中純化去除6XHis_Tag標籤和腸激酶的步驟，同時用陰離子交換柱的純化大大筒化了 rh-VEGF165的純化工藝，降低了生產成本，極大地方便了rh-VEGF165的エ業化生產。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為pET_28a的圖譜；
[0019]圖2為pET-28a_hVEGF165重組質粒的酶切檢測；
[0020]圖3 為 BL21 (DE3) /pET_28a_hVEGF165 誘導表達檢測；
[0021]圖4為rh-VEGF165蛋白表達位置檢測(20°C誘導)；
[0022]圖5為rh_VEGF165蛋白表達位置檢測(37°C誘導)；[0023]圖6為rh-VEGF165蛋白包涵體的尿素溶解檢測；
[0024]圖7為復性體系中DTT與GSSG比率的優化；
[0025]圖8為復性體系中DTT和GSSG濃度的優化；
[0026]圖9為rh-VEGF165包涵體復性液的DEAE柱純化；
[0027]圖10為rh-VEGF165包涵體復性液的CM柱純化；
[0028]圖11為hVEGF165/His基因PCR產物的檢測；
[0029]圖12為pET-28ar-hVEGF165/His重組質粒的酶切檢測；
[0030]圖13 為 BL2I (DE3) /pET-28ar-hVEGF165/His 誘導表達檢測；
[0031]圖14為rh-VEGF165/His包涵體復性液的鎳柱純化；
[0032]圖15為不同濃度rh-VEGF165刺激HUVEC細胞增殖的作用；
[0033]圖16為rh_VEGF165生物活性(EC5tl)計算圖；
[0034]圖17為不同濃度rh-VEGF165/His刺激HUVEC細胞增殖的作用。
【具體實施方式】
[0035]本申請中所用的實驗材料如無特別說明均為市售購買產品。各種試劑和培養基的成分和配置方法可以參見常規實驗手冊中的描述。
[0036]為了更好地理解本發明的本質，下面結合附圖，通過對發明較佳實施方式的描述，詳細說明製備rh-VEGF165蛋白質的復性方法及復性液，但是這些實施方式不限制本發明的範圍。
[0037]本發明提供了一種製備重組人源血管內皮生長因子rh_VEGF165的方法，該方法包括步驟①構建用於表達不帶標籤的重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165的表達載體！②利用所述表達載體通過表達系統表達重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165 ；和③分離並用陰離子交換柱純化所述表達系統中表達的重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF1650
[0038]在一些實施方式中，一種製備重組人源血管內皮生長因子rh_VEGF165蛋白質的方法包括步驟:①通過大腸桿菌表達重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165，②破碎表達所述重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165的大腸桿菌菌體，③離心收集所述重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165蛋白質的包涵體，④利用包涵體復性液復性重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165，⑤用陰離子交換柱純化重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF1650
[0039]步驟①:通過大腸桿菌表達rh_VEGF165蛋白質
[0040]一、rh_VEGF165蛋白質表達載體的構建
[0041]一)模板、引物和目的基因序列
[0042]l、hVEGF165基因克隆模板:以人胚胎細胞的cDNA作為VEGF165基因克隆用模板。
[0043]2、hVEGF165基因克隆引物(南京金斯瑞合成)序列如下:
[0044]上遊引物(序列表序列1):TACATG CCATGG CACCCATGGC AGAAGGAG，下劃線為 NcoI酶切位點
[0045]下遊引物(序列表序列2) =ATACCG CTCGAG TTATCACCGC CTCGGCTTGTC，下劃線為XhoI酶切位點[0046]3、hVEGF165目的基因序列(序列表序列3):
[0047]GCACCCATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTT CATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGAC ATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCATCCTGTG TGCCCCTGATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTG TGCCCACTGAGGAGTCCAACATCACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCTC ACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTG AATGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAAGAAAATCCCTGTGGGCCT TGCTCAGAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAA TGTTCCTGCAAAAACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTGAGTTA AACGAACGTACTTGCAGATGTGACAAGCCGAGGCGGTAA
