對伯氏疏螺旋體的新型抗病毒活性的鑑定的製作方法
2023-07-01 21:30:51 1
相關申請的交叉引用
本申請要求申請日為2014年10月31日的美國臨時專利申請no.62/073,605和申請日為2015年3月23日的美國臨時專利申請no.62/136,678的優先權，其中的每個均通過引用整體而被併入本文。
背景技術：
萊姆病是一種多系統疾病，該疾病由螺旋體細菌伯氏疏螺旋體所引起(meek等人，1996；stricker等人，2011)。該疾病由蜱媒介傳播，所述蜱媒介可以通過齧齒動物，爬行動物，鳥和鹿傳播(stricker等人，2011；radolf等人，2012)。在美國，萊姆病病例數在過去15年翻了一番(orloski等人，2000；bacon等人，2008)，並且估計每年約有30萬病例(centersfordiseasecontrol，2014)。目前，萊姆病被認為是在美國和歐洲最常見的蜱傳播疾病(bacon等人，2008；armedforceshealthsurveillance；2001-2012；cdc，lymedisease，2014)。萊姆病早期的臨床表現最常見的特徵是遊走性紅斑皮疹，常伴有流感樣症狀。炎症性關節炎或神經功能障礙可為未經治療的感染的頻繁後遺症。
大多數萊姆病患者可用抗生素多西環素或阿莫西林在用藥2-4周的持續時間後治癒，特別是在疾病的早期階段。但是，一部分患者儘管進行了抗菌治療仍經歷持續症狀，包括疲勞、神經認知困難(腦疲勞)或者肌肉骨骼疼痛。當在抗生素治療後症狀持續超過6個月的時候，這已被建議作為一種非傳染性的治療後萊姆病症候群(ptlds)，由於無法找到可行的剩餘生物且採用頭孢曲松、多西環素或阿莫西林的長期單一療法缺乏實質性的療效(cdc，post-treatmentlymediseasesyndrome，2014；wormser等人，2006；klempner等人，2013)。患有ptlds或慢性持續性萊姆病的約10-20％的患者(疾病控制中心，2014)，尤其是那些由於忽視蜱叮咬或不準確的測試而錯過早期診斷和治療的患者(stricker等人，2011)。
目前尚不清楚什麼機制傳播了這些患者中的這種情況。提出的概念包括宿主反應，雖然緩慢或無效的殺死b.螺旋體持留菌已被表示為可能的解釋，儘管缺乏存在於ptlds中的活生物體的證據(berndtson，2013)。以前的研究表明b.螺旋體在抗生素短期療程之後可能仍然存在於一些患者中(stricker等人，2011；hodzic等人，2008；diterich等人，2003)。
當ptlds只有主觀症狀複合體時，儘管進行了抗生素治療，約10％的萊姆關節炎晚期患者有客觀，持續性關節腫脹(antibioticrefractorylymearthritis；steere和glickstein，2004)。雖然，這種反應的一部分可以包括在某些宿主中由b.螺旋體誘導的自身免疫模擬，另外的解釋取決於持續感染所驅動的免疫應答或者抗原性碎片的存在(bockenstedt等人，2012)。
某些人已提出了在抗生素治療之後b.螺旋體是否仍然存在於某些患者內且進一步逃避宿主免疫清除的問題，但存在爭議(stricker等人，2011；hodzic等人，2008；diterich等人，2003)。在各種動物模型中，例如小鼠，狗和猴，採用多西環素，頭孢曲松或替加環素的抗生素治療不能完全根除如異核診斷和pcr所示的b.螺旋體的檢測，即使活生物體不能在常規培養基中培養(barthold等人，2010；等人，2012；hodzic等人，2014；straubinger等人，1997)。最近的研究顯示，抗生素後的持久性與不可培養的b.螺旋體dna的復甦同時存在，該不可培養的b.螺旋體dna於抗生素治療後12個月的小鼠內被發現(hodzic等人，2014)。關於蜱異體接種診斷法的人類研究顯示，一些患者治療後仍然具有伯氏疏螺旋體病菌(marques等人，2014)。這些觀察表明採用抗生素劑量的持續性b.螺旋體的某種形式不能夠完全消除，雖然在動物實驗中的抗生素水平可能不足。
目前沒有用於治療慢性持續性萊姆病的有效的抗生素。目前使用的一線藥物，如多西環素，阿莫西林和米諾環素對持續性b.螺旋體只有有限的活性。許多前瞻性、隨機臨床研究已經發現，採用常用的抗生素單一療法的額外延長抗生素治療沒有顯著有益效果，也沒有證據表明具有長期症狀的病人體內的b.螺旋體的持續存在(klempner等人，2013；fallon等人，2008)。一項研究報導了長期靜脈注射頭孢曲松對疲勞症狀的一些改善，雖然最終認為不值得冒為此效果而僅採用頭孢曲松注射的風險(krupp等人，2003)。頭孢曲松最近被證明是對於抗b.螺旋體持留菌比多西環素或阿莫西林更有活性(feng，wang，shi等人，2014)。有趣的是，在人類中的一項最近研究通過在儘管進行了抗生素治療的單個ptlds患者中的異體接種診斷法而證明了b.螺旋體dna的恢復(marques等人，2014)。b.螺旋體能夠在體外具有複雜的生活方式，其特徵在於多形性形式，包括螺旋體，原生質體(或l型)，囊腫或圓形體(rb)，以及小菌落形式(diterich等人，2003；brorson等人，2009；sapi等人，2012；miklossy等人，2008；alban等人，2000；hodzic等人，2008)。這些b.螺旋體的形態變體具有不同的抗生素敏感性(sapi等人，2011)。rb形式顯示為球菌狀的，b.螺旋體的膜結合非典型變體，在實驗應力條件下形成，如飢餓，氧化應激，ph變化，加熱或培養中的抗生素治療(brorson等人，2009；murgia和cinco，2004；brorson和brorson，1997；kersten等人，1995)。rb形式具有較低的代謝並且抵抗各種應力，可能是一種保護機制以克服不利的環境條件(murgia和cinco，2004；brorson等人，2009)。這些對通過包括多西環素和阿莫西林在內的許多抗生素殺滅相對耐受(feng，wang，shi等人，2014；brorson等人，2009)，並且可在新鮮的含非抗生素的傳代培養物中恢復到傳統螺旋形式的螺旋體(brorson等人，2009；brorson和brorson，1998；murgia與cinco，2004)。
b.螺旋體的圓形體形式也在螺旋體感染期間於體內被發現，如見於脊髓液(brorson和brorson，1998)，以及慢性神經萊姆病患者的腦組織中(miklossy等人，2008)。這些發現表明b.螺旋體的圓形體形式可能在慢性萊姆病中發揮作用。
雖然，非典型囊腫或顆粒形式已經在人類中被發現(miklossy等人，2008)，既沒有好的證據證明這種形態變體與人類感染是共同常見的，在初始治療後也沒有額外的抗生素改善具有持續症狀的患者(lantos等人，2014)。當一線藥物多西環素，阿莫西林和米諾環素相當有效地殺滅b.螺旋體的複製螺旋體形式的時候，它們對非複製的持留菌或生物膜樣聚集體或富集在穩定期培養物中的b.螺旋體的微菌落具有很小的活性(feng，wang，shi等人，2014；sapi等人，2011)。
此外，雖然一些抗生素已經進行了對於它們抗b.螺旋體的活性檢測，b.螺旋體中的全譜抗生素敏感性尚未確定(hunfeld和brade，2006)。於是，尋找有效的抗生素及其組合對於開發用於慢性萊姆病的有效治療是重要的。fda批准的藥物已經具有相對清楚的安全性和病人體內的藥代動力學特徵，以及製造和分銷網絡。因此，如果批准的藥物被證明有活性，那麼批准的藥物可以快速應用於治療萊姆病。
篩選具有抗b.螺旋體活性的新型抗生素，採用目前的活性測定是困難的，目前的活性測定主要基於顯微計數和pcr。這些測定是冗長的且不能被用於高通量篩選。常用的live/deadbaclight測定具有較高的背景問題，並且不能以高通量形式直接用於細菌的活力評估，如伯氏疏螺旋體或者其它感興趣的細菌。
技術實現要素：
一方面，本公開主題提供了用於評估螺旋體有機體的生存力或評估螺旋體有機體的抗微有機體藥物敏感性的方法，所述螺旋體有機體例如來自疏螺旋體屬，並且優選為伯氏疏螺旋體物種，以及相關有機體和其它細菌，包括但不限於：金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，肺炎克雷伯菌，鮑氏不動桿菌和結核分枝桿菌。
因此，在一些方面，本公開主題提供了一種用於評估來自所選屬的細菌的生存力的方法，該方法包括：(a)建立細菌培養物，包含從所選屬分離的細菌；(b)用染色混合物孵育細菌培養物，所述染色混合物包含：(i)第一試劑，其發射第一顏色的螢光，指示培養物裡的活細菌細胞，和(ii)第二試劑，其發射與第一顏色形成對比的第二顏色的螢光，並且指示培養物裡的死亡的細菌細胞；以及(c)計算第一顏色的發射螢光強度與第二顏色的發射螢光強度的比值；並且(d)評估培養物裡的細菌的生存力，其中，(c)中所計算出的比值指示培養物裡的活細菌的百分比。
在一些方面，本公開主題提供了一種用於評估來自所選屬的細菌對至少一種抗微生物劑的敏感性的方法，該方法包括：(a)建立細菌培養物，包含從所選屬分離的細菌；(b)在合適的條件下孵育所述培養物用於出現細菌生長，採用：(i)至少一個劑量的至少一種抗微生物劑；和(ii)染色混合物，包含第一試劑，該第一試劑發射第一顏色的螢光，指示培養物裡的活細菌，並包含第二試劑，該第二試劑發射與第一顏色形成對比的第二顏色的螢光，並且指示培養物裡的死細菌，其中，第一顏色的發射螢光強度與第二顏色的發射螢光強度的比值指示培養物內活細菌的百分比；以及(c)在暴露於至少一個劑量的至少一種抗微生物劑的一段時間後，通過計算(b)(ii)中的比值來評估來自所選屬的細菌對至少一種抗微生物劑的敏感性，無需細菌生長，如果(b)(ii)中的比值在暴露於至少一個劑量的至少一種抗微生物劑的一段時間之後保持相同或降低，那麼其中所述細菌被評估為對至少一種抗微生物劑敏感的，並且，如果(b)(ii)中的比值在暴露於至少一個劑量的至少一種抗微生物劑的該段時間之後增加了，那麼所述細菌被評估為對至少一種抗微生物劑抗性的。
在特定方面，該方法以高通量形式執行，例如用於藥物篩選。
在其它方面，本公開主題提供了一種識別候選試劑的方法，所述候選試劑能夠抑制來自所選屬的細菌的生長或存活，所述方法包括：(a)建立培養物，包含從所選屬分離的細菌；(b)使所述培養物與測試試劑接觸；(c)在測試試劑的存在下，在不同的時間跨度對不生長的持留菌以連續時間推移的方式並且以增長獨立的方式進行快速抗微生物藥敏試驗來評估培養物內細菌的生存力，並與對照培養物中細菌的生存力進行比較，所述對照培養物缺少用於藥物篩選的測試試劑，以使對測試試劑的敏感性可以快速確定，而不需要像在常規抗生素敏感性試驗中那樣依賴細菌生長，其中，評估培養物內細菌的生存力包括：(i)用染色混合物孵育所述培養物，所述染色混合物包含：第一試劑，其發射第一顏色的螢光，指示培養物裡的活細菌，和第二試劑，其發射與第一顏色形成對比的第二顏色的螢光，並且指示死亡的細菌；(ii)計算第一顏色的發射螢光強度與第二顏色的發射螢光強度的比值，其中所述比值指示培養物裡的活細菌的百分比；以及(d)如果對於培養物計算的比值比對於對照組培養物類似計算的比值要小，則識別所述測試試劑為候選試劑，所述候選試劑能夠抑制來自所選屬的細菌的生長或存活。
在一些方面，本公開主題提供了用於篩選能夠抑制來自所選屬的細菌的生長或存活至少一種試劑的試劑盒，所述試劑盒包含來自所選屬的細菌分離的非複製持留菌形式和用於進行sybrgreeni/碘化丙啶活力測定的試劑。
在某些方面，本公開主題提供了用於評估來自所選屬的細菌培養物的生存力和對至少一種試劑的敏感性的試劑盒，所述試劑(例如，目前的萊姆病抗生素或者任何新試劑)能抑制來自所選屬的細菌的生長或存活，所述試劑盒包含來自所選屬的細菌培養物，用於進行sybrgreeni/碘化丙啶活力測定的試劑，以及可選的至少一種測試試劑。
在某些方面，本公開主題提供了用於篩選至少一種候選試劑的試劑盒，所述候選試劑能夠抑制來自所選屬的細菌的生長或存活，所述試劑盒包含：(a)分離的細菌群體，包含來自所選屬的細菌或者其培養物；(b)染色混合物，包含：(i)第一試劑，其發射第一顏色的螢光，指示活細菌細胞，和(ii)第二試劑，其發射與第一顏色形成對比的第二顏色的螢光，並且指示死亡的細菌細胞；其中，當將染色混合物與細菌群體或其培養物一起孵育時，計算的第一顏色的發射螢光強度與第二顏色的發射螢光強度的比值指示群體或其培養物內活細菌的百分比；以及(c)使用(a)中的細菌和(b)中的染色混合物的指令，以篩選至少一種候選試劑，所述候選試劑能抑制來自所選屬的細菌的生長或存活。
在本公開方法的某些方面，選擇的屬為疏螺旋體屬。在特定的方面，所述細菌為伯氏疏螺旋體。在其它方面，所選擇的屬選自由以下組成的組：葡萄球菌屬，埃希氏菌屬，克雷伯氏菌屬，不動桿菌屬和分支桿菌屬。在更具體的方面，所述細菌選自由以下組成的組：金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，肺炎克雷伯桿菌，鮑氏不動桿菌，非結核分枝桿菌以及結核分枝桿菌。
在某些方面，本公開主題提供了一種用於抑制來自所選屬的細菌的生長和/或存活的方法，該方法包括：將來自所選屬的細菌與有效量的以下物質相接觸：(a)選自下組中的至少一種化合物：達託黴素，青蒿素，環丙沙星，磺胺醋醯，磺胺甲氧噠嗪，硝呋醛肟，磷黴素，金黴素，磺胺噻唑，氯法齊明，頭孢甲肟，頭孢哌酮，卡波黴素，頭孢替安，頭孢吡肟，阿莫地喹，磷黴素和鏈黴素；(b)選自下組中的至少一種化合物：道諾黴素3-肟；二甲基道諾黴素；柔紅黴素；9，10-蒽二酮，1-羥基-4-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-雙〔3-〔〔(2-羥乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氫-；諾加黴素；派洛寧b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑並[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤黴素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羥基-2-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-；靈菌紅素；絲裂黴素；納紫黴素；9-羥基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)異喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羥基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻噸-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羥基-4-甲基-，一水合物；更生黴素；大黃素；(5，8-二羥基-1，4-二氧代-1，4-二氫萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲醯胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3』，4』，7-四羥基黃酮；苯甲酸，2-羥基-(2，6-吡啶二基二亞乙基)二醯肼，鎳絡合物；1-(1，2-二氫-5-苊基)-n-羥基-1-苯基甲亞胺；2-甲基-4，4』-[(4-亞氨基-2，5-環己二烯-1-亞基)亞甲基]二苯胺；3，3』-二乙基-9-甲基硫雜羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌；(c)至少兩種化合物的組合，包括：
(i)選自下組中的第一化合物：達託黴素，頭孢哌酮，咪康唑，以及磺胺甲氧噠嗪；和(ii)選自下組的不同於第一化合物的第二化合物：達託黴素，阿莫西林，頭孢呋辛，頭孢曲松，咪康唑，多西環素，羧苄青黴素，氯法齊明，青蒿素，環丙沙星，磺胺醋醯，磺胺甲氧噠嗪，磺胺氯達嗪，硝呋諾酮，呋喃妥因，磷黴素，金黴素，磺胺噻唑，氯法齊明，氯四環素，頭孢甲肟，頭孢美唑，頭孢哌酮，卡波黴素，頭孢替安，頭孢吡肟，阿莫地喹，磷黴素，鏈黴素，道諾黴素3-肟；二甲基道諾黴素；柔紅黴素；9，10-蒽二酮，1-羥基-4-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-雙〔3-〔〔(2-羥乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氫-；諾加黴素；派洛寧b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑並[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤黴素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羥基-2-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-；靈菌紅素；絲裂黴素；納紫黴素；9-羥基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)異喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羥基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻噸-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羥基-4-甲基-，一水合物；更生黴素；大黃素；(5，8-二羥基-1，4-二氧代-1，4-二氫萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲醯胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3』，4』，7-四羥基黃酮；苯甲酸，2-羥基-(2，6-吡啶二基二亞乙基)二醯肼，鎳絡合物；1-(1，2-二氫-5-苊基)-n-羥基-1-苯基甲亞胺；2-甲基-4，4』-[(4-亞氨基-2，5-環己二烯-1-亞基)亞甲基]二苯胺；3，3』-二乙基-9-甲基硫雜羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌；或者(d)至少三種化合物的組合，包括：(i)作為第一化合物的多西環素；(ii)選自下組中的第二化合物：達託黴素或頭孢哌酮；和(iii)不同於第二化合物的選自下組中的第三化合物：達託黴素，阿莫西林，頭孢呋辛，頭孢曲松，咪康唑，多西環素，羧苄青黴素，氯法齊明，青蒿素，環丙沙星，磺胺醋醯，磺胺甲氧噠嗪，磺胺氯達嗪，硝呋諾酮，呋喃妥因，磷黴素，金黴素，磺胺噻唑，氯法齊明，氯四環素，頭孢甲肟，頭孢美唑，頭孢哌酮，卡波黴素，頭孢替安，頭孢吡肟，阿莫地喹，磷黴素，鏈黴素，道諾黴素3-肟；二甲基道諾黴素；柔紅黴素；9，10-蒽二酮，1-羥基-4-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-雙〔3-〔〔(2-羥乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氫-；諾加黴素；派洛寧b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑並[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤黴素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羥基-2-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-；靈菌紅素；絲裂黴素；納紫黴素；9-羥基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)異喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羥基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻噸-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羥基-4-甲基-，一水合物；更生黴素；大黃素；(5，8-二羥基-1，4-二氧代-1，4-二氫萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲醯胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3』，4』，7-四羥基黃酮；苯甲酸，2-羥基-(2，6-吡啶二基二亞乙基)二醯肼，鎳絡合物；1-(1，2-二氫-5-苊基)-n-羥基-1-苯基甲亞胺；2-甲基-4，4』-[(4-亞氨基-2，5-環己二烯-1-亞基)亞甲基]二苯胺；3，3』-二乙基-9-甲基硫雜羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌。
