細胞材料的乾粉的製作方法

2023-07-01 04:59:16 4

專利名稱：細胞材料的乾粉的製作方法
細胞材料的乾粉對相關申請的交叉引用本申請要求提交於2007年10月5日的美國申請流水號60/997923的優先權，將 該申請的全部內容以引用的方式併入本文中。背景病毒顆粒、細胞生物和其它膜被材料(membrane bound material)的乾燥形式 (dry form)在製藥與綜合醫療保健(general healthcare)工業中可以具有巨大的應用。 乾燥細胞形式(dry cellular form, DCF)展示了在長期儲藏、便於加工和運輸方面具有實 用性以供食品、農業和人類健康應用。DCF的示例包括供食品應用的乾酵母，冷凍保存細 胞(例如血細胞)和供基因遞送的全細胞(Trsic-Milanovic等，J. Serb. Chem. Soc. ,66 435-42，2001 ；Diniz-Mendes 等，Biotechnol. Bioeng.，65 :572_8，1999 ；以及 Seville 等， J. Gene Med.，4 :428_37，2002)。DCF通常通過兩種方法製備i)凍幹法(lyophilization)或冷凍乾燥，其涉及大 量乾燥所述細胞形式的水性懸浮液，或者ii)冷凍保存，其涉及將高水平的冷凍保護劑注 入水性細胞懸浮液中，並以規定的(prescribed)速率將所述懸浮液的溫度降低到0°C以下 以將細胞死亡降到最低。凍幹法(或冷凍乾燥)和冷凍保存的一個不利之處為難以以大容 量低成本製備DCF並同時保全(preserve)大部分細胞材料(Kirsop和Snell，編者，1984， Maintenance ofMicroorganisms AManual of Laboratory Methods, London, Academic Press)。兩個技術均受到跨脂質雙層膜的質量傳遞和相關的滲透應力(osmotic stress) 的限制。凍幹法用於商業製備卡介苗(BCG)疫苗。每年BCG通過注射施與數百萬新生嬰兒 以針對結核(TB)進行保護，結核是一種由稱為結核桿菌(tuberclebacillus)或結合分枝 木幹胃(Mycobacterium tuberculosis)白勺_胃弓Ife白勺雙_ (Roche Trends Microbiol.， 3 :397-401，1995)。當下，TB為第六大死亡原因，且其全球流行以預計每年3%的速率增長。 AIDS的出現與其和TB的聯繫招致對新疫苗的緊急需求的增加，這是因為BCG在人針對TB 感染的脆弱(vulnerability)期間內，通常為人的生命的前30年，僅為一般有效的(Fine， Lancet, 346 1339-1345，1995)。BCG缺乏效力的一個潛在原因為BCG在製成的DCF中的低 存活力。概述本發明部分基於下述噴霧乾燥細胞材料的新方法和組合物的發現，即所述材料展 現顯著的產品產率、高生物活性(例如，存活力)和良好的粉末加工性質。以一定比例含有 棒狀和球狀兩種顆粒的粉末綜合了載體和多孔顆粒系統(porous particle system)的益 處，並較之標準球形並具有類似幾何直徑的顆粒提供更好的分散(dispersion)和更高的 霧化(aerosolize)能力。這些性質提供了新的方法和組合物，其作為疫苗(例如，通過注 射、口服或吸入施用的疫苗)是有用的，並產生天然摻入幹細菌(如卡介苗(BCG))的配製 劑(formulation)，同時允許使用簡單且低成本的吸入器用於遞送氣霧劑(aerosol)。在一個方面，本發明的特徵在於包括球狀顆粒形式的賦形劑和棒狀顆粒形式的細胞材料的乾粉，其中按重量計所述粉末的70%或更多包含球狀顆粒，且按重量計所述粉末 的30%或更少包含棒狀顆粒。在多個實施方案中，所述細胞材料可包括細菌，例如結核分枝桿菌、恥垢分枝杆 菌(Mycobacterium smegmatis)細菌、卡介苗(BCG)細菌。所述賦形劑可為或包括亮氨 酸、甘露醇、海藻糖、葡聚糖、乳糖、蔗糖、山梨醇、白蛋白、甘油、乙醇或其混合物。所述棒 狀顆粒可具有約1-4 μ m的長度和200-400nm的直徑。所述球狀顆粒可具有約1_4 μ m的 平均幾何直徑。所述粉末可具有約2-3μπι的質量中值空氣動力學直徑(mass median aerodynamicdiameter) 0在一些實施方案中，所述粉末包含按重量計少於10%的水。這些乾粉可用於施用細胞材料、刺激針對細胞材料的免疫應答的方法，並通常用 作疫苗。在另一個方面，本發明包括方法，所述方法包括(a)測定要向患者施用的包含細 胞材料的乾粉的顆粒的幾何性狀(geometry)；並(b)若所述粉末包含按重量計70%或更 多球狀顆粒和按重量計30%或更少棒狀顆粒，則選擇所述乾粉作為供通過吸入施用的組合 物。在這些方法中，所述棒狀顆粒可包含細胞材料，如細菌，例如，本文所述的那些，且 可具有本文所述的尺寸。球狀顆粒亦可具有本文所述的尺寸。包含球狀與棒狀兩種顆粒的混合物的乾粉可包含按重量計60%或更多(例如， 70%或更多，80%或更多，85%或更多，90%或更多，95%或更多)的球狀顆粒和按重量 計40%或更少(例如，30%或更少，20%或更少，15%或更少，10%或更少，5%或更少) 的包括細胞材料的棒狀顆粒。在一些實施方案中，所述棒狀顆粒具有約0.5-10 μ m(例 如，約 1-10 μ m, 2-10 μ m, 4-10 μ m, 0. 5-8 μ m, 1-8 μ m, 2-8 μ m, 4-8 μ m, 0. 5-6 μ m, 1-6 μ m, 2-6 μ m，0· 5-4 μ m 或 1-4 μ m)的長度，以及約 IOO-IOOOnm (例如，約 100_800nm，100_600nm， 200-1000nm，200-800nm，200-600nm 或 200-400nm)的直徑。在一些實施方案中，所述球 狀顆粒具有約 0. 5-10 μ m(例如，約 1-10 μ m，1-8 μ m，1-5 μ m，1-4 μ m，1-3 μ m，3-10 μ m， 3_8μπι或3_5μπι)的平均幾何直徑。在一些實施方案中，所述乾粉具有約1_4μπι(例如， 約 1-3. 5 μ m，1-3 μ m, 1. 5-4 μ m, 1. 5-3. 5 μ m，L 5-3 μ m, 2-4 μ m, 2-3. 5 μ m 或 2-3 μ m)的質 量中值空氣動力學直徑。如本文所使用的術語「棒狀(rod-like) 」指具有至少為其寬度或直徑兩倍的長度 的顆粒或細胞材料，且大致具有圓柱形外觀。棒狀顆粒或細胞材料不必需具有平滑表面。如本文所使用的「球狀(sphere-like) 」顆粒或細胞材料的總體外觀為球，但不必 需為完美的球，且不必需具有平滑表面。舉例而言，橢球可視為球狀顆粒，只要其長度小於 兩倍寬度或直徑。在另一方面，本發明包括產生包含細胞材料的乾粉方法，所述方法通過如下進行 提供包括至少0. 01mg/ml (例如，至少0. 1，1，2，5，10，20，50，100或200mg/ml)賦形劑和至 少IO5單位/ml (例如，至少IO6, IO7, IO8, IO9或IO10單位/ml)細胞材料的水溶液，並將所 述溶液在下述條件下噴霧乾燥，即在所述條件下產生包括所述細胞材料(例如，棒狀細胞 材料)、與按重量計少於約10% (例如，少於約8%，5%，4%，3%，2%或)的水(例如， 游離水)的乾粉。在一些實施方案中，賦形劑質量對細胞材料單位數的比例為至少每單位 細胞材料 0. 25 皮克(picogram)賦形劑(例如，至少 0. 25，0. 5，1，2，5，10，20，50，100，200，500，1000，2000，5000，10，000或20，OOOpg賦形劑每單位細胞材料)。在一些實施方案中， 賦形劑質量對細胞材料質量的比例為至少0. 1 (例如，至少0. 25，0. 5，1，2，5，10，15，20，25， 30，40，50，100，200，500，1000或2000)。在一些其中所述細胞材料包括細菌(例如，棒狀細 菌(rod-shaped bacteria)或革蘭氏陽性細菌)的實施方案中，所述溶液不含添加的鹽或 冷凍保護劑。在一些其中所述細胞材料包括真核細胞(例如，哺乳類細胞)的實施方案中， 所述溶液可包含鹽或其它足以使滲透壓降到最低(minimize)的溶質。在一些實施方案中，所述溶液按乾重計包含至少10% (例如，至少25%，30%， 40%，50%，60%，70%，80%，90%，92%，94%，96%，98%，99%或更多)賦形劑。在一些 實施方案中，所述溶液包含少於IO10單位/ml (例如，少於IO9, IO8, IO7或IO6單位/ml)的 細胞材料。在一些實施方案中，所述細胞材料，例如，棒狀細胞材料，包括細菌(例如，分枝 桿菌屬(Mycobacterium)的細菌，例如，結核分枝桿菌，恥垢分歧桿菌，或卡介苗)，病毒， 真核微生物，哺乳動物細胞(例如，紅細胞，幹細胞，粒細胞，成纖維細胞或血小板)，膜被 細胞器(membrane-bound organelles)，月旨質體，基於膜的生物反應器(membrane-based bioreactor)或基於膜的藥物遞送系統。在一些實施方案中，所述賦形劑包括亮氨酸，甘露 醇，海藻糖，葡聚糖，乳糖，蔗糖，山梨醇，白蛋白，甘油，乙醇或其混合物。在一些實施方案 中，水溶液不含冷凍保護劑，例如，非賦形劑的冷凍保護劑。在一些實施方案中，所述方法進 一步包括將所述乾粉配製在藥物組合物中，例如，以供通過吸入施用。本發明亦包括由所述 新方法產生的包含細胞材料的乾粉。在另一方面，本發明包括噴霧乾燥細胞材料，例如，棒狀細胞材料，以通過降低滲 透應力而使對所述材料的損害減至最小。滲透應力可通過下述方法降低，即獲取待噴霧 乾燥的所述細胞材料單位(本文中亦稱為細胞)的半徑的初始值or(0))，選擇下述諸項 的值(i)噴霧乾燥器入口與出口氣體溫度的差異(ΔΤ)，(ii)平均小滴尺寸(average droplet size) (Rd)，(iii)溶劑汽化的潛熱(λ)，(iv)所述細胞材料的膜對冷凍保護劑的 液壓滲透性(hydraulicpermeability) (Lp), (ν)胞外溶質的摩爾數(Xes)，(vi)胞內溶質的 摩爾數(Xis), (vii)胞外冷凍保護劑的摩爾數(χ:)，(viii)冷凍保護劑的初始胞內濃度 (Cici(O))，和(ix)細胞數(n。ells)，使用所選值求解方程式36 且，若Re (t)在整個預期的乾燥時間內保持在最小與最大極限值之間，則使用所選 值的條件對所述細胞材料進行噴霧乾燥以使對所述材料的損害減為最小。在一些實施方案 中，所述方法亦包括確定預測的乾燥時間。乾燥時間的最小與最大極限值可經選擇而使對 所述材料的損害減為最小。舉例而言，所述最小極限值可設為在乾燥後所得半徑至少為初 始半徑的約60% (例如，至少70%，80%，90%，95%，98%或99% )。舉例而言，所述最大極限值可為初始半徑的至多160% (例如，至多140%，125%，110%，105%，102%或101%)。在一些實施方案中，所述細胞材料包括細菌(例如，分枝杆 菌屬的細菌，例如，結核分枝桿菌，恥垢分歧桿菌，或卡介苗)，病毒，真核微生物，哺乳動物 細胞(例如，紅細胞，幹細胞，粒細胞，成纖維細胞或血小板)，膜被細胞器，脂質體，基於膜 的生物反應器或基於膜的藥物遞送系統。在一些實施方案中，在噴霧乾燥之前即刻將所述 冷凍保護劑添加於所述細胞材料(例如，在所述細胞材料之內或之外)。在一些實施方案 中，所述方法進一步包括將所述乾粉配製到藥物組合物中，例如，以供通過吸入施用。本發 明亦包括由所述新方法產生的包含細胞材料的乾粉。在又一個方面，本發明包括乾粉，其具有少於約10% (例如，少於約8%，5%，4%， 3%，2%或1%)的水(例如，游離水)，細胞材料(例如，棒狀細胞材料)，和按乾重計至少 25 % (例如，至少 30 %，40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %，92 %，94 %，96 %，98 %，99 % 或 更多)的賦形劑(例如球狀顆粒賦形劑)的乾粉。在一些實施方案中，所述粉末通過噴霧 乾燥產生。在一些實施方案中，所述細胞材料包括細菌(例如，分枝桿菌屬的細菌，例如，結 核分枝桿菌，恥垢分歧桿菌，或卡介苗)，病毒，真核微生物，哺乳動物細胞(例如，紅細胞， 幹細胞，粒細胞，成纖維細胞或血小板)，膜被細胞器，脂質體，基於膜的生物反應器或基於 膜的藥物遞送系統。在一些實施方案中，賦形劑質量對細胞材料單位數的比例為至少0. 25pg賦形劑 每單位細胞材料(例如，至少 0. 25，0. 5，1，2，5，10，20，50，100，200，500，1000，2000，5000， 10000或20000pg賦形劑每單位細胞材料)。在一些實施方案中，賦形劑質量對細胞材料質 量的比例為至少 0. 1(例如，至少 0. 25，0. 5，1，2，5，10，15，20，25，30，40，50，100，200，500， 1000 或 2000)。在一些實施方案中，當所述粉末包含活細胞(例如，細菌)時，多於0.5% (例 如，1%，2%，4%，5%，6%，8%，10%，12%，15%，18%，20%，25%或更多)的細胞為存活 的。在一些實施方案中，在粉末中的活細胞在儲藏於高於0°C (例如，高於41，101，201， 251，301，401，或501)下超過 10 天(例如，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110 或 120 天)的時間後保留大於1/1000 (例如，大於1/500，1/200，1/100，1/50，1/20或1/10)的其 初始活性。在一些實施方案中，所述賦形劑包括亮氨酸，甘露醇，海藻糖，葡聚糖，乳糖，蔗糖， 山梨醇，白蛋白，甘油，乙醇或其混合物。在一些實施方案中，所述粉末不包括冷凍保護劑， 例如，添加的冷凍保護劑或顯著量的冷凍保護劑(例如，非賦形劑的冷凍保護劑)。在一些 實施方案中，所述粉末不包括鹽，例如，添加的鹽或顯著量的鹽。所述乾粉可配製為藥物組 合物，例如，以供通過吸入施用。本發明進一步包括產生包括少於約10% (例如，少於約8%，5%，4%，3%，2%或 1%)的水(例如，游離水)、和分枝桿菌屬細菌的乾粉的方法，所述方法通過如下進行，即 提供包含至少0. 01mg/ml (例如，至少0. 1，1，2，5，10，20，50，100或200mg/ml)的賦形劑和 至少IO5菌落形成單位/ml (例如，至少IO6, IO7, IO8, IO9或IO10菌落形成單位/ml)的分枝 桿菌屬細菌的水溶液，並將所述溶液在下述條件下噴霧乾燥，即在所述條件下產生包含少 於約10% (例如，少於約8%，5%，4%，3%，2%或1%)的水(例如，游離水)、和分枝桿菌 屬細菌的乾粉。在一些實施方案中，所述溶液包括至少0. 25pg賦形劑每菌落形成單位(例 如，至少0. 5，1，2，5，10，15，20，25，35或50pg賦形劑每菌落形成單位)的分枝桿菌屬細菌。在一些實施方案中，所述水溶液不含冷凍保護劑，例如，非賦形劑的冷凍保護劑。在一些實 施方案中，所述分枝桿菌屬的細菌為結核分枝桿菌，恥垢分枝桿菌，牛分枝桿菌(Mbovis)， 或卡介苗細菌。在一些實施方案中，所述方法進一步包括將所述乾粉配製到藥物組合物中， 例如，以供通過吸入施用，或在將所述粉末在藥學上可接受的液體載體中重建後通過注射 施用。