[0048]ニ ) hVEGF165 基因的擴增
[0049]以人胚胎細胞的cDNA為模板、上遊引物和下遊弓丨物直接對hVEGF165基因進行PCR擴增。
[0050]1、PCR 反應體系(50 U I):
[0051]TaKaRa PrimeSTAR Premix,25 U I ；
[0052]上遊引物，I ill;
[0053]下遊引物，I Pi;
[0054]人胚胎細胞cDNA，0.5u I ；
[0055]ddH20，22.5u I。
[0056]2,PCR 擴增條件:94°C，3 分鐘；(94。。，20 秒；56°C, 20 秒；72V, 40 秒)X 30 循環；72°C，10 分鐘;16°C保溫。`
[0057]三)pET-28a-hVEGF165重組載體的構建
[0058]1、將hVEGF165的PCR產物和pET_28a載體分別用Ncol/Xhol進行雙酶切消化，瓊脂糖凝膠回收後進行連接:
[0059]連接體系(IOiU):
[0060]DNA Ligation Kit Solution I,5 U I ；
[0061]pET-28a酶切回收片段，Iu I ；
[0062]hVEGF165 酶切回收片段，4 ；
[0063]16 °C連接過夜。
[0064]2、連接產物轉化DH5a感受態細胞，在含有50 ii g/ml卡那黴素的LB平板上於37 °C培養過夜。
[0065]3、挑取單菌落用LB液體培養基培養後提取質粒進行重組質粒的酶切檢測，結果如圖2。圖2為pET-28a-hVEGF165重組質粒的酶切檢測，其中，M為DNA Marker II (紐龍生物)，泳道I為pET-28a-hVEGF重組質粒Ncol/Xhol雙酶切檢測，pET_28a_hVEGF165重組質粒經雙酶切後產生了目標條帶，說明成功構建了 pET-28a-hVEGF165重組質粒。
[0066]用NcoI/XhoI雙酶切pET_28a載體使得pET_28a載體上位於NcoI下遊的6 XHis標籤被切除，並且由於hVEGF165基因克隆用下遊引物帶有終止子，所以XhoI下遊的6 XHis標籤也無法表達，因此構建的pET-28a-hVEGF165重組質粒表達的hVEGF165蛋白質不帶任何標籤。
[0067]ニ、hVEGF165蛋白質的表達
[0068]一 ) hVEGF165蛋白的誘導表達檢測[0069]1、提取構建正確(南京金斯瑞測序)的pET-28a_hVEGF165質粒並轉化BL21(DE3)菌株。
[0070]2、挑取 4 個 BL21 (DE3) /pET_28a_hVEGF165 單菌落，用 5ml LB (含 50 y g/ml 卡那黴素)於37°C培養4h，添加ImM IPTG於37°C誘導表達5h。同時設BL21 (DE3)/pET_28a作為陰性對照。
[0071]3、上述單菌落分別取800 ii I菌液於8000rpm離心2min,沉澱用80 ii I PBS重懸，加入20 u I上樣緩衝液混勻，取10 u I進行SDS-PAGE(12% )檢測。
[0072]圖3為BL21 (DE3)/pET-28a_hVEGF165誘導表達檢測，其中，M為蛋白質分子量標準I (紐龍生物)，泳道I-4為BL21 (DE3) /pET_28a_hVEGF165的I-4號單菌落；泳道5為BL21 (DE3)/pET-28a 對照。從 SDS-PAGE 檢測結果可以看出，BL21 (DE3)/pET_28a_hVEGF165的4個單菌落在19kDa處均有明顯蛋白質表達。
[0073]ニ)rh-VEGF165蛋白的表達位置檢測
[0074]1、BL2I (DE3) /pET-28a-hVEGF165 表達菌株用 100ml LB (含50 y g/ml 卡那黴素)於37°C培養4h，添加IPTG使其終濃度分別為0.lmM、0.2mM、0.和1.5mM的，ー組於20°C誘導表達12h,另一組於37°C誘導表達4h。
[0075]2、離心收集菌體，用20ml的IOmM PBS (pH7.4)懸浮後超聲破碎:超聲3s，間隔7s，超聲破碎200次，超聲功率為650X0.45W。
[0076]3、離心破碎後的菌體，包涵體用20mll0mM PBS (pH7.4)重懸，上清和包涵體分別進行 SDS-PAGE (12% )檢測。
[0077]圖4和圖5分別為 rh_VEGF165蛋白在20°C誘導和37 °C誘導的表達位置檢測。圖4中，M，蛋白質分子量標準I (紐龍生物)，泳道I和泳道2分別為BL21(DE3)/pET-28a-hVEGF165用0.1mM IPTG誘導破碎後的上清和沉澱，泳道3和泳道4分別為BL21 (DE3)/pET-28a-hVEGF165用0.2mM IPTG誘導破碎後的上清和沉澱，泳道5和泳道6分別為BL21 (DE3) /pET-28a-hVEGF165用0.5mM IPTG誘導破碎後的上清和沉澱，泳道7和泳道8分別為BL21 (DE3) /pET-28a_hVEGF165用ImM IPTG誘導破碎後的上清和沉澱，泳道9和泳道10分別為BL21 (DE3) /pET_28a_hVEGF165用1.5mM IPTG誘導破碎後的上清和沉澱。圖5中，M為蛋白質分子量標準I (紐龍生物)，泳道I和泳道2分別為BL21 (DE3)/pET-28a-hVEGF165用0.1mM IPTG誘導破碎後的上清和沉澱，泳道3和泳道4分別為BL21 (DE3) /pET-28a-hVEGF165用0.2mM IPTG誘導破碎後的上清和沉澱，泳道5和泳道6分別為BL21 (DE3) /pET-28a-hVEGF165用0.5mM IPTG誘導破碎後的上清和沉澱，泳道7和泳道8分別為BL21 (DE3) /pET-28a_hVEGF165用ImM IPTG誘導破碎後的上清和沉澱，泳道9和泳道10分別為BL21 (DE3) /pET-28a-hVEGF165用1.5mM IPTG誘導破碎後的上清和沉澱。