在其它方面，本公開主題提供了一種在有需要的受試者中用於治療萊姆病的方法，所述方法包括給予所述受試者有效量的：
(a)選自下組中的至少一種化合物：達託黴素，青蒿素，環丙沙星，磺胺醋醯，磺胺甲氧噠嗪，硝呋醛肟，磷黴素，金黴素，磺胺噻唑，氯法齊明，頭孢甲肟，頭孢哌酮，卡波黴素，頭孢替安，頭孢吡肟，阿莫地喹，磷黴素和鏈黴素；(b)選自下組中的至少一種化合物：道諾黴素3-肟；二甲基道諾黴素；柔紅黴素；9，10-蒽二酮，1-羥基-4-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-雙〔3-〔〔(2-羥乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氫-；諾加黴素；派洛寧b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑並[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤黴素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羥基-2-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-；靈菌紅素；絲裂黴素；納紫黴素；9-羥基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)異喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羥基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻噸-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羥基-4-甲基-，一水合物；更生黴素；大黃素；(5，8-二羥基-1，4-二氧代-1，4-二氫萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲醯胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3』，4』，7-四羥基黃酮；苯甲酸，2-羥基-(2，6-吡啶二基二亞乙基)二醯肼，鎳絡合物；1-(1，2-二氫-5-苊基)-n-羥基-1-苯基甲亞胺；2-甲基-4，4』-[(4-亞氨基-2，5-環己二烯-1-亞基)亞甲基]二苯胺；3，3』-二乙基-9-甲基硫雜羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌；(c)至少兩種化合物的組合，包括：
(i)選自下組中的第一化合物：達託黴素，頭孢哌酮，咪康唑，以及磺胺甲氧噠嗪；和(ii)選自下組的不同於第一化合物的第二化合物：達託黴素，阿莫西林，頭孢呋辛，頭孢曲松，咪康唑，多西環素，羧苄青黴素，氯法齊明，青蒿素，環丙沙星，磺胺醋醯，磺胺甲氧噠嗪，磺胺氯達嗪，硝呋諾酮，呋喃妥因，磷黴素，金黴素，磺胺噻唑，氯法齊明，氯四環素，頭孢甲肟，頭孢美唑，頭孢哌酮，卡波黴素，頭孢替安，頭孢吡肟，阿莫地喹，磷黴素，鏈黴素，道諾黴素3-肟；二甲基道諾黴素；柔紅黴素；9，10-蒽二酮，1-羥基-4-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-雙〔3-〔〔(2-羥乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氫-；諾加黴素；派洛寧b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑並[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤黴素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羥基-2-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-；靈菌紅素；絲裂黴素；納紫黴素；9-羥基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)異喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羥基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻噸-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羥基-4-甲基-，一水合物；更生黴素；大黃素；(5，8-二羥基-1，4-二氧代-1，4-二氫萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲醯胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3』，4』，7-四羥基黃酮；苯甲酸，2-羥基-(2，6-吡啶二基二亞乙基)二醯肼，鎳絡合物；1-(1，2-二氫-5-苊基)-n-羥基-1-苯基甲亞胺；2-甲基-4，4』-[(4-亞氨基-2，5-環己二烯-1-亞基)亞甲基]二苯胺；3，3』-二乙基-9-甲基硫雜羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌；或者(d)至少三種化合物的組合，包括：(i)作為第一化合物的多西環素；(ii)選自下組中的第二化合物：達託黴素或頭孢哌酮；和(iii)不同於第二化合物的選自下組中的第三化合物：達託黴素，阿莫西林，頭孢呋辛，頭孢曲松，咪康唑，多西環素，羧苄青黴素，氯法齊明，青蒿素，環丙沙星，磺胺醋醯，磺胺甲氧噠嗪，磺胺氯達嗪，硝呋諾酮，呋喃妥因，磷黴素，金黴素，磺胺噻唑，氯法齊明，氯四環素，頭孢甲肟，頭孢美唑，頭孢哌酮，卡波黴素，頭孢替安，頭孢吡肟，阿莫地喹，磷黴素，鏈黴素，道諾黴素3-肟；二甲基道諾黴素；柔紅黴素；9，10-蒽二酮，1-羥基-4-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-雙〔3-〔〔(2-羥乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氫-；諾加黴素；派洛寧b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑並[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤黴素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羥基-2-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-；靈菌紅素；絲裂黴素；納紫黴素；9-羥基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)異喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羥基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻噸-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羥基-4-甲基-，一水合物；更生黴素；大黃素；(5，8-二羥基-1，4-二氧代-1，4-二氫萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲醯胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3』，4』，7-四羥基黃酮；苯甲酸，2-羥基-(2，6-吡啶二基二亞乙基)二醯肼，鎳絡合物；1-(1，2-二氫-5-苊基)-n-羥基-1-苯基甲亞胺；2-甲基-4，4』-[(4-亞氨基-2，5-環己二烯-1-亞基)亞甲基]二苯胺；3，3』-二乙基-9-甲基硫雜羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌。
在一些方面，本公開主題提供了一種在有需要的受試者中用於治療萊姆病的方法，所述方法包括：(a)向受試者施用有效量的至少兩種試劑的組合，所述至少兩種試劑包括：(i)至少一種試劑抑制來自疏螺旋體屬的複製形式的細菌的生長和/或存活；以及(ii)至少一種試劑抑制來自疏螺旋體屬的非複製的持留菌形式的細菌的生長和/或存活。
本公開主題的某些方面已經在上文中進行了詳細描述，通過本公開的主題，發明內容得以完整或部分地被描述，隨著描述的進行，結合如下文優選描述的實施例和附圖，其它方面將變得明顯而易於理解。
附圖說明
圖1顯示了用抗生素治療之後的代表性的形態變化疏螺旋體屬細胞；
圖2顯示了在96孔板中用於分析b.螺旋體生存力的方法的比較；
圖3顯示了活的b.伯氏疏螺旋體的百分比與sybrgreen/碘化丙啶(pi)測定的綠/紅螢光比之間的線性關係(在live/dead測定之前，1bsk-h培養基在洗滌步驟中被除去)；
圖4顯示了b.螺旋體b31菌株進行的常規的生存力測定mtt，xtt，螢光素二乙酸酯測定(fda)，市售live/deadbaclight測定，以及本公開的sybrgreeni/pi測定；
圖5a～5d顯示了所述b.螺旋體b31菌株，觀察到：(圖5a)螢光顯微鏡live/deadbaclight染色；(圖5b)sybrgreen/pi染色；(圖5c)fda染色；以及(圖5d)由sybrgreen/pi染色的b.螺旋體生物膜；
圖6顯示了sybrgreen/pi測定，示出了在抗生素暴露中與直接顯微鏡計數的相關性(1樣品由live/deadbaclight試劑盒染色)；
圖7顯示了細菌持留菌和潛伏感染的陰陽模型的代表性圖，其中，它提出靶向生長和非生長細菌群體，為更有效地治療難治的疾病或者持續性細菌感染，甚至癌症(zhang，2014)；
圖8a～8c顯示了：(圖8a)b.螺旋體b31菌株的體外生長曲線；使用sybrgreeni/pi染色，用螢光顯微鏡觀察到的b.螺旋體b31菌株(圖8b)對數期(3天培養)和穩定期(7天培養)的代表性圖像；箭頭表示穩定期的b.螺旋體的多種形態形式；以及(圖8c)5天治療後，b.螺旋體的對數期(3天)和穩定期(7天)對50μm藥物的敏感性。殘留活細胞的百分比通過sybrgreeni/pi測定法測定。圖9顯示了在穩定期的疏螺旋體持留菌上對fda批准的藥物庫(2000個化合物)的篩選。抗穩定期(培養7天)的b.螺旋體的一些有效抗生素的體外活性得到了顯示；
圖10a～10d顯示了通過道諾黴素(圖10a)，頭孢哌酮(圖10b)，四環素(圖10c)以及無藥物對照(圖10d)處理的b.螺旋體b31菌株的穩定期的代表性圖像。處理後用sybrgreeni/pi進行染色；
圖11顯示了用卡泊黴素(左)和氯法齊明(右)處理的b.螺旋體b31菌株的穩定期的代表性圖像；
圖12顯示了一些用於b.螺旋體b31菌株的持留菌活性抗生素的抗生素最小抑制濃度(mics)；
圖13a～13c顯示了以下代表性圖像：(圖13a)3日齡對數期；(圖13b)7日齡穩定期；以及(圖13c)10日齡穩定期的b.螺旋體培養物；將不同齡的b.螺旋體培養物用sybrgreeni/pi測定染色，並在顯微鏡下觀察(400×放大倍率)。箭頭指示穩定期培養物內螺旋體(s)，圓形體(r)，以及小菌落(m)形式的b.螺旋體；
圖14顯示了藥物的效果(50μg/ml)和在穩定期的疏螺旋體的組合。處理5天後，穩定期的b.螺旋體對單獨的藥物及其組合的敏感性。g/r：綠/紅比率；括號內的值：顯微鏡計數殘留活細胞的百分比；dox：多西環素；amox：阿莫西林；cef-p：頭孢哌酮；cef-t：頭孢曲松；mtz：甲硝唑；cfz：氯法齊明；mcz：咪康唑；pmb：多粘菌素b；
圖15顯示了抗疏螺旋體生物膜的代表性藥物組合。用落射螢光倒置顯微捕獲的圖像(20x放大倍率)。藥物濃度，50μg/ml；
圖16顯示了代表性的藥物組合抗疏螺旋體生物膜的活性。螢光強度和圖像面積通過imageproplus軟體計算得到；
圖17a和圖17b顯示了單獨的抗生素和其組合對聚集的小菌落形式與浮遊形式的b.螺旋體的效果。穩定期b.螺旋體培養物(10日齡)用10μg/ml藥物(標記在圖像上)處理7天，然後通過sybrgreeni/pi測定染色。綠細胞表示活細胞，而紅細胞表示死細胞：(圖17a)如通過400×放大倍率的螢光顯微鏡觀察到的，b.螺旋體聚集小菌落(mc)形式比浮遊形式(圓形體和螺旋形)(pt)更耐受不同的抗生素或其組合；並且，(圖17b)通過200×放大倍率的螢光顯微鏡評估了b.螺旋體小菌落形式對抗生素和抗生素組合的敏感性。當小菌落被檢查時，單個rb的亮度比小菌落弱得多，這使得單個細胞難以觀察。縮寫：dox，多西環素；cefp，頭孢哌酮；cfz，氯法齊明；dap，達託黴素；smx，磺胺甲惡唑；cab，羧苄青黴素；car，卡波黴素；
圖18a～18i顯示了用不同的單獨抗生素或其組合處理的10日齡b.螺旋體穩定期培養物的傳代培養物(15天)。使用sybrgreeni/pi染色，用螢光顯微鏡(400×放大倍率)拍攝代表性圖像。只有dox+dap+cefp完全殺死所有形式的b.螺旋體持留菌，包括小菌落形式的b.螺旋體持留菌，如傳代培養15天後缺乏任何可行的綠色螺旋形式所示。縮寫：dox，多西環素；cefp，頭孢哌酮；cfz，氯法齊明；dap，達託黴素；smx，磺胺甲惡唑；
圖19a～19d顯示了在傳代培養期間，阿莫西林的存在下顯微鏡示出的圓形體形式，並且隨後回到b.螺旋體的螺旋形式：(圖19a)5日齡的b.螺旋體培養物，主要由螺旋形式組成；(圖19b)在用阿莫西林(50μg/ml)處理3天後從b.螺旋體的螺旋形式形成的球菌圓形體形式；(圖19c)在新鮮bsk-培養基中傳代培養5天之後，從b.螺旋體的圓形體形式(圖19b)回復到螺旋體形式；並且(圖19d)用100μg/ml阿莫西林將7日齡的穩定期b.螺旋體處理3天；
圖20顯示了將5日齡的螺旋體和阿莫西林誘導的圓形體的b.螺旋體(5天)暴露於50μm的多西環素，頭孢呋辛和頭孢曲松中5天。殘留活細胞的百分比通過sybrgreeni/pi測定法測定，然後進行螢光顯微鏡計數；
圖21a～21i顯示了用不同抗生素(50μm)處理7天，隨後用sybrgreeni/pi測定法染色並用螢光顯微鏡顯示的b.螺旋體(將6日齡培養物用50μg/ml阿莫西林誘導72小時)的阿莫西林誘導的圓體形式的代表性圖像；
圖22a～22p顯示了在穩定期b.螺旋體微菌落上單獨或組合使用抗生素的效果。b.螺旋體(10日齡)的穩定期培養物被單獨或組合使用10μg/ml藥物處理7天(標記在圖像上)，然後用sybrgreeni/pi測定法染色。綠細胞表示活細胞，而紅細胞表示死細胞。縮寫：dox，多西環素；cefp，頭孢哌酮；art，青蒿素；dap，達託黴素；cefm，頭孢美唑；scp，磺胺氯達嗪；
圖23a～23i顯示了b.螺旋體(將6日齡的培養物用50μg/ml的阿莫西林誘導72小時)的阿莫西林誘導的圓形體形式的傳代培養物(20天)，採用不同的單獨抗生素或其組合對其進行處理。使用sybrgreeni/pi染色，用螢光顯微鏡拍攝的代表性圖像。20天傳代培養之後(圖23g)，只有dox+dap+cefp完全殺死b.螺旋體持留菌的所有圓形體，如缺乏任何可行的綠色螺旋形式所示。縮寫：dox，多西環素；cefp，頭孢哌酮；dap，達託黴素；art，青蒿素；scp：磺胺氯達嗪；
圖24顯示了穩定期b.螺旋體的代表性圖像，所述穩定期b.螺旋體用不同的化合物(50μm)進行了處理，並隨後用sybrgreeni/pi測定進行了染色。縮寫：dox：多西環素，amo：阿莫西林，dap：達託黴素，dau：道諾黴素，nog：諾加黴素，pyr：嘌呤黴素，rho：rhodomycina，cha：chaetochromin，pro：靈菌紅素，mit：絲裂黴素，nan：納紫黴素，dac：更生黴素，emo：大黃素；
圖25顯示了用不同化合物(20μm)處理並隨後用sybrgreeni/pi測定法染色的穩定期b.螺旋體b31菌株的代表性圖像。縮寫：dox：多西環素，dap：達託黴素，dau：道諾黴素，nog：諾加黴素，pyr：嘌呤黴素，rho：rhodomycina，cha：chaetochromin，pro：靈菌紅素，nan：納紫黴素。
具體實施方式
以下對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為範例，本發明並不限制於以下描述的具體實施例。對於本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和替代也都在本發明的範疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和範圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發明的範圍內。
i、用於識別抗持留菌活性的方法
本公開主題涉及用於評估細菌(例如，來自疏螺旋體屬，例如，b.螺旋體的複製和/或非複製持留菌形式，和在一些實施例中，金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，肺炎克雷伯桿菌，鮑氏不動桿菌，以及結核分枝桿菌)生存力的方法，用於評估細菌對候選抗微生物劑的敏感性的方法，用於篩選抑制細菌的生長或存活的至少一種試劑的方法，用於抑制細菌的生長和/或存活的方法，治療萊姆病的方法，並且涉及能夠用於實施所述方法的組合物和試劑盒。
因此，在一些實施例中，本公開主題提供了一種用於評估來自疏螺旋體屬的細菌的生存力的方法，所述方法包括：(a)建立細菌培養物，包含從疏螺旋體屬分離的細菌；(b)用染色混合物孵育細菌培養物，所述染色混合物包含：(i)第一試劑，其發射第一顏色的螢光，指示培養物裡的活細菌細胞，和(ii)第二試劑，其發射與第一顏色形成對比的第二顏色的螢光，並且指示培養物裡的死亡的細菌細胞；以及(c)計算第一顏色的發射螢光強度與第二顏色的發射螢光強度的比值；並且(d)評估培養物裡的細菌的生存力，其中，(c)中所計算出的比值指示培養物裡的活細菌的百分比。
在一些實施例中，本公開主題提供了一種新的sybrgreeni/碘化丙啶(pi)檢測法(也稱為sybrgreen/pi)，基於用於細菌的快速生存力評估的綠色螢光與紅色螢光的比值，其中所述細菌例如為來自疏螺旋體屬或選自由以下組成的組的屬：葡萄球菌屬，埃希氏菌屬，克雷伯氏菌屬，不動桿菌屬分支桿菌屬。該檢測法優於常用的其它用於測量生存力和用於b.螺旋體和其它細菌的快速藥物敏感性試驗的檢測法，如目前市售的live/deadbaclight生存力測定(invitrogen，carlsbad，ca)。此處所使用的術語「生存力測定」是指確定細胞維持或恢復生存力的能力的測定，如增長的能力。
在其它實施例中，本公開主題提供了一種用於評估來自疏螺旋體屬的細菌的生存力的方法，所述方法包括：(a)獲得包含來自疏螺旋體屬的細菌細胞的培養物；(b)通過使用sybrgreeni/碘化丙啶測定實施培養物內細菌細胞的生存力測定，所述sybrgreeni/碘化丙啶測定基於指示活細菌細胞的綠色螢光與指示死亡細菌細胞的紅色螢光的比值，包括：(i)將所述培養物與包含sybrgreeni和碘化丙啶的染色混合物混合；(ii)使培養物和染色混合物在黑暗中孵育；(iii)確定培養物的螢光強度，並在測量綠色螢光的535nm處與測量紅色螢光的635nm處染色混合物；以及(iv)計算綠色螢光與紅色螢光的比值；並且其中，綠色螢光與紅色螢光的比值大於約7意味著細菌細胞是活的。
在一些實施例中，第一顏色是綠色，第二顏色是紅色或橙色。在其它實施例中，第一試劑為sybrgreeni而第二試劑為碘化丙啶。在另外的實施例中，sybrgreeni以約0.1x至約100x的濃度範圍存在於培養物中，而碘化丙啶則以約0.1mm至約5mm的濃度範圍存在於培養物中。在另外的實施例中，培養物中sybrgreeni的濃度為10x，並且碘化丙啶的濃度為2mm。
在一些實施例中，所述培養物還包括bsk-h培養基。在其它實施例中，用所述混合物孵育所述培養物的步驟進行約15分鐘。在另外的實施例中，孵育的步驟在黑暗中實施。
疏螺旋體屬是螺旋體門的細菌屬。所述伯氏疏螺旋體廣義的複合物包括至少18種基因種。該屬中的細菌的非限制性實例包括：b.伯氏疏螺旋體，b.伽氏疏螺旋體，b.阿氏疏螺旋體，b.americana，b.carolinensis，b.lusitaniae，b.japonica，b.miyamotoi和b.sinica。在一些實施例中，所述細菌為伯氏疏螺旋體。在其它實施例中，所述伯氏疏螺旋體包括選自以下組的形態形式：螺旋形式，原生質球形式，囊性或圓體形式，小菌落形式，生物膜樣和生物膜形式，以及它們的組合。
在一些實施例中，所述方法以高通量方式實施，例如，用於藥物篩選。意外地發現了在某些實施例中本發明所述的方法可在沒有洗滌步驟的情況下使用，並用於高通量篩選。也就是說，所述方法可用於評估細菌的生存力、對抗微生物劑的敏感性，在沒有洗滌的情況下以及直接以高通量方式用於藥物篩選。在其它實施例中，高通量方式使用至少一種多孔微板。合適的多孔微量培養板的非限制性實例包括但不限於：6孔微量培養板，24孔微量培養板，96孔微量培養板，384孔微量培養板和1536孔微量培養板。在其它實施例中，所述多孔微孔板包含96孔微量培養板。