本發明亦包括由所述新方法產生的包含分枝桿菌屬細菌的乾粉。在另一方面，本發明包括疫苗組合物，其包含具有少於約10% (例如，少於約8%， 5 %，4 %，3 %，2 %或1 % )的水(例如，游離水)，細胞材料(例如，棒狀細胞材料)，和按乾重 計至少 25% (例如，至少 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%或更多)的賦形劑(例如，球狀顆粒材料)的乾粉。在一些實施方案中，所述乾粉通過 本文所描述的方法產生。所述疫苗組合物可配製用於胃腸外或黏膜(例如，口服或吸入)施 用。在一些實施方案中，所述細胞材料包括細菌(例如，分枝桿菌屬的細菌，例如，結核分枝 桿菌，恥垢分枝桿菌，或卡介苗)，病毒，真核微生物，哺乳動物細胞(例如，紅細胞，幹細胞， 粒細胞，成纖維細胞或血小板)或膜被細胞器。疫苗組合物可包含一種或多種佐劑。在一 些實施方案中，將所述一種或多種佐劑與所述細胞材料一起噴霧乾燥以形成乾粉。在一些 實施方案中，將所述一種或多種佐劑與所述乾粉在其產生後混合。本發明亦包括將細胞材料向受試者施用的方法，其包括向受試者施用下述組合 物，即所述組合物包含本文所述的乾粉或由本文所述方法產生的乾粉。在一些實施方案中， 施用為通過吸入，口服攝入，或表皮，皮下或靜脈內注射進行的。本發明還包括刺激或誘導免疫應答的方法(例如，免疫的方法)，所述方法通過如 下進行，即通過向受試者(例如，人或動物)施用包含本文所述乾粉的疫苗組合物。在一些 實施方案中，所述乾粉是通過本文所述方法產生的。所述疫苗組合物可配製用於胃腸外或 黏膜(例如，口服或吸入)施用。在一些實施方案中，所述受試者為嬰兒，兒童或成人。在 一些實施方案中，所述細胞材料包括細菌(例如，分枝桿菌屬的細菌，例如，結核分枝桿菌， 恥垢分枝桿菌，或卡介苗)，病毒，真核微生物，哺乳動物細胞(例如，紅細胞，幹細胞，粒細 胞，成纖維細胞或血小板)或膜被細胞器。供免疫方法使用的疫苗組合物可包含一種或多 種佐劑。本方法亦包括本文所述的乾粉或由本文所述方法產生的乾粉治療多種疾病的用 途，或在藥物(例如，疫苗)製備中的用途。在進一步的方面，本發明包括儲藏本文所述乾粉的方法，所述方法通過將所述 粉末保持在高於凍結的溫度，例如，4°C -50 0C (例如，4°C -40°C,40C -30°C,4°C -20°C, 4°C -10°C,10°C -50°C, 10°C -40°C, 10°C -30°C )至少一天(例如，至少一周，兩周，三周，一 個月，兩個月，三個月，四個月，五個月，六個月，七個月，八個月，九個月，十個月，十一個月， 一年或更長)的時間段。在一些實施方案中，將所述乾粉保持在環境溫度下。在一些實施 方案中，所述乾粉由本文所述方法產生。在一些實施方案中，將所述乾粉配製為藥物或疫苗 組合物。在更進一步方面，本發明包括運輸藥物或疫苗組合物的方法，所述組合物包含具 有少於約10% (例如，少於約8%，5%，4%，3%，2%或1%)的水(例如，游離水)，細胞材 料，和按乾重計至少 25% (例如，至少 30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，92%，94%， 96%,98%,99%或更多)的賦形劑的乾粉。所述方法包括產生包含乾粉(例如，由本文所述
7方法產生的乾粉)的藥物或疫苗組合物，並將所述藥物或疫苗組合物或疫苗組合物以高於 凍結的溫度，例如，4°C -500C (例如 40C -400C，40C -300C，40C -200C，4°C -IO0C，10°C -500C， IO0C -40IO0C -300C )運輸。在一些實施方案中，所述藥物或疫苗組合物在環境溫度下 運輸。在另一方面，本發明包括乾粉遞送裝置用於向嬰兒遞送乾粉(例如，本文所述的 乾粉，藥物，疫苗，或由本文所述方法產生的乾粉)。所述裝置包含安慰器(pacifier)，其核 心含有主動或被動乾粉遞送系統。空氣流經所述乾粉系統，在該系統中使空氣充滿粉狀藥 物或疫苗。充滿粉狀藥物或疫苗的空氣通過進入口腔的乳頭裝置(參見圖24)或者通過進 入鼻腔的管狀裝置(參見圖25)排離安慰器。乾粉氣霧劑較之噴霧溶液的優勢在於它們可 更易於儲藏，通常以更高效率遞送於肺部，並允許遞送化學上更加複雜的物質。在另一方面，本發明包括用於組合物的經口遞送裝置(oral deliverydevice), 其包含安慰器，所述安慰器帶有塗覆在置於所述安慰器的乳頭上的口相容性帶(oral compatible tape)上或浸漬於置於所述安慰器的乳頭上的口相容性帶中的組合物(例如， 本文所述的乾粉，藥物，疫苗，或由本文所述方法產生的乾粉)。當嬰兒吮吸所述安慰器時， 來自他或她口中的唾液導致所述組合物溶解並經口攝入。在一些實施方案中，所述組合物 可製備為具有長效性質的可生物降解多聚物配製劑或藥物前體。在一些實施方案中，所述 帶可移除並丟棄，並於其位置放置新帶條。本文所描述的組合物包含具有兩個納米級尺寸的軸(例如，棒狀材料的寬度或直 徑)和微米尺寸的第三軸(例如，棒狀材料的長度)的顆粒；所述第三軸尺寸允許有效的類 微米物理分散(micrometer-like physical dispersion)，且前兩個尺寸使主要納米尺寸 顆粒軸與空氣流的方向能夠校直(alignment)。由此納米與微米級尺寸組合而形成的顆粒 較之標準球形各相同性形狀並具有相似幾何直徑的顆粒擁有更好的霧化能力。除非另行定義，本文所用的所有技術與科學術語與本發明所屬領域普通技術人員 通常理解的含意相同。雖然在本發明的實踐或測試中可使用類似於或等價於本文所述的方 法與材料的方法與材料，但是下面描述了合適的方法與材料。本文所提及的所有公開出版 物，專利申請，專利與其它參考文獻均以其全文引用的方式包含於本文中。當出現衝突時， 應以包括定義的本說明書為準。此外，所述材料，方法與實施例僅為說明所用，並無進行限 定的意圖。本發明的一個或多個實施方案的細節呈於下述附圖和描述中。本發明的其它特 徵，目標與益處從所述描述與圖、以及權利要求而言為顯而易見的。附圖詳述

圖1為描述由水包圍的細胞材料模型的概略圖。『表示所述細胞的半徑。Ces, Cecp, Cis與Cici分別表示胞外鹽濃度、胞外冷凍保護劑濃度、胞內鹽濃度與胞內冷凍保護劑濃度。圖2A為平行膜的二維描述。圖 2B 為凸坪邊界(convex plateau border)的二維描述。圖3為80 20Leu 恥垢分枝桿菌噴霧乾燥產物的電鏡顯微照片。圖4為95 5Leu 恥垢分枝桿菌噴霧乾燥產物的電鏡顯微照片。圖5為90 IOLeu 恥垢分枝桿菌噴霧乾燥產物的螢光顯微照片。使用的恥垢 分枝桿菌表達GFP並且在該顯微照片中顯示螢光。
圖6為95 5Leu 恥垢分枝桿菌在儲藏於25°C—周后的電鏡顯微照片。圖7為描述在下述條件下乾燥的小滴中相對細胞體積(V/X)的數值解的圖(a) 細胞內冷凍保護劑量較之細胞外為大；(b)無冷凍保護劑；(c)細胞內外的冷凍保護劑等量。圖8為描述甘油和鹽因相似滲透應力而產生的對噴霧乾燥的恥垢分枝桿菌存活 力的作用的圖。圖9為描述恥垢分枝桿菌的存活率(viability yield)相對賦形劑(亮氨酸)溶 液在噴霧乾燥粉末中百分比的圖。圖10為描述對於50 50亮氨酸/恥垢分枝桿菌(smeg)粉末在三種儲藏條件下 恥垢分枝桿菌存活率的經時線性圖。圖11為描述對於95 5亮氨酸/恥垢分枝桿菌粉末在三種穩定條件下恥垢分枝 桿菌存活率的經時線性圖。所示結果為五次實驗的平均值。圖12A與12B為描述對於95 5亮氨酸/恥垢分枝桿菌粉末在三種穩定條件下， 包含或不包含單磷脂A時，恥垢分枝桿菌存活率的經時線性圖。圖13為描述在表面活性劑泰洛沙泊與Plur0niCTM-F68存在下噴霧乾燥的95 5 與50 50Leu 恥垢分枝桿菌的存活率的圖。圖14為描述牛分枝桿菌BCG在兩種儲藏條件下存活率的經時線性圖。圖15為活NIH 3T3胚胎小鼠成纖維細胞在噴霧乾燥一個月後的顯微照片。圖16A到16F為一組原代收穫大鼠心肌成纖維細胞在噴霧乾燥後第3日與第8日 的20X相差顯微照片圖像。圖17A到17F為一組NIH 3T3胚胎小鼠成纖維細胞在噴霧乾燥後第3日與第8日 的20X相差顯微照片圖像。圖18為具有擠壓啟動(squeeze actuation)的功能活性嬰兒乾粉吸入裝置的表 示圖。圖19為包括描述於圖18的吸入器和機電擠壓固定機械裝置從而允許所述吸入器
可靠並可重複啟動的體外啟動系統。圖20為95 5恥垢分枝桿菌L-亮氨酸粉末的電鏡顯微照片。棒狀恥垢分枝 桿菌細菌與球狀亮氨酸顆粒相關聯。[需更佳的清晰度/對比度，或放棄該圖]圖21為不同比例的亮氨酸恥垢分枝桿菌噴霧乾燥材料的質量中值空氣動力學 直徑(MMAD)的柱形圖。水平線表示在2. 3 μ m處噴霧乾燥的100%亮氨酸在2bar下測定的 幾何尺寸(d50)。圖22為在用細菌攻擊(challenge)用95 5顆粒或BCG溶液通過所示路徑免疫 的動物後，在肺和脾組織中的屍體剖檢中每ml組織勻漿中活細菌數(CFU/ml)的柱形圖。 未處理的對照(Unt. Ctl.)，用下述免疫的動物皮下2 X IO6CFU的BCG溶液(SC sol MED)， 皮內 2X IO6CFU 的 BCG 溶液(ID sol MED)，吹入 2X IO6CFU 的顆粒(Ins LPP MED)，皮下 2 X IO6CFU 的 95 5 顆粒(SC LPPMED)，皮下 2 X IO5CFU 的 BCG 溶液(SC sol LOW)，以及吹 入2X IO5CFU的95 5顆粒(Ins LPP LOW)。結果表示為平均值士標準偏差，對於每組η =6。圖23A-23D為一組在用細菌攻擊用95 5顆粒或BCG溶液通過所示路徑免疫的動物後的肺組織病理學顯微照片。未處理的對照(23A)，經下述免疫的動物皮下2X106CFU 的BCG溶液(23B)，皮下2 X IO6CFU的95 5顆粒(23C)，以及吹入2 X IO6CFU的95 5顆 粒(23D)。圖24為用於經口腔吸入的乾粉遞送系統的示意圖，所述系統包括安慰器外罩和 乾粉遞送系統。通過該裝置的空氣流方向如箭頭所示。圖25為用於經鼻腔吸入的乾粉遞送裝置的示意圖，所述裝置包括安慰器外罩和 乾粉遞送系統。通過該裝置的空氣流方向如箭頭所示。詳細描述本發明涉及用於製造乾燥細胞形式(DCF)的新組合物和方法。這些組合物和方 法促進細胞材料乾燥形式以大容量生產，並具有良好的加工特徵與細胞存活力。在優選 的實施方案中，所述細胞材料通過按乾重計通常為至少50% (例如，至少60 %，70%，80% 或90%)的初始賦形劑濃度進行乾燥。然而，在一些情況下，所述初始賦形劑濃度可低至 25%。這些賦形劑可以下述方式選擇或加工，所述方式使得所述細胞材料與冷凍保護劑一 起乾燥以減低所述乾燥過程中的滲透應力。本文所述的組合物方法可用於乾燥任何細胞材料，例如，與藥物，農業或食品應用 相關的細胞材料。在本文中「細胞材料」與「膜被材料」可互換使用，並指由脂雙層構成的 膜所包圍的材料。細胞材料的示例包括細菌(例如，革蘭氏陰性與革蘭氏陽性細菌，及其疫 苗形式)，膜被病毒(例如，HIV)，真核微生物(例如，酵母)，哺乳動物細胞(例如，血細胞 (例如，臍帶血細胞)，血小板，幹細胞，粒細胞，成纖維細胞，內皮細胞(例如，脈管內皮細 胞)，肌肉細胞，皮膚細胞，骨髓細胞與其它細胞)，膜被細胞器(例如，線粒體)，脂質體，基 於膜的生物反應器(Bosquillon 等，J. Control. Release, 99 =357-367,2004)與基於膜的藥 物遞送系統(Smith 等，Vaccine，21 :2805_12，2003)。細胞材料的進一步示例包括膜被病毒(例如，流感病毒，狂犬病病毒，痘苗病毒， 西尼羅河病毒(West Nile virus), HIV, HVJ(仙臺病毒)，B型肝炎病毒(HBV)，正痘病 毒(orthopoxvirus)(例如，天花病毒與痘苗病毒)，單純皰疹病毒(HSV)與其它皰疹病 毒)。其它示例性細胞材料的示例包括病毒性傳染病(例如，AIDS，AIDS相關綜合症(AIDS Related Complex)，水痘(varicella)，普通感冒，巨細胞病毒感染，科羅拉多蜱熱，登革熱， 伊波拉出血熱，流行性腮腺炎，手足口病，肝炎，單純皰疹，帶狀皰疹，人乳頭瘤病毒(HPV)， 流感(flu)，拉沙熱，麻疹，馬爾堡出血熱，傳染性單核細胞增多症，流行性腮腺炎，脊髓灰 質炎，進 亍個生多病灶腦白質病(progressivemultifocal leukencephalopathy),狂犬病， 風疹，SARS，天花(variola)，病毒性腦炎，病毒性胃腸炎，病毒性腦膜炎，病毒性肺炎，西尼 羅河病和黃熱病)的病原體，細菌性傳染病(例如，炭疽，細菌性腦膜炎，布魯菌病，彎曲 菌病，貓抓病，霍亂，白喉，流行性斑疹傷寒，淋病，膿皰病，軍團桿菌病，麻風病(Hansen氏 病)，鉤端螺旋體病，李斯特菌病，萊姆病，類鼻疽，抗甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)感 染，諾卡菌病，百日咳(whoopingcough)，鼠疫，肺炎球菌性肺炎，鸚鵡熱，Q熱，落基山斑疹 熱(RMSF)，沙門氏菌病，猩紅熱，志賀氏菌病，梅毒，破傷風，沙眼，結核，土拉菌病，傷寒， 斑疹傷寒以及尿道感染)的病原體，寄生蟲傳染病(例如，非洲錐蟲病，阿米巴病，蛔蟲 病，巴貝蟲病，恰加斯氏病(Chagas disease)，枝睪吸蟲病，隱孢子蟲病，囊尾蚴病，裂頭絛 蟲病，龍線蟲病(dracunculiasis)，棘球蚴病，蟯蟲病，肝片吸蟲病，薑片蟲病，絲蟲病，自生阿米巴感染，賈第蟲病，顎口線蟲病，膜殼絛蟲病，等孢子球蟲病，黑熱病，利什曼病，瘧 疾，後殖吸蟲病，蠅蛆病，盤尾絲蟲病，蝨病，蟯蟲感染，疥瘡，血吸蟲病，絛蟲病，弓蛔蟲病， 弓形體病，毛線蟲病(trichinellosis)，旋毛蟲病(trichinosis)，鞭蟲病與錐蟲病)的 病原體，以及真菌傳染病(例如，麴黴病，芽生菌病，念珠菌病(dandidiasis)，球孢子菌 病(doccidioidomycosis)，隱球菌病(cryptococcosis)，組織胞漿菌病與腳癬)的病原 體。此外，減弱的(例如營養缺陷的)版本的病原體與相關的可促進針對該病原體的免 疫的物質(例如，BCG與痘苗)可用於本文所述方法中，例如，用於疫苗生產(參見，例如， Sambandamurthy 等，Nat. Med.，9 9,2002 ；Hondalus 等，Infect. Immun. ,68 :2888_98，2000 ； 以及 Sampson 等，Infect. Immun. ,72 :3031_37，2004)。用於本文所述方法和組合物的賦形劑包括但不限於，相容性碳水化合物，天然和 合成多肽，胺基酸，表面活性劑，聚合物或其組合。通常的賦形劑對所乾燥的細胞材料的 膜會具有小於1.0的反射係數(例如，小於0. 9，0. 8，0. 7，0. 6，0. 5，0. 4，0. 3，0. 2或0. 1) (參見，例如，Adamski and Anderson, Biophys J. ,44 79-90,1983 ；以及 Janacek and Sigler，Physiol. Res. ,49 191-195，2000)。合適的碳水化合物包括單糖，例如半乳糖， D-甘露糖，山梨糖，葡萄糖(dextrose)等。亦可使用二糖，例如乳糖，海藻糖，麥芽糖，蔗 糖等。