[0078]從圖4和圖5中可看出rh_VEGF165蛋白在20°C和37°C條件下均有表達，不同濃度IPTG的誘導表達效果差別不明顯，rh-VEGF165蛋白均以包涵體的形式表達在沉澱中。後續實驗選擇37°C、0.1mM IPTG誘導表達rh_VEGF165。
[0079]步驟②和③:破碎表達rh-VEGF165的菌體和離心收集rh_VEGF165的包涵體
[0080]一 ) rh-VEGF165包涵體變性溶解條件優化
[0081]1、BL21 (DE3) /pET-28a-hVEGF165 用 500ml LB (含 50 y g/ml 卡那黴素)、0.1mMIPTG於37 °C誘導表達4h。[0082]2、8000rpm離心5min收集菌體，用IOOml的IOmM PBS (pH7.4)懸浮後超聲破碎:超聲3s，間隔7s，超聲破碎200次，超聲功率為650X0.45W。
[0083]3、離心破碎後的菌體於12000rpm離心IOmin,收集包涵體。
[0084]4、包涵體沉澱用20ml的IOmM PBS (pH7.4)重懸，分別取Iml重懸的包涵體於8個EP 管中，12000rpm 離心 lOmin，沉澱分別用含有 1M、2M、3M、4M、5M、6M、7M、8M尿素的 lml20mMTris-HCl (pH8.6)重懸，室溫充分溶解2h。
[0085]6、將rh-VEGF165包涵體溶解液於12000rpm離心，取上清制樣，SDS-PAGE (12% )鑑定如下圖6。圖6為rh-VEGF165包涵體的尿素溶解檢測，其中，M為蛋白質分子量標準I (紐龍生物)，泳道I-8分別為用含I-8M尿素的20mMTris-HCl (pH8.6)溶解的rh-VEGF165包涵體溶解液，泳道9為rh_VEGF165包涵體。表I為不同濃度尿素對rh-VEGF165包涵體的溶解率。
[0086]表I
[0087]
【權利要求】
1.一種製備重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165蛋白質的方法，該方法包括步驟: ①構建用於表達不帶標籤的重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165的表達載體； ②利用所述表達載體通過表達系統表達重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165;和 ③分離並用陰離子交換柱純化所述表達系統中表達的重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF1650
2.如權利要求1所述的製備重組人源血管內皮生長因子蛋白質的方法，其中，所述表達系統包括大腸桿菌。
3.如權利要求1或2所述的製備重組人源血管內皮生長因子蛋白質的方法，其中，進ー步包括復性步驟，所述復性步驟包括利用包涵體復性液來復性重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165蛋白質的包涵體，其中，所述包涵體復性液中包含濃度大於等於2mM的GSSG和濃度大於等於ImM的DTT，並且DTT與GSSG的摩爾濃度的比例小於I，優選大於等於1: 2.5並且小於等於1: 1.5。
4.如權利要求3所述的製備重組人源血管內皮生長因子蛋白質的方法，其中，所述包涵體復性液包含2mM至IOmM的GSSG和ImM至5mM的DTT。
5.如前述任一項權利要求所述的製備重組人源血管內皮生長因子蛋白質的方法，其中，所述表達載體為pET-28a，優選其中克隆rh-VEGF165基因的插入位點為Nco I和Xho I酶切位點。
6.如權利要求5所述的製備重組人源血管內皮生長因子蛋白質的方法，其中，克隆rh-VEGF165基因的上 遊引物和下遊引物分別為TACATGCCATGG CACCCATGGCAGAAGGAG和ATACCGCTCGAGTTATCACCGCCTCGGCTTGTC。
7.如前述任一項權利要求所述的製備重組人源血管內皮生長因子蛋白質的方法，其中，所述陰離子交換柱為DEAE柱，並且進行DEAE柱純化之前僅進行一次透析。
8.—種重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165的復性方法，所述重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165不帶任何表達標籤，所述復性方法包括利用包涵體復性液復性重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165蛋白質的包涵體，其中，所述包涵體復性液包括濃度大於等於2mM的GSSG和濃度大於等於ImM的DTT，並且DTT與GSSG的摩爾濃度的比例小於1，優選地大於等於1: 2.5並且小於等於1: 1.5。
9.一種重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165的純化方法，所述重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165不帶任何表達標籤，所述方法包括用陰離子交換柱純化重組人源血管內皮生長因子蛋白質。
10.如權利要求9所述的方法，其中所述陰離子交換柱為DEAE柱，並且進行DEAE柱純化之前僅進行一次透析。
【文檔編號】C12N15/70GK103451220SQ201310283384
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年7月4日 優先權日:2013年7月4日
【發明者】錢永常 申請人:杭州紐龍日尚生物製品有限公司