在一些實施例中，本公開主題提供了一種用於評估來自疏螺旋體屬的細菌對至少一種抗微生物劑的敏感性的方法，該方法包括：(a)建立細菌培養物，包含從疏螺旋體屬分離的細菌；(b)在合適的條件下孵育所述培養物用於出現細菌生長，採用：(i)至少一個劑量的至少一種抗微生物劑；和(ii)染色混合物，包含第一試劑，該第一試劑發射第一顏色的螢光，指示培養物裡的活細菌，並包含第二試劑，該第二試劑發射與第一顏色形成對比的第二顏色的螢光，並且指示培養物裡的死細菌，其中，第一顏色的發射螢光強度與第二顏色的發射螢光強度的比值指示培養物內活細菌的百分比；以及(c)在暴露於至少一個劑量的至少一種抗微生物劑的一段時間後，通過計算(b)(ii)中的比值來評估來自疏螺旋體屬的細菌對至少一種抗微生物劑的敏感性，無需細菌生長，如果(b)(ii)中的比值在暴露於至少一個劑量的至少一種抗微生物劑的一段時間之後保持相同或降低，那麼其中所述細菌被評估為對至少一種抗微生物劑敏感的，並且，如果(b)(ii)中的比值在暴露於至少一個劑量的至少一種抗微生物劑的該段時間之後增加了，那麼所述細菌被評估為對至少一種抗微生物劑抗性的。
在其它實施例中，本公開主題提供了一種用於篩選能抑制來自疏螺旋體屬的細菌的化合物的方法，所述方法包括：(a)獲取對數期或穩定期的細菌培養物，其包含來自疏螺旋體屬的細菌；(b)使所述培養物與測試化合物接觸；(c)通過使用sybrgreeni/碘化丙啶測定法，進行培養物內細菌細胞的生存力測定，所述sybrgreeni/碘化丙啶測定法基於指示活細菌細胞的綠色螢光與指示死亡細菌細胞的紅色螢光的比值，包括：(i)將所述培養物與包含sybrgreeni和碘化丙啶的染色混合物混合；(ii)使培養物和染色混合物在黑暗中孵育；(iii)確定培養物的螢光強度，並在測量綠色螢光的535nm處與測量紅色螢光的635nm處染色混合物；(iv)計算綠色螢光與紅色螢光的比值；以及(v)將所述綠色螢光與紅色螢光的比值與具有已知量的活和死細菌細胞數的一對照組的綠色螢光與紅色螢光的比值進行比較，以確定培養物內活細菌細胞和死細菌細胞的百分比；並且(d)將培養物內用測試化合物處理的活細菌細胞的百分比與在相同條件下但無測試化合物的情況下的對照組進行比較；其中，與在相同條件下但無測試化合物的情況下的對照組中活細菌細胞或死菌細胞的百分比相比，採用了測試化合物的培養物內的活細菌細胞百分比的顯著降低和/或死亡細菌細胞百分比的顯著增加，表示所述測試化合物能夠抑制細菌細胞。
在一些實施例中，所述方法還包括確定對於所述至少一種抗微生物劑的最小抑制濃度中斷點。在其它實施例中，第一顏色是綠色，第二顏色是紅色或橙色。在另外的實施例中，第一試劑是sybrgreeni，且第二試劑是碘化丙啶。在另外的實施例中，培養物內的sybrgreeni的濃度為約10x，並且碘化丙啶的濃度為約2mm。在其它實施例中，所述培養物還包含bsk-h培養基。
在一些實施例中，所述細菌是伯氏疏螺旋體。在其它實施例中，所述伯氏疏螺旋體包含選自由以下組成的組的形態形式：螺旋形式，原生質球形式，囊性或圓體形式，小菌落形式，生物膜樣和生物膜形式，以及它們的組合。
在一些實施例中，所述方法以高通量形式實施。在其它實施例中，所述高通量形式使用至少一種多孔微板。在另外的實施例中，所述多孔微板包括96孔微孔板。
在一些實施例中，本公開主題提供了一種用於識別候選試劑的方法，所述候選試劑能夠抑制來自疏螺旋體屬的細菌的生長或存活，所述方法包括：(a)建立培養物，包含從疏螺旋體屬分離的細菌；(b)使所述培養物與測試試劑接觸；(c)在測試試劑的存在下，在不同的時間跨度對不生長的持留菌以連續時間推移的方式並且以增長獨立的方式進行快速抗微生物藥敏試驗來評估培養物內細菌的生存力，並與對照培養物中細菌的生存力進行比較，所述對照培養物缺少用於藥物篩選的測試試劑，以使對測試試劑的敏感性可以快速確定，而不需要像在常規抗生素敏感性試驗中那樣依賴細菌生長，其中，評估培養物內細菌的生存力包括：(i)用染色混合物孵育所述培養物，所述染色混合物包含：第一試劑，其發射第一顏色的螢光，指示活細菌，和第二試劑，其發射與第一顏色形成對比的第二顏色的螢光，並且指示死亡的細菌；(ii)計算第一顏色的發射螢光強度與第二顏色的發射螢光強度的比值，其中所述比值指示培養物裡的活細菌的百分比；以及(d)如果對於培養物計算的比值比對於對照組培養物類似計算的比值要小，則識別所述測試試劑為候選試劑，所述候選試劑能夠抑制來自疏螺旋體屬的細菌的生長或存活。如此處所使用的，「類似計算的比值」的意思是，對照培養物的比值採用與計算細菌培養物的比值相同的方式計算得到。
在一些實施例中，所述細菌為伯氏疏螺旋體。在其它實施例中，培養物包含穩定期培養物。在其它實施例中，所述穩定期培養物包含非複製持留菌細胞。在其它實施例中，所述穩定期培養物包含選自以下組成的組的形態形式：圓形體形式，浮遊形式和生物膜形式。
在一些實施例中，第一顏色是綠色，第二顏色是紅色或橙色。在其它實施例中，第一試劑是sybrgreeni，而第二試劑是碘化丙啶。在其它實施例中，培養物內sybrgreeni的濃度大約是10x，並且碘化丙啶的濃度大約是2mm。在其它實施例中，培養物還包含bsk-h培養基。
在一些實施例中，所述方法以高通量形式實施。在其它實施例中，所述高通量形式使用至少一種多孔微板。在其它實施例中，所述多孔微板包括96孔微孔板。
在某些實施例中，所述方法包括進行微觀計數再篩選，以確認至少一種測試試劑是候選試劑，用於抑制細菌的生長或存活。
如本文所使用的，術語「抑制」或者「顯著減少」的意思是，例如，在培養物中或在受試者中的細菌的生長和/或存活相較於未處理的對照培養物或受試者下降，抑制，減弱，減少或阻滯了至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％，99％或甚至100％。本文中所述抑制細菌的「存活」是指殺死細菌或減少活細菌細胞計數。在一些實施例中，細菌的生長被抑制超過約50％。在其它實施例中，用試驗化合物處理後的培養物內活細菌細胞的百分比，要比在對照組中的活細菌細胞的百分比少約50％，所述對照組在相同條件下，但其中不存在測試化合物。在其它實施例中，穩定期的細菌培養物包含非複製持留菌細胞。另外，如此處所使用的術語「顯著增加」的意思是增加了至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％，99％或甚至100％。
所述測試化合物(與本文中的試劑同義使用)可以是測試抑制活性需要的，尤其是測試抗持留菌活性需要的任何化合物或藥物。術語「抗持留菌活性」的意思是該化合物具有抗那些在接觸或施用一個療程的抗生素之後可能仍然存在於培養物或受試者內的細菌細胞的抑制活性。持留性細菌可以逃避宿主免疫清除，並導致受試者內慢性持續性感染。測試化合物可以是已知化合物，如已識別的藥物，發現在至少一種疾病或病症中有效，或者可為未知化合物，其不被認為在任何疾病或病症中有效。在一些實施例中，所述測試化合物是已知的化合物，其已獲衛生管理機構(例如fda或ema)批准用於除了治療慢性持續性萊姆病之外的指示。在一些實施例中，所述測試化合物是一種已知其顯示針對除了那些來自疏螺旋體屬之外的細菌的抗生素活性的化合物。在一些實施例中，所述測試化合物是一種已知化合物，其在以前沒有被報導顯示有針對非複製的持留菌形式的細菌的抗生素活性。
在一些實施例中，所述方法以高通量的形式實施。通過「高通量」形式的意思是，許多樣品，如測試化合物，可一次進行測試。例如，在其它實施例中，高通量形式使用至少一塊96孔板。當然，普通技術人員會理解的是，更大或更小的微孔板可被用於高通量形式，以實施本發明所述的方法。
如本文所使用的，術語「細菌培養物」或「培養物」是指，生長在培養基中的細菌，所述培養基有利於這些細菌的生長。所述細菌培養物可以在任何類型的容器中找到，如燒瓶，試管，微孔板等。一般地，細菌具有不同的生長階段。當細菌群體首先進入允許生長的高營養環境的時候，細胞需要適應它們的新環境。生長的第一階段為滯後期，是一段生長緩慢的時期，當細胞適應高營養環境且準備快速增長的時候。滯後期具有很高的生物合成率，這是由於生產出了快速生長所需的蛋白質。生長的第二階段為對數期，也稱為對數或指數相，其中所述細菌經歷快速指數生長。在對數期過程中，營養物以最大速度新陳代謝，直至營養物之一被耗盡，並開始限制增長。生長的第三階段為穩定期，且是由被耗盡的營養物引起的。在一些實施例中，在「穩定期」的細菌培養物的意思是，培養物內的細菌具有大致相等的出生率和死亡率。本文所使用的術語細菌的「生長形式」一般指在滯後或對數期的而非穩定期的細菌。在一些實施例中，穩定期細菌培養物已經生長了約7天。在其它實施例中，所述穩定期細菌培養物包含非複製持留菌細胞。「非複製持留菌細胞」的意思是，進入停止複製的狀態且能夠耐受抗生素的細菌細胞。
ii、用於識別抗持留菌活性和藥敏評價的試劑盒
本公開主題還涉及用於實施本發明所述方法的試劑盒。通常，目前公開的試劑盒包含一些或所有組分，試劑，供應品等，以實施根據本公開主題的一種方法。在一些實施例中，術語「試劑盒」是指任何預期的任何製品(例如，一個包裝或容器)，包含有來自疏螺旋體屬的細菌和有效量的試劑，用於實施目前公開的測定方法。所述試劑盒也可包括用於實施本發明所述方法的一組特定指令。在其它實施例中，本公開主題提供了一種用於篩選能夠抑制來自疏螺旋體屬的細菌的藥物的試劑盒，該試劑盒包含來自疏螺旋體屬的細菌細胞和用於實施目前公開的測定方法的試劑。
相應地，在一些實施例中，本公開主題提供了一種用於篩選能抑制來自疏螺旋體屬的細菌的生長或存活的至少一種試劑的試劑盒，該試劑盒包含來自疏螺旋體屬的細菌的分離的非複製持留菌形式和用於進行sybrgreeni/碘化丙啶生存力測定的試劑。
在其它實施例中，本公開主題提供了一種用於篩選至少一種候選試劑的試劑盒，所述候選試劑能夠抑制來自疏螺旋體屬的細菌的生長或存活，所述試劑盒包括(a)分離的細菌群體，包含來自疏螺旋體屬的細菌或者其培養物；(b)染色混合物，包含：(i)第一試劑，其發射第一顏色的螢光，指示活細菌細胞，和(ii)第二試劑，其發射與第一顏色形成對比的第二顏色的螢光，並且指示死亡的細菌細胞；其中，當將染色混合物與細菌群體或其培養物一起孵育時，計算的第一顏色的發射螢光強度與第二顏色的發射螢光強度的比值指示群體或其培養物內活細菌的百分比；以及(c)使用(a)中的細菌和(b)中的染色混合物的指令，以篩選至少一種候選試劑，所述候選試劑能抑制來自疏螺旋體屬的細菌的生長或存活。
在一些實施例中，所述試劑盒還包含至少一種測試試劑，以篩選其抑制來自疏螺旋體屬的細菌生長或存活的能力。在其它實施例中，所述試劑盒還包含用於將細菌群體或其培養物與至少一種測試試劑相接觸的指令。在其它實施例中，該試劑盒進一步包含用細菌群體或其培養物孵育染色混合物的指令。在進一步的實施例中，該試劑盒還包含評估細菌在群體或其培養物中的生存力的指令。在另外的實施例中，所述試劑盒還包含用於計算第一顏色的發射螢光強度與第二顏色的發射螢光強度的比值的指令。
在一些實施例中，計算出的強度比指示在暴露於至少一種測試試劑一段時間之後群體或培養物中的活細菌百分比。在特定實施例中，所述細菌為伯氏疏螺旋體。在其它實施例中，所述細菌選自由以下組成的組：金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，肺炎克雷伯桿菌，鮑氏不動桿菌以及結核分枝桿菌。
在一些實施例中，第一試劑發出綠色螢光，而第二試劑發出紅色或橙色螢光。在其它實施例中，所述第一試劑為sybrgreeni，並且所述第二試劑為碘化丙啶。在另外的實施例中，所述試劑盒還包括在篩選中以約10x的濃度使用sybrgreeni和在篩選中以約2mm的濃度使用碘化丙啶的指令。
在一些實施例中，本公開的主題提供了一種用於評估來自疏螺旋體屬的細菌培養物生存力和其對於至少一種能抑制來自疏螺旋體屬的細菌的生長或存活的試劑(例如，目前萊姆病的抗生素或任何新的藥劑)的敏感性的試劑盒，所述試劑盒包含：來自疏螺旋體屬的細菌的培養物，用於實施sybrgreeni/碘化丙啶測定的試劑，以及可選的至少一種測試試劑。
iii、用於抑制來自疏螺旋體屬的細菌的生長和/或存活的方法
本公開主題提供了用於殺死、抑制和/或預防細菌細胞生長的方法。在一些實施例中，本發明提供了一種用於抑制來自疏螺旋體屬的細菌的生長和/或存活的方法，所述方法包括：將來自疏螺旋體屬的細菌與有效量的以下物質相接觸：(a)選自下組中的至少一種化合物：達託黴素，青蒿素，環丙沙星，磺胺醋醯，磺胺甲氧噠嗪，硝呋醛肟，磷黴素，金黴素，磺胺噻唑，氯法齊明，頭孢甲肟，頭孢哌酮，卡波黴素，頭孢替安，頭孢吡肟，阿莫地喹，磷黴素和鏈黴素；(b)選自下組中的至少一種化合物：道諾黴素3-肟；二甲基道諾黴素；柔紅黴素；9，10-蒽二酮，1-羥基-4-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-雙〔3-〔〔(2-羥乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氫-；諾加黴素；派洛寧b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑並[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤黴素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羥基-2-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-；靈菌紅素；絲裂黴素；納紫黴素；9-羥基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)異喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羥基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻噸-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羥基-4-甲基-，一水合物；更生黴素；大黃素；(5，8-二羥基-1，4-二氧代-1，4-二氫萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲醯胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3』，4』，7-四羥基黃酮；苯甲酸，2-羥基-(2，6-吡啶二基二亞乙基)二醯肼，鎳絡合物；1-(1，2-二氫-5-苊基)-n-羥基-1-苯基甲亞胺；2-甲基-4，4』-[(4-亞氨基-2，5-環己二烯-1-亞基)亞甲基]二苯胺；3，3』-二乙基-9-甲基硫雜羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌；(c)至少兩種化合物的組合，包括：(i)選自下組中的第一化合物：達託黴素，頭孢哌酮，咪康唑，以及磺胺甲氧噠嗪；和(ii)選自下組的不同於第一化合物的第二化合物：達託黴素，阿莫西林，頭孢呋辛，頭孢曲松，咪康唑，多西環素，羧苄青黴素，氯法齊明，青蒿素，環丙沙星，磺胺醋醯，磺胺甲氧噠嗪，磺胺氯達嗪，硝呋諾酮，呋喃妥因，磷黴素，金黴素，磺胺噻唑，氯法齊明，氯四環素，頭孢甲肟，頭孢美唑，頭孢哌酮，卡波黴素，頭孢替安，頭孢吡肟，阿莫地喹，磷黴素，鏈黴素，道諾黴素3-肟；二甲基道諾黴素；柔紅黴素；9，10-蒽二酮，1-羥基-4-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-雙〔3-〔〔(2-羥乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氫-；諾加黴素；派洛寧b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑並[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤黴素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羥基-2-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-；靈菌紅素；絲裂黴素；納紫黴素；9-羥基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)異喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羥基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻噸-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羥基-4-甲基-，一水合物；更生黴素；大黃素；(5，8-二羥基-1，4-二氧代-1，4-二氫萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲醯胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3』，4』，7-四羥基黃酮；苯甲酸，2-羥基-(2，6-吡啶二基二亞乙基)二醯肼，鎳絡合物；1-(1，2-二氫-5-苊基)-n-羥基-1-苯基甲亞胺；2-甲基-4，4』-[(4-亞氨基-2，5-環己二烯-1-亞基)亞甲基]二苯胺；3，3』-二乙基-9-甲基硫雜羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌；或者(d)至少三種化合物的組合，包括：(i)作為第一化合物的多西環素；(ii)選自下組中的第二化合物：達託黴素或頭孢哌酮；和(iii)不同於第二化合物的選自下組中的第三化合物：達託黴素，阿莫西林，頭孢呋辛，頭孢曲松，咪康唑，多西環素，羧苄青黴素，氯法齊明，青蒿素，環丙沙星，磺胺醋醯，磺胺甲氧噠嗪，磺胺氯達嗪，硝呋諾酮，呋喃妥因，磷黴素，金黴素，磺胺噻唑，氯法齊明，氯四環素，頭孢甲肟，頭孢美唑，頭孢哌酮，卡波黴素，頭孢替安，頭孢吡肟，阿莫地喹，磷黴素，鏈黴素，道諾黴素3-肟；二甲基道諾黴素；柔紅黴素；9，10-蒽二酮，1-羥基-4-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-雙〔3-〔〔(2-羥乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氫-；諾加黴素；派洛寧b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑並[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤黴素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羥基-2-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-；靈菌紅素；絲裂黴素；納紫黴素；9-羥基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)異喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羥基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻噸-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羥基-4-甲基-，一水合物；更生黴素；大黃素；(5，8-二羥基-1，4-二氧代-1，4-二氫萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲醯胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3』，4』，7-四羥基黃酮；苯甲酸，2-羥基-(2，6-吡啶二基二亞乙基)二醯肼，鎳絡合物；1-(1，2-二氫-5-苊基)-n-羥基-1-苯基甲亞胺；2-甲基-4，4』-[(4-亞氨基-2，5-環己二烯-1-亞基)亞甲基]二苯胺；3，3』-二乙基-9-甲基硫雜羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌。在其它實施例中，(c)(ii)和(d)(iii)中的化合物可以是目前使用的治療萊姆病的任何一線藥物。在另外的實施例中，本公開的方法包含施用(a)，(b)，(c)和(d)中所述化合物的任何組合，例如，至少兩種化合物，包含選自(a)，(b)，(c)和(d)的第一化合物和選自(a)，(b)，(c)和(d)的不同於第一化合物的第二化合物；至少三種化合物，包含選自(a)，(b)，(c)和(d)的第一化合物，選自(a)，(b)，(c)和(d)的不同於第一化合物的第二化合物和選自(a)，(b)，(c)和(d)的不同於第一或第二化合物的第三化合物，等等。