其它的賦形劑包括環糊精，例如2-羥丙基-β -環糊精；和多糖，例如棉子糖，麥芽 糊精，葡聚糖等；和糖醇，例如甘露醇，木糖醇，山梨醇等。合適的多肽包括二肽阿斯巴甜 (aspartame)。合適的胺基酸包括任何在標準藥物加工技術中形成粉末的天然存在的氨基 酸並包括非極性(疏水)胺基酸和極性(不帶電荷的，帶正電荷和帶負電荷的)胺基酸，這 些胺基酸通常被FDA認為是安全的(GRAS)。非極性胺基酸代表性的示例包括丙氨酸，異亮 氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，色氨酸和纈氨酸。極性、不帶電荷的胺基酸的代 表性示例包括半胱氨酸，穀氨醯胺，絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸。極性、帶正電荷的胺基酸的代 表性示例包括精氨酸，組氨酸和賴氨酸。帶負電荷的胺基酸的代表性示例包括天冬氨酸和 穀氨酸。合適的合成有機聚合物包括聚[1-(2_氧-1-吡咯烷基)乙烯]，亦即，聚維酮或 PVP。乾燥的組合物通常，細胞材料與相對少量的賦形劑一起乾燥，常常涉及凍結。在不進行凍結時， 所得的粉末趨向於包含顯著量的水，這是由於下述事實，即所述細胞材料，如不進行凍結， 無法乾燥至給定含水量以下(例如，按重量計大約40%的水)，且仍保持活性。具有良好加 工和穩定性質的乾燥的粉末通常需要按重量計少於10%，並優選少於5%的水。這是因為 較大的水組分導致在粉末顆粒之間顯著的毛細管力(capillary force)並從而使所述粉末 聚集。因而為獲取具有良好粉末加工和穩定性性質的DCF涉及用大量賦形劑進行噴霧幹 燥。具體而言，為獲取具有少於10%或5%總含水量的乾粉，應將按重量計至少25% (例 如，至少 30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，92%，94%，96%，98%，99% 或更多)的 賦形劑與所述細胞形式一起乾燥，產生含有相對較小重量份的細胞材料的乾粉，其儘管保 留足夠的水以維持活性，但對於粉末並不存在太多的水而損害所述粉末的總體加工性質。噴霧乾燥是食品工業、製藥工業和農業中使用的標準方法。在噴霧乾燥中，通過將 噴霧的小滴與乾燥介質(例如，空氣或氮氣)混合而使水分自霧化的進料(atomized feed) 蒸發。該過程使小滴中的揮發性物質乾燥，並留存「幹」顆粒的非揮發性組分，其尺寸、形態、密度和揮發物含量由乾燥過程所控制。進行噴霧的混合物可為溶劑，乳劑，懸浮液或分 散液。乾燥過程中的許多因素可影響幹顆粒的性質，包括噴嘴的類型，圓筒的尺寸，揮發 性溶液的流速和循環的氣體，以及環境條件(Sacchetti and Van Oort, SprayDrying and Supercritical Fluid Particle Generation Techniques, Glaxoffellcome Inc.,1996)。通常，噴霧乾燥的過程涉及四個步驟，將混合物分散為小滴，將噴霧與乾燥介質 (例如，空氣)混合，從噴霧中蒸發水分，並將乾產物從乾燥介質中分離(Sacchetti and Van Oort, Spray Drying and Supercritical Fluid ParticleGeneration Techniques, Glaxo Wellcome Inc. ，1996)。將混合物分散為小滴極大地增加了待乾燥體積的表面積，導致更加快速的乾燥過 程。通常，更高能量的分散導致獲得更小的小滴。所述分散可通過任何本領域已知方法達 成，包括壓力噴嘴(pressure nozzle)，氣動霧化噴嘴(two-fluid nozzle)，旋轉式霧化器 (rotary atomizer)禾口超聲噴嘴(Hinds, Aerosol Technology, 2nd Edition, New York, John Wiley and Sons，1999)。在一些實施方案中，所述混合物在低於200psi的壓力下噴 霧。在所述混合物分散(噴霧)後，將所得噴霧與乾燥介質(例如，空氣)混合。通 常，所述混合過程發生於加熱空氣的連續流中。所述熱空氣改善向所述噴霧小滴的熱轉移 並增加蒸發速率。在乾燥後空氣流可排到大氣中，或循化並重新利用。空氣流通常通過在 所述氣流任一端提供正和/或負壓來保持(S acchetti and Van Oort, Spray Drying and Supercritical Fluid ParticleGeneration Techniques, Glaxo Wellcome Inc.,1996)。當所述小滴與乾燥介質發生接觸時，蒸發迅速發生，這是由於所述小滴的比表面 積高且尺寸小。基於所述乾燥系統的性質，可在乾燥產物內保留殘餘水平的水分(Hinds， Aerosol Technology, 2ndEdition, New York, JohnWiley and Sons，1999)。所述產物隨即自所述乾燥介質分離。通常，所述產物的初步分離發生於幹 燥室的基部，且隨即使用，例如，旋風分離器(cyclone)、靜電沉積器(electrostatic precipitator)(scrubber)(Masters SprayDrying Handbook. Harlow，UK，Longman Scientific and Technical，1991)。終產物的性質，包括顆粒大小、最終溼度和收率取決於乾燥過程中的許多因素。 通常，調整參數如進氣溫度、空氣流速、液體進樣的流速、小滴大小和混合物濃度以產生所 期望的產物(Masters 等，Spray DryingHandbook, Harlow, UK, Longman Scientific and Technical，1991)。進氣溫度指加熱的乾燥介質(通常為空氣)如在流入乾燥室之前測量的溫度。通 常，進氣溫度可根據需要調整。所述乾燥介質在產物回收位點的溫度稱為出口溫度，且取決 於進氣溫度、乾燥介質流速和噴霧的混合物的性質。通常，更高的進氣溫度使得終產物中水 分的量減少(Sacchetti and VanOort, Spray Drying and Supercritical Fluid Particle Generation Techniques, Glaxo Wellcome Inc.，1996)0空氣流速涉及所述乾燥介質流經所述系統。所述空氣流可通過在所述噴霧乾燥 系統任一末端或在所述噴霧乾燥系統內保持正和/或負壓來提供。通常，較高空氣流速導 致所述顆粒在所述乾燥裝置中的較短停留時間(亦即，乾燥時間)並導致在終產物中較大 量的殘餘水分(Masters 等，Spray DryingHandbook, Harlow, UK, Longman Scientific andTechnical,1991)。所述液體進樣的流速指每單位時間遞送到所述乾燥室的液體量。所述液體的通過 量越高，則需要更多能量來將小滴蒸發成為顆粒。因而，較高流速導致較低輸出溫度。通常， 當保持進氣溫度和空氣流速常數恆定而降低流速時終產物的水分含量降低(Masters等， Spray Drying Handbook，Harlow，UK，Longman Scientific and Technical，1991)。小滴尺寸指由噴霧噴嘴分散的小滴的尺寸。通常，較小的小滴在終產物中提供較 低的水分含量與較小的顆粒尺寸(Hinds, Aerosol Technology, 2ndEdition, New York, John Wiley and Sons,1999)。待噴霧乾燥的混合物的濃度亦影響終產物。通常，較高的濃度導致終產物中較大 的顆粒尺寸，這是因為每噴霧的小滴含有更多材料(Sacchetti andVan Oort, Spray Drying and Supercritical Fluid Particle Generation Techniques, Glaxo Wellcome Inc., 1996)。噴霧乾燥系統為可商購的，例如，可購自Armfield，Inc. (Jackson,NJ),Brinkmann Instruments(Westbury, NY), BUCHI Analytical(New Castle, DE), Niro Inc (Columbia, MD), Sono-Tek Corporation(Milton, NY), Spray DryingSystems, Inc. (Randallstown, MD),以及 Labplant, Inc. (North Yorkshire, England)。噴霧乾燥粉末的最終水分含量可通過任何本領域已知方法來確定，例如，通過熱 重量分析。所述水分含量通過下述方法用熱重量分析確定，即加熱所述粉末，並測定在水分 蒸發過程中的質量損失(Maa等，Pharm. Res.，15 :5，1998)。通常，對含有細胞材料(例如，細 菌)的樣品，水將蒸發成兩相。第一相，稱為游離水，主要為幹賦形劑所含的水。第二相，稱 為結合水，主要為所述細胞材料所含的水。游離水和結合水二者均可經測量以確定所述粉 末是否在所述賦形劑或細胞材料中含有所期望的水分含量(Snyder等，Analytica Chimica Acta, 536 :283_293，2005)。在一些實施方案中，所述乾粉包括球狀和棒狀顆粒的混合物以形成有效的乾粉 氣霧劑作為有效吸入疫苗的基底。空氣播散的棒作為極小的顆粒可具有穿過空氣的能力 (而作為較大顆粒則表現為粉末形式)(Gonda等，Aerosol Sci. Tech.，4 =233-238,1985 ； Crowder 等，Pharm. Res.，19 :239_245，2002)，雖然有聚集的傾向(Hickey 等，Adv. Drug Del. Rev.，26 29-40,1997 ；Fults 等，Pharm. Dev. Tech.，2 :67_79，1997)。通過在粉末中保 持細菌的低重量濃度，賦形劑(例如，亮氨酸)可充當載體顆粒的角色，賦予與球狀亮氨酸 顆粒相關的流動性質。一旦播散於空氣中，所述細菌以棒狀結構優異的氣霧劑性質傳播。這 導致兼具載體和多孔顆粒系統的優勢的粉末。雖然大百分比的細菌妨礙氣霧劑的流動(吸 入器散布(inhaler emission))性質，但是小百分比則允許自所述吸入器的優異散布(如 由所述球狀亮氨酸顆粒所賦予)以及所期望的MMAD值(如由所述棒狀細菌顆粒所賦予)。 這導致形成下述配製劑，即其自然地摻入幹細菌，例如BCG，同時允許使用簡單且低成本的 吸入器以供遞送所述氣霧劑。在噴霧乾燥過程中降低滲透應力導入待噴霧乾燥的細胞溶液的賦形劑可以下述方式選擇和/或導入，即該方式使 對所述細胞材料膜的總體滲透應力最小化，並從而保持活性。儘管由於上述理由，保留所期 望的相對於細胞材料質量分率(mass fraction)的賦形劑質量分率是重要的，但是這些賦形劑的性質，以及在噴霧乾燥前導入它們的方法，對細胞存活亦是重要的，甚至是至關重要 的。對細胞材料，在噴霧乾燥圓筒中小滴的乾燥可視為類似於在標準冷凍保存過 程中對生物體的凍結，如圖 1 所示(James，"Maintenance of ParasiticProtozoa by Cryopreservation, "Maintenance of Microorganisms, AcademicPress, London,1984.)。當含生物體的小滴蒸發時，在小滴中(且在細胞外)的鹽濃度(Ces)相對於生物體 內的鹽濃度(Cis)會增加。其理由為細胞膜對於鹽的轉移而言為不可滲透的，但其對於水的 轉移是相對可滲透的。其結果為小滴的乾燥增加蒸發小滴中鹽的濃度，並對所述細胞膜形 成了滲透應力(由所述膜兩側鹽濃度的不平衡所造成)，其導致水被擠出細胞。該脫水過 程可視為所述膜試圖通過消除鹽濃度不平衡而機械地減少滲透應力的嘗試(Batycky等， Phil. Trans. Roy. Soc. Lond.，A355 :2459_88，1997)。在小滴蒸發過程中細胞材料的「脫水」與細胞材料發生凍結時產生的過程基本上 相同。過分脫水，如上所述，能夠裂解所述細胞材料，為避免如此，已開發了與冷凍保存領域 相關的技術，即使用冷凍保護劑和控制凍結與解凍循環。冷凍保護劑為藥理學上惰性的物 質，其以低於水但高於鹽的速率滲透細胞膜。因這些技術與噴霧乾燥細胞材料的方法相關， 所以在下文對其簡單綜述(Karlsson and Toner，Biomaterials，17 :243_256，1996)。首先，考慮到膜對冷凍保護劑的半滲透性，冷凍保護劑對所述膜施加滲透 壓-其與冷凍保護劑濃度成比例，且對於最有效的冷凍保護劑，其非常接近於相同濃度 (equivalent concentration)的鹽所施加的滲透壓。這表明浸於含與不可滲透的鹽濃度相 似量冷凍保護劑的水介質中的細胞膜會趨向於承受滲透應力和不等滲狀況，其受冷凍保護 材料的存在的顯著影響。冷凍保護劑的跨膜擴散因此提供了即使在當鹽濃度在所述膜兩側 不一致的狀況下亦抵消滲透應力的手段。由於此理由，冷凍保護劑提供了分散滲透應力的 機制。可供用於所述新方法的合適冷凍保護劑包括但不限於，二甲亞碸，乙二醇，丙二醇與 甘油(Chesne and Guillouzo, Cryobiology，25 :323_330，1988.)。在一些實施方案中，7令 凍保護劑被排除在已乾燥的混合物外。在冷凍保存方法中，冷凍保護劑以與鹽濃度顯著相關的濃度(CT。p)添加至細胞材 料的懸浮液中。值得注意的是，該添加可加以控制而使所述細胞不遭受過多的滲透應力， 即，所述冷凍保護劑可以以足夠低的速率添加，從而使得所述冷凍保護劑可跨細胞膜擴散 而不使細胞脫水。隨即，在凍結過程中_由於所述細胞內天然冷凍保護劑的存在，其導致 冰形成於所述細胞外，從而增加了所述細胞外鹽濃度-所述冷凍保護劑能夠跨細胞膜擴 散並增加細胞內部濃度，其增加冷凍保護劑的內部濃度(C、)。這緩解了針對細胞膜的滲 透壓力，尤其是當凍結以足夠慢的速率發生時。以此方法，冷凍保護劑促成對細胞存活力 的保護，這解釋了其用於保存血液、精子以及其它有用細胞的用途(Karlsson and Toner, Biomaterials, 17 :243_256，1996)。即使不考慮其與冷凍保存的相似性，噴霧乾燥亦提供了針對細胞材料的特殊益 處，其尤其與大規模應用相關。大體積的細胞懸浮液使細胞的冷凍保存受到挑戰，這是因為 質量轉移的動力學要求(涉及添加或移除冷凍保護劑，以及凍結細胞)在細胞和懸浮液規 模上非常不同，其中後者遠高於前者。這可為為何通過標準冷凍保存方法凍結血液無法簡 單適用於凍結整個器官的理由。噴霧乾燥自動將所述細胞懸浮液分割成小體積(亦即，小滴)，其可大致視為小的冷凍保存單位。規模放大(scale-up)並不需要噴霧小滴的體積顯 著增加相反，規模放大是通過增加噴霧乾燥的容器的尺寸，增加懸浮液通過噴嘴的流速以 及其它標準規模放大方法來達成的。噴霧乾燥可因此提供產生大體積DCF的方法，且其具有較之另外通過冷凍保存和 凍幹技術可獲得的更高的活性。接下來，描述了提供噴霧乾燥細胞形式的法則的理論形式，遵循所述法則將使膜 應力最小化並因此使存活力最大化。所述方法依賴於使用冷凍保護劑和控制標準噴霧乾燥 參數，例如，溶劑類型，進氣溫度，和噴霧乾燥噴嘴形狀尺寸(nozzle dimensions)與旋轉速 度(小滴尺寸)。所述方法確定在加熱環境內能夠使噴霧小滴乾燥的速度，從而使得，在冷凍保存 試劑存在的情況下，能夠調製懸浮材料的膜半徑。從而，可防止所述膜收縮至Rcfflin以下或擴 展至Rcfflax以上。為了在Rcfflin的情況下加以說明的目的，所有懸浮材料將不會因滲透驅動的 脫水的後果而收縮至臨界半徑(Rcrai)以下。在剛性細胞壁的情況下，該條件可直接等同於 導致失活的臨界應力。首先，考慮所述問題內理想化的幾何性狀與濃度，其後考慮兩個極限 條件下的運動學。之後，導出流體動力學和質量轉移方程以描述作為系統參數的函數的細 胞半徑變化率。為了方便說明起見，可想像在細胞懸浮液中細胞為具有平衡半徑Rc0的球體。在細 胞內，鹽和冷凍保護劑以細胞內濃度Cis和Cici存在，並在細胞外以濃度CTs和cr。p存在。在噴霧乾燥時，形成懸浮材料的單獨小滴。在此，假定細胞在噴霧溶液和噴霧過程 中保持均勻分布，且因此在單獨噴霧小滴中處於相等濃度。流速，其可在噴霧乾燥過程中能 夠用物理方法控制，可明確的如下求解