在一些實施例中，(b)中的至少一種化合物選自由以下組成的組：道諾黴素3-肟；二甲基道諾黴素；柔紅黴素；9，10-蒽二酮，1-羥基-4-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-雙〔3-〔〔(2-羥乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氫-；以及諾加黴素。在其它實施例中，(c)中的至少兩種化合物的組合為達託黴素和多西環素。在另外的實施例中，(c)中的至少兩種化合物的組合是達託黴素和頭孢哌酮。
在一些實施例中，(d)中的至少三種化合物的組合為：達託黴素，多西環素和頭孢哌酮。在另外其它實施例中，(d)中的至少三種化合物的組合為：達託黴素，多西環素和磺胺甲氧噠嗪。在其它實施例中，(d)中的至少三種化合物的組合為：達託黴素，多西環素和氯法齊明。在另外的其它實施例中，(d)中的至少三種化合物的組合為：達託黴素，多西環素和羧苄青黴素。在進一步的實施例中，(d)中的至少三種化合物的組合為：頭孢哌酮，多西環素和氯法齊明。在另外的實施例中，(d)中的至少三種化合物的組合為：頭孢哌酮，多西環素和磺胺甲氧噠嗪。在其它實施例中，(d)中的至少三種化合物的組合為：頭孢哌酮，多西環素和咪康唑。
在一些實施例中，所述細菌是伯氏疏螺旋體。在其它實施例裡，所述細菌包含複製形式的伯氏疏螺旋體，非複製持留菌形式的伯氏疏螺旋體，以及複製形式的伯氏疏螺旋體和非複製持留菌形式的伯氏疏螺旋體的組合。在另外的實施例中，該細菌包含選自以下組的伯氏疏螺旋體的形態形式：圓形體形式，浮遊形式，生物膜形式。在其它實施例內，所述細菌選自由以下組成的組：金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，肺炎克雷伯桿菌，鮑氏不動桿菌，以及結核分枝桿菌。在進一步的實施例中，所述接觸發生在體外或體內。
本文所使用的術語「接觸」是指，導致本發明所述的至少一種化合物物理接觸至少一種細菌細胞或環境的任何動作，至少一種細菌細胞駐留在所述環境中(例如培養基)。
iv、治療萊姆病的方法
在一些實施例中，本公開主題提供了治療萊姆病的方法，例如，在患有治療萊姆病後症候群(ptlds)和/或抗生素難治性萊姆關節炎的受試者中治療。已經發現，有效量的特定抗生素與有效量的至少一種其它特定抗生素相結合能夠殺滅非複製持留菌細胞。在其它實施例中，該方法抑制受試者中的細菌感染，例如伯氏疏螺旋體感染的受試者。
因此，在一些實施例中，本公開主題提供了一種在有需要的受試者中治療萊姆病的方法，所述方法包括給予所述受試者有效量的：(a)選自下組中的至少一種化合物：達託黴素，青蒿素，環丙沙星，磺胺醋醯，磺胺甲氧噠嗪，硝呋醛肟，磷黴素，金黴素，磺胺噻唑，氯法齊明，頭孢甲肟，頭孢哌酮，卡波黴素，頭孢替安，頭孢吡肟，阿莫地喹，磷黴素和鏈黴素；(b)選自下組中的至少一種化合物：道諾黴素3-肟；二甲基道諾黴素；柔紅黴素；9，10-蒽二酮，1-羥基-4-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-雙〔3-〔〔(2-羥乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氫-；諾加黴素；派洛寧b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑並[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤黴素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羥基-2-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-；靈菌紅素；絲裂黴素；納紫黴素；9-羥基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)異喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羥基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻噸-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羥基-4-甲基-，一水合物；更生黴素；大黃素；(5，8-二羥基-1，4-二氧代-1，4-二氫萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲醯胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3』，4』，7-四羥基黃酮；苯甲酸，2-羥基-(2，6-吡啶二基二亞乙基)二醯肼，鎳絡合物；1-(1，2-二氫-5-苊基)-n-羥基-1-苯基甲亞胺；2-甲基-4，4』-[(4-亞氨基-2，5-環己二烯-1-亞基)亞甲基]二苯胺；3，3』-二乙基-9-甲基硫雜羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌；(c)至少兩種化合物的組合，包括：(i)選自下組中的第一化合物：達託黴素，頭孢哌酮，咪康唑，以及磺胺甲氧噠嗪；和(ii)選自下組的不同於第一化合物的第二化合物：達託黴素，阿莫西林，頭孢呋辛，頭孢曲松，咪康唑，多西環素，羧苄青黴素，氯法齊明，青蒿素，環丙沙星，磺胺醋醯，磺胺甲氧噠嗪，磺胺氯達嗪，硝呋諾酮，呋喃妥因，磷黴素，金黴素，磺胺噻唑，氯法齊明，氯四環素，頭孢甲肟，頭孢美唑，頭孢哌酮，卡波黴素，頭孢替安，頭孢吡肟，阿莫地喹，磷黴素，鏈黴素，道諾黴素3-肟；二甲基道諾黴素；柔紅黴素；9，10-蒽二酮，1-羥基-4-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-雙〔3-〔〔(2-羥乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氫-；諾加黴素；派洛寧b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑並[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤黴素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羥基-2-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-；靈菌紅素；絲裂黴素；納紫黴素；9-羥基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)異喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羥基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻噸-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羥基-4-甲基-，一水合物；更生黴素；大黃素；(5，8-二羥基-1，4-二氧代-1，4-二氫萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲醯胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3』，4』，7-四羥基黃酮；苯甲酸，2-羥基-(2，6-吡啶二基二亞乙基)二醯肼，鎳絡合物；1-(1，2-二氫-5-苊基)-n-羥基-1-苯基甲亞胺；2-甲基-4，4』-[(4-亞氨基-2，5-環己二烯-1-亞基)亞甲基]二苯胺；3，3』-二乙基-9-甲基硫雜羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌；或者(d)至少三種化合物的組合，包括：(i)作為第一化合物的多西環素；(ii)選自下組中的第二化合物：達託黴素或頭孢哌酮；和(iii)不同於第二化合物的選自下組中的第三化合物：達託黴素，阿莫西林，頭孢呋辛，頭孢曲松，咪康唑，多西環素，羧苄青黴素，氯法齊明，青蒿素，環丙沙星，磺胺醋醯，磺胺甲氧噠嗪，磺胺氯達嗪，硝呋諾酮，呋喃妥因，磷黴素，金黴素，磺胺噻唑，氯法齊明，氯四環素，頭孢甲肟，頭孢美唑，頭孢哌酮，卡波黴素，頭孢替安，頭孢吡肟，阿莫地喹，磷黴素，鏈黴素，道諾黴素3-肟；二甲基道諾黴素；柔紅黴素；9，10-蒽二酮，1-羥基-4-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-雙〔3-〔〔(2-羥乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氫-；諾加黴素；派洛寧b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑並[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤黴素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羥基-2-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-；靈菌紅素；絲裂黴素；納紫黴素；9-羥基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)異喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羥基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻噸-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羥基-4-甲基-，一水合物；更生黴素；大黃素；(5，8-二羥基-1，4-二氧代-1，4-二氫萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲醯胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3』，4』，7-四羥基黃酮；苯甲酸，2-羥基-(2，6-吡啶二基二亞乙基)二醯肼，鎳絡合物；1-(1，2-二氫-5-苊基)-n-羥基-1-苯基甲亞胺；2-甲基-4，4』-[(4-亞氨基-2，5-環己二烯-1-亞基)亞甲基]二苯胺；3，3』-二乙基-9-甲基硫雜羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌。在其它實施例中，(c)(ii)和(d)(iii)裡的化合物可以是目前使用的治療萊姆病的任何一線藥物。在另外的實施例中，本公開的方法包括施用(a)，(b)，(c)和(d)中所述化合物的任何組合。
在一些實施例中，(b)中的至少一種化合物選自由以下組成的組：道諾黴素3-肟，二甲基道諾黴素，柔紅黴素，9，10-蒽二酮，1-羥基-4-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-雙〔3-〔〔(2-羥乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氫-，以及諾加黴素。在其它實施例中，(c)中的至少兩種化合物的組合為達託黴素和多西環素。在另外進一步的實施例中，(c)中的至少兩種化合物的組合為達託黴素和頭孢哌酮。
在一些實施例中，(d)中的至少三種化合物的組合為：達託黴素，多西環素和頭孢哌酮。在其它實施例內，(d)中的至少三種化合物的組合為：達託黴素，多西環素和磺胺甲氧噠嗪。在另外的實施例中，(d)中的至少三種化合物的組合為：達託黴素，多西環素和氯法齊明。在進一步的實施例中，(d)中的至少三種化合物的組合為：達託黴素，多西環素和羧苄青黴素。在另外的實施例中，(d)中的至少三種化合物的組合為：頭孢哌酮，多西環素和氯法齊明。在一些實施例中，(d)中的至少三種化合物的組合為：頭孢哌酮，多西環素和磺胺甲氧噠嗪。在其它實施例中，(d)中的至少三種化合物的組合為：頭孢哌酮，多西環素與咪康唑。
在一些實施例中，所述細菌為伯氏疏螺旋體。在其它實施例中，所述細菌包含複製形式的伯氏疏螺旋體，非複製形式的伯氏疏螺旋體，以及複製形式的伯氏疏螺旋體和非複製形式的伯氏疏螺旋體的組合。在另外的實施例中，所述細菌包含選自由以下組成的組的伯氏疏螺旋體的形態形式：圓形體形式，浮遊形式和生物膜形式。在其它實施例中，所述受試者已經或被懷疑患有治療萊姆病後症候群(ptlds)和/或抗生素難治性萊姆關節炎。
在某些實施例中，本公開的主題提供了一種在有需要的受試者中治療萊姆病的方法，該方法包含：(a)向受試者施用有效量的至少兩種試劑的組合，所述至少兩種試劑包括：(i)至少一種試劑抑制來自疏螺旋體屬的複製形式的細菌的生長和/或存活；以及(ii)至少一種試劑抑制來自疏螺旋體屬的非複製持留菌形式的細菌的生長和/或存活。在其它實施例中，所述方法還包括選自以下的一個或多個步驟：(b)從受試者獲得生物樣品，所述生物樣品包含一種或多種形態形式的來自疏螺旋體屬的細菌；(c)分離至少一種形態形式的細菌；(d)培養所分離的細菌；並且(e)評估培養的細菌對至少一種抑制複製形式的細菌的生長和/或存活的試劑，至少一種抑制非複製的持留菌形式的細菌的生長和/或存活的試劑，或二者的敏感性。
在一些實施例中，抑制複製形式的細菌的生長和/或存活的至少一種試劑選自由以下組成的組：β-內醯胺，破壞dna的抗生素，以及能量抑制劑。在其它實施例中，抑制複製形式的細菌的生長和/或存活的至少一種試劑採用一種培養物在體外孵育，所述培養物包含：來自疏螺旋體屬的非複製的持留菌形式的細菌，抑制複製形式的細菌的生長和/或存活的至少一種試劑，抑制培養物內非複製性持留菌細菌的小於25％的群體的生長和/或存活。在另外的實施例內，抑制複製形式的細菌的生長和/或存活的至少一種試劑，選自由以下組成的組：多西環素，頭孢哌酮，羧苄青黴素，氯法齊明以及它們的組合。在進一步的實施例中，抑制非複製持留菌形式的細菌的生長和/或存活的至少一種試劑，是含蒽醌的化合物。在進一步的實施例中，抑制非複製持留菌形式的細菌的生長和/或存活的至少一種試劑採用一種培養物在體外進行孵育，所述培養物包含：來自疏螺旋體屬的非複製持留菌形式的細菌，抑制非複製持留菌形式的細菌的生長和/或存活的至少一種試劑，抑制培養物內非複製持留菌形式的細菌的大於約50％的群體的生長和/或存活。在一些實施例中，至少一種試劑抑制培養物內非複製持留菌形式的細菌的大於約75％的群體的生長和/或存活。在一些實施例裡，至少一種試劑比目前用於萊姆病的抗生素更好地抑制生長和/或存活，所述目前用於萊姆病的抗生素例如為：多西環素，阿莫西林，頭孢呋辛，或者頭孢曲松，甲硝唑，替硝唑，以及它們的組合。在其它實施例中，至少一種試劑比目前用於萊姆病的抗生素更好地抑制生長和/或存活，並且該試劑可以使用本公開的方法來確定。
在某些實施例中，抑制非複製性持留菌形式的細菌的生長和/或存活的至少一種試劑選自由以下組成的組：達託黴素，青蒿素，環丙沙星，磺胺醋醯，磺胺甲氧噠嗪，硝呋醛肟，磷黴素，金黴素，磺胺噻唑，氯法齊明，頭孢甲肟，頭孢哌酮，卡波黴素，頭孢替安，頭孢吡肟，阿莫地喹，磷黴素和鏈黴素；道諾黴素3-肟；二甲基道諾黴素；柔紅黴素；9，10-蒽二酮，1-羥基-4-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-雙〔3-〔〔(2-羥乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氫-；諾加黴素；派洛寧b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑並[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤黴素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羥基-2-[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-；靈菌紅素；絲裂黴素；納紫黴素；9-羥基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)異喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羥基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻噸-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羥基-4-甲基-，一水合物；更生黴素；大黃素；(5，8-二羥基-1，4-二氧代-1，4-二氫萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲醯胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3』，4』，7-四羥基黃酮；苯甲酸，2-羥基-(2，6-吡啶二基二亞乙基)二醯肼，鎳絡合物；1-(1，2-二氫-5-苊基)-n-羥基-1-苯基甲亞胺；2-甲基-4，4』-[(4-亞氨基-2，5-環己二烯-1-亞基)亞甲基]二苯胺；3，3』-二乙基-9-甲基硫雜羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌。
在一些實施例中，所述細菌為伯氏疏螺旋體。在其它實施例中，所述細菌包含複製形式的伯氏疏螺旋體，非複製持留菌形式的伯氏疏螺旋體，以及複製形式的伯氏疏螺旋體和非複製持留菌形式的伯氏疏螺旋體的組合。在另外的實施例中，所述細菌包含選自由以下組成的組的伯氏疏螺旋體的形態形式：圓形體形式，浮遊形式和生物膜形式。
本文所使用的術語「抗生素」是指，具有殺死或抑制細菌生長的能力的化合物，特別是來自疏螺旋體屬的細菌，包括但不限於：疏螺旋體屬，葡萄球菌屬，埃希氏菌屬，克雷伯氏菌屬，不動桿菌屬和分枝桿菌屬。更一般而言，一種抗菌劑為一種殺死微生物或抑制其生長的試劑。抗菌藥物可根據它們主要針對的微生物進行分組。例如，抗生素用於抗細菌。如此處所使用的術語「β-內醯胺」或「β-內醯胺抗生素」指的是具有β-內醯胺環作為其核心結構的一部分的抗生素，如青黴素和青黴素衍生物(青黴烷類)，頭孢菌素(頭孢類)，單環β-內醯胺類以及碳青黴烯類。這些抗生素中的多種都是通過抑制細菌細胞壁的生物合成而發揮作用。
在一些實施例中，所述受試者已經或被懷疑患有治療萊姆病後症候群(ptlds)和/或抗生素難治性萊姆關節炎。通過本發明所述方法治療的受試者在其許多實施例中理想地為人類受試者，雖然應當理解的是，本文所述的方法對所有脊椎動物物種都有效，所有脊椎動物物種皆意在被包涵在術語「受試者」中。因此，「受試者」可包括用於醫學目的的人類受試者，例如，用於治療現有的疾病，障礙，病症，或者用於預防性治療，即用於預防疾病，障礙，病症的發作；或者用於醫藥、獸醫或發展用途的動物受試者。合適的動物受試者包括哺乳動物，包括但不限於：靈長類，例如，人，猴，猿，長臂猿，黑猩猩，猩猩，獼猴等等；牛科動物，例如，牲畜牛，野牛等等；綿羊類動物，例如，綿羊等；山羊類動物，例如，山羊等等；豬類動物，例如，家豬，野豬等等；馬科動物，例如，馬，驢，斑馬等等；貓科動物，包括野貓和家貓；犬科動物，包括狗；兔形目動物，包括兔子，野兔等等；以及齧齒動物，包括小鼠，大鼠，豚鼠等等。動物可以為轉基因動物。在一些實施例中，所述受試者為人類，包括但不限於：胎兒，新生兒，嬰兒，少年和成人受試者。此外，「受試者」可包括患有罹患或懷疑患有疾病、障礙或病症的患者。因此，術語「受試者」和「患者」在本文中可互換使用。受試者也包括動物疾病模型(例如，在實驗中使用的大鼠或小鼠等)。
在一些實施例中，術語「有效量」指的是，抑制或殺死細菌細胞所需的抗生素或化合物的量。在其它實施例中，術語「有效量」，治療劑的「治療有效量」指的是，引起期望的生物應答所必需的試劑的量。如本領域技術人員會理解的，試劑的有效量可以根據這些因素而變化：期望的生物學終點，待遞送的藥劑，藥物組合物的組合，靶組織或細胞等。更具體的是，術語「有效量」是指足以產生所需效果的量，例如，以降低或改善嚴重性，持續時間，進展或疾病、障礙或病症的發作，或者其一種或多種症狀；防止疾病、障礙或病症的發展，導致疾病、障礙或病症的消退；防止與疾病、障礙或病症相關的症狀的復發，發展，發作或進展，或者增強或改善另一種療法的預防或治療效果。在特定的實施例中，所述疾病、障礙或病症為萊姆病。
此處所使用的術語「處理」，「治療」等的意思是，下降，抑制，減弱，減少或阻滯疾病、障礙或病症的根本原因，或者穩定疾病、障礙或病症和/或與其相關的症狀的發展或進展。此處所使用的術語「處理」，「治療」等可以指治癒性治療，預防性治療和防止性治療。所述處理、給藥或治療可以是連續的或間歇的。連續處理、給藥或治療是指在至少每天的基礎上連續一天或多天進行不間斷的治療。間歇處理或給藥，或者以間歇方式處理或給藥，是指：治療是不連續的，但是，而是周期性循環的。根據本發明所述方法的處理可導致疾病、障礙或病症的完全緩解或治癒，或者部分改善疾病、障礙或病症的一種或多種症狀，並且可以是臨時的或永久的。術語「處理」也意在包括預防，治療和治癒。
術語「組合」以其最廣泛的含義被使用，並且意思是，受試者施用至少兩種試劑，例如，一種抗生素和一種或多種抗菌劑。更具體地，術語「組合」指伴隨施用兩種(或多種)活性劑，用於治療，例如，具有異質細菌群體的單個和多個疾病狀態，所述異質細菌群體由生長和非生長的或其之間的任何細菌細胞組成。如此處所使用的，活性劑可在單一劑型中被組合併施用，可以獨立的劑型同時施用，或者可以獨立的劑型在相同或分開的日子裡交替或順序施用。在本公開主題的一個實施例中，活性劑在單一劑型中被組合併施用。在另一實施例中，所述活性劑以獨立的劑型施用(例如，其中期望改變一種而不是另一種的量)。單一劑型包括額外的活性劑，用於治療疾病狀態。
進一步地，本文所述的化合物可以單獨施用或與輔藥組合施用，所述輔藥增強化合物的穩定性，在某些實施例中促進含有它們的藥物組合物的施用，提供增加的溶解性或分散性，增加抑制活性，提供輔助治療等，包括其它活性成分。有利地，這種組合療法使用較低劑量的常規治療劑，於是避免了當這些試劑作為單一療法時可能的毒性和發生的不良副作用。
化合物的給藥時間可以是變化的，只要實現了這些試劑組合的有益效果。因此，詞彙「與……相結合」指的是，同時、依次、或結合其施用一種化合物和至少一種額外的治療劑，所述額外的治療劑例如為抗生素或其它化合物。因此，施用了一種化合物與至少一種額外的治療劑的組合的受試者，能夠在同一時間(即同時地)或在不同的時間(即在同一天或不同的日子裡以任何順序依次地)接受所述化合物和所述至少一種額外的治療劑，只要在受試者中獲得兩種試劑的組合的效果即可。
當順序給藥時，試劑可在1分鐘，5分鐘，10分鐘，30分鐘，60分鐘，120分鐘，180分鐘，240分鐘或更長的時間內一個接一個地施用。在其它實施例中，順序施用的試劑可在1天，5天，10天，15天，20天或更多天內一個接一個地施用。當所述化合物和至少一種額外的治療劑被同時施用時，它們可作為不同的藥物組合物施用給受試者，每個都包含化合物或至少一種額外的治療劑，或者，它們可作為單一的藥物組合物施用給受試者，含有所有的試劑。
當組合施用時，引起特定的生物反應的每個試劑的有效濃度可小於單獨施用時每個試劑的有效濃度，從而允許一種或多種試劑的劑量相對於如果該試劑作為單一試劑施用而需要的劑量減少。多試劑的效果可能，但不必是，相加或協同。所述試劑可以施用多次。
在一些實施例裡，當組合施用時，兩種或多種試劑可以具有協同效應。如本文所使用的，術語「協同作用」，「協同」，「協同地」以及其類似表述，如「協同效應」或「協同組合」或「協同組合物」是指這樣的情況：化合物或至少一種額外的治療劑的組合的生物活性要大於單獨施用時各個試劑的生物活性的總和。
協同作用可以用「協同指數(si)」來表示，其通常可以通過f.c.kull等人(appliedmicrobiology9，538(1961))描述的方法測定，其由以下公式計算出比率：
qa/qa+qb/qb＝協同指數(si)
其中：
qa是單獨作用的組分a的濃度，其產生相對於組分a的終點；
qa是混合物中的組分a的濃度，其產生終點；
qb是單獨作用的組分b的濃度，其產生相對於組分b的終點；
qb是混合物中的組分b的濃度，其產生終點；
通常，當qa/qa和qb/qb的和大於1時，則指示拮抗作用。當它們的和等於1時，指示相加性。當它們的和小於1時，則顯示了協同作用。si越低，由該特定混合物顯示的協同作用則越大。因此，「協同組合」具有比基於單獨使用時觀察到的單個組分的活性可預期的更高的活性。進一步地，「協同有效量」的組分是指，例如在存在於組合物的另一種治療劑中引起協同效應所需的組分的量。
v、一般定義
在整個說明書和權利要求書中，術語「包含」，「含有」以一種非排他性意義被使用，除非上下文另有要求。同樣地，術語「包括」及其其語法變體旨在是非限制性的，以使得列出的名單中的項目並不排除其他類似的項目，其他類似的項目可以替換或添加到列出的項目中。
實施例
以下實施例已經包含向本領域普通技術人員提供指導以實施當前公開的主題的代表性實施例。根據本公開和本領域的一般水平的技術，本領域技術人員可以理解，以下實施例僅旨在是示例性的，並且在不脫離當前公開的主題的範圍的情況下可以採用多種改變、修改和變化。以下的合成描述和具體實施例僅意在用於說明的目的，並且不應解釋為以任何方式限制本公開的化合物通過其它方法製成。
實施例
以下實施例已經包含向本領域普通技術人員提供指導以實施當前公開的主題的代表性實施例。根據本公開和本領域的一般水平的技術，本領域技術人員可以理解，以下實施例僅旨在是示例性的，並且在不脫離當前公開的主題的範圍的情況下可以採用多種改變、修改和變化。以下的合成描述和具體實施例僅意在用於說明的目的，並且不應解釋為以任何方式限制本公開的化合物通過其它方法製成。
實施例1
鑑定伯氏疏螺旋體的新型抗抑鬱活性的方法
細菌菌株、培養基和培養物：伯氏疏螺旋體菌株b31從americantypetissuecollection獲得。將伯氏疏螺旋體在含有6％兔血清(sigma-aldrich，st.louis，mo)的bsk-h培養基(himedialaboratoriespvt.ltd.)中培養。所有培養基用0.2-μm過濾器過濾滅菌。將培養物在無抗生素的無菌50-ml封閉錐形管(bdbiosciences，sandiego，ca)中進行33℃溫育。7天後，將100μl穩定期伯氏疏螺旋體培養物(1×106個細胞)轉移到96孔組織培養微量培養板中用藥物進行篩選。
顯微技術：在配備有微分幹涉對比(dic)和落射螢光照明的nikoneclipsee800顯微鏡上檢查樣品，並用spot滑塊彩色照相機記錄。通過使用細菌計數室(hausserscientificpartnership，horsham，pa)和dic顯微鏡直接計數進行細胞增殖測定。為了測定伯氏疏螺旋體的生存力，進行sybrgreeni/pi測定或live/deadbaclight細菌生存力測定。通過使用細菌計數室和落射螢光顯微鏡計數這些細胞中活(綠色)和死(紅色)的伯氏疏螺旋體的比率。
抗生素和fda批准的藥物文庫：將多西環素、阿莫西林、甲硝唑、氯法齊明、酮康唑、咪康唑、阿司匹林、多粘菌素b(pmb)和磺胺甲惡唑(smx)(均購自sigma-aldrich)標準研究所，2007)形成庫存溶液。所有抗生素原液通過0.2μm過濾器過濾滅菌。然後將所述原液預稀釋到500-m預稀釋的原液中並儲存在-20℃環境中。將約翰霍普金斯臨床化合物文庫(jhccl)(chong等人，2006)中的每種藥物製成具有dmso的10-mm儲備溶液。將儲備溶液排列在總共24個96孔板中，留下用於對照的每個板中的第一和最後一列。將這些主平板中的每種溶液用pbs稀釋以製備成500-μm預稀釋的平板。每個預稀釋板中的第一和最後一列作為空白對照，多西環素對照和阿莫西林對照。將預稀釋的藥物板密封並儲存在-20℃環境中。
抗生素敏感性試驗：為了定性測定抗生素的效果，將10μl來自預稀釋板或預稀釋儲備液的各化合物加入篩選板中的伯氏疏螺旋體培養物中。將每孔的終體積調節至100μl。將板密封並置於33℃培養箱中7天。
為了測定篩選平板中的活細胞和死細胞，如之前的研究中所述使用sybrgreeni/pi測定(feng、wang、sh等人，2014)。將sybrgreeni(10,000×原液，invitrogen，carlsbad，ca)(10μl)與30μl碘化丙啶(20mm，sigma-aldrich)混合到1.0ml無菌dh2o中並充分混合。將染色混合物(10μl)加入每個孔中並充分混合。將板在室溫下在黑暗中孵育15分鐘。在485nm的激發波長下，使用hts7000生物測定讀數器(perkinelmerinc.，waltham，ma)對篩選平板的每個孔測量535nm(綠色發射)和635nm(紅色發射)波長下的螢光強度。同時，將伯氏疏螺旋體懸浮液(活的和70％異丙醇殺死的)與五種不同比例的活的：死細胞(0∶10，2∶8，5∶5，8∶2，10∶0)混合加入96孔板的孔中。然後將sybrgreeni/pi試劑加入到每一個樣品中，並且如上所述使用hts7000plusbioassayreader測量活/死的伯氏疏螺旋體的各比例的綠/紅螢光比。通過最小二乘擬合分析獲得活細菌百分比與綠色/紅色螢光比率之間關係的回歸方程和回歸曲線。使用回歸方程計算平板的每個孔中的活細胞的百分比。一些有效的候選物通過落射螢光顯微鏡計數進一步證實。
mic測定：使用標準微量稀釋法測定在72小時孵育期後抑制伯氏疏螺旋體的可見生長的抗生素最小抑制濃度(mic)(sapi等人，2011；dever等人，1992；boerner等，1995)。將伯氏疏螺旋體細胞(1×105)接種到每孔含有90μl新鮮bsk-h培養基的96孔微量培養板的每個孔中。將每種稀釋的抗生素(10μl)加入到培養物中。所有實驗一式三份進行。將96孔板密封並置於33℃的培養箱中5天。在孵育後使用sybrgreeni/pi測定細菌計數室細胞增殖情況。
建立用於藥物篩選的穩定期模型：在用一些目前使用的抗生素治療之後，疏螺旋體細胞的代表性形態學變化顯示在圖1中。在對數期，用阿莫西林和多西環素處理的疏螺旋體細胞採用囊性或圓形體形式。在穩定期，用相同抗生素處理的疏螺旋體細胞採用螺旋形式。伯氏疏螺旋體的這些形態變體對抗生素具有不同的敏感性。
結果
用於測定96孔板中的伯氏疏螺旋體生存力的方法的結果顯示，使用綠色螢光與紅色螢光比的sybrgreen/碘化丙啶(pi)測定導致活細胞百分比與比值之間的一致的相關性(圖2)。當繪製時，發現這是線性比關係(圖3)。
圖4顯示了具有常用的活力測定mtt、xtt、螢光素二乙酸酯測定(fda)，市場銷售的live/deadbaclight測定和本公開的sybrgreeni/pi測定的伯氏疏螺旋體b31菌株。sybrgreeni/pi測定具有小於10％的誤差，並且約在20分鐘內完成。
圖5a-5d顯示用以下方法觀察到的伯氏疏螺旋體b31菌株：(a)螢光顯微鏡live/deadbaclight染色；(b)sybrgreen/pi染色；(c)fda染色；和(d)由sybrgreen/pi染色的伯氏疏螺旋體生物膜。sybrgreen/pi測定結果顯示直接顯微鏡計數與抗生素暴露相關(圖6)。
圖7顯示了細菌持續性和潛伏感染的陰陽模型的代表圖(zhang，2014)。陰陽模型描繪了一個動態和複雜的細菌群體，包括在連續體中處於不同代謝狀態的生長(yang，紅色)和非生長群體(yin，黑色)，並且這些群體可以相互轉化。在不斷增長的人口(yang)中，有一小部分非生長或緩慢生長的持久性有機體(yin)，其又含有少量生長細菌。持久性群體再次是異質的，並且由連續體中的各種子群體組成，並且包括持久體的不同層級。在tb的情況下，異煙肼(inh)殺死生長細菌(yang)，利福平(rif)殺死一些生長的細菌和緩慢生長的滯留物，而吡嗪醯胺(pza)僅殺死存留物。不被抗生素殺死的持續性可以恢復為複製形式(逆轉)並導致復發。目前萊姆病抗生素多西環素和阿莫西林或頭孢曲松僅殺死生長的伯氏疏螺旋體細菌(yang)，並對休眠的非生長性伯氏疏螺旋體(yin)幾乎沒有活性。陰陽模型提出靶向複製和非複製細胞以更好地治療持續性細菌感染，包括萊姆病。例如，新鑑定的持久活性藥物或抗生素例如達託黴素、氯法齊明、頭孢哌酮、卡波黴素、磺胺藥物和/或喹諾酮類可與目前使用的萊姆病抗生素如多西環素、阿莫西林和/或頭孢曲松一起使用，其對增殖的伯氏疏螺旋體細菌(yang)具有活性，以更有效地治療所有形式的萊姆病，特別是慢性和持續形式的疾病。
圖8伯氏疏螺旋體培養物在bsk-h培養基中生長7天，通過顯微鏡計數在不同時間點測定細胞數。在5-6天後，伯氏疏螺旋體生長達到峰值(5×107螺旋體/ml)。直到孵育11天(圖8a)，細胞密度的顯微鏡計數保持相對恆定。研究表明，持久性伯氏疏螺旋體可能具有不同的形態，即圓形體(囊腫)和生物膜。這些多種形態的伯氏疏螺旋體可能具有不同的抗生素敏感性(brorson等人，2009；sapi等人，2011)。通過顯微鏡檢查，圓形體和生物膜樣集落的比例在穩定期伯氏疏螺旋體培養物中顯著增加(圖8b)。這些穩定期培養物可以代表不同形態形式的混合群體。選擇7天的伯氏疏螺旋體穩定期培養物作為篩選藥物的持續模型。
評價穩定期伯氏疏螺旋體的體外抗生素敏感性：以前的研究和臨床經驗表明多西環素和阿莫西林對伯氏疏螺旋體表現出殺菌活性(hunfeld和brade，2006)。用於萊姆病的常規抗生素如多西環素和青黴素不會殺死螺旋體的囊性形式，但一些研究表明，甲硝唑可以殺死伯氏疏螺旋體的囊性形式(brorson和brorson，1999)。本方法公開的主題公開了這些前線藥物(多西環素、阿莫西林和甲硝唑)對對數期和穩定期伯氏疏螺旋體和通過sybrgreeni/pi測定的評價和易感性的作用。用臨床常用抗生素治療顯示這些前線藥物對對數期伯氏疏螺旋體有效，但對穩定期伯氏疏螺旋體的影響很小(圖8c)。顯微鏡計數的結果與sybrgreeni/pi測定的結果相關。
篩選fda批准的用於針對休眠的伯氏疏螺旋體的有效藥物的藥物文庫：為了篩選對持續伯氏疏螺旋體、穩定期伯氏疏螺旋體起作用的抗生素，用作篩選fda批准的藥物文庫的持久性模型。同時，將多西環素和阿莫西林添加到每個測試板作為對照藥物。對照藥物活性的幾種測量顯示使用sybrgreeni/pi測定的結果顯示相對誤差小於15％。在所測試的1514種藥物中，幾十種抗生素被認為具有比臨床常用針對伯氏疏螺旋體細菌的抗生素更高的活性(表1)。螢光顯微鏡計數進一步驗證了一些有效的候選藥物測量sybr綠色i/pi，他們的協調是好的，最大差異小於20％。
表1.針對穩定期伯氏疏螺旋體多發性硬化症具有良好活性(優於目前的臨床藥物)的最佳27種活性物
a穩定期伯氏疏螺旋體(7日齡)細胞用藥物處理7天。
b通過落射螢光顯微鏡計數測定殘留的活的伯氏疏螺旋體。
c根據回歸方程和通過sybrgreeni/pi測定獲得的綠色/紅色螢光比率計算殘留存活的伯氏疏螺旋體。
d實驗組和阿莫西林治療樣品的標準t檢驗的p值。
e實驗組和多西環素處理的樣品的標準t檢驗的p值。
基於初步篩選，選擇一些活性候選物(具有小於50％的殘餘活細胞)以通過sybrgreeni/pi測定和顯微鏡計數進行重新篩選。重新篩選證實了初步篩選的結果。幾種fda批准的藥物被鑑定顯示對穩定期伯氏疏螺旋體具有良好的殺菌活性。一些藥物的殺菌活性顯著高於前線抗生素多西環素或阿莫西林的殺菌活性(圖9)。例如，達託黴素、氯法齊明、卡波黴素、一些頭孢菌素抗生素(例如頭孢哌酮、頭孢噻吩和頭孢吡肟)、鏈黴素和抗瘧疾抗生素阿莫地喹，顯示出對穩定期伯氏疏螺旋體的相對高的殺菌活性。
代表圖顯示了穩定期伯氏疏螺旋體菌株b31經達託黴素、頭孢哌酮和四環素(圖10a-10d)以及卡波黴素和氯法齊明顯示(圖11)處理後的變化。這些化合物中的一些能阻斷蛋白質合成。例如，大環內酯類具有比青黴素或頭孢曲松更大的活性，用於伯氏疏螺旋體存留者。碳黴素，一種大環內酯，顯示比其他大環內酯類如紅黴素具有更高的伯氏疏螺旋體的活性。其他化合物可能損害dna和/或能量，如氯法齊明。化合物也可能阻斷dna合成。一些磺胺藥物，如塞米松和磺胺異惡唑，對穩定期伯氏疏螺旋體有效，而磺胺甲惡唑也表現出較低的mic(≤0.2μg/ml)。
雖然大多數藥物不影響sybrgreeni/pi測定，但一些有色化合物會造成對sybrgreeni/pi測定的幹擾。例如，吡磺酸託吡酯和多柔比星通過sybrgreeni/pi測定顯示非常高的活性，但是通過顯微計數沒有觀察到殺菌活性。發現這些紅色化合物可能使背景變紅導致假陽性結果。因此，建議通過其他方法例如顯微計數來進行sybrgreeni/pi數據的驗證。
mic測試：通過新的sybrgreeni/pi測定和顯微鏡計數測定一些有效抗生素的mic對穩定期伯氏疏螺旋體的作用。從兩種方法獲得的結果相同。多西環素、阿莫西林和甲硝唑的mic值(圖12)與以前的研究一致(sapi等人，2011；hunfeld和brade，2006)。同時，發現對數期伯氏疏螺旋體對卡泊黴素、頭孢哌酮、頭孢替安和磺胺甲惡唑非常敏感(圖12)。另一方面，甲硝唑、氯法齊明、他唑巴坦、酮康唑、咪康唑對伯氏疏螺旋體的繁殖力影響效果較弱(圖12)。
本公開的主題提供了適合於高通量篩選以鑑定新藥物和快速評價伯氏疏螺旋體的抗生素敏感性的快速且方便的生存力測定(例如，sybrgreeni/pi)(feng、wang、shi等人，2014)。使用這種快速方法，篩選了fda批准的針對伯氏疏螺旋體的非複製頑固性的活性化合物文庫。鑑定了許多藥物候選物，其具有對疏螺旋體菌的殺菌活性。
達託黴素是用於治療革蘭氏陽性生物引起的感染的脂肽抗生素。目前公開的數據顯示達託黴素在所有活性命中具有針對穩定期伯氏疏螺旋體維生素的最高活性。達託黴素可從多個方面破壞細菌細胞膜功能。它插入膜中，並產生允許細胞洩漏離子的孔，這導致快速去極化，導致膜電位的喪失和細菌細胞的死亡(pogliano等人，2012)。用達託黴素處理的伯氏疏螺旋體細胞在染色後顯示幾乎所有的紅色螢光為螺旋體(圖10a)。這個結果表明達託黴素可以破壞伯氏疏螺旋體的細胞膜，導致碘化丙錠滲透到細胞中。顯微鏡計數顯示達託黴素處理後的幾個原生質球；不希望受任何一個特定理論的束縛，認為達託黴素可誘導原生質球細胞的裂解。
大環內酯類和酮內酯類藥物在以前的研究中被選為萊姆病臨床治療的候選抗生素(hunfeld和brade，2006)。在這裡，已經發現卡波黴素、16-元大環內酯，比常規大環內酯類如紅黴素和羅紅黴素顯示出對穩定期伯氏疏螺旋體的更高的殺菌活性。mic數據(圖12)顯示卡巴黴素也能有效對抗伯氏疏螺旋體。
用β-內醯胺治療伯氏疏螺旋體是臨床上常用的治療方法(hunfeld和brade，2006)。β-內醯胺可通過破壞細胞壁的肽聚糖層的合成而誘導伯氏疏螺旋體的圓形體繁殖體(kersten等人，1995)。顯微鏡檢查還顯示，圓形體繁殖體(brorsen等，2009)大多數是頭孢哌酮處理的穩定期伯氏疏螺旋體(圖10b)。根據先前研究測量的mic，所有β-內醯胺顯示出良好的抗伯氏疏螺旋體增殖的活性。然而，本方法公開的主題顯示，β-內醯胺抗生素對穩定期伯氏疏螺旋體細胞的作用存在差異。
頭孢哌酮是第三代頭孢菌素，似乎是針對穩定期伯氏疏螺旋體的最佳β-內醯胺抗生素，然後是一些第二代頭孢菌素，例如頭孢替安、頭孢美唑和頭孢噻肟。如在以前的研究(hunfeld和brade，2006)，第一代頭孢菌素顯示對穩定期伯氏疏螺旋體的活性非常有限。已經發現頭孢菌素對穩定期伯氏疏螺旋體的活性不能根據它們對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌的活性譜與這些抗生素的經典代組分完全匹配。這一觀察結果可能與伯氏疏螺旋體與普通革蘭氏陰性或革蘭氏陽性菌的差異有關(和zückert，2010)。雖然β-內醯胺酶抑制劑他唑巴坦對增殖伯氏疏螺旋體的作用有限，但是哌拉西林-他唑巴坦對穩定期b螺旋體有活性。基因組數據顯示伯氏疏螺旋體具有編碼推定的β-內醯胺酶phnp基因。因此，β-內醯胺酶抑制劑可能有助於降低伯氏疏螺旋體對β-內醯胺的抵抗率。在一些實施例中，β-內醯胺和內醯胺酶抑制劑的優化組合具有針對伯氏疏螺旋體持久性的良好活性。
四環素抗生素，特別是多西環素，在臨床環境中用作萊姆病的前線藥物。這些抗生素具有較低的mic值(hunfeld和brade，2006)，並且對伯氏疏螺旋體的增殖具有良好的抑制活性。有趣的是，發現四環素比多西環素對穩定期伯氏疏螺旋體具有更高的活性。觀察到大多數細胞是在由四環素處理的穩定期伯氏疏螺旋體中的圓形體繁殖體(圖10c)。伯氏疏螺旋體可能在穩定期或在不利條件下形成不同的形態，而四環素抗生素可能對一些形態細胞例如圓形體(囊腫)細胞無效(sapi等人，2011)。
此外，一些fda批准的抗生素被發現在本公開主題中對穩定期伯氏疏螺旋體具有殺細菌活性。氯法齊最初被開發用於治療結核病，雖然現在它通常用於麻風病的治療(arbiser和moschella，1995)。目前公開的數據顯示，氯法齊明對穩定期伯氏疏螺旋體有效，儘管氯法齊明的mic相對較高(6.25μg/ml)。此外，一些磺胺類藥物，例如亞碸和磺胺異惡唑，被發現對穩定期伯氏疏螺旋體有效，而磺胺甲惡唑顯示低mic值(≤0.2μg/ml)。這些有效的抗生素可以被認為是在動物模型和臨床研究中進一步藥物組合研究的候選物。
總之，使用新開發的sybrgreeni/碘化丙錠(pi)測定法，在富含非複製型持久性細胞的穩定期伯氏疏螺旋體中篩選由約2,000種化合物組成的fda批准的藥物文庫。從用於治療其他疾病或病症的現有藥物中鑑定了許多對伯氏疏螺旋體存留者具有優異活性的候選藥物。這些藥物包括達託黴素、氯法齊明、卡波黴素、磺胺藥物如磺胺甲惡唑和某些頭孢菌素，如頭孢哌酮。本方法公開的主題提供了可用於鑑定對疏螺旋體屬中的細菌的新的抗持久活性的方法。
實施例2
藥物組合對疏螺旋體在體外的存活：消滅
通過使用達託黴素、頭孢哌酮和多西環素實現
材料和方法
菌株、培養基和培養物：菌株、培養基和培養物按照實施例1獲得和使用。