N ηΛa =- (J)
ncdlsK其中α為每單位時間小滴的形成率，Iirells為懸浮於每個單獨噴霧小滴中的細胞 數，N為該體積中的細胞總數，而t。為將體積V。噴霧所需時間的量。將在需噴霧的懸浮液中細胞的體積分率稱為Φ。，而
傘^ 總細胞體積⑵
° 懸浮液體積Vd且N為所述懸浮液體積Φ。中的細胞總數。這些小滴假定擁有均一的半徑Rd。氣，從而使得細胞材料的分率可表達為
r Rc yφ0 =Ticens -^1(3)其中η為懸浮於每個單獨噴霧小滴中的細胞數。假定其為均勻，那麼在原始懸浮液中測得的四個濃度(Ts，Cecp, Cis, Cicp與每個噴霧 小滴細胞內的鹽和冷凍保護劑的初始濃度相等。這些濃度會隨著時間基於小滴直徑和細胞 直徑的變化而變化，考慮到鹽和冷凍保護劑的絕對摩爾數在每個小滴內必需守恆。用Xis和X^以及Xicp和X:分別表示在鹽和冷凍保護劑分散於單獨小滴內之後細 胞外側和內側的鹽以及冷凍保護劑的摩爾數。這給出下述方程
其中Vcex。^d為鹽和/或冷凍保護劑無法分配的每個單獨細胞的體積，並應視為相 對於時間的常數。參數Xis和X6s(代表細胞內和細胞外鹽的摩爾數)亦是相對於時間的常 數，這是由於鹽無法滲透過膜。那麼這些表達式中僅有的時間變量為IT和Rd，且細胞內和 細胞外冷凍保護劑的摩爾數為Ρ。ρ和Xecp0每個單獨的小滴在噴霧乾燥圓筒中會以依賴於外界條件，小滴尺寸，小滴揮發性 等等的速率蒸發。起初，平均而言單獨細胞會彼此遠離，使所述懸浮液具有初始的稀釋性質 (Φ。<< 1)。隨著時間的推移，細胞將逐漸互相靠近接觸，從而能夠想到兩種極限情況在此，在乾燥過程中Φ (t) << 1。在此情況下，假定每個單獨細胞如其懸浮於無 限大的水浴中一般是彼此分離的，且響應於變化的鹽和冷凍保護劑濃度(以及其導致的滲 透應力)。該問題的對稱性(參見以下質量轉移方面的考慮)使得所述小滴和細胞均徑向 地收縮(或擴展)。因此，考慮圖1，在單獨細胞內或周圍由於滲透應力而非流體運動造成 的速度分布可表達為ν =trvr(l)(8) 其中t ^為球面坐標系中在沿坐標軸r方向的單位矢量，起始於細胞中心，且、(t) 為徑向速度的大小。 此外，考慮到所述細胞和小滴流體為不可壓縮的。 或者
由於細胞中心處的徑向速度必須為零，可得出結論在任何地方ν = 0(11)。該結論暗示細胞膜的任何徑向運動都必須是「非實質的(non-material) 」，意指所 述膜運動不等同於鄰接流體的質量平均運動。因此，情況1的問題為其中小滴內單獨細胞的演變受擴散驅動。在極限情況Φ。一 1時，乾燥中的小滴中的單獨細胞變得處於非常靠近的接觸中。 細胞膜的演化，作為滲透應力的後果，在下述環境內確定，即在所述環境中細胞膜或者挨著 相鄰細胞變平，或者在所謂「坪邊界(plateauborder)」處以凸狀彎曲。這些膜的情況示於 圖2。
幾個情況1中的基本假定在情況2中不再有效。首先，考慮到所述細胞的緊密接 觸，以及由所述細胞的排除體積所造成的所述小滴「鄰接」相中對質量轉移的抵抗，無法期 待在外界或連續相中鹽和冷凍保護劑濃度的增加相對於跨細胞膜的水分運輸是即時的。這 意味著隨著小滴體積持續減少，在所述小滴外周的鹽和冷凍保護劑的濃度會相對於靠近所 述小滴中央的濃度顯著增加，因而靠近小滴外周的細胞經受高滲透應力，而在中央的細胞 則會受極小的滲透應力甚至不受滲透應力。在所述乾燥過程中使每個細胞的徑向擴展或收 縮最小化的目標則因此具有曖昧的含意，這是因為隨著時間的推移每個細胞均將經受多種 狀況。或者在情況2中的目標為針對最容易受損的細胞(那些在外周的)使其細胞膨脹最 小化，或者為考慮到在乾燥時的合理時限，在所述小滴內救回最多數量的細胞。(注意在外 周使細胞死亡最小化所需的終極乾燥限制可能在極限條件下需要無限緩慢的乾燥。)就此分析而言，剩下的考慮將仍全部集中於情況1。可在情況1中識別出兩個明顯的質量轉移問題，其一涉及在所述乾燥中的小滴內 鹽和冷凍保護劑的質量轉移，考慮到在所述乾燥中的小滴內鹽和冷凍保護劑的濃度作為時 間的函數均勻增長。由於所述細胞懸浮液的稀釋度，小滴乾燥問題可分開考慮。此後一問 題為球狀水滴在連續熱空氣中乾燥的問題。在外界的鹽和冷凍保護劑濃度突然均勻變化的無邊界環境內球狀細胞的質量轉 移問題之前由Batycky等(1997)所解決。在其分析中，將細胞流體描述為連續介質，其中 將細胞內的鹽和冷凍保護劑濃度視為在胞質溶膠(cytosolic fluid)和內部細胞器中為均 一的，或尤其為平均的。使用對膜滲透壓的標準定義，即Reynolds Transport Theorem與 Darcy定律對水穿膜滲透性的描述，膜的速度可顯示為， 其中Lp為所述膜的液壓滲透性(m/s -atm)，而σ，即所謂反射係數(0 < σ < 1)， 代表膜對冷凍保護劑的滲透性相對於對鹽減少的比率。在細胞內在膜處鹽和冷凍保護劑濃度變化的時間速率可通過解出相關質量轉移 守恆方程來確定。儘管有鹽和冷凍保存試劑在細胞內的高濃度，亦可假定恆定鹽和冷凍 保護劑遵循 Fickian 擴散。根據 Batycky 等(1997)並結合 Edwards 和 Davis (Chem. Eng. Sci. ,50 =1441-54,1995)的結果，這些擴散性可表達為依賴過程的係數(course-scale
coefficients) (f，《),其反映細胞器在所述細胞內的存在。鹽濃度的支配微分方程在Batycky等(1997)中可表述為 ζ"=有限的,Vr= 0乂(14) 給定起始條件為 在上述方程中，C丨與ζ"的關係為
0145] 可求解上述方程得到
0146]
0147]
0148] 冷凍保護劑濃度的支配微分方程在Batycky等(1997)中可表述為
0149]
(20)
0150]服從邊界條件，
0151]Clp =有限的，V r=0,t.
(21)
為所述細胞器的比表面積，而K為分配至所述細胞器中的分配係數。
0159]根據方程(14)求解這些方程得到(Batycky等1997)
0160]
(22)
與起始條件
Cjp =C^(0乂當 t = 0(23) IT (t) = JC當 t = 0(24) 其關係為
其中θ為細胞中對滲透為無活性的部分(細胞器)，k = Henry定律吸收係數，α
服從初始條件
這裡λ n為該超越方程非零根的本徵值
其中Psp為半滲透性溶質進入細胞的速率，而係數β定義為 注意儘管λ η基本上在擴散的快速時間尺度上是恆定的，但是其在整個細胞膜擴張的時間尺度上緩慢變化。方程(28)將細胞半徑Rlt)與外界鹽和冷凍保存濃度相聯繫， 其繼而依賴於所述小滴蒸發的速率。這種關係在下文描述。許多研究者對在氣相中乾燥的球形小滴進行了檢查，尤其是當忽略氣體中的對流 作用時。在噴霧乾燥器中蒸發依賴於蒸發的支配速率與蒸發的停留時間。所述停留時間為 乾燥器中噴霧-空氣運動的函數。在小滴相對於周圍空氣移動的情況下，在移動中的小滴 周圍的流動情況影響蒸發速率。在此情況下，當空氣與小滴間相對速度非常緩慢時，所述小 滴完全受空氣流影響。根據邊界層理論，以零相對速度移動的小滴的蒸發速率等同於在靜 止空氣狀況下的蒸發。從而，將所述小滴通過噴霧乾燥的蒸發作為與在靜止空氣狀況下相 似的蒸發機制建模。見於小滴半徑與噴霧乾燥過程中支配參數之間的一般性關係，在實驗上與理論 上肖由(Masters, 1991, Spray Drying Handbook, Longman Scientificand Technical, Harlow, UK)給出 其中，D = 2R。，Kd為圍繞蒸發中小滴的氣態薄膜的平均熱導率，P ！為所述氣相的 密度，λ為所述小滴蒸發的潛熱，而LMTD為如下定義的對數平均溫度差異 其中八！；與AT1為所述小滴與所述氣相間的起始與最終溫度差異。將(30)進行 積分得到
(32)其中 將(32)代入(6)與(7)，得到鹽和冷凍保護劑即時濃度與小滴蒸發參數的關係 噴霧乾燥的方法可以下述微分方程的形式表達
(36)通過計算上述方程，可確定所述噴霧乾燥器進氣和出氣溫度的條件(亦即，ΔΤ)， 噴嘴類型與小滴大小的旋轉速度(Rd)，溶劑類型(λ )，以及使對懸浮膜被材料的應力最小 化，允許保持屺, <^ υ<< ，或將應力最大化所必需的冷凍保護劑類型(Lp)。發現這些 規律與冷凍保存中關於凍結和解凍細胞的速率的規律相似。藥物組合物本文所述的乾燥細胞形式，例如，用新組合物產生的或由新方法產生的，可製備為 藥物組合物，例如，疫苗組合物。所述細胞材料可與多種藥學上可接受的稀釋劑，填充劑， 鹽，緩衝液，穩定劑，增溶劑和其它本領域眾所周知的材料一同噴霧乾燥以製成藥物粉末。 或者，在噴霧乾燥後，可將產物與多種藥學上可接受的稀釋劑，填充劑，鹽，緩衝液，穩定劑， 增溶劑與其它本領域眾所周知的材料中至少一種一起配製以製成藥物組合物，例如，藥物 粉末。術語「藥學上可接受的」意指不幹擾活性成分生物學活性效力的無毒材料。所述組 合物的特性可取決於施用途徑。在一些實施方案中，所述組合物可在施用前儲藏於受控溫 度下。施用藥物組合物(例如，包含乾燥細胞形式的藥物組合物)可用多種常規方法進 行，例如吸入，口服攝入，或表皮，皮下或靜脈內注射。優選通過吸入施用。在一些實施方案 中，所述組合物作為疫苗施與。所述乾燥細胞形式可經配製以供使用醫療裝置進行吸入，例如，吸入器(參見，例 如，美國專利Nos. 6102035 (粉末吸入器)和6012454 (乾粉吸入器))。所述吸入器可包含 分離的隔室用於在適宜儲藏的PH下的活性化合物，和另一個用於中和緩衝液的隔室，以及 將所述化合物與中和緩衝液在噴霧之前即刻合併的機理。在一個實施方案中，所述吸入器 為定量吸入器(metered dose inhaler)。三種用於局部遞送藥物至肺部氣道的常見系統包括乾粉吸入器(DPI)，定量吸入 器(MDI)與噴霧器(nebulizer)。MDI，用於最流行的吸入施用方法，可用於將藥物以溶解形 式或作為分散劑遞送。通常MDI包含Freon或其它相對高蒸汽壓的推進劑，其在啟動裝置 後迫使霧化的藥物進入呼吸道。與MDI不同，DPI通常完全依賴於患者的呼吸動作將藥物 以乾粉的形式導入肺中。噴霧器通過對液體溶液賦予能量而形成待吸入的藥物氣霧劑。亦 探索過使用螢光化學介質在液體通氣或肺部灌洗過程中直接肺部遞送藥物。這些和其它方 法可用於遞送乾燥細胞形式。示例性的吸入裝置描述於美國專利No. 6732732和6766799。所述組合物可方便地以氣霧劑噴霧呈遞的形式自加壓包或噴霧器遞送，使用合適 的推進劑，例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合適的氣體。 在加壓氣霧劑的情況下，劑量單位可通過提供閥門以定量遞送來確定。用於吸入器或吹入 器的膠囊或藥筒可配製為含有乾燥細胞形式。儘管非必不可缺，可使用遞送增強劑，例如表面活性劑以進一步增強向肺部的遞 送。如本文所使用的「表面活性劑」指具有親水和親脂部分的化合物，其通過與兩個不混溶相之間的界面相互作用來促進藥物吸收。表面活性劑因數種原因而與幹顆粒一同使用是 有用的，例如，減少顆粒團聚，減少巨噬細胞吞噬，等等。當與肺部表面活性劑偶聯時，可達 成對所述化合物更加有效的吸收，這是因為表面活性劑，例如DPPC，會極大地促進所述化合 物的擴散。表面活性劑在本領域為眾所周知的，並包括但不限於，磷酸甘油酸，例如，磷脂 醯膽鹼，二棕櫚醯 L- α -磷脂醯膽鹼(L-alpha-phosphatidylcholine dipalmitoyl，DPPC) 和二磷酯醯甘油(DPPG)；十六醇；脂肪酸；聚乙二醇(PEG)；聚氧乙烯-9 ；月桂基醚(auryl ether)；棕櫚酸；油酸；脫水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)；甘氨膽酸鹽；表面活性蛋白 (surfactin)；泊洛沙姆(poloxomer)；山梨醇月旨肪酸酉旨(sorbitan fatty acid ester)；脫 水山梨糖醇三油酸酯；泰洛沙泊；以及磷脂。在另一方面，所述乾燥細胞形式可與藥學上可接受的載體一同配製，所述載體所 具有的顆粒大小使其無法吸入(not respirable)，即，是使其不能以任何顯著的量攝入肺 部的這樣的尺寸。該配製劑可為所述乾燥細胞形式的較小顆粒(例如，小於10 μ m)與所述 載體的較大顆粒(例如，約15到ΙΟΟμπι)的均一混合物。在分散時，較小的顆粒則吸入肺 中而較大的顆粒通常留存於口中。適於混合的載體包括結晶或無定形的賦形劑，其具有可 接受的味道，並無論是吸入還是口服，在毒理學上是無害的，例如，糖類，二糖和多糖。代表 性的示例包括乳糖，甘露醇，蔗糖，木糖醇等。對經口施用，所述藥物粉末可配製為，例如，用常規方法與藥學上可接受的賦形劑 一起製備的片劑或膠囊，所述賦形劑可舉出結合劑(例如，預膠化的玉米澱粉，聚乙烯吡咯 烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如，乳糖，微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例 如，硬脂酸鎂，滑石或矽石)；崩解劑(例如，馬鈴薯澱粉或澱粉羥乙酸鈉(sodium starch glycolate)或溼潤劑(例如，月桂基硫酸鈉)為例。所述片劑可通過本領域眾所周知的方 法包被。經口施 用的液體製備物可採取下列形式，例如，溶液，糖漿或懸浮液，或其可表現為 乾產品而在使用前用水或者其它合適的溶劑載體(vehicle)構建。這些液體製備物可通過 常規方法與藥學上可接受的添加劑一起製備，所述添加劑可舉出助懸劑(例如，山梨醇糖 漿，纖維素衍生物或氫化可食用脂肪)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯膠)；非水溶劑載體 (例如，杏仁油，油性酯，乙醇或分餾植物油)；以及防腐劑(例如，甲基或丙基-P-羥基苯甲 酸，或山梨酸)。如適合，該製備物亦可包含緩衝液，鹽，調味料，著色劑以及甜味劑。所述組合物可配製用於通過注射的胃腸外施用，例如，推注(bolusinjection)或 連續輸注。活性成分可以粉末形式提供以供在使用前用合適的溶劑載體(例如，無菌的無 熱原水)構建。供注射的配製劑可以單位劑量形式呈現，例如，在安瓿(ampule)中或在多 劑量容器中，其中添加有防腐劑。所述組合物可選用下述形式，例如，懸浮液，溶液或在油性 或水性溶劑載體中的乳液，並可包含例如助懸劑，穩定劑和/或分散劑等的試劑。佐劑本發明的疫苗可與其它免疫調節劑一同配製。具體而言，疫苗組合物可包含一種 或多種佐劑。可用於本文所描述的疫苗組合物的佐劑但不限於A.含無機物的組合物本文所描述的適用於佐劑的含無機物的組合物包含無機鹽，例如鋁鹽和鈣 鹽。