抗生素：多西環素(dox)、阿莫西林(amo)、頭孢哌酮(cefp)、氯法齊明(cfz)、咪康唑(mcz)、多粘菌素b(pmb)、磺胺甲惡唑(smx)、達託黴素(dap)、carbomycin(magnamycina)、乳鏈菌肽、羧苄青黴素、氧氟沙星、替加環素、羥氯喹、利福平和克拉黴素(sigma-aldrich)溶解在合適的溶劑中(clinicalandlaboratorystandardsinstitute，2007)。抗生素原液通過0.2μm過濾器過濾滅菌，除了氯法齊明，將其溶解在dsmo(二甲基亞碸)中，不予過濾。然後將儲備物儲存在-20℃環境中。
顯微技術：在配備有微分幹涉對比(dic)和表面螢光照明的nikoneclipsee800顯微鏡上檢查樣品，並用spot滑塊彩色照相機記錄。通過使用細菌計數室(hausserscientificpartnership)和dic顯微鏡直接計數進行細胞增殖測定。進行sybrgreeni/pi測定以評估伯氏疏螺旋體的生存力。通過使用細菌計數室和落射螢光顯微鏡計數這些細胞，計算活(綠色)和死(紅色)伯氏疏螺旋體的比率。捕獲每個樣品的三個代表性圖像用於定量分析。應用imagepro-plus軟體測量如先前所述的伯氏疏螺旋體的不同形式(螺旋體、圓形體和小菌落)的生物量(螢光強度)(shopov和williams，2000)。
抗生素暴露測定：為了定性測定抗生素的效果，將10μl來自預稀釋板或預稀釋儲備液的各化合物加入96孔板中的穩定期伯氏疏螺旋體培養物中。對於每種抗生素，將每孔的終體積調節至100μl，濃度為10μg/ml。將板密封並置於33℃培養箱中7天。sybrgreeni/pi生存力測定法用於評估抗生素暴露後的活細胞和死細胞(feng，wang，shi，etal。，2014)。簡言之，將10μlsybrgreeni(10,000×儲備液，invitrogen)與30μl碘化丙啶(pi，20mm)混合到1.0ml無菌dh2o中。然後，向每個孔中加入10μl染色混合物並充分混合。將板置於室溫下黑暗中孵育15分鐘，然後在485nm的激發波長下讀板，在酶標儀中測量在535nm(綠色發射)和635nm(紅色發射)下的螢光強度(hts7000plusbioassayreader，perkinelmerinc.，usa)。使用最小二乘擬合分析，獲得活細菌百分比與綠色/紅色螢光比率之間關係的回歸方程和回歸曲線。使用回歸方程計算96孔板的每個孔中的活細胞的百分比。經抗生素處理的伯氏疏螺旋體亞種群培養以評估生物體的生存力：在eppendorf管中用藥物或藥物組合處理七天齡的伯氏疏螺旋體培養物(1×107螺旋體/ml)(500μl)。在33℃下振蕩培養7天後，通過離心收集細胞，並用1ml新鮮的bsk-h培養基衝洗，然後重懸於500μl不含抗生素的新鮮bsk-h培養基中。然後將50μl細胞懸浮液轉移至1ml新鮮bsk-h培養基中，在33℃下傳代培養2周。使用sybrgreeni/pi測定和通過如上所述的顯微鏡評估細菌計數室(hausserscientificpartnership)的細胞增殖情況。
結果
利用新開發的sybrgreeni/pi生存力測定法，最近針對穩定期伯氏疏螺旋體保留物和27個候選藥物篩選了fda批准的藥物文庫，其分別具有比目前推薦的萊姆抗生素多西環素或阿莫西林更高的活性(實施例1；feng、wang、shi等人，2014)。在前27個確認的藥物候選物中，達託黴素、氯法齊明、卡波黴素、磺胺藥物(例如磺胺甲惡唑)和某些頭孢菌素(例如頭孢哌酮)對伯氏疏螺旋體菌具有更高的活性(feng、wang、shi等人，2014)。有趣的是，一些藥物候選物，如達託黴素和氯法齊明，對非生長持久劑具有最高活性，對活性生長的具有高mic的伯氏疏螺旋體的活性差，分別為12.5-25μg/ml和6.25μg/ml(feng、wang、shi等人，2014)。儘管這些具有抗持久性的藥物候選物在單獨使用時可能不具有良好的活性，這是由於其對生長的伯氏疏螺旋體具有差的活性，所以提出了這樣的問題，即它們是否可以與另一種抗生素如多西環素一起用於抑制或殺死伯氏疏螺旋體的增殖。這樣的組合可以產生萊姆病的更有效的治療方法。
實驗上，由於穩定期培養物包含具有不同形態變體的生長和非生長細菌的混合群體，例如對抗生素耐受的圓形體和小菌落(feng、wang、shi等人，2014；brorson等人，2009；sapi等人，2011)，最有可能單一藥物不能有效地殺死所有細菌群體，其中包括形態變異體。在本方法公開的主題中，評價一系列藥物組合，目的是鑑定出最有效殺死伯氏疏螺旋體培養物的最佳藥物組合。
伯氏疏螺旋體培養物具有不同比例的形態變體，包括圓形體和小菌落形式作為培養物的年齡：如先前研究所示(feng、wang、shi等人，2014)，穩定期培養物富集形態變體，例如圓形形式和生物膜樣聚集的小菌落，與對數期培養中發現的單個螺旋體相比，以增加的比例形成(圖13)。為了更準確地評估不同形態變異形式的比例，檢查從不同年齡的培養物取得的每個樣品的代表性圖像以測量不同形態形式的伯氏疏螺旋體的百分比(表2)。結果發現對數期(3日齡)伯氏疏螺旋體培養物幾乎完全由螺旋形式(96％)組成，幾乎沒有圓形體(4％)且沒有聚集的小菌落形式(圖13a)。在伯氏疏螺旋體的7天齡的穩定期培養物中，有38％的螺旋形，23％的囊狀或圓形，和39％的小集落形式(圖13b)。當將伯氏疏螺旋體穩定期培養物培養10天時，小菌落形式的百分比增加至64％，螺旋形和圓形形式分別為20％和16％(圖13c)。
對數期和穩定期培養物中的滯留頻率：由於伯氏疏螺旋體在瓊脂平板上不容易形成菌落，通過計算殺菌抗生素殺死的細菌的百分比來測定抗生素暴露後的持續頻率的常規方法不能應用於伯氏疏螺旋體。因此，在培養物暴露於抗微生物劑之後，使用sybrgreeni/pi生存力測定來評估對數期和穩定期培養物中的伯氏疏螺旋體菌的頻率。大腸桿菌培養物在暴露於抗生素後用作對照，以驗證用於持續頻率評估的sybrgreeni/pi生存力測定。暴露於50μg/ml阿莫西林3小時的對數期大腸桿菌培養物的持續頻率對於sybrgreeni/pi測定為4.4％，對於cfu測定為0.9％(表1)。使用sybrgreeni/pi測定，對照期培養物的伯氏疏螺旋體的持續頻率範圍為5-10％，但在用頭孢曲松、多西環素或阿莫西林處理的穩定期培養物中的範圍為16-27％(表1)。考慮到sybrgreeni/pi生存力測定似乎比用大腸桿菌對照的cfu測定提供持續頻率的約5倍(4.4％/0.9％)的過高估計，伯氏疏螺旋體的實際持續頻率可能對於伯氏螺旋體對數期培養物為1-2％，對於穩定期培養物為3-5.5％。
小菌落形式比自由、活的螺旋體和圓形體更耐受抗生素：先前的研究表明，穩定期伯氏疏螺旋體對抗生素比對數期培養更具抗性或耐受性(feng、wang、shi等人，2014)。考慮到穩定期培養物的形態變體的異質性(圖13b和圖13c)，不同變體形式的伯氏疏螺旋體對通常用於萊姆病的抗生素(多西環素，阿莫西林和頭孢曲松)的易感性是以更定量的方式確定。有趣的是，發現不同的變體形式對這些抗生素具有不同的易感性(表2)。主要由螺旋形式組成的對數期培養物(3日齡)對這些抗生素高度敏感，而主要包含圓形體和生物膜樣微集落形式的穩定期(7天和10天)培養物對這些抗生素的影響，如在抗生素暴露後剩餘的活細胞的比例所示(表2)。
圖14顯示藥物(50μg/ml)和組合對穩定伯氏疏螺旋體的影響。圖15顯示了5種有希望針對疏螺旋體生物膜的藥物組合。圖16顯示藥物組合對疏螺旋體生物膜的活性。
當10天齡的穩定期培養物(其由小部分的螺旋形形式和圓形體和小菌落形式的主要比例的混合群組成)暴露於各種抗生素時，發現小集落形式對抗生素比自由生活螺旋形和圓形體對抗生素更耐受。達博黴素10μg/ml是一種對伯氏疏螺旋體存活菌具有高活性的藥物(feng、wang、shi等人，2014)，殺死穩定期細胞(圖17a，小圖h)的所有浮遊形式(螺旋體和圓形體)，但是只能部分殺死伯氏疏螺旋體菌的小菌落形式，如在小菌落中存在與一些綠色細胞(活細胞)混合的顯著數量的紅細胞(死細胞)所示(圖17a，小圖h)。另一種持久活性藥物頭孢哌酮(feng、wang、shi等人，2014)具有比達託黴素更弱的活性，因為它對浮遊細胞具有一些活性(52％細胞是綠色細胞)，但對於小菌落形式幾乎沒有活性，其中大多數小集落細胞保持為綠色(活的)細胞(圖17a，小圖e)。相反的，多西環素對穩定期伯氏疏螺旋體存活菌具有最小的活性，其中約71％的自由活體浮遊細胞(包括螺旋形和圓形體)未被多西環素殺死，如綠色(活)細胞所示(圖17a，小圖d、f和j)，但是小集落形式幾乎全部存活(圖17a，小圖c、e和i)。這些研究結果表明，不同變體形式的體外(螺旋形、圓體形式和小菌落以增加的抗性順序)對當前萊姆病抗生素以及甚至持久活性抗生素達託黴素和頭孢哌酮具有不同的耐受性或耐藥性，小菌落形式對抗生素耐受性最強。
藥物組合對穩定期伯氏疏螺旋體維生素的作用：儘管達託黴素和頭孢哌酮具有強的抗持久活性，但是它們在10μg/ml時殺死最具抗性的小菌落形式的持久性具有有限的活性(圖17)。這些研究結果表明，如果對伯氏疏螺旋體單獨使用，這些fda批准的持久性藥物可能有限的潛力。為了鑑定更有效的藥物組合殺死不同變異形式的伯氏疏螺旋體穩定期存留物，評估了81種藥物組合，包括在10天齡的伯氏疏螺旋體培養物上的fda批准的藥物，所述伯氏疏螺旋體培養物富含小菌落和10μg的圓形體/ml(接近或低於mic)。結果表明，一些藥物組合確實比單獨的藥物更有效(表2)。其中，達託黴素突出顯示其與其他藥物組合時對穩定期伯氏疏螺旋體多發性硬化症具有最佳活性。
單獨的達託黴素(10μg/ml)不能單獨消除小菌落(圖17a，小圖g)，但是達託黴素與多西環素或β-內醯胺的組合對於伯氏疏螺旋體浮遊生物滯留菌和對小菌落非常有效(表2，圖17b)。然而，達託黴素與多西環素或頭孢哌酮組合比單獨使用這些藥物或與沒有達託黴素的藥物組合(例如多西環素+頭孢哌酮或甚至多西環素+頭孢哌酮+磺胺甲惡唑)相比對小菌落形式產生更好的殺菌活性如更多的紅細胞(死細胞)是在達託黴素藥物組合後產生的(圖17b，小圖f、g、i、j、k和1)。然而，用作兩種藥物組合的一部分的達託黴素沒有完全根除存留物的小菌落形式(圖17b，小圖f和g)。值得注意的是，作為使用多西環素和頭孢哌酮的三種藥物組合的一部分，達託黴素根除了僅有少量痕量紅色(死亡)細胞的所有小菌落(圖17b，小圖h、i、j、k和1)，而其他含達託黴素的，使用頭孢哌酮+羧苄青黴素或卡波黴素或氯法齊明的三種藥物組合在治療後仍然具有一些紅色小菌落。
除了多西環素和β-內醯胺，一些臨床藥物，例如萬古黴素、氧氟沙星、克拉黴素和羥氯喹，不推薦用於治療萊姆病，其單獨或與多西環素和頭孢哌酮組合也對10天齡的穩定期伯氏疏螺旋體顯示出一些弱的活性培養物。單獨的利福平對於伯氏疏螺旋體耐藥菌沒有顯著活性，但與多西環素、阿莫西林、頭孢曲松或頭孢哌酮組合對伯氏疏螺旋體菌的活性更高(表3)。在所有其他非達託黴素藥物組合中，在殺死伯氏疏螺旋體滯留物中接近達託黴素藥物組合的兩種藥物組合是dox+cefp或咪康唑或磺胺甲惡唑(表3)。此外，當與多西環素和頭孢哌酮組合時，氯法齊明顯示出對穩定期伯氏疏螺旋體多發性骨髓炎的良好活性(表3)。值得注意的是，羧苄青黴素、萬古黴素、氧氟沙星、克拉黴素、替加環素、乳鏈菌肽和羥氯喹與多西環素聯合時的活性僅略微增強多西環素活性和它們的抗持續活性，這不如當它們與達託黴素組合時有效(表3)。
抗生素治療的伯氏疏螺旋體的亞種群：在先前的研究中，發現達託黴素以50μm(相當於81μg/ml，在人中達到高劑量)具有顯著的抗持續活性，似乎可以殺死所有伯氏疏螺旋體，如通過pi染色的所有紅細胞所示(圖3d，feng、wang、shi等人，2014)。為了證實這些紅細胞確實死亡，在新鮮bsk-h培養基中進行傳代培養試驗，發現實際上用50μm達託黴素處理的這些紅細胞已經死亡，因為它們在傳代培養試驗中未能生長，如缺少任何15天傳代培養後可見的綠色螺旋體(數據未顯示)。已經建立了亞種群試驗作為用於評估抗生素處理的細胞的生存力的可靠測定法，驗證了對選擇的抗生素或抗生素組合產生對抗持久性的最佳殺菌效果所獲得的上述結果(參見圖17)。
為此，將7天齡的穩定期伯氏疏螺旋體培養物與選定的抗生素和抗生素組合暴露7天，然後在新鮮的bsk-h培養基中傳代培養7天或15天。顯微鏡計數顯示無藥物對照和用單一藥物處理的樣品在7天傳代培養中生長。用兩種藥物組合治療的樣品生長較慢(表4)。然而，在7天傳代培養後，所有三種藥物組合，例如多西環素+達託黴素+頭孢哌酮或smx或cfz沒有顯示任何生長跡象，因為沒有觀察到可見的螺旋形式，而其他藥物組合在顯微鏡下都具有可見的綠色螺旋體。在15天傳代培養後，對照樣品中有約1×107個螺旋體，多西環素或阿莫西林處理的樣品中有5×106個螺旋體(表4)。有趣的是，單獨的達託黴素或兩種藥物組合多西環素+頭孢哌酮和多西環素+達託黴素，或甚至三種藥物組合多西環素+達託黴素+氯法齊明不能對伯氏疏螺旋體菌消毒，因為它們都在傳代培養後具有可見的螺旋體生長(圖18)。
然而，多西環素+達託黴素+磺胺甲惡唑能顯著減少螺旋體的數目，在15天傳代培養後可見非常少的螺旋體(圖18h)。到目前為止，達託黴素與多西環素和頭孢哌酮組合實現了最佳結果，其殺死了所有的沒有觀察到活菌的伯氏疏螺旋體的存留者(圖18i)。這與用單獨的其它藥物或藥物組合處理的樣品相比，綠色/紅色螢光減少和缺乏任何可行的綠色螺旋體來證明，所述樣品都具有更高的綠色/紅色螢光和可見的綠色螺旋菌(表4，圖18)。重要的是，這種藥物組合不僅可以消除浮遊生物穩定期伯氏疏螺旋體的存留物(螺旋體和圓形體形式)，而且可以消除更具有抗性的生物膜樣微生物群(表4，圖18)。對用該藥物組合處理的樣品進行亞培養，即使在15天的傳代培養後，通過顯微鏡檢查(檢測限＜105)也沒有顯示任何可檢測生物體的信號(表4，圖18i)。這些結果表明小菌落結構不被多西環素、阿莫西林、持久活性藥物單獨，兩種藥物組合或甚至三種藥物組合消除，但可以通過多西環素、頭孢哌酮和達託黴素的藥物組合消除。
討論
在目前公開的主題中，使用持久活性藥物的第一次體外藥物組合研究(feng、wang、shi等人，2014)與目前推薦的萊姆抗生素如多西環素或阿莫西林或其他抗生素，可以實現更有效地根除伯氏疏螺旋體滯留物。發現通過藥物聯合比單一抗生素殺滅伯氏疏螺旋體菌更有效，但殺菌活性取決於所使用的特定抗生素(表3)。有趣的是我們注意到，儘管持久的活性抗生素，例如脂肽達託黴素和β-內醯胺頭孢哌酮本身，對於浮遊螺旋體博氏疏螺旋體(螺旋體和圓形體)具有相當活性，但當它們當單獨使用或甚至組合使用時(圖17)，不能根除更耐藥的小菌落。以前的研究表明，與多西環素和阿莫西林相比，噻唑烷、甲硝唑和替加環素對伯氏疏螺旋體圓形體和小菌落更有活性，但即使在高濃度的抗生素也不能完全殺死小菌落(sapi等人，2011)這些抗生素單獨使用對伯氏疏螺旋體存留物的作用是有限的。儘管在該研究中替加環素與圓環體形式相比是最活躍的抗生素(sapi等人，2011)，但是我們發現替加環素本身不能非常有效地殺死生物膜樣小菌落(表3)。
顯著地，我們發現達託黴素與多西環素和頭孢哌酮或羧苄青黴素的組合能夠完全根除最具抗性的小菌落(圖17)，並且通過傳代培養研究進一步證實，其結果顯示無任何生長(圖18)。雖然各種藥物組合顯示改善的活性針對穩定期伯氏疏螺旋胃潰瘍，達託黴素組合在對持續劑的藥物組合中具有最佳活性(表3)。僅接近達託黴素組合的非達託黴素方案包含有頭孢哌酮(圖17，表3)。出人意料的是，其他抗生素，如磺胺甲惡唑、氯法齊明和咪康唑，也與多西環素和頭孢哌酮組合對穩定期伯氏疏螺旋體多發性硬化症患者具有更多的活性。這些藥物目前不用作用於臨床治療萊姆病的抗生素(cdc，治療後萊姆病症候群，2014；hunfeld和brade，2006)。雖然磺胺藥物在單獨用於生長細菌時是抑菌的，但是它們可以在長期治療期間殺死伯氏疏螺旋體的非生長的圓形體或聚集形式的小菌落。具有高抗持久活性的氯法齊明改善了與達託黴素或達託黴素加多西環素的組合(表3)，這可能是由於其多種作用機制，包括膜的不穩定，活性氧產生和結核分枝桿菌(xu等人，2012)。我們還發現當與多西環素和頭孢哌酮組合時，咪康唑(咪唑抗真菌藥物)對伯氏疏螺旋體耐藥菌具有高活性(表2)。咪康唑已證實可以改變脂質膜的完整性(vandenbossche等人，1989)，因此可促進其他藥物如多西環素和頭孢哌酮的滲透，用於改善針對伯氏疏螺旋體菌的活性(表3)。
在本方法公開的主題或任何其它先前研究中，通過達託黴素+多西環素+頭孢哌酮的三種藥物組合完全根除任何單一、雙重或甚至三種藥物組合不能實現徹底根除伯氏疏螺旋體生物膜樣小菌落。這三種藥物組合能夠實現這一顯著活性的機制是值得評論。多西環素和頭孢哌酮分別抑制蛋白質合成和細胞壁肽聚糖的合成(kersten等人，1995)不希望受任何一種特定理論束縛。可能需要殺死在伯氏疏螺旋體小菌落中存在的生長形式或者偶爾從小菌落恢復為生長形式，但是這些藥物對圓形體或小菌落持續體本身的效果較差(feng、wang、shi等人，2014；brorson等人，2009；sapi等人，2011)。這種不可能性可能是因為藥物滲透進入微集落結構，外排機制(brorson等人，2009；casjens，2000)，或減少了蛋白質或細胞壁合成的持久性造成的。達託黴素對伯氏疏螺旋體存留菌的高效性可能是由於其對膜破裂或去極化的作用，導致膜電位的損失和能量代謝的抑制(feng、wang、shi等人，2014；pogliano等人，2012)，這是持續存活所必需的(zhang，2014)。先前的研究表明，β-內醯胺加達託黴素的組合即使具有達託黴素抗性，但也增加革蘭氏陽性感染的有效性(dhand等人，2011)。雖然傳統上對革蘭氏陽性生物體有活性的藥物不被認為具有針對伯氏疏螺旋體的活性，但是體外研究先前已經記錄了藥物例如萬古黴素的活性(hall等人，2014；dever等人，1993)不是替考拉寧或達託黴素，雖然這項研究進行檢查的不是持續期而是對數期培養。儘管達託黴素不用於革蘭氏陰性病原體，但是已經提出諸如粘菌素的藥物由於外膜透化而改善聚陰離子脂肽活性(morris等人，1995)。無論如何，這些研究表明，殺死或抑制生長生物(多西環素和頭孢哌酮)和非複製生物(達託黴素和頭孢哌酮)的這些試劑的組合使用對於針對高度抗性小菌落的良好活性是重要的，這與使用藥物靶向生長和非生長微生物群體改善持續性感染治療的主題是一致的(zhang，2014)。
值得注意的是，在抗生素處理的伯氏疏螺旋體的亞種群研究中的短期培養不足以評估穩定根除持久期菌落。這通過用三種藥物組合達託黴素+多西環素+頭孢哌酮或smx或cfz處理的伯氏夜蛾存活細胞的7天傳代培養物顯示，其均不產生可檢測水平的任何殘餘生長(表4)。然而，延長溫育至15天的傳代培養表明僅達託黴素、多西環素和頭孢哌酮組合能夠完全根除沒有可檢測的螺旋體的生物膜樣微集落(圖18i)。這些發現表明，可能需要在抗生素暴露後更長時間的孵育至15天或更長時間，以徹底評估穩定根除持續形式而不復發的藥物組合。亞種群結果確認驗證sybrgreeni/pi生存力測定，是一種有用的和更敏感的技術，用於評估藥物治療後的伯氏疏螺旋體滯留物或小菌落的可行性，以確定最佳的藥物組合，以殺死更多的耐藥性細菌。
伯氏疏螺旋體的年齡或遭受不利條件可以形成形態變體作為體外培養物。(feng、wang、shi等人，2014；brorson等人，2009；alban等人，2000；sapi等人，2011；murgiaandcinco，2004)。這些變體的比例在培養條件下沒有隨時間被很好地表現出來。通過仔細測量，當隨著對數期培養物生長至穩定期(7-10天)時，確定形態變體的百分比，形態變體從螺旋體逐漸變為圓形體形變為小菌落形式(圖13)。雖然以前的研究報告顯示，圓體形式或生物膜樣小菌落形式是更耐抗生素(feng、wang、shi等人，2014；brorson等人，2009；sap等人，2011)，但它們的相對電阻未被充分研究。在這裡，隨著變體的形態從螺旋體變為圓形體，並且隨著抗生素耐受性增加而變為小菌落形式，已經發現了層次結構或不同水平的穩定期伯氏疏螺旋體存留物的持久性水平(表2)。
在穩定期伯氏疏螺旋體培養物中持續頻率高於對數期培養物的發現與其他細菌中的研究一致。然而，通過sybrgreeni/pi測定確定的伯氏螺旋菌對數期培養物(5-10％)和穩定期培養物(16-27％)中的持續頻率似乎高於大腸桿菌(在對數期的0.001％至穩定期的1％)(keren等人，2004)。鑑於sybrgreeni/pi測定傾向於基於大腸桿菌數據(表2)將持續頻率高估約5倍(表2)，轉化的持續細胞頻率為1-2％和3-5％的伯氏疏螺旋體對數期和穩定期培養物仍然表明與伯氏疏螺旋體的更高持續頻率。這可以反映它們形成滯留物的能力，生物體的生長速度，當加入抗生素時的培養時間以及影響在傳代培養期間攜帶的持留菌數量的稀釋因子之間的差異。此外，已經發現持續頻率根據所使用的抗生素而變化，更有效的抗生素頭孢曲松具有比阿莫西林更低的持續頻率(表2)，這與先前的研究一致(zhang，2014；lu和zhang，2007)。如果伯氏疏螺旋體菌株的高持續頻率與抗生素療法的頑固性相關，如何確定伯氏疏螺旋體菌株的持久性是否存在差異。
總之，已經發現，隨著培養物從對數期到穩定期的老化，具有從螺旋形式到圓形體和小菌落形式的形態學變化，具有增加的抗生素耐受性的體外伯氏疏螺旋體的層級。根據通過sybrgreeni/碘化丙錠(pi)活力染色和顯微鏡計數測量的抗生素，使用大腸桿菌作為對照，對數期伯氏疏螺旋體培養物中的滯留頻率範圍為5.8-9.6％，但校正的對數期伯氏疏螺旋體持留菌株頻率為1-2％。為了更有效地根除耐受多西環素或阿莫西林的這些持久形式菌落，使用來自fda批准的藥物文庫的先前鑑定的藥物研究藥物組合，所述藥物文庫具有針對伯氏疏螺旋體耐藥的高活性。使用sybrgreen/pi生存力測定，含達託黴素的藥物組合對殺死伯氏疏螺旋體是最有效的。在研究的組合中，當與多西環素加β-內醯胺(頭孢哌酮或羧苄青黴素)或能量抑制劑(氯法齊明)一起使用時，達託黴素是對抗持久劑的最活躍方案中的常見元素。達託黴素加多西環素和頭孢哌酮根除了伯氏疏螺旋體存活菌的最具抵抗力的小菌落形式，並且在繼代培養後不產生活的螺旋體，表明這些持續形式的持久殺滅效果，這是任何其他兩種或三種藥物組合都不能實現的。如果持續性生物體或碎屑引起常規治療不能解決的症狀，這些發現可能對具有頑固持續症狀或抗生素-難治性關節炎的萊姆病患者的治療有影響。
實施例3
有效抗伯氏疏螺旋體持留菌的圓形體形式的fda批准的藥物
材料和方法
菌株、培養基和培養物：從美國典型培養物保藏中心獲得的伯氏疏螺旋體菌株b31。伯氏疏螺旋體在具有6％兔血清(sigma-aldrich，co)的bsk-h培養基(himedialaboratoriespvt.ltd)中培養。所有培養基通過0.2μm過濾器進行過濾滅菌。培養物在33℃無抗生素的條件下，在無菌的50ml密閉錐形管(bdbiosciences，california，usa)中進行孵育。
伯氏疏螺旋體的圓形體形式的誘導：為了誘導伯氏疏螺旋體的圓形體形式，伯氏疏螺旋體(1×105螺旋體/毫升)在bks-h培養基中不振蕩培養6天。在孵育6天後，將終濃度為50μg/ml的阿莫西林加入到培養物中以進行圓形體形式的誘導。在33℃誘導72小時後，伯氏疏螺旋體的圓形體形式可通過顯微的鏡進行檢查。將圓形體細胞(100μl)轉移到96孔組織培養微孔反應板中以進行抗生素治療效果評價。
顯微鏡技術：在配備微分幹涉差(dic)和落射式螢光照明的nikoneclipsee800顯微鏡上檢查樣品，並用點滑塊彩色相機記錄。通過使用細菌計數室(hausserscientificpartnership，pa，usa)和dic顯微鏡的直接計數進行細胞增殖試驗。採用sybrgreeni/pi螢光檢測法(feng、wang、shi等人，2014)以測定伯氏疏螺旋體的生存力。存活的(綠色)伯氏疏螺旋體和死亡的(紅色)伯氏疏螺旋體的比例通過使用細菌計數室和螢光顯微鏡進行計數而計算得到。
抗生素和fda藥物庫：多西環素、甲硝唑、頭孢美唑、吡咯烷甲基四環素、磺胺氯噠嗪、青蒿素、頭孢哌酮、達託黴素(sigma-aldrich)溶解在合適的溶劑(wikler和ferraro，2008)中以形成儲備溶液。抗生素儲備液通過0.2μm過濾器進行過濾滅菌。然後將儲備液預稀釋成500μm的預稀釋儲備液中並在-20℃下儲存。
將jhcclfda批准的藥物庫(ricker等人，2011)中的每種藥物製成10mm含有二甲基亞碸的儲備溶液。將儲備溶液排列在總數為24的96孔板中，留取每個板中的第一列和最後一列作為對照。將這些主板中的每種溶液用pbs稀釋以製備500μm的預稀釋工作儲備板。將每個預稀釋板中的第一列和最後一列設置為空白對照、多西環素對照和阿莫西林對照。將預稀釋的藥物儲備板密封並在-20℃下儲存。
抗生素敏感性試驗：為了定性測定抗生素的效果，來自預稀釋板或預稀釋儲備液的10μl的每一化合物(終濃度為50μm)被添加至96孔板中的圓形體形式或穩定期的伯氏疏螺旋體培養物中。將每一孔的最終體積調節至100μl。將孔板密封並置於33℃孵育箱中7天。sybrgreeni/pi螢光檢測法的生存力測定被用於評估暴露於如前所述的抗生素後的活細胞和死細胞(feng、wang、shi等人，2014)。簡言之，將10μl的sybrgreeni(10000×原液，invitrogen)與30μl碘化丙啶(pi，20mm，sigma-aldrich)在1.0ml無菌蒸餾水中混合。然後，在每一孔中加入10μl染色混合物並充分混合。將板在室溫下暗處孵育15分鐘，隨後在485nm的激發波長和535nm(綠光發射)和635nm(紅光發射)的螢光強度下，在酶標儀(hts7000plusbioassayreader，perkinelmerinc.，usa)中進行讀板。採用最小二乘擬合分析、回歸方程和回歸曲線，獲得活細菌和死細菌的百分比之間的關係，如綠色/紅色螢光比所示。使用回歸方程計算96孔板的每個孔中的活細胞的百分比。
結果
通過阿莫西林誘導伯氏疏螺旋體的圓形體形式：β-內醯胺抗生素是用於治療萊姆病的最常用的前線藥物，但有趣的是可以誘導伯氏疏螺旋體的螺旋體形成圓形體，其對萊姆抗生素具有抵抗力(brorson等人，2009；sapi等人，2011)。為了鑑定fda批准的藥物針對伯氏疏螺旋體的圓形體形式的活性，評估了用於誘導圓形體形式的最佳條件。研究發現6天或更長時間的培養物完全不能被誘導成圓形體形式，甚至採用100μg/ml的阿莫西林也不行(圖19d)。研究發現用於fda藥物庫篩選的圓形體的最佳生產條件為：用50μg/ml阿莫西林處理72小時的5天伯氏疏螺旋體培養物。顯微鏡檢查顯示，在上述誘導條件下，高達約96％的伯氏疏螺旋體的螺旋體形式可通過阿莫西林誘導成圓形體形式(圖19a)。為了證實誘導的圓形體形式仍然存活，在新鮮bsk-h培養基中進行傳代培養試驗。通過離心分離收集圓形體(在500μl培養物中)，並用1ml新鮮bsk-h培養基進行衝洗，隨後再懸浮於500μl新鮮bsk-h培養基中。然後，將50μl細胞懸浮液轉移至1ml新鮮bsk-h培養基中，在33℃下傳代培養5天。顯微鏡分析顯示，在5天傳代培養後，阿莫西林誘導的伯氏疏螺旋體的圓形體形式可在bsk-h培養基中恢復成螺旋體形式(高達95％)(圖19)，這表明誘導圓形體形式以及耐受阿莫西林治療是完全可行的。
為了比較伯氏疏螺旋體的圓形體形式與螺旋體形式的抗生素敏感性，在5天育齡的螺旋體形式上和阿莫西林誘導的伯氏疏螺旋體的圓形體形式上測試了常用的萊姆病抗生素多西環素、頭孢呋辛和頭孢曲松。結果顯示，伯氏疏螺旋體的圓形體形式比螺旋體形式更耐受或抵抗抗生素(圖20)。隨後將阿莫西林誘導的圓形體形式用於如下所述的藥物篩選。
篩選針對伯氏疏螺旋體的圓形體形式有效的藥物：在先前的研究中，開發了sybrgreeni/pi螢光檢測法，其可作為用於對伯氏疏螺旋體的快速生存力評估的高通量篩選方法(feng，wang，shi等人，2014)。在本研究中，這種快速的sybrgreeni/pi螢光檢測法通過使用fda批准的藥物庫用於鑑定具有針對伯氏疏螺旋體持留菌的圓形體形式的活性的藥物。由於甲硝唑已顯示出能夠殺死伯氏疏螺旋體的圓形體形式(amant等人，2012)，甲硝唑和多西環素作為對照藥物包括在篩選中。在初始篩選中，選擇有效目標物，其殘留活細胞比率低於阿莫西林對照的殘留活細胞比率。選擇目標化合物用於進一步的篩選，隨後通過顯微鏡計數以驗證篩選結果。通過sybrgreeni/pi螢光檢測法的螢光顯微鏡計數進一步驗證了有效藥物的候選物(數據未顯示)。在1582個fda批准的藥物測試中，發現23種藥物具有比多西環素更高的針對伯氏疏螺旋體的圓形體形式的活性(表5)。在23種目標物中的活性高於多西環素的11種藥物，以遞減的活性順序，達託黴素、青蒿素、環丙沙星、磺胺醋醯、磺胺甲氧嗪、硝呋醛肟、磷黴素、金黴素、磺胺噻唑、氯法齊明和頭孢甲肟，比已知的圓形體活性抗生素甲硝唑或或替硝唑具有更好的活性(表5)。抗瘧疾藥物青蒿素顯示出針對伯氏疏螺旋體的圓形體形式的高活性。有趣的是，環丙沙星(殘留活細胞為28％)在喹諾酮類藥物左氧氟沙星41％，諾氟沙星41％和莫西沙星49％(未顯示)中活性是最高的。此外，針對圓形體形式，金黴素、甲氯環素和吡咯烷甲基四環素的活性高於多西環素(殘留活細胞為42％)(表5)。另一方面，一些細胞壁抑制劑，如萬古黴素和大環內酯類抗生素卡波黴素，在以前的研究中對穩定期伯氏疏螺旋體有合理的活性(feng，wang，shi等人，2014)，其顯示對伯氏疏螺旋體的圓形體形式相對較弱的活性，分別具有38％和43％的殘留活細胞(數據未顯示)。
表5.伯氏疏螺旋體a的圓形體形式具有良好活性的前23種活性目物的活性
a：來自採用fda批准的藥物(50μm)處理7天的7天育齡培養物的伯氏疏螺旋體的圓形體形式；替硝唑下面的線以上的藥物是指用於治療萊姆病的抗生素；
b：根據通過sybrgreeni/pi螢光檢測法獲得的回歸方程和綠色/紅色螢光的比例來計算殘留存活的伯氏疏螺旋體；
c：將選擇的抗生素處理的樣品，與作為對照的阿莫西林處理的樣品相比，計算標準t-檢驗的p-值。
d：粗體表示針對圓形體形式具有比甲硝唑或替硝唑更好的活性的11種藥物候選物，以遞減的活性順序。
圓形體活性抗生素的mic值：在先前的研究中，發現抗生素針對非生長持留菌的活性並不總是與其針對生長的伯氏疏螺旋體的活性相關(feng，wang，shi等人，2014)。因此，具有優異活性的青蒿素和環丙沙星的mic值通過使用sybrgreeni/pi螢光檢測法和顯微鏡計數針對伯氏疏螺旋體的圓形體形式進行測試。青蒿素的mic值可高達50～100μg/ml，這表明青蒿素針對生長的伯氏疏螺旋體的活性低得多，儘管其具有針對非生長的伯氏疏螺旋體的圓形體形式的高活性。相比之下，環丙沙星針對生長的伯氏疏螺旋體具有相當的活性，且具有低的mic值(0.8～1.6μg/ml)，這與先前的研究(kraiczy等人，2001)一致，這表明其針對生長的和非生長的伯氏疏螺旋體的圓形體形式具有相當的活性。
藥物組合物對圓形體形式和穩定期的伯氏疏螺旋體持留菌的影響：在先前的研究中(feng，wang，shi等人，2014)，發現穩定期培養物富含形態變體，例如圓形體形式和生物膜樣聚集的微集落形式。這些形態變體形式的伯氏疏螺旋體具有不同的抗生素敏感性(brorson等人，2009；sapi等人，2011)，最近的研究表明，與單一藥物相比，藥物組合物能更有效地殺滅伯氏疏螺旋體(feng等人，提交)。為了鑑定來自上述篩選的活性目標物中針對伯氏疏螺旋體的圓形體形式的最佳藥物組合物，評估了一些活性目標物對對圓形體形式和穩定期的伯氏疏螺旋體培養物的影響，所述活性目標物包括青蒿素、頭孢美唑和磺胺氯噠嗪與目前持留菌篩選中有希望的fda批准的藥物達託黴素或頭孢哌酮的組合物(feng，wang，shi等人，2014)，以及與目前的萊姆抗生素多西環素的組合物。結果顯示，藥物組合比這些藥物中的任一單一藥物均更有效(表6，圖22)。總體上，對於測試藥物或藥物組合物，圓形體形式比10天育齡的富含更多的抗性小菌落形式的穩定期培養物更易受影響(表6)。值得注意的是，抗瘧藥物青蒿素與其他藥物組合時突出表現為針對穩定期的伯氏疏螺旋體持留菌的最佳活性。例如，青蒿素與多西環素和頭孢哌酮的組合針對穩定期的伯氏疏螺旋體持留菌顯示出顯著的活性(表6，圖22o)。針對伯氏疏螺旋體的圓形體形式，頭孢甲肟和頭孢美唑在測試的少數頭孢菌素藥物中是最有效的。此外，注意到當磺胺類藥物磺胺氯噠嗪與達託黴素和多西環素組合時，顯示針對伯氏疏螺旋體持留菌的顯著的活性(圖22n)。再者，磺胺氯噠嗪與多西環素和達託黴素的組合顯示出針對伯氏疏螺旋體的圓形體形式的最佳活性(表6)。
表6.物合物伯氏疏螺旋體的圓形體形式和穩定期培養育齡)的影響
採用10μg/ml的藥物或其組合物處理圓形體形式和10日齡的穩定期(括號內)的伯氏疏螺旋體7天。根據通過前述的sybrgreeni/pi螢光檢測法(feng，wang，shi等人，2014)獲得的回歸方程和綠色/紅色螢光的比例來計算殘留存活的伯氏疏螺旋體。使用直接顯微鏡計數來校正sybrgreeni/pi螢光檢測方的結果。低於30％的殘留存活率以粗體顯示，以及沒有達託黴素的最佳藥物組合物用下劃線表示。縮寫：dox、多西環素；cefp、頭孢哌酮；dap、達託黴素；cefm、頭孢美唑；scp、磺胺氯噠嗪；art，青蒿素；nft、呋喃妥因。
為了證實藥物組合物的結果，在如先前研究(feng等人，發表)中所述的新鮮bsk-h培養基中進行傳代培養研究，發現無藥物的圓形體對照和用單一藥物處理的樣品在10天的傳代培養中生長(表7)。採用用兩種藥物的組合物處理的樣品生長更慢(表7)。然而，在10天的傳代培養後，三種藥物的組合物，例如多西環素+達託黴素+頭孢哌酮或青蒿素或磺胺氯噠嗪沒有顯示任何生長跡象，因為沒有觀察到任何可見的螺旋體，而其他藥物組合物在顯微鏡下都具有可見的活螺旋體(數據未示出)。在20天的傳代培養後，在對照樣品中有約8×106個螺旋體，在多西環素處理的樣品中有約5×106個螺旋體(表7)。單獨的達託黴素或兩種藥物的組合物多西環素+頭孢哌酮和多西環素+達託黴素不能對伯氏疏螺旋體持留菌的圓柱體形式進行滅菌，因為它們在20天的傳代培養後均具有生長可見的螺旋體(圖23)。然而，多西環素+達託黴素+青蒿素或磺胺氯噠嗪在20天的傳代培養後螺旋體的數量顯著減少，具有非常少的可見的螺旋體(圖23)。達託黴素與多西環素和頭孢哌酮的組物合仍顯示具有最佳活性，其殺死所有伯氏疏螺旋體持留菌的圓形體形式，在20天的傳代培養後觀察不到任何活的螺旋體(圖23)。
表7.傳代培養試驗以評估藥物處理的伯氏疏螺旋體a的圓形體形式的生存力
a：來自10μg/ml單一藥物或藥物組合物處理7天的阿莫西林誘導的伯氏疏螺旋體的圓形體形式(500μl))；然後，將50μl洗滌的細菌細胞在1ml新鮮bsk-h培養基中分別傳代培養10天和20天，並通過顯微鏡檢查；
b：縮寫：dox、多西環素；cefp、頭孢哌酮；dap、達託黴素；art，青蒿素；scp、磺胺氯噠嗪；
c：在sybrgreeni/pi螢光染色後，通過酶標儀獲得綠色/紅色螢光比，每個值是三次重複的平均值；
d：通過顯微鏡計數評價螺旋體的數量；
e：低於檢測限，如通過顯微鏡所示的沒有任何可見的螺旋體。
討論
先前的體外和體內研究表明，作為持留菌形式的伯氏疏螺旋體的圓形體形式可以在不利條件下存活，包括體外抗生素暴露，並且在體內慢性萊姆神經型病內發現(brorson和brorson，1998；miklossy等人，2008)。如先前的研究所示(brorson和brorson，1997；murgia和cinco，2004；brorson和brorson，1998)，並且在這項研究中，伯氏疏螺旋體的圓形體形式仍然可以在適當的條件下，基於在傳代培養中應力的消除，可再生並恢復到螺旋體形式。伯氏疏螺旋體的圓形體形式顯示較低的代謝活性，並且耐受抗生素(brorson等人，2009；kersten等人，1995；barthold等人，2010)。雖然據報導甲硝唑、替硝唑和替加環素針對圓形體形式具有一定的活性，但它們不能完全根除這些持留菌形式(sapi等人，2011)。因此，沒有可供使用的良好的針對伯氏疏螺旋體的圓形體形式的抗生素(brorson等人，2009；barthold等人，2010)。這些研究表明，使用當前的抗生素難以殺死伯氏疏螺旋體的圓形體形式。
在本研究中，這個問題的解決方式為：首先建立阿莫西林誘導伯氏疏螺旋體持留菌的圓形體形式，然後以針對伯氏疏螺旋體持留菌的圓形體形式篩選fda批准的藥物庫中的活性藥物。針對伯氏疏螺旋體持留菌的圓形體形式，11種候選藥物被認為比甲硝唑或替硝唑具有更好的活性(表5)，對照藥物是已知的針對圓形體形式具有活性的藥物(sapi等人，2011；brorson和brorson，1999)。
在先前的研究中，鑑定了幾種藥物，其顯示來自fda批准的藥物庫針對穩定期伯氏疏螺旋體持留菌的優異活性(feng，wang，shi等人，2014)。針對穩定期伯氏疏螺旋體持留菌的一些目標物在本篩選中針對圓形體形式也被鑑定，例如達託黴素、氯法齊明和磺胺類藥物，這驗證了先前發現的這些試劑對持留菌形式具有活性。重要的是，發現一些針對伯氏疏螺旋體持留菌的圓形體形式的活性抗生素，其在先前的藥物篩選中並沒有顯示對穩定期伯氏疏螺旋體持留菌具有良好的活性(feng，wang，shi等人，2014)。這些活性抗生素包括青蒿素、環丙沙星、硝呋醛肟、磷黴素、替硝唑、氯碳頭孢和百裡香酚，其顯示出針對圓形體形式的特異活性。這些候選藥物是被fda批准的並用於治療萊姆病以外的感染。
正如在先前的研究中(feng，wang，shi等人，2014)，達託黴素仍然是針對伯氏疏螺旋體持留菌的圓形體形式最具活性的藥物。達託黴素殺死大多數浮遊的伯氏疏螺旋體的圓形體形式(圖21d)。達託黴素可能優先作用於伯氏疏螺旋體的圓形體形式的膜，其與積極生長的螺旋體形式的膜不同，因此使其對持留菌形式特別有效。已知達託黴素能破壞膜結構並引起快速去極化，從而消耗可能是持留菌形式存活所需的膜能量。
這項研究的一個有趣發現是觀察到的抗瘧藥青蒿素對伯氏疏螺旋體持留菌的圓形體形式具有優異的活性(圖21e)。值得注意的是，與最常用的抗生素相比，青蒿素在具有高的mic值(50-100μg/ml)同時對伯氏疏螺旋體持留菌的圓形體形式具有優良的活性。青蒿素是一種常用的從植物黃花蒿(一種中藥材)中分離的抗瘧藥物。青蒿素的作用機制尚不清楚。青蒿素的抗瘧活性可能涉及通過來自由瘧疾蟲消化的血紅蛋白的自由亞鐵離子活化內過氧化化物(wells等人，2009)。然而，在伯氏疏螺旋體培養物中亞鐵離子、血紅蛋白含量很低，所以內過氧化物的活化可能不是青蒿素活性針對伯氏疏螺旋體持留菌的圓形體形式的主要機制。對酵母的研究指出，青蒿素損害膜結構，並引起線粒體膜的去極化(wang，huang等人，2010；li等人，2005)。在這方面，它可能是青蒿素具有類似的破壞細菌膜的作用機制以作為針對伯氏疏螺旋體持留菌的圓形體形式的依據。值得注意的是，青蒿素已被用於治療萊姆病感染並發現是臨床有效的。青蒿素的有效性的原因被解釋為是由於其作用是針對巴貝蟲的協同感染，但很可能，青蒿素的臨床療效至少部分是由於本文所述的針對伯氏疏螺旋體持留菌的圓形體形式的活性。
先前發現達託黴素與多西環素和頭孢哌酮的組合物可最好地消除最耐藥的小菌落形式的持留菌(feng等人，提交)。在本研究中，發現青蒿素是與多西環素和頭孢哌酮的藥物組合物中達託黴素的最佳替代物，並且對持留菌的圓形體形式顯示出優異的活性(表6，圖22m)。此外，具有複雜的抗菌活性(包括膜破裂和去極化)的脂溶性抗生素氯法齊明(vanrensburg等人，1992；cholo等人，2012)顯示出對圓形體和穩定期持留菌均具有良好活性。基於對達託黴素、青蒿素和氯法齊明的這些發現，並且不希望受任何一個具體理論的束縛，提出膜破裂可能是殺滅伯氏疏螺旋體持留菌的較佳途徑。
除了篩選藥物中的名列前茅的目標物，許多磺胺類抗生素，如磺胺醋醯、磺胺甲氧嗪和磺胺喹惡啉，被發現對圓形體形式具有高活性(表5)。磺胺類抗生素在先前針對穩定期持留菌的藥物篩選中也被鑑定，並且顯示出低的mic值(＜0.2μg/ml)(feng，wang，shi等人，2014)。磺胺類藥物抑制葉酸合成中所需的對氨基苯甲酸的利用，其導致合成dna、甲硫氨酸、甘氨酸和甲醯基甲硫醯基轉移-rna所需的幾種酶的阻斷。值得注意的是，作為磺胺甲氧嗪類似物的磺胺氯噠嗪對穩定期伯氏疏螺旋體顯示出良好的活性(殘留活細胞為約38％)，並且當與達託黴素和多西環素組合時，顯示出對穩定期伯氏疏螺旋體的顯著活性(殘留活細胞為約8％)(表6)。因此認為，進一步研究伯氏疏螺旋體的圓形體形式的代謝變化可幫助理解磺胺類藥物針對伯氏疏螺旋體持留菌的作用機制。
除了先前發現的藥物(feng，wang，zhang等人，2014)，在本研究中發現一些針對伯氏疏螺旋體的圓形體形式具有極佳活性的新藥物。作為氟喹諾酮的環丙沙星已經顯示出針對體外伯氏疏螺旋體的活性，並且在72小時後可以用16μg/mlmbc(41.5μm)殺死接種物(kraiczy等人，2001)。目前已經公開了在其他喹諾酮類藥物中，環丙沙星是針對伯氏疏螺旋體的圓形體形式的最具活性的氟喹諾酮，但是在先前篩選中，環丙沙星未被鑑定為具有針對穩定期伯氏疏螺旋體持留菌的活性(feng，wang，shi等人，2014)，因為它未被記載在舊版本的fda藥物庫中。然而，單一的環丙沙星(50μm)在7天後不能完全殺死圓形體形式。這個結果表明，圓形體形式對抗生素的耐藥性或耐受性都超過了繁殖的伯氏疏螺旋體。另一方面，在先前的藥物篩選中，一些藥物，例如硝呋醛肟和百裡香酚在穩定期伯氏疏螺旋體上沒有顯示活性，但在本研究中對圓形體形式表現出良好的活性。這種針對圓形體形式的特異性活性與不同形態形式的生理學差異和/或這些藥物與用於誘導用於藥物篩選的圓形體形式的阿莫西林的協同活性相關。值得注意的是，金黴素比多西環素對圓形體形式更具活性，並且硝基呋喃衍生物硝呋醛肟比甲硝唑或替硝唑更具活性(表5)。這些發現可以表明在兩種情況下所涉及的側鏈可能已經賦予了對圓形體持留菌的額外活性。使用硝呋醛肟類似物的呋喃妥因(殘留活細胞為39％)對穩定期伯氏疏螺旋體的藥物組合試驗顯示呋喃妥因與頭孢哌酮的組合比單獨的每種藥物更有效(表6)。同樣，在圓形體形式的藥物篩選中，天然抗菌的百裡香酚與阿莫西林的組合顯示出良好的活性(殘留活細胞為34％)，但在先前的藥物篩選中，單獨的百裡香酚不能在穩定期伯氏疏螺旋體上產生作用(殘留活細胞為82％)。palaniappan等人報導百裡香酚可以降低大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對氨苄青黴素和青黴素的抗性(2010)。百裡香酚和β-內醯胺之間的這種協同活性可以解釋其針對伯氏疏螺旋體的圓形體形式的活性。這些結果表明，藥物組合物是一種抵抗伯氏疏螺旋體持留菌的有效方法。