亦包括下述無機鹽，例如氫氧化物(例如，羥基氧化物)，磷酸鹽(例如，羥基磷酸鹽 (hydroxyphosphates)，正磷酸鹽)，硫酸鹽，等等(例如，參見 Vaccine Design (1995) eds.Powell&Newman. ISBN :030644867X. Plenum的8和9)，或者不同無機化合物的混合物(例 如，磷酸鹽和氫氧化物佐劑的混合物，任選地磷酸鹽為過量)，所述化合物可採取任何合適 的形式(例如，凝膠，晶體，無定形，等等)，並且優選吸附於鹽。所述含無機物的組合物亦可 配製為金屬鹽的顆粒(PCT公開No. W000/23105)。鋁鹽可包含於本文所描述的組合物中，從而使得Al3+的劑量在每劑0.2-1. Omg。在 一個實施方案中，用於本組合物的基於鋁的佐劑為明礬(硫酸鋁鉀(AlK(SO4)2)),或明礬衍 生物，例如，用下述方法在原位(in situ)製成的將磷酸緩衝液中的抗原與明礬混合，繼 以用鹼滴定並沉澱，所述鹼如氫氧化銨或氫氧化鈉。另一種用於本發明疫苗配製劑的基於鋁的佐劑為氫氧化鋁佐劑(Al (OH)3)或晶狀 羥基氧化鋁(AlOOH)，其為優異的吸附劑，具有大約500m2/g的表面積。或者，提供磷酸鋁佐 劑(AlPO4)或羥基磷酸鋁，其含有磷酸根取代氫氧化鋁佐劑中一些或全部氫氧根。本文所 提供的優選磷酸鋁佐劑為無定形的，並可溶於酸性，鹼性和中性介質。在另一個實施方案中，用於本組合物的佐劑包括磷酸鋁和氫氧化鋁兩者。在其更 加特定的實施方案中，所述佐劑具有較之氫氧化鋁更大量的磷酸鋁，例如按磷酸鋁對氫氧 化鋁的重量比，為 2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 1 或大於 9 1 的 比例。更具體而言，鋁鹽可以每疫苗劑量0. 4到1. Omg存在，或每疫苗劑量0. 4到0. 8mg,或 每疫苗劑量0. 5到0. 7mg,或每疫苗劑量約0. 6mg。通常，優選的基於鋁的佐劑，或多種基於鋁的佐劑的比例，例如磷酸鋁對氫氧化鋁 的比例通過優化分子間的靜電吸引，從而使得抗原在所期望的PH攜帶與所述佐劑相反的 電荷來選擇。舉例而言，在PH7. 4，磷酸鋁佐劑(等電點=4)吸附溶菌酶，但非白蛋白。若 以白蛋白為靶，則應選擇氫氧化鋁佐劑(等電點=11.4)。或者，用磷酸預處理氫氧化鋁降 低其等電點，使其對更多鹼性抗原成為優選佐劑。B.油乳膠適於在組合物中用作佐劑的油乳膠組合物包括角鯊烯-水乳劑。特別優選的佐 劑為亞微米的水包油乳劑。本文所用的優選的亞微米水包油乳劑為角鯊烯/水乳劑任選 含有不同量的MTP-PE，例如包含4-5% w/v角鯊烯，0. 25-1.0% w/v Tween 80(聚氧乙烯 失水山梨糖醇單油酸酯(polyoxyelthylenesorbitan monooleate))，和 / 或 0. 25-1. 0% Span 85 (脫水山梨糖醇三油酸酯)，和任選地，N-乙醯胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺 醯-L-丙氨酸_2-(1，-2，- 二棕櫚醯-s-n-甘油-3-羥磷醯基氧)_乙醇胺(N-acetylmur amy1-L-alanyl-D-isogluatminyl-L-alanine-2-(l『 -2『 -dipalmitoyl-s-n-glycero-3-h uydroxyphosphophoryloxy)-ethylamine) (MTP-PE)的亞微米水包油乳劑，例如，以」MF59」 為人所知的亞微米水包油乳劑(國際公開NO.W090/14837 ；美國專利Nos. 6，299，884和 6，451，325，以及 Ott 等，"MF59__Design andEvaluation of a Safeand Potent Adjuvant for Human Vaccines，，in VaccineDesign :The Subunit and Adjuvant Approach(Powell, M. F. and Newman,M. J. eds.) Plenum Press, New York, 1995，pp. 277—296)。MF59 包含 4—5% w/v 角鯊烯(例如，4.3% )，0·25-0·5% w/v Tween 80 和 0.5%w/v Span 85，並任選 地含有不同量的MTP-PE，使用微流化器(microfluidizer)，例如Model 110Y微流化器 (Microfluidics,Newton,Mass.)配製成亞微米顆粒。舉例而言，MTP-PE可以約0-500 μ g/ 劑，更優選0-250 μ g/劑以及最優選0-100 μ g/劑的量存在。舉例而言，「MF59-100」含有每劑100 μ g MTP-PE，依此類推。MF69，另一種本文所使用的亞微米水包油乳劑，包含4. 3% w/v 角鯊烯，0. 25% w/vTween 80 和 0. 75%w/v Span 85，和任選地 MTP-PE。又另一種亞 微米水包油乳劑為MF75，亦稱作SAF，包含10%角鯊烯，0. 4%w/v Tween 80, 5% Pluronic 封閉的聚合物L121，和thr-MDP，亦經微流化成為亞微米乳劑。MF75-MTP指包含MTP，如每 劑從 100-400 μ g MTP-PE 的 MF75 配製劑。亞微米水包油乳劑，及其製造方法與供在所述組合物中使用的免疫刺激劑，例如 胞壁醯肽，詳細描述於國際公開No. W090/14837以及美國專利Nos. 6299884和6451325。完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)亦可在題述組合物中用作佐劑。C.皂苷配製劑皂苷配製劑亦可作為佐劑用於所述組合物中。皂苷為留醇苷和三萜苷的異源組， 其見於廣泛的植物物種的樹皮，葉，莖/幹，根和甚至是花中。自皂樹(Quillaia saponaria Molina tree)樹皮分離的皂苷作為佐劑得到廣泛研究。皂苷亦可從棕菝契(Smilax ornata(sarsaprilla))、圓維石頭花(Gypsophillapaniculata(brides veil))禾口月巴阜草 (Saponaria officianalis (soap root))商購獲得。皂苷佐劑配製劑包括純化的配製劑，例 如QS21，以及液體配製劑，例如免疫刺激複合物(ISCOM)。阜昔複合物己使用 High Performance Thin Layer Chromatography (HP-TLC ；^ 效薄層層析)與 Reversed Phase High Performance LiquidChromatography (RP-HPLC ；反 相高效液相層析)純化。使用這些技術的具體純化級分已經鑑定，包括QS7，QS17，QS18， QS21，QH-A，QH-B和QH-C。通常，所述皂苷為QS21。產生QS21的方法公開於美國專利 No. 5，057，540。皂苷配製劑亦可包含留醇，例如膽固醇(參見PCT公開No. W096/33739)。皂苷和膽固醇的組合可用於形成稱為Immunostimulating Complexes (ISCOMs ；免 疫刺激複合物)的獨特顆粒。ISCOM通常亦包括磷脂，例如磷脂醯乙醇胺或磷脂醯膽鹼。任 何已知的皂苷可用於ISC0M。所述ISCOM優選含有一種或多種Quil A、QHA和QHC。ISCOM 進一步描述於EP0109942，W096/11711和W096/33739。任選地，所述ISCOM可缺乏額外的 洗滌劑。參見W000/07621。關於基於皂苷的佐劑的開發的綜述可見於Barr，等，Advanced DrugDelivery Reviews(1998)32 :247_271。 # 參 B sjolander, φ, Advanced DrugDelivery Reviews(1998)32 :321_338。D.病毒體和病毒樣顆粒(VLPs)病毒體和病毒樣顆粒(VLP)亦可在本發明的組合物中用作佐劑。這些結構通 常含有一種或多種來自病毒的蛋白質，其任選地與磷脂組合或一起配製。其通常為非病 原性的、非複製的並通常不含有任何天然病毒基因組。病毒蛋白可重組產生或分離自全 病毒。這些適用於病毒體和VLP的病毒蛋白包括源自以下病毒的蛋白質流感病毒(例 如HA或NA)，B型肝炎病毒(例如核心蛋白和衣殼蛋白)，戊型肝炎病毒，麻疹病毒，辛 德比斯病毒(Sindbisvirus)，輪狀病毒，口蹄疫病毒，逆轉錄病毒，諾沃克病毒(Norwalk virus)，人乳頭狀瘤病毒，HIV, RNA噬菌體，Qi3-噬菌體(例如外殼蛋白)，GA-噬菌 體，fr-噬菌體，AP205噬菌體，和Ty (例如逆轉座子Ty蛋白pi)。VLP進一步討論於 W003/024480.W003/024481 和 Niikura 等，Virology (2002) 293 :273_280 ；Lenz 等，Journal of Immunology(2001)5246-5355 ;Pinto，等，Journal of Infectious Diseases(2003)188 327-338 ；以及 Gerber 等，JournalofVirology (2001) 75 (10) :4752_4760。病毒體進一步討 論於，例如，Gluck等，Vaccine (2002) 20 :B10_B16。將經免疫增強的重構流感病毒體(IRIV) 在鼻內三價體 NFLEXAL 產品(Mischler&Metcalfe (2002) Vaccine 20Suppl5 :B 17-23)和 INFLUVAC PLUS 產品中用作亞基抗原遞送系統。E.細菌或微生物衍生物適用於本組合物的佐劑包括細菌或微生物衍生物，例如(1)腸細菌脂多糖(LPS)的無毒衍生物這些衍生物包括單磷醯基脂肪A(MPL)與3-0-脫乙醯基MPL(3dMPL)。3dMPL為 3-脫-0-乙醯基單磷醯脂質A與4，5或6位乙醯化鏈的混合物。在EP 0689454中公開了 3-脫-0-醯化單磷醯脂質A的優選「小顆粒」形式。這種3dMPL的「小顆粒」小到足以穿 過0. 22微米膜進行過濾除菌(參見EP 0689454)。其它無毒的LPS衍生物包括單磷醯脂 質A模擬物，例如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物，例如，RC-529。參見Johnson等(1999) Bioorg. Med. Chem. Lett.，9 :2273_2278。⑵脂質A衍生物脂質A衍生物包括來自大腸桿菌的脂質A衍生物，例如0M-174。0M-174描述於，例 如，Meraldi 等，Vaccine (2003) 21 :2485_2491 ；以及 Pajak,等，Vaccine (2003) 21 :836_842中。(3)免疫刺激性寡核苷酸適用作佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序(包含未甲基化的胞嘧啶繼以 鳥苷且兩者以磷酸鍵連接的序列)的核苷酸序列。含有回文或聚(dG)序列的寡核苷酸或 細菌雙鏈RNA亦被顯示為免疫刺激性的。所述CpG可包含核苷酸修飾/類似物，例如硫代磷酸酯修飾，且可為雙鏈或 單鏈的。任選地，所述鳥苷可由例如2』-脫氧-7-脫氮鳥苷的類似物所取代。參見， Kandimalla,等，Nucleic Acids Research(2003)31(9) :2393_2400 ;W002/26757 和 W099/62923中可能的類似物取代的示例。CpG寡核苷酸的佐劑作用進一步討論於Krieg， Nature Medicine(2003)9(7) 831-835 ；McCluskie, φ, FEMS Immunology and Medical Microbiology(2002) 32 :179-185 ；W098/40100 ；美國專利 No. 6，207，646 ；美國專利 No. 6，239，116 和美國專利 No. 6，429，199。所述CpG序列可定向於TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT。參見，Kandimal la，等， Biochemical Society Transactions (2003) 31 (第 3 部分)654_658。所述 CpG 序列可針 對誘導Thl免疫應答具有特異性，例如CpG-AODN，或可針對誘導B細胞應答具有更高特異 性，例如 CpG-B ODN0 CpG-A和 CpG-B ODN討論於Blackwell，等，J. Immunol. (2003) 170(8) 4061-4068 ；Krieg,TRENDS in Immunology (2002) 23 (2) :64_65 和 W001/95935。通常，所述 CpG 為 CpG-A ODN。通常，所述CpG寡核苷酸的構建使得其5』端便利於受體識別。任選地，兩個CpG 寡核苷酸序列可附接在其3』端以形成「免疫聚體(immunomer) 」。參見，例如，Kandimalla， 等，BBRC (2003) 306 948-953 ；Kandimalla, BiochemicalSocietyTransactions (2003) 3 1 (part 3) :664_658 ；Bhagat 等，BBRC (2003) 300 :853_861 和 W003/035836。(4) ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物