然而，一些對穩定期伯氏疏螺旋體具有活性的藥物，如β-內醯胺、萬古黴素、鏈黴素和兩性黴素b(feng，wang，shi等人，2014)表5)。然而，注意到兩種頭孢菌素，頭孢甲肟和頭孢美唑，對伯氏疏螺旋體的圓形體形式顯示出良好的活性。在先前針對穩定期伯氏疏螺旋體的藥物篩選中，頭孢哌酮是用於殺死穩定期伯氏疏螺旋體的最佳頭孢菌素，其也對圓形體形式(未示出)具有一定的活性。需要進一步研究以進一步探索這些頭孢菌素的作用機制，這些頭孢菌素具有針對伯氏疏螺旋體持留菌的活性，這可能涉及細胞壁合成之外的範圍。萬古黴素是作用於細胞壁而不是作用於細胞膜(如達託黴素)的糖肽抗生素。對於阿莫西林處理的圓形體，沒有發現萬古黴素的良好活性，儘管其在之前的藥物篩選中對穩定期伯氏疏螺旋體顯示出相對良好的活性(feng，wang，shi等人，2014)。這可能是由於阿莫西林誘導的圓形體形式的細胞壁缺陷。
總之，這項研究代表了針對伯氏疏螺旋體持留菌的圓形體形式的第一個高通量藥物篩選，並確定了許多fda批准的抗生素，其顯示出對這種形式的優異活性。儘管藥物對穩定期持留菌和圓形體形式的持留菌有一些重疊，但是一些有趣的藥物候選物被鑑定為優先對圓形體形式的持留菌具有活性，包括青蒿素、環丙沙星、硝呋醛肟、磷黴素、金黴素以及一些第一次被發現對圓形體形式具有活性的磺胺類藥物。這些圓形體形式的有效藥物以適當的組合物形式可被用於消除持留現象，改善萊姆病持留形式的治療，包括抗生素難治性萊姆關節炎和綜合症。
實施例4
鑑定來自nci化合物收藏的針對伯氏疏螺旋體持留菌的具有高活性的新化合物
原料和方法
菌株、培養基和培養物：從美國典型培養物保藏中心獲得的伯氏疏螺旋體菌株b31(atcc35210)。伯氏疏螺旋體在具有6％兔血清(sigma-aldrich)的bsk-h培養基(himedialaboratoriespvt.ltd.)中培養。所有培養基通過0.2μm過濾器進行過濾滅菌。培養物在33℃無抗生素的條件下，在無菌的50ml密閉錐形管(bdbiosciences，california，usa)中進行孵育。基於展示穩定期培養物的抗生素耐受性的先前研究，選擇富含持留菌的7天育齡的穩定期伯氏疏螺旋體培養物用於在96孔微量滴定板中的藥物篩選(feng，wang，shi等人，2014)。
顯微鏡技術：在配備微分幹涉差(dic)和落射式螢光照明的zeissaxiolmagerm2顯微鏡上檢查樣品，並用hamamatsuorca-r2c10600相機記錄。通過使用細菌計數室(hausserscientificpartnership，pa，usa)和dic顯微鏡的直接計數進行細胞增殖試驗。採用如前所述的sybrgreeni/pi螢光檢測法以測定伯氏疏螺旋體的生存力(feng、wang、shi等人，2014)。存活的(綠色)伯氏疏螺旋體和死亡的(紅色)伯氏疏螺旋體的比例通過使用如前所述的細菌計數室和螢光顯微鏡的計數進行計算(feng、wang、shi等人，2014)。
抗生素和nci化學化合物庫：抗生素包括從sigma-aldrich購買的多西環素、阿莫西林和達託黴素，其溶解在合適的溶劑(clinicalandlaboratorystandardsinstitute(臨床實驗室標準化研究所)，2007)中以形成儲備溶液。所有的抗生素儲備液通過0.2μm過濾器進行過濾滅菌。然後將儲備液預稀釋成500μm的預稀釋儲備液中並在-20℃下儲存。
由多樣性集v(moody等，1978)、機制多樣性集ii(dtp-機制集信息，2015)和天然產物集iii(dtp-天然產物集信息，2015)組成的nci化合物庫集，由nationalcancerinstitutedevelopmentaltherapeuticprogram′sopencompoundrepository(國家癌症研究所發展治療程序的開放化合物庫)提供。這些nci化合物庫在96孔板中在含有二甲基亞碸的1mm儲備溶液中製備，留取每個板中的第一列和最後一列用於對照，包括二甲基亞碸空白對照，多西環素對照和阿莫西林對照。將預稀釋的藥物板密封並儲存在-20℃。
針對伯氏疏螺旋體穩定期持留菌的nci化合物庫篩選：為了定性測定化合物對伯氏疏螺旋體持留菌的作用，將來自預稀釋儲備液中的每種化合物(5μl)加入96孔微量滴定板中的7天育齡的伯氏疏螺旋體穩定期培養物中。將每孔的最終體積調整至100μl以在藥物篩選中實現50μm的最終藥物庫濃度。將板密封並置於33℃孵育箱中7天，此時細菌的生存力通過如先前研究中所述的sybrgreeni/pi螢光檢測法來評估(feng，wang，zhang等人，2014)。在485nm的激發波長下，使用spectramaxm2酶標儀(moleculardevicesinc.，usa)對篩選平板的每個孔進行535nm(綠光發射)和635nm(紅光發射)的螢光強度的測量。一些有效的候選物通過螢光顯微鏡進一步證實(feng，wang，zhang等人，2014)。
mic測定：使用標準微量稀釋法測定在72小時孵育期後抑制伯氏疏螺旋體可見生長的最小抑制濃度(mic)(sapi等人，2011；deveret等人，1992；boerner等人，1995)。將伯氏疏螺旋體細胞(1×105)接種到每孔含有90μl新鮮bsk-h培養基的96孔微型板的每個孔中。將每種稀釋的化合物(10μl)加入到培養物中。所有實驗一式三份進行。將96孔板密封並置於33℃的孵育箱中5天(feng，wang，shi等人，2014)。使用如前所述的sybrgreeni/pi螢光檢測法和細菌計數室在孵育後評估細胞增殖(feng，wang，shi等人，2014)。
介紹
為了確定能夠更有效地殺死伯氏螺旋體持留菌的藥物，目前已開發出使用sybrgreeni/碘化丙啶(pi)染色的新的活性檢測(feng，wang，zhang等人，2014)，其可實現針對穩定期伯氏疏螺旋體持留菌的fda批准的藥物庫篩選(feng，wang，zhang等人，2014)。採用這種高通量的檢測，鑑定了許多有趣的候選藥物，如達託黴素、氯法齊明、頭孢哌酮、卡波黴素，其對體外伯氏疏螺旋體持留菌具有極好的活性(feng，wang，shi等人，2014)。在先前的研究中，在所有的候選藥物中，發現達託黴素對伯氏疏螺旋體持留菌具有最高的活性。儘管達託黴素在50μm下幾乎可以根除伯氏疏螺旋體持留菌，但此藥物濃度在臨床使用中是相當高的，此外，達託黴素通常被用於靜脈注射，這不方便管理。
為了鑑定在殺死伯氏疏螺旋體持留菌方面，比達託黴素更有效的新的藥物，在此實施例中，針對穩定期伯氏疏螺旋體持留菌的新的藥物篩選通過使用美國國家癌症研究所的化學庫集進行(nci化合物庫集)。此nci化合物庫集有三個化合物庫：多樣性集iv化合物庫(1593種化合物)、機制集ii庫(816種化合物)和天然產物集iii庫(117種化合物)，共有2526種化合物。這些化合物是基於250000多個天然產品和人工合成的化合物中的結構的多樣性而選擇的(openrepositorycollectionofsyntheticsandpurenaturalproducts(合成和純天然產品的開放性保藏庫)，2014)。通過篩選nci化合物庫集，新的抗持留菌化合物被確定，此在先前的篩選中並未被發現(feng，wang，shi等人，2014)。這些新的持留菌活性目標物可用於萊姆病的治療。
結果
篩選nci化合物庫以鑑定針對靜止期伯氏疏螺旋體具有活性的有效藥物：在暴露於化合物庫後，使用sybrgreeni/pi螢光檢測法作為用於伯氏疏螺旋體快速生存力評估的高通量篩選方法(feng，wang，shi等人，2014)。基於先前的研究，一些紅色染色的化合物造成了sybrgreeni/pi螢光檢測法的幹擾，這可能導致底色為紅色並導致假陽性結果。因此，在本發明公開的主題中，進行顯微計數篩選以檢查sybrgreeni/pi螢光檢測法中的目標化合物。
為了鑑定針對伯氏疏螺旋體持留菌具有活性的有效化合物，使用穩定期伯氏疏螺旋體作為篩選nci化合物庫的持留菌模型。同時，將目前使用的萊姆病抗生素多西環素和阿莫西林作為對照藥物。與先前的結果一致(feng，wang，shi等人，2014)，目前使用的萊姆抗生素對穩定期伯氏疏螺旋體持留菌的活性較差，與無藥物對照中的93％活細胞相比，使用用兩種抗生素處理的細菌分別仍有75％和76％的殘留活細胞(表8)。
在所測試的nci化合物庫集中的2526種化合物中，發現237種在初級篩選中針對伯氏疏螺旋體持留菌具有比多西環素和阿莫西林更高的的活性。通過使用sybrgreeni/pi生存力測定的顯微鏡計數來重新篩選這237個候選物。在通過顯微鏡的再篩選之後，前30種活性目標物在經過處理後具有小於50％的殘留活細胞(表8，圖24)。在這30種活性目標物中，發現22種化合物為機制集ii，9種化合物為多樣性集iv，3種化合物為天然產物集iii。七尾黴素和更生黴素同時出現在機制集ii和天然產物集iii中，以及nsc311153和nsc637578同時出現在機制集ii和多樣性集iv中。有趣的是，它們都是芳香族化合物。鑑定了幾種臨床使用的藥物，其對穩定期伯氏螺旋體持留菌具有優異的活性。一些藥物的抗持留菌活性顯著高於前述的抗生素多西環素或阿莫西林，並且甚至比達託黴素更有活性，達託黴素是在先前研究中針對伯氏疏螺旋體持留菌的最佳抗生素(表8，圖24)。6種蒽醌抗生素和化合物，道諾黴素3-肟、二甲基道諾黴素、柔紅黴素、nsc299187、nsc363998和諾加黴素顯示出針對穩定期伯氏疏螺旋體持留菌的最高活性(殘留活細胞從6％至15％)。這6種化合物顯示比達託黴素(18％殘留活細胞)更高的活性。此外，另外5種蒽醌化合物，吡咯黴素、紫紅黴素a，ncs316157，大黃素和nsc156516也顯示出對穩定期伯氏疏螺旋體持留菌的良好活性(殘留活細胞從21％至50％)。在6種蒽醌類化合物之後，派洛寧b，一種呫噸化合物強調其本身對穩定期伯氏疏螺旋體持留菌具有良好的活性(殘留活細胞為19％)。在30種活性化合物中，發現了7種含氮芳族化合物，nsc343783(殘留活細胞為20％)、靈菌紅素(殘留活細胞為24％)、nsc637578、nsc678917、nsc118832、nsc617570和nsc96932。此外，毛殼色菌素，雙萘-γ-吡喃酮化合物，顯示良好的活性，其殘留活細胞為22％。絲裂黴素，含氮丙啶的苯醌類抗腫瘤藥物，顯示相當好的活性，其殘留活細胞為25％。三-1，4-萘醌，七尾黴素(殘餘活細胞為26％)，ncs659997和ncs224124對穩定期伯氏疏螺旋體持留菌具有相對良好的活性。多肽抗生素更生黴素對穩定期伯氏疏螺旋體持留菌也具有相對高的活性(殘餘活細胞為30％)。除了11種臨床使用的藥物(道諾黴素3-肟、二甲基道諾黴素、柔紅黴素，諾加黴素，吡咯黴素，毛殼色菌素、靈菌紅素、絲裂黴素、七尾黴素、更生黴素)外，還發現19種非藥物化合物對穩定期伯氏疏螺旋體持留菌具有不同水平的良好活性(表8，圖24)。
表8.前30種對穩定期伯氏疏螺旋體持留菌a具有良好活性的活性目標的活性
a：來自藥物或化合物(50μm)處理7天的7天育齡的穩定期伯氏疏螺旋體培養物，此時細菌的生存力由如前所述的方法所確定(feng，wang，shi等人，2014)：
b：nsc編號是美國國家癌症研究所(nci)所提出的物質的數字編碼；
c：根據如前所述的sybrgreeni/pi螢光檢測法(feng，wang，shi等人，2014)獲得的回歸方程和綠色/紅色螢光的比例來計算殘留存活的伯氏疏螺旋體；
d：根據如前所述的螢光顯微鏡計數(feng，wang，shi等人，2014)測定殘留存活的伯氏疏螺旋體。
mic值和抗持留活性之間的關係：據發現一些化合物帶有良好的活性對抗非生長穩定期伯氏疏螺旋體持留菌(表8)，但是必須確定的是這些化合物的mic值對抗著伯氏疏螺旋體的生長(表9)。如先前研究中所述，使用標準微量稀釋法測定mic值(feng，wang，shi，eta1.，2014)。研究發現三蒽環類抗生素，道諾黴素3-肟，柔紅黴素和吡咯黴素，除了對抗穩定期伯氏疏螺旋體持留菌有良好的活性之外，也在低mic值(分別為＜0.36，0.36，0.36-0.72μg/ml)下對抗對數相生長伯氏疏螺旋體中有良好活性。另一種蒽醌化合物，nsc299187，雖然具有優秀的抗持久活性(殘留活細胞13％)，但展示了較高mic值(3.26-6.52μg/ml)。同時值得注意的是靈菌紅素(含氮芳環化合物)，絲裂黴素(含氮丙啶的苯醌)，萘諾黴素(1，4-萘醌)和更生黴素(多肽抗生素)在低mic值(分別為＜0.2，＜0.21，0.761.57，＜0.78μg/ml)下有很好的活性對抗複製伯氏疏螺旋體。在另一方面，pyroninb和chaetochromin對生長伯氏疏螺旋體在較高mic值下(分別為1.8-3.6，2.74-5.47μg/ml)效力較低，但具有優秀的抗持留活性。
表9.比較伯氏疏螺旋體的一些化合物的mic值和抗持留活性。
a.顯示為殘留活細胞百分比。
b.c的最大值來自於已發表的文獻。
低藥物濃度下抗持留活性的比較：雖然從具有50μm化合物篩的nci化合物庫中獲取高效的命中，但這種藥物濃度對於體內實驗可能太高。在以前的研究中，50μm的達託黴素顯示出對抗穩定期伯氏疏螺旋體持留菌有強力的活性(feng，wang，shi，eta1.，2014)，但不能在較低濃度下殺死伯氏疏螺旋體持留菌中的小菌落，例如10μg/ml(fengetal.2015，inpress)。為了進一步比較命中化合物和達託黴素的活性，在20μm藥物濃度下(大多數化合物為約10μg/ml，達託黴素為32μg/ml)，測試對抗穩定期伯氏疏螺旋體持留菌的活性。隨著藥物濃度的降低，穩定期伯氏疏螺旋體的大部分殘留活力百分比增加(表10，圖25)，但五蒽環黴素，二甲基地黴素，ncs363998，諾加黴素，吡咯黴素和rhodomycina，在20μm下仍顯示出對穩定期伯氏疏螺旋體持留菌的活性為50μm(表10，圖25)。其它非蒽環類化合物在20μm下顯示出比達託黴素更弱的活性。
表10.比較一些命中化合物在20μm和50μm下對穩定期伯氏疏螺旋體持留菌的活性
a.用藥物處理7天的穩定期伯氏疏螺旋體培養物7天。
b.根據回歸方程和通過sybrgreeni/pi測定獲得的綠色/紅色螢光比率計算的殘留存活伯氏疏螺旋體。
c.通過落射螢光顯微鏡計算測定的殘留活性伯氏疏螺旋體。
d.nsc編號是該物質提交給國家癌症研究所(nci)的數字標識符。
現有技術討論
最近已經鑑定了許多有趣的候選藥物，其對來自fda批准的藥物庫的非複製伯氏疏螺旋體持留菌具有優異的活性(feng，wang，shi，etal.，2014)。本研究的目的是使用nci化合物庫的收集來鑑定對伯氏疏螺旋體持留菌具有高活性的新化合物。從三個nci化合物庫的2526種化合物中，發現237種化合物比多菌靈或阿莫西林對伯氏疏螺旋體具有更高的活性，其中從通過顯微鏡再篩選確認了前30個活性命中。機械化合物庫的使用有助於鑑定蒽醌類藥物(蒽環類)，對伯氏疏螺旋體持留菌具有高活性。有趣的是，30種最具活性的化合物中超過三分之一具有蒽醌(也稱為蒽二酮或二氧代蒽)結構。前6種活性化合物，道諾黴素3-肟，二甲基地黴素，道諾黴素(柔紅黴素)，nsc299187，nsc363998和諾加黴素都是蒽醌衍生物，其特徵在於3個芳香環與苯醌在中心連接在一起。以前，蒽環類抗生素多柔比星的抗持留活性被發現(feng，wang，shi，etal.，2014)，但它被錯誤地排除在活性藥物之外，因為它幹擾了sybrgreeni/pi染色。然而，通過顯微鏡仔細檢查證實了紅色蒽醌藥物的抗持留活性，包括多柔比星。值得注意的是，並不是所有的紅色蒽醌化合物都具有良好的抗持留活性。例如，ncs156516具有弱的抗持留活性並顯示50％的殘留活(綠色)細胞(圖24)。因此，需要通過仔細的顯微鏡檢查，使用低濃度的化合物和傳代培養研究來評估化合物，具有紅色和具有抗伯氏疏螺旋體持留菌活性。
值得注意的是，具有6-15％殘留活細胞的前六種蒽醌化合物似乎甚至比達託黴素活性更高，達託黴素在sybrgreeni/pi生存力測定中具有18％的殘留活細胞(表8)。然而，由於任何單一藥物不可能殺死所有細菌群體，並且使用代理定位的生長和非生長持留菌的藥物組合需要在體外和在持續感染期間更有效地殺死異質細菌群體(zhang，2014)，所以有必要評價蒽醌組合與目前的萊姆抗生素針對更耐藥形式的伯氏疏螺旋體持留菌的功效包括包括小菌落和生物膜樣生長。最近已顯示，單獨的達託黴素不能殺死凝集形式的伯氏疏螺旋體持留菌，例如例如小菌落或生物膜樣結構，而達託黴素與多西環素和頭孢哌酮的組合，在沒有亞培養物的再生長下，能夠完全根除更具抗性的小菌落或生物膜樣結構(feng，etal.，2015，inpress)。因此，需要進一步的藥物組合和亞培養研究以確認前六種蒽醌化合物是否確實比達託黴素在體內和體外對伯氏疏螺旋體持留菌更有活性。
醌是一類從鏈黴菌中分離的天然存在的酚類化合物，並且具有不同的醫學用途，包括抗癌，抗瘧藥和輕瀉藥。蒽環類抗生素如道諾黴素，諾加黴素，吡咯黴素和紫紅黴素a用於某些癌症的化療，特別是幾種特定類型的白血病(tanetal.，1967)。據報導，蒽環黴素藥物對金黃色葡萄球菌具有抗菌活性，道諾黴素和多柔比星的mic分別為8-32μg/ml和0.12-0.5μg/ml(zhuetal.，2005)。道諾黴素對革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌，肺炎克雷伯菌和大腸桿菌沒有顯示殺菌活性(moodyetal.，1978)。這項研究是第一個證明這類化合物對生長和非生長形式的革蘭氏陰性伯氏疏螺旋體具有活性。然而，這類蒽醌化合物對伯氏疏螺旋體的作用機制尚不清楚，仍有待確定。蒽環類抗生素可通過插入dna/rna鏈的鹼基對來抑制dna和rna合成(mizunoetal.，1975)。此外，蒽環類抗生素可以穩定拓撲異構酶ii複合物，並防止拓撲異構酶ii從其核酸底物解離，導致dna損傷和阻斷dna轉錄和複製以及產生活性氧，其可能損傷線粒體並導致心臟毒性的副作用(jensenetal.，1993；pommieretal.，2010)。道諾黴素的糖部分在確定其抗癌活性中起關鍵作用(zhuetal.，2005)。在本研究中，發現具有糖結構的蒽環類抗生素和不具有糖結構的蒽醌化合物(ncs299187和ncs363998)都對伯氏疏螺旋體持留菌具有良好的活性。這些研究結果表明蒽醌藥物的作用機制在真核生物和伯氏疏螺旋體持留菌中的抗癌活性可能不是相同的。需要進一步的研究來確定蒽環類抗生素對伯氏疏螺旋體持留菌的作用機制，闡述了該類化合物對於伯氏疏螺旋體持留菌的結構活性關係，並且還研究了利用這類化合物的強抗持留活性而對宿主細胞沒有不利毒性的可能性。
除了蒽環類抗生素外，還發現一些1，4-萘醌，例如萘諾黴素，ncs659997和ncs224124，顯示出類似於蒽醌的高度相似的分子結構。納紫黴素可能干擾細菌細胞膜的功能並與細菌的呼吸鏈相互作用(hayashietal.，1982)，並且這種作用模式可以解釋其對伯氏疏螺旋體持留菌的活性。
據發現，毛殼菌色素由幾種毛殼菌產生的雙-萘並吡喃酮，也顯示出對穩定期伯氏疏螺旋體的高活性。雙萘並吡喃具有廣泛的生物活性，例如抑制線粒體中的atp合成，細胞增殖抑制，三醯基甘油合成抑制和抗微生物活性(luetal.，2014)。雙萘並吡喃對各種細菌如金黃色葡萄球菌，大腸桿菌和結核分枝桿菌具有活性，mic值範圍為2至50μg/ml(luetal.，2014)。atp合成的抑制可以解釋雙萘並吡喃酮對伯氏疏螺旋體持留菌的活性。頭孢菌素已顯示抑制脂肪酸生物合成(campbellandcronan，2001)。脂肪酸合成可能在伯氏疏螺旋體持留菌的構造中起作用，並且需要未來的研究以證實這種可能性。
在這項研究中，發現一些抗生素化合物，如紅藻毒素，絲裂黴素和更生黴素，對伯氏疏螺旋體持留菌具有合適的活性，儘管它們的活性(24-30％殘留活細胞)不如達託黴素(18％殘留活細胞)(表8)。洋甘菊苷是粘質沙雷氏菌的次級代謝產物，並且眾所周知具有抗菌，抗真菌，抗原生動物，抗瘧，免疫抑制和抗癌活性(williamsonetal.，2007)。絲裂黴素通過其氮丙啶官能團顯示其作為dna交聯劑的活性，並交聯dna雙螺旋的互補鏈以引起細菌細胞的死亡(szybalskiandiyer，1964；tomasz，1995)。絲裂黴素對伯氏疏螺旋體持留物的活性也可能是由於其dna交聯活性。更生黴素是從土壤細菌鏈黴菌(hollstein，1974)分離的多肽抗腫瘤抗生素，並且已知結合dna並幹擾dna複製(hollstein，1974)，並且還抑制rna轉錄(sobell，1985)。
此外，一些未研究的化合物，例如nsc343783和ncs311153，被發現在不同程度上對固定相伯氏疏螺旋體持留菌有效。這些新發現的有趣的化合物比當前的萊姆抗生素具有更多的抗持久活性，並且可以在將來作為引導進一步探索藥物開發和用於細菌持久性的機制研究。總之，蒽環類化合物和抗生素連同一些其它化合物，包括巖藻紅素，絲裂黴素，納諾黴素和更生黴素，已經被鑑定為對伯氏疏螺旋體持留菌具有優異的活性。蒽環類/蒽醌類化合物對伯氏疏螺旋體持留菌的結構活性關係和作用機制應該在未來的研究中解決。以蒽環類/蒽醌類化合物和目前的萊姆抗生素在體外和動物模型中根除伯氏疏螺旋體持留菌的藥物組合研究應該對改善萊姆病的治療具有價值。