細菌ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物可在所述組合物中用作佐劑。通常，所 述蛋白質源自大腸桿菌(亦即，大腸桿菌熱不穩定腸毒素「LT」)，霍亂(「CT」)或百日咳 (「PT」)。使用脫毒ADP-核糖基化毒素作為黏膜佐劑描述於W095/17211，而作為胃腸外佐劑 描述於W098/42375。所述佐劑優選為脫毒的LT突變體，例如，LT-K63，LT-R72和LTR192G。 使用ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物(尤其是LT-K63與LT-R72)作為佐劑，可見於 下述參考文獻Beignon，等，Infection and Immunity (2002) 70 (6) 3012-3019 ；Pizza, 等，Vaccine (2001) 19 :2534_2541 ；Pizza,等，Int. J. Med. Microbiol. (2000)290(4-5) 455-461 ;Scharton-Kersten 等，Infection and Immunity(2000)68(9) 5306-5313 ；Ryan 等，Infection and Immunity (1999) 67 (12) 6270-6280 ；Partidos 等，Immunol. Lett. (1999)67(3) 209-216 ；Peppoloni 等，Vaccines (2003) 2 (2) :285_293 ；以及 Pine 等， J. Control Release (2002) 85 (1-3) :263_270。許多關於胺基酸取代的參考文獻通常基於在 Domenighini 等，Mol. Microbiol (1995) 15 (6) 1165-1167 中列出的 ADP-核糖基化毒素的 A 和B亞基的排列。F.生物粘附劑和黏膜粘附劑(Bioadhesives and Mucoadhesives)生物粘附劑和黏膜粘附劑亦可在題述組合物中用作佐劑。合適的生物粘附劑包括 脂化的透明質酸微球(Singh等(2001) J. Cont. Rele. 70 :267_276)，或黏膜粘附劑例如聚丙 烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纖維素的交聯衍生物。殼聚糖及其衍生物 亦可在所述組合物中用作佐劑。參見，例如，W099/27960。G.顆粒微粒和納米顆粒(例如，多聚納米顆粒)亦可在所述組合物中用作佐劑。微 粒(通常直徑為 IOOnm到 150 μ m的顆粒，例如，直徑 200nm到 30 μ m或直 徑 500nm到 ΙΟμπι)和納米顆粒(通常 IOnm到 IOOOnm的顆粒，例如，直徑 IOnm到 lOOnm，直徑 20nm到 500nm，或直徑 50nm到 300nm)可自下述材料形 成，即所述材料為可生物降解並無毒的(例如，聚(α -羥酸)，聚羥基丁酸，聚原酸酯 (polyorthoester)，聚酐，聚已內酯(polycaprolactone)等等，以及聚(丙交酯-共-乙 交酯)(polydactide-co-glycolide))。任選地，可處理顆粒以使其具有帶負電荷的表面 (例如，用SDS處理)或帶正電荷的表面(例如，用陽離子洗滌劑，例如CTAB處理)。顆粒 可就其特異性進行改造，從而使得其可將增加濃度的試劑遞送到所期望的位置。參見，例 如，Matsumoto 等，Intl. J. Pharmaceutics, 185 :93_101，1999 ；Williams 等，J. Controlled Release,91 167-172，2003 ；Leroux 等，J.Controlled Release, 39 :339_350，1996 ； Soppimath 等，J. Controlled Release, 70 :1_20,2001 ；Chawla 等，Intl. J. Pharmaceutics, 249 127-138,2002 ；Brannon-Peppas, Intl. J. Pharmaceutics, 116,1-9,1995 ；Bodmeier 等，Intl. J. Pharmaceutics,43 :179-186,1988 ；Labhasetwar 等，Adv. Drug Delivery Reviews,24 :63_85,1997 ；Pinto-Alphandary 等，Intl.J.AntimicrobialAgents, 13 155-168，2000 ；Potineni 等，J. Controlled Release, 86 -.223-234,2003 ；Kost 等，Adv. Drug Delivery Reviews,46 :125_148，2001 ；以及 Saltzman 等，DrugDiscovery，1 :177-186， 2002。顆粒，優選納米顆粒，可裝配為在微米大小尺度有結構的聚集體，具有由親脂性和 /或親水性分子的混合物構成的殼或基質(通常為藥物「賦形劑」)。所述納米顆粒可在前述方法中形成，並摻入細胞材料作為顆粒的主體，在顆粒表面上或包埋於顆粒內。聚集的顆 粒殼或基質可包括藥物賦形劑，例如脂質，胺基酸，糖，聚合物並亦可摻入核酸和/或肽和/ 或蛋白質和/或小分子抗原。亦可使用抗原性材料的組合。這些聚集顆粒可在下述方法中 形成。美國專利申請流水號2004/0062718描述了製造多孔納米顆粒聚集顆粒(PNAP)以 供作為疫苗使用的方法。抗原可通過下述方法與納米顆粒相關聯，即通過裝配(make up) 所述納米顆粒，結合於所述納米顆粒表面或包埋於所述納米顆粒內或其可摻入微米顆粒的 殼中，並隨即引發體液和細胞免疫兩者。其它製造PNAP方法的示例描述於Johnson and PrucT homme，Austral. J. Chem. ,56 :1021-1024，2003。這些顆粒，如Edwards，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 19 :12001-12005，2002 所描 述，聚集產生較小亞基顆粒的較大顆粒(稱為特洛伊顆粒，因為其保持其較小亞基的獨特 性質，同時亦保持較大顆粒的關鍵特徵)。試劑可包埋於所述亞基顆粒內或由所述較小顆粒 的聚集物形成的較大顆粒內。所述顆粒可以是適於吸入的乾粉形式。在特定實施方案中，所述顆粒可具有小於 約0. 4g/cm3的夯實密度(tap density)。具有小於約0. 4g/cm3夯實密度的顆粒在本文中 稱為「空氣動力學輕顆粒(aerodynamically light particle)」。更優選具有夯實密度小 於約0. lg/cm3的顆粒。空氣動力學輕顆粒具有優選的尺寸，例如，至少約為5微米的體積 中值幾何直徑(volume median geometricdiameter，VMGD)。在一個實施方案中，所述VMGD 為約5微米到約30微米。在另一個實施方案中，所述顆粒具有自約9微米到約30微米範 圍的VMGD。在其它實施方案中，所述顆粒具有至少5微米的中值直徑(mediandiameter)， 質量中值直徑(mass median diameter, MMD),質量中值包膜直徑(mass median envelope diameter, MMED)或質量中值幾何直徑(mass mediangeometric diameter, MMGD)，例如自 約5微米到30微米。空氣動力學輕顆粒優選具有約1微米到約5微米的「質量中值空氣動 力學直徑(mass medianaerodynamic diameter (MMAD) 」，在本文中亦稱為「空氣動力學直徑 (aerodynamic diameter) 」。在一個實施方案中，所述MMAD為約1微米到約3微米。在另 一個實施方案中，所述MMAD為約3微米到約5微米。在另一個實施方案中，所述顆粒具有小於約0. 4g/cm3的包膜質量密度(envelope mass density)，本文中亦稱為「質量密度」。各向同性顆粒的包絡質量密度定義為所述顆粒 的質量除以可將其包埋在內的最小球狀包膜體積(minimum sphere envelope volume)。夯實密度可通過使用本領域技術人員已知的裝置，例如Dual PlatformMicroprocessor Controlled Tap Density Tester(Vankel,N. C.)或Geopyc 裝 g (Micrometrics Instrument Corp. ， Norcross, Ga. 30093) HlJ胃。It^fiS^jl^ii^& 膜質量密度的標準量度。夯實密度可使用USP Bulk Density and TappedDensity,United States Pharmacopia convention,Rockville,Md. , IOthSupplement,4950-4951,1999 的方 法來確定。可促成低夯實密度的特徵包括不規則的表面紋理和多孔結構。所述顆粒的直徑，例如，其VMGD，可使用電子區域感知裝置(electricalzone sensing instrument), 例 如 Multisizer lie, (Coulter Electronic, Luton, Beds, England),或雷射衍身寸裝置(laser diffraction instrument)(例如，Helos,由 Sympatec, Princet0n，N. J製造)測定。其它供測定顆粒直徑的裝置在本領域中為眾所周知的。樣品中顆粒的直徑的範圍會取決於例如顆粒組成和合成方法這樣的因素。在樣品中顆粒大小的 分布可經選擇以允許在呼吸道內目標部位內的最佳沉積。所述顆粒可以合適的材料，表面糙度，直徑和夯實密度製造以供局部遞送至呼吸 道的選定區域，例如肺深部或上或中呼吸道。舉例而言，較高密度或較大的顆粒可用於上呼 吸道遞送，或在樣品中混合不同大小的顆粒，配以同樣或不同的治療劑，可於一次施用中施 用以靶向肺的不同區域。具有空氣動力學直徑範圍自約3到約5微米的顆粒優選用於向中 或上呼吸道遞送。具有空氣動力學直徑範圍自約1到約3微米的顆粒優選用於向肺深部遞 送。氣霧齊[J 的惰性碰撞(inertial impaction)禾口重力沉降(gravitational settling)為正常呼吸情況下在氣道和肺泡(acini of lung)中的主要沉積機理 (Edwards, J. Aerosol Sci. ,26 =293-317,1995) 兩個沉積機理的重要性均與氣霧劑的質 量，而非顆粒(或包膜)體積，成正比增加。因為氣霧劑在肺中的沉積位點由所述氣霧劑的 質量確定(至少對平均空氣動力學直徑大於大約1微米的顆粒為如此)，若其餘物理參數均 相同，通過增加顆粒表面的凹凸不平(irregularity)和微粒多孔性以減少夯實密度允許 將較大微粒包膜體積遞送入肺部。可計算所述空氣動力學直徑以提供肺內的最大沉積，之前是通過使用非常小的顆 粒實現的，所述顆粒的直徑小於約5微米，優選為約1到約3微米，其繼而遭受吞噬作用 (phagocytosis)。選擇具有較大直徑，但足夠輕(因此其特徵為「空氣動力學輕」)的顆粒 導致相同的向肺的遞送，但較大尺寸的顆粒不會被吞噬。改善的遞送可通過使用相對於具 有平滑表面的顆粒，具有粗糙或不平表面的顆粒來獲取。可製造或分離合適的顆粒，例如，通過過濾或離心，以提供具有預先選定的大小分 布的顆粒樣品。舉例而言，樣品中多於約30%，50%，70%或80%的顆粒可具有在選定範圍 內，即至少約5微米的直徑。在選定的範圍內一定百分比的顆粒必然沉降，該範圍可為，例 如，約5到約30微米，或最好在約5到約15微米。在一個優選的實施方案中，至少所述顆粒 的部分具有約9到約11微米的直徑。任選地，亦可製造下述的顆粒樣品，即在所述樣品中 至少約90%或任選地約95%或約99%的直徑在選定的範圍內。在顆粒樣品中較高比例的 空氣動力學輕、較大直徑的顆粒的存在增強其中摻入的治療或診斷劑向肺深部的遞送。大 直徑顆粒通常意指具有至少約5微米的中值幾何直徑的顆粒。靶向抗原遞呈細胞(APC)的優選顆粒具有400nm的最小直徑，其為APC吞噬的限 值。在組織間穿過並靶向細胞以供攝取的優選顆粒具有IOnm的最小直徑。最終配製劑可 形成下述乾粉，即所述乾粉適用於肺部遞送並在室溫下穩定。H.脂質體作為佐劑適用的脂質體配製劑示例描述於美國專利No. 6090406，美國專利 No.5916588 和 EP 0626169。I.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯配製劑適用於所述組合物中的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯。參見，例如， W099/52549。這種配製劑可進一步包括聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯表面活性劑與辛苯聚醇 (octoxynol)的組合(W001/21207)，以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑與至少一種額外 的非離子型表面活性劑，例如辛苯聚醇的組合(W001/21152)。優選的聚氧乙烯醚選自下組聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth9)，聚氧乙烯_9_硬脂醯醚(polyoxyethylene-9-steoryl ether)，聚氧乙烯 _8_ 硬脂醯醚(polyoxyethylene-8-steoryl ether)，聚氧乙烯 _4_ 月桂 基醚，聚氧乙烯-35-月桂基醚，以及聚氧乙烯-23-月桂基醚。J.聚磷腈(Polyphosphazene) (PCPP)PCPP 配製劑描述於，例如，Andrianov 等，Biomaterials (1998) 19 (1-3) 109-115 和 Payne 等，Adv. Drug. Delivery Review (1998) 31 (3) :185_196。K.胞壁醯肽作為佐劑適用的胞壁醯肽的示例包括N-乙醯_胞壁醯-L-蘇氨醯-D-異穀氨醯 胺(thr-MDP)，N-乙醯-正胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺(nor-MDP)和N-乙醯胞壁 醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺醯-L-丙氨酸-2-(1』 -2』 - 二棕櫚醯-s-n-甘油_3_羥磷醯 基氧)-乙醇胺(MTP-PE)。L.咪唑喹啉(Imidazoguinoline)化合物作為佐劑適用於所述組合物中的咪唑喹啉化合物的示例包括咪喹莫特 (Imiquimod)及其類似物，進一步描述於 Stanley，Clin. Exp. Dermatol. (2002)27(7) 571-577 Jones, Curr. Opin. Investig. Drugs(2003)4(2) :214_218 ；以及美國專利 Nos.4689338，5389640，5268376，4929624，5266575，5352784，5494916，5482936，5346905， 5395937，5238944 和 5525612。Μ.縮氨基硫脲(Thiosemicarbazone)化合物縮氨基硫脲化合物的示例，以及配製、生產和篩選所有作為佐劑適用於所述組合 物中的化合物的方法包括描述於W004/60308的那些。所述縮氨基硫脲在刺激人外周血單 核細胞用於產生細胞因子(例如TNF-α)中特別有效。N.色胺酮(Tryptanthrin)化合物色胺酮化合物的示例，以及配製、生成和篩選所有作為佐劑適用於所述組合物中 的化合物的方法包括描述於W004/64759的那些。所述色胺酮化合物在刺激人外周血單核 細胞用於產生細胞因子(例如TNF-α)中特別有效。0.人類免疫調節劑作為佐劑適於使用在所述組合物中的人免疫調節劑包括細胞因子，例如白介素 (例如，IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-T, IL-12 等等)，幹擾素(例如，幹擾素-Y)，巨 噬細胞集落刺激因子以及腫瘤壞死因子。所述組合物亦可包含上面所述佐劑中一種或多種的組合。舉例而言，可在本發明 中使用下述佐劑組合物(1)皂苷和水包油乳劑(TO"/11241)；(2)皂苷(例如，QS21) +無毒的LPS衍生物(例如，3dMPL)(參見W094/00153)；(3)皂苷(例如，QS21) +無毒的LPS衍生物(例如，3dMPL) +膽固醇；(4)皂苷(例如，QS21) +3dMPL+IL_12 (任選地 + 甾醇)(W098/57659)；(5) 3dMPL與，例如，QS21和/或水包油乳劑的組合(參見歐洲專利申請0835318， 0735898 和 0761231)；(6)SAF，包含 10% 角鯊烷，0. 4% Tween 80,5% Pluronic -封閉聚合物 L121 和 thr-MDP，或者微流化為亞微米乳劑或渦旋振蕩(vortex)以產生較大顆粒尺寸的乳劑；
(7)Ribi 佐劑系統(RAS)，(Ribi Immunochem)包含 2%角鯊烯，0. 2% Tween 80 和一種或多種選自下組的細菌細胞壁組分單磷脂A (MPL)，海藻糖二黴菌酸酯(TDM)和細 胞壁骨架(CWS)，優選 MPL+CWS (Detox )；(8) 一種或多種無機鹽(例如鋁鹽)+LPS無毒衍生物(例如3dPML)；和(9) 一種或多種無機鹽(例如鋁鹽)+免疫刺激性寡核苷酸(例如包含CpG基序的 核苷酸序列)。鋁鹽和MF59為用於可注射疫苗的典型佐劑。細菌毒素和生物粘附劑為用於粘 膜遞送疫苗，例如鼻或吸入疫苗的典型佐劑。附加的在黏膜疫苗中有用的佐劑在例如， Stevceva and Ferrari, Curr. Pharm. Des. ,11 :801_11, 2005, and Cox 等，Vet. Res. ,37 511-39，2006 中討論。供施用粉末的裝置在另一方面，本方面包括用於向患者，例如嬰兒與初學走路的孩子(toddler)遞 送乾粉(例如，藥物，疫苗，本文所述的乾粉，或由本文所述方法產生的乾粉)的乾粉遞送 裝置。通常而言，所述裝置包括安慰器，其與乾粉遞送系統，例如常規的基於主動旋轉膠囊 (active spinning capsule-based)的系統一同使用。空氣流過所述乾粉遞送系統，在其 中使空氣充滿粉末的藥物或疫苗。被充滿的空氣通過進入口腔的乳頭裝置(參見圖18和 24)或通過具有進入鼻腔的導氣管的乳頭裝置(參見圖25)而排出安慰器。較之噴霧溶液，乾粉氣霧劑的優勢為，其可更易於儲藏，經常以更高的效率遞送至 肺部，並允許遞送化學上更加複雜的物質。圖18顯示了低成本的、基於主動選擇膠囊的乾粉吸入器10以供嬰兒疫苗遞送應 用。所述吸入器裝置10包括安慰器12，主體14和小氣球(air-bulb)型泵18。安慰器12 除用於將安慰器12與主體14相連接的肘部外，具有常規構型。使用時，氣球型泵18由護 理提供者擠壓以提供足夠的空氣流以使儲存在所述主動旋轉膠囊16中的粉末狀的疫苗霧 化，並通過安慰器12將其遞送給嬰兒。所述裝置亦在主體14中包含整合的膠囊穿刺裝置， 以及常規構型的單向流動控制閥。圖24顯示用於將乾粉遞送至患者口腔的安慰器型裝置30。所述裝置30在罩33 內包含主動或被動的乾粉遞送系統32。所述安慰器的乳頭34與其它標準安慰器乳頭(例 如，塑料或橡膠材料的)以相似方式構建，但包含導管36，其與遞送系統32流體聯通。當嬰 兒吮吸安慰器時，空氣流經乾粉遞送系統，在此使其變得充滿粉末狀的藥物或疫苗。被充滿 的空氣通過導管36離開安慰器進入口腔。圖25顯示另一種安慰器型裝置40，以供將乾粉遞送至患者的鼻腔。所述裝置40 在罩43內包含主動或被動的乾粉遞送系統42。所述安慰器的乳頭44與其它標準安慰器乳 頭(例如，塑料或橡膠材料的)以相似方式構建。該安慰器裝置40的獨特之處，在於所述 裝置包含由，例如，塑料或橡膠材料，例如，矽膠，製成的兩個導氣管46a和46b，其與所述遞 送系統42流體聯通。將這兩個導氣管配製成在嬰兒吮吸安慰器時，插入(例如，自動地) 嬰兒的鼻孔。當嬰兒呼吸時，空氣流經所述乾粉遞送系統，在此其變得充滿粉末狀的藥物或 疫苗。被充滿的空氣隨即通過所述導氣管46a和46b進入鼻腔。在另一方面，所述發明包括針對組合物的經口遞送裝置，其包含安慰器，所述安慰 器有組合物(例如，藥物，疫苗，本文所描述的乾粉，或由本文所描述方法生成的乾粉)塗覆於口相容性帶之上或浸於口相容性帶之中，所述口相容性帶置於所述安慰器的乳頭之上。 當嬰兒吮吸所述安慰器時，來自他或她口中的唾液導致所述組合物溶解並經口攝入。在一 些實施方案中，所述組合物可作為可生物降解的聚合物配製劑或具有長效作用性質的藥物 前體製備。在一些實施方案中，所述帶可移除並丟棄，而將新的帶置於其位置。
實施例實施例1 噴霧乾燥恥垢分枝桿菌的懸浮液為說明噴霧乾燥無賦形劑的細胞形式 導致過於潮溼而不適於生產或加工的粉末，使用恥垢分枝桿菌作為模式微生物。乾粉通過 ^fflBilchisMiniSpray Dryer B-290 (Brinkmann Instruments,ffestbury, NY)噴霧乾燥來 形成，進氣溫度、流速和賦形劑濃度均受控制。將所述微生物在無賦形劑存在的情況下噴霧乾燥。將純恥垢分枝桿菌的溶液在 PBS-Tween 80中洗滌，並重新懸浮於90mL水中使細菌濃度為3xl08CFU/mL。在19. 50C 與48%溼度的環境條件下，對所述恥垢分枝桿菌溶液以進氣溫度130°C，出氣溫度50°C以 及流速22mL/min進行噴霧乾燥。所述細菌團塊聚集在噴霧乾燥器圓筒內，無法自旋風分離 器中作為粉末排出。在所述噴霧乾燥器中收集到的材料為潮溼的，幾乎無法進行加工。實施例2 用亮氨酸噴霧乾燥恥垢分枝桿菌為說明用相對少量的賦形劑不會產生成功乾燥的粉末，使用亮氨酸作為模式賦形 劑對恥垢分枝桿菌進行噴霧乾燥。乾燥溶液由對於400mL溶液(按重量計)80%的4mg/mL 亮氨酸溶液和20%的3xl09CFU/mL的恥垢分枝桿菌懸浮液組成。將所述溶液在即將到達噴 霧噴嘴之前在管線內混合(mixin-line)。在20°C與69%溼度的環境條件下，對所述溶液以 進氣溫度150°C，出氣溫度60°C和流速SmL/min進行噴霧乾燥。平均小滴尺寸估計為50-60 微米。該過程通過所述噴霧乾燥器的旋風分離器產生了產物，但產物過於潮溼，收率也低。 獲得了含活細菌的淡黃色粉末(圖3)。然而，該粉末形成團塊，並且顯示不良的流動性能。^MM 3 用較高濃It的亮,MiIX寸耳止垢分fefflf講行Pty乾燥較高濃度的賦形劑，例如亮氨酸，可導致良好噴霧乾燥的粉末，而更加高濃度的賦 形劑增加生物體的存活力。同上，通過將90%和95%的4mg/mL亮氨酸溶液與10%和5% 的3xl09CFU/mL的恥垢分枝桿菌懸浮液混合製備400mL的溶液。同上，所述溶液在即將到 達噴霧噴嘴之前在管線內混合。在20°C和69%溼度的環境條件下，對所述溶液以進氣溫度 1500C，出氣溫度55°C和流速SmL/min進行噴霧乾燥。平均小滴尺寸估計為50-60微米。表1提供了噴霧乾燥的運行結果。在所有情況下，噴霧乾燥得到了精細的、白色的 活的粉末，適於氣霧劑分散，具有高產物收率。存活力以在含潮黴素的7H9瓊脂板上的菌落 形成單位進行測定。對於95 5 (亮氨酸恥垢分枝桿菌)粉末(圖4)，較之90 10粉 末，觀察到了顯著較高的生物存活力(大約20-80倍)，說明添加的賦形劑對在噴霧乾燥過 程中保護所述微生物的重要性。含水量基於所述粉末的總體外觀(gross appearance)來 估計。熱重量分析(TGA)用於定量分析含水量。圖5為描述表達綠色螢光蛋白(GFP)的恥 垢分枝桿菌的螢光顯微照片，其使用90 10亮氨酸恥垢分枝桿菌噴霧乾燥。該顯微照 片顯示所述粉末的顆粒僅部分(subset)含有具螢光的恥垢分枝桿菌(綠色)。表1.用亮氨酸噴霧乾燥恥垢分枝桿菌 表1中的產物收率以終產物的質量與噴霧溶液中溶質的質量比例進行測定。終產 物質量包括任何粉末中的殘餘水分。通常，所述質量的一部分粘附於乾燥裝置而無法回收。實施例4用甘露醇對恥垢分枝桿菌進行噴霧乾燥
為證明可用其它賦形劑對微生物進行噴霧乾燥，使用糖甘露醇進行了進一步的實 驗。賦形劑溶液由200mL溶液中95%的10mg/mL甘露醇溶液和5%的3xl09CFU/mL恥垢分 枝桿菌懸浮液組成，所述賦形劑溶液通過在即將到達噴霧噴嘴之前在管線內混合來產生。 在21. 9°C與63%溼度的環境條件下，對所述溶液以進氣溫度145°C，出氣溫度55°C和流速 12mL/min進行噴霧乾燥。平均小滴尺寸估計為50-60微米。噴霧乾燥產生了精細的、白色 的活的粉末，適於氣霧劑分散，具有50%的產物收率，其中包含活細菌。棚列5 肝燥_抄後乂遍幹態·其胴讓舌力為確定經噴霧乾燥的恥垢分枝桿菌在儲藏期間的存活il，噴霧乾燥如實施例3中 進行，並將所得粉末在密封的容器中在4°C，25°C和40°C下儲藏一到兩周。以在板上的菌落 形成單位測定存活il。95 5亮氨酸恥垢分枝桿菌粉末在4°C或25°C下儲藏一周後保留 了相當的存活il，但在40°C下儲藏後沒有明顯的存活。90 10亮氨酸恥垢分枝桿菌粉 末在4°C下儲藏一周後保持存活il，但在較高溫度下無法存活。95 5亮氨酸恥垢分枝 桿菌粉末在25°C下儲藏一周後的電鏡顯微照片示於圖6。實施例6 對使用冷凍保護劑的噴霧乾燥津模為顯示在噴霧乾燥過程中導入賦形劑的方式在保持存活力方面起重要因素的作 用，使用方程36對在噴霧乾燥過程中下述三種不同條件下細胞材料的體積進行建模無冷 凍保護劑，胞內與胞外具有相同濃度的冷凍保護劑，以及較之胞外在胞內具有更高濃度的 冷凍保護劑(圖7)。目的為顯示下述範例，即根據該範例可通過將冷凍保護劑(賦形劑) 導入胞內和/或胞外以使對膜的應力最小化。所述建模使用Mathematica 程序(Wolfram，Inc., Champaign, IL)完成。對所有 三個圖，將起始細胞半徑(Re(O))設為Ιμπι，起始小滴半徑(RdQ)設為25μπι，並將相對細胞 體積針對時間繪圖。將 Lp 設為 1. 0ym/(atm min) ；Rgas 設為 0. 08205745867258821 (atm L)/ (K mol) ；T 設為 295. 15K。在所有三種情況下，k= (Kd LMTD) / ( λ P1) (Eq，33)。LMTD 通過 將進氣溫度設為500°C，出氣溫度設為200°C，起始小滴溫度設為20°C而最終小滴溫度設為 65°C來測定。將這些數值輸入方程30以得到LMTD = ((500°C -20V )-(200°C -65V ))/ (2. 303*log10 ((500°C -20°C ) / (200°C _65°C )))。將 Kd 設為 0. 02kcal/(m hr°C ) ； λ 設為 530kcal/kg ； P i 設為 1000kg/m3。細胞數(ncells)設為 100，排除體積(Vexcluded)設為 0. 46 倍
初始體積。萬；設為ιο_6。對於圖7中的跡線(a)，其中胞外冷凍保護劑濃度較之胞內為低，胞外鹽量(Xes)設 為0. 26M乘以初始小滴體積(Vdtl = 4/3 π (Rdtl)3)，胞內鹽量(Xis)設為0. 26M乘以初始小滴 體積，胞外冷凍保護劑量(x\p)設為Omol，而胞內冷凍保護劑濃度(Cici(O))設為1M。使用 這些條件在時間0到0. 105秒對方程36進行計算以給出跡線(a)。對圖7中的跡線(b)，其中胞外或胞內沒有冷凍保護劑，胞外和胞內鹽的量0^和 Xis)各自設為0. 26M乘以初始小滴體積。胞內冷凍保護劑的量(χ:)和濃度(Ciep(O))分別 設定為Omol和0M。使用這些條件在時間0到0. 105秒對方程36進行計算以給出跡線(b)。對圖7中的跡線(C)，其中胞內冷凍保護劑濃度與胞外冷凍保護劑的濃度相等，胞 外和胞內鹽的量(必和Xis)設為0.26M乘以初始小滴體積。胞內(Cici(O))和胞外冷凍保 護劑濃度設為1M，使得胞外冷凍保護劑濃度(χ:)為IM乘以初始小滴體積。使用這些條件 在時間0到0. 105秒對方程36進行計算以給出跡線(c)。
這些結果顯示取決於導入冷凍保護性賦形劑的方法，得到非常不同的體積偏移 (或膜應力)概略(volume excursion (or membrane stress) profile)。該認識可弓|導出 使細胞活性損失最小化的噴霧乾燥細胞形式的方法。7 誦i寸#^草豸胃&力jl/MtlUX寸耳Ib後胃優,HM胞舌力為了說明使膜應力最小化可以如何改善乾燥細胞的存活力，如實施例3中所示 通過將95 %的4mg/mL亮氨酸溶液與5 %的3xl09CFU/mL的恥垢分枝桿菌懸浮液混合製備 400ml溶液。然而，在此情況下，不向恥垢分枝桿菌懸浮液中添加甘油。這些同樣的溶液亦 在不含甘油的情況下進行噴霧乾燥，並使用等滲鹽水(0.9%氯化鈉)替代所有之前實施例 中使用的蒸餾水。同上，所述溶液在即將到達噴霧噴嘴之前在管線內混合。在20°C與69% 溼度的環境條件下，對所述溶液以進氣溫度150°C，出氣溫度55°C和流速SmL/min進行噴霧 乾燥。平均小滴尺寸估計為50-60微米。表2.在有或無甘油的情況下噴霧乾燥95 5 (恥垢分枝桿菌/亮氨酸) 表2提供了從在有或無甘油存在下對95 5亮氨酸/恥垢分枝桿菌混合物運行噴 霧乾燥獲得的結果。在所有情況下，噴霧乾燥得到了精細的、白色的活的粉末，適用於氣霧 劑分散，具有高產物收率。存活力以在含潮黴素的7H9瓊脂板上的菌落形成單位來測定。對 於無甘油的95 5 (亮氨酸恥垢分枝桿菌)粉末，較之有甘油的那些觀察到明顯較高的 生物存活力。當95 5 (亮氨酸恥垢分枝桿菌)混合物在無甘油而有0.9%等滲鹽水條 件下噴霧乾燥時，相對於無甘油且無0.9%等滲鹽水的95 5(亮氨酸恥垢分枝桿菌)， 觀察到了低細胞存活力(圖8)，說明從所述噴霧乾燥溶液中移除滲透活性物質對於在噴霧 乾燥期間保護微生物的重要性。這些結果證認了實施例6的預測，即在細胞材料懸浮液的乾燥過程中存在冷凍保 護劑或鹽可導致對細胞膜的顯著應力，導致存活力降低，推測這是因為噴霧乾燥期間細胞 死亡的緣故。棚列8甚肺飾舌爐i後碰__軒'燥力口為說明噴霧乾燥細胞保留高存活力可導致在噴霧乾燥粉末中較低的游離水量並 且因而導致較高的細胞含量，如實施例7中，通過將90%，50%，40%，30%，20%和10%的 4mg/mL亮氨酸溶液與10%，50%，60 %，70%，80 %和90%的3xl09CFU/mL恥垢分枝桿菌懸 浮液混合，製備了 400mL溶液，不含甘油並不含鹽。再次，所述溶液在即將到達噴霧噴嘴之 前在管線內混合。在20°C與69%溼度的環境條件下，對所述溶液以進氣溫度150°C，出氣溫 度55°C和流速SmL/min進行噴霧乾燥。平均小滴尺寸估計為50-60微米。圖9顯示了自噴霧乾燥運行所得的存活力結果。如之前實施例中，存活力隨較低 賦形劑濃度而下降，說明高水平的賦形劑是良好細胞存活力所必需的。然而，與之前的實施 例不同，以低至50%的賦形劑濃度獲得了具有良好存活力的精細乾粉。這似乎指明低濃度賦形劑(低於90%)可提供良好結果，如若細胞完整性得到保持，和/或如若未使用下述添 加劑，即所述添加劑在室溫下保持液態，如甘油的情況。存活力以在含潮黴素的7H9瓊脂板 上的菌落形成單位來測量，且顯示的是每個比例四次重複的結果。這些結果說明消除冷凍保護劑導致在賦形劑濃度降低的情況下細胞存活力增加。t施例9 含Slb後分fe桿菌的Bfg乾燥粉末的彳諸藏期(shelf-life)穩定十牛為說明在乾燥後且無凍結的情況下，細胞的存活力可保持一定時間，將在實施例8 中製備的具有50 50和95 5亮氨酸恥垢分枝桿菌的粉末置於4°C、25°C和40°C下的 大量儲藏環境中，且存活力以在含潮黴素的7H9瓊脂板上的菌落形成單位來測量。圖10與11顯示了所述兩種粉末存活力作為時間函數的結果。存活力在幾個月內 得到保持，其中最嚴重的存活力損失發生於前三個月，而在更長的期間內則存活力穩定。在 4°C條件下儲藏的粉末在三個月期間內保持了大於十分之一的原始活性。在25°C條件下儲 藏的粉末保持其存活力高於最適於遞送的IO6閾值，而在40°C條件下儲藏的粉末保持了 2 個月的存活力。50 50和95 5粉末的存活力隨時間變化的差異似乎是由於細菌濃度的 差異，其影響粉末內的含水量。實施例10 使用單磷脂A對穩定件的作用測定了親脂性物質，單磷脂A(MpLA)對噴霧乾燥的恥垢分枝桿菌的作用。進行實 驗以探明油性外被(oily coat)能否用作將內部的水保留在細菌內以增加其在較長時點的 存活力的方法。將恥垢分枝桿菌如上所述用95% 4g/ml亮氨酸溶液和5%恥垢分枝桿菌懸 浮液，以及0.25% MpLA—起進行噴霧乾燥。所述溶液以124°C的進氣溫度和45°C的出氣 溫度進行噴霧乾燥。周圍環境為31. 6°C與34%的相對溼度。從這些條件得到質量收率為 66%。如圖12A和12B所示，經MpLA處理的細菌較之未經MpLA處理的細菌相對而言在 16周的時間段內更具有保持存活力的能力。存活力在儲藏直至一年後測定。實施例11 多種表面活性劑的作用為說明前述結果可用多種分散劑獲得且對存活力無影響，所述95 5和50 50 恥垢分枝桿菌配製劑使用0. 05%泰洛沙泊(在前述實施例中使用的分散劑)與0. 05%和 0. Pluronic -F68製備。這些實驗的結果示於圖13。使用這些Pluronic -F68較之使 用泰洛沙泊產生的粉末，不顯著影響所得粉末的存活力。^MM 12的噴霧幹'燥私制諸藏J廂I定個牛為說明我們的結論對疫苗生物的適用性，我們用牛分枝桿菌BCG實施了相似的實 驗。我們使用與實施例3相同的過程製備了 95 5亮氨酸牛分枝桿菌BCG的粉末，其不 含鹽或冷凍保護劑，並將經乾燥的材料在4°C、25°C和40°C下置於大量儲藏環境中，且以在 7H9瓊脂板上的菌落形成單位測定存活力。圖14顯示直至三個月時兩種粉末的存活力作為 時間函數的結果。儲藏在4°C條件下的粉末大部分在三個月的儲藏過程中保持了其原始存 活力。儲藏在25°C條件下的粉末在三個月時保持了類似的存活力，但有部分損失。這些存 活力結果與圖9和圖10中所示的細菌恥垢分枝桿菌的結果類似。實施例13 噴霧乾燥哺乳動物細胞為顯示具有最小膜滲透應力的高亮氨酸濃度配製劑可進一步適用於非細菌細胞， 我們使用培養的NIH 3T3胚胎小鼠成纖維細胞與原代收穫的大鼠心肌成纖維細胞實施了實驗。我們製備了三種配製劑我們將每毫升一百萬成纖維細胞用每毫升蒸餾水4毫克 亮氨酸以30/70，50/50和70/30的亮氨酸溶液/細胞溶液的體積/體積比懸浮。我們使用 類似於實施例3對恥垢分枝桿菌所用的條件對這些配製劑進行了噴霧乾燥。所有的實驗指明原代收穫的大鼠心肌成纖維細胞和OTH 3T3胚胎小鼠成纖維細 胞具有大致等同的自所述噴霧乾燥過程存活的能力。較高的亮氨酸濃度似乎導致在噴霧幹 燥時較好的存活力；然而，考慮到所述成纖維細胞細胞膜不如細菌細胞膜剛硬(rigid)，且 對於由胞內具有滲透活性的物質產生的滲透應力更敏感，通過在PBS(表3)或「Tyrode」溶 液(表4)中噴霧乾燥細胞獲得了較高的存活力與較低的淨滲透應力。細胞和亮氨酸兩者 均懸浮於PBS或Tyrode中，並如上以亮氨酸溶液/細胞溶液的體積/體積比30/70，50/50 和70/30進行噴霧乾燥。在後者情況下，活NIH 3T3胚胎小鼠成纖維細胞在噴霧乾燥後回 收，並於噴霧乾燥後一個月進行觀察，如圖15中所示。表3.磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)配製劑 表4. Tyrode氏哺乳動物胞外電解質溶液配製劑 在噴霧乾燥後，活的OTH 3T3胚胎小鼠成纖維細胞和原代收穫的大鼠成纖維細胞 從所述70/30，50/50和30/70配製劑中回收並鋪板。圖16和17顯示在噴霧乾燥後第3天和第8天的鋪板的細胞。這些圖顯示較高的賦形劑濃度(亮氨酸濃度)在乾燥時產生較高 的活細胞數。實施例14 動物的吸入免疫材料L-亮氨酸(MW = 131. 2，^ 98. 5 % 純度)，甘油(1，2，3_ 丙三醇，麗 =92. 10)，和泰洛沙泊(4-(1，1，3，3，-四甲基丁基)苯酚，麗=1066)購自 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)。Deionized Sterile Milli-Q Biocel AlOFiltered Water過濾器購自Millipore (Billerica，ΜΑ)。磷酸鹽緩衝鹽水(ρΗ = 7. 4)購自 InvitrogenCorporation(Grand Island, NY)。細菌培養恥垢分枝桿菌mc2155培養於標準基本液體培養基，即含10% 0ADC(油酸，白蛋白， 葡萄糖和過氧化氫酶；BD diagnostics)，0· 2%甘油(SIGMA) ,0.05% Tween 80 (SIGMA)以 及適當時補充以SOyg/ml潮黴素(Roche)的Middlebrook 7H9。對螢光成像，將恥垢分 枝桿菌 mc2155 (Harris and Timbrell, 1977, InInhaled Particles, ed. W. H. Walton. Vol. IV. 1977,Oxford =PergamonPress,pp. 75-89)用潮黴素-標記的附加體質粒轉化，所述質粒 攜帶組成性表達的綠色螢光蛋白(gfp)基因，並將其命名為恥垢分枝桿菌mc2155:gfp。對 所有其它研究，將恥垢分枝桿菌mc2155用pSS3 (攜帶潮黴素抗性盒的附加體質粒)轉化，將 其命名為恥垢分枝桿菌mc2155:pSS3。將恥垢分枝桿菌培養2 3日直至OD為0. 8-1. O。 將細胞沉澱，用PBS-0. 05% Tween 80洗滌，並隨即重新懸浮於同樣體積的H2O-O. 05%泰 洛沙泊中以供噴霧乾燥。泰洛沙泊的作用為在噴霧乾燥前保持所述細菌的分散。通常，供 噴霧乾燥用的懸浮液包含大約109CFU/ml。^^feff ^ BCG Pasteur JA Aeras Global TB Vaccine Foundation (Rockville, MD)獲得。在使用前，將細胞解凍，用PBS-0. 05% Tween 80洗滌，並隨即重新懸浮於同樣 體積的H2O-O. 05%泰洛沙泊中以供噴霧乾燥。通常，供噴霧乾燥用的懸浮液為108CFU/ml。細菌計數通過在含10% 0ADC，0. 5%甘油的Middlebrook 7H10瓊脂糖(對恥垢分 枝桿菌mc2155:pSS3補充以50 μ g/ml潮黴素)上鋪板連續稀釋來確定。噴霧乾燥噴霧乾燥溶液通過將L-亮氨酸(Sigma)溶液與之前製備的恥垢分枝桿菌或牛分 枝桿菌BCG懸浮液以不同的期望比例(wt/wt)混合來製備。使用亮氨酸是因為其為FDA接 受的粘合劑，且不在所用的濃度下對細菌細胞膜施加傷害性的滲透應力作用。攪拌所述亮 氨酸細菌懸浮液並在製備後立即使用。溶液用Buchi Mini Spray Dryer B-290 (Flawil，Switzerland)噴霧乾燥，使用 位於噴霧乾燥圓筒上方的0. 7mm壓力噴嘴頭，乾燥空氣流速為35L/小時。將經噴霧乾燥的 顆粒自高效旋風分離器收集在6英寸收集容器中。進氣溫度在100與125°C間變動以保持 40°C的恆定出氣溫度，以及7ml/分鐘的溶液進樣速率。立即收集粉末以供表徵，或如下所 述儲藏。亮氨酸和恥垢分枝桿菌以按重量計99 1,95 5,70 30和50 50的比例噴霧 乾燥。對本實施例中的大部分實驗，使用95 5亮氨酸恥垢分枝桿菌(或亮氨酸BCG) 單獨一種比例。噴霧乾燥粉末的表在
連續稀釋鋪板用於評估恥垢分枝桿菌或牛分枝桿菌BCG細菌在噴霧乾燥前的細 胞懸浮液中與噴霧乾燥後的粉末中的活菌落形成單位(CFU)數。將粉末分散於PBS-0. 05% Tween 80以溶解賦形劑，並渦旋振蕩以均勻地重懸細菌。為了用CFU評估細菌存活力的穩 定性，將粉末在不同溫度下儲藏限定的時間。將粉末在-20°C，10%相對溼度(RH)(冷凍櫃 條件)，4°C，25% RH(冷藏櫃條件)，25°C，60% RH(環境室溫條件)，以及40°C，75% RH(加 速條件(accelerated condition))下儲藏於單獨小瓶中，並按月間隔鋪板(1,2,3,4,6,9, 12個月)。為確定每種粉末的活細菌中精細顆粒分數(顆粒尺寸小於5.8μπι的質量的比 例)以供填充目的，我們使用了六階段(six-stage)Anderson Cascade Impactor (ACI-6, Thermo Andersen, Smyrna, GA) 0將含有10士2. 5mg粉末的膠囊置於手持乾粉吸入裝置 (Plastiape,Osnago Lecco, Italy)中。對所述吸入器中的膠囊進行穿刺，而激發吸氣(4.2 秒期間28. 3L/分)的泵將所述經乾燥的細菌粉末在不同階段沉積，取決於所述顆粒的空氣 動力學直徑。在每階段收集粉末，並鋪板於7H10瓊脂糖板以確定在每個階段的每種粉末的 CFU數。質量中值空氣動力學直徑(MMAD)通過測量粉末各階段的質量分布使用各階段的空 氣動力學直徑校準來確定。空氣動力學直徑D，其相對於幾何直徑d定義為 D= (ρ/ξ)1/2 d
(37) 其中隨即通過重量分析方法確定顆粒密度P和針對完美球體具有值統一性 (value unity)的無維(dimensionless)形狀係數ξ。可測定該值並將其與質量中值幾何 直徑d相比較以確定每冪(per power)的形狀係數ξ。對具有長度D1和直徑D2的圓柱形 顆粒，所述形狀係數可表示為
and Shape of Aerosol Particles, in Mechanics of Aerosols. 1964, Oxford, England Pergamon Press, pp. 1-20)。牛分枝桿菌BCG的尺寸範圍為大約1-4 μ m的長度和0. 2-0. 4 μ m的軸直徑(D2) (Flynn, Tuberculosis,84 =93-101,2004)；假定為圓柱形則據此得到近似的形狀係數為 0. 6。體積-中值幾何直徑通過雷射衍射光學定徑系統(optical sizing system) (Sympatec HELOS-SystemHiISn該裝置允許使用雷射衍射光學和光敏陣列(laser diffraction optics and photosensor array)測量固體、懸浮液和噴霧的顆粒尺寸分布。 基於每個顆粒均具有均一密度的假定，可採用確定質量中值幾何直徑的算法。顆粒大小可 在多種壓力(0.5，1.0，2.0和4. Obar)處測定以評估顆粒聚集的作用。x5(1的值報導為體積 中值幾何直徑值dg，而X16和X84用於指示顆粒尺寸分布以根據下式獲取GSD 在我們的噴霧乾燥粉末中恥垢分枝桿菌和牛分枝桿菌BCG細菌的總數使用Auramine/Rhodamine螢光染色確定。將BCG粉末渦旋振蕩10分鐘以移除團塊。將所述細 菌溶解於？83/0.05%1 6611"180，並將2(^1^ BCG溶液置於具有0. 2mm χ 0. 2mm網格的載玻 片上。將BCG通過在80°C下加熱2小時的方法固定於載玻片上，並在37°C下用Auramine/ Rhodamine螢光染料染色15分鐘。隨即用緩衝液洗滌載玻片，並在所述載玻片網格的10個 方塊上對細菌數進行計數，並乘以相應的稀釋係數以確定每mL溶液中BCG細菌的總數。cells材料的凍幹凍幹使用Virtis Freezemobile Freeze Dryer (Gardiner, NY)進行。溶液製備 遵循用於噴霧乾燥材料的相同方法。將樣品用乾冰凍結於滅菌玻璃瓶側面上，並置於凍幹 器中。在50psig的壓力下，將溫度降至-20°C持續28小時直至所述粉末因升華而乾燥。乾燥cells 材料的裝瓶(vial filling)噴霧乾燥的安慰劑粉末(不含細菌)在Eratech (Italy)配製並產生，其具有與 BCG粉末相似的氣霧劑分散特徵。這種粉末的組合物按重量計為20%異亮氨酸和80%乳 糖，經選擇以符合粉末的生產規模(production scale)生產的需要，並且還獲取與小規模 產生的細菌粉末具有相似氣霧劑分散(反映於，例如，裝填中)性質的粉末。所選供噴霧幹 燥用的溶劑混合物為70/30水/乙醇。所述噴霧乾燥過程用Labplant SD-06噴霧乾燥器 使用Imm噴嘴在160°C的進氣溫度和67°C的出氣溫度以進樣速率7ml/min和29. 4psig的 噴霧壓力進行。在相對較短的時間段內獲取了兩千克的安慰劑粉末，其MMAD為4.43 μ m， 亦即，在對細菌粉末觀察到的範圍內。將所述粉末用於使用由IMA(Italy)生產的、設計用 來以最大速率每小時4200-6000裝瓶的模塊無菌設備(modular aseptic equipment,MAC) 的裝填部件實施模擬裝瓶。該設備以「真空/壓力(vacuum/pressure)」機理運作，使用真 空以填充容量室(volumetricchamber)並壓實(compact)粉末片，其隨即由瓶中的加壓空 氣排出。在我們的實驗中，將2kg安慰劑粉末置於所述填充設備的計量器(hopper)中，並 分別將所述填充室的體積和真空調整為30和45mg的填充目標。獨立計算填充的粉末的淨 重。經乾燥材料的包裝為調查水分和溫度對乾粉穩定性的作用，將所述噴霧乾燥粉末置於兩種包裝中。 「低水分保護包裝(Low moisture protection packaging) 」允許水分在穩定性測試起始 兩周內進入所述包裝從而使得所述包裝圍住的空間與包裝外60或75% RH的大氣相平衡。 「高水分保護包裝(High-moisture protectionpackaging) 」在整個穩定性測試中保持乾燥 狀態。新生兒吸入器裝置開發了低成本的、基於主動旋轉膠囊的吸入器以供嬰兒疫苗遞送應用。所述吸入 器裝置包含小的氣球型泵，其當受到看護提供者的擠壓時，提供足夠的空氣流以使位於所 述膠囊內的粉末狀疫苗霧化，並將其遞送給嬰兒(圖18)。所述裝置亦包含整合的膠囊穿刺 裝置以及單向氣流控制閥。為測試自所述吸入器的排出劑量(emitted dose)，構建了機電擠壓固定裝置 (electro-mechanical squeeze fixture mechanism) 20以允許在測試過禾呈中連貫且可重 復的啟動所述吸入器裝置(圖19)。對每種粉末配製劑的N = 5的膠囊實施測試。膠囊填充 以大約IOmg安慰劑粉末。評估了亮氨酸和恥垢分枝桿菌按重量計比例為99 1,95 5，70 30和50 50的粉末。膠囊填充以大約IOmg安慰劑粉末。對每個測試的膠囊，對所 述機電固定裝置進行編程以進行5個循環的啟動，每個循環由0. 25秒擠壓期(用球泵28) 繼以2秒的間歇期組成。排出劑量自在擠壓測試之前和之後的重量分析數據確定。動物和處理將重量為479. 4士46. 7g的雄性豚鼠圈養於12小時光照/12小時黑暗的循環中和 22°C恆溫環境下。無限制(ad libitum)提供標準的飲食和水。將動物隨機指定到8個不同 組(每組η = 6)中，並用BCG溶液或顆粒如下免疫皮下2 X IO5CFU和2 X IO6CFU溶液；皮 內 2Χ IO6CFU溶液；皮下 2Χ IO6CFU 95 5 顆粒；和肺部 2X 105CFU、2X IO6CFU和 2X IO7CFU 95 5顆粒(將顆粒遞送至肺)。通過吹入將BCG顆粒施用給經麻醉的動物(Perm Century, Philadelphia, PA)。將未處理的動物用作對照。結核菌素皮試在免疫六周後，評估動物中的延遲型超敏反應，其通過皮內注射純化蛋白衍生物 溶液(PPD，100TU)來進行，並在24小時後測定硬結直徑。細菌攻擊(Bacterial Challenge)緊接著對延遲型超敏反應進行評定後，通過呼吸途徑用結核分枝桿菌菌株H37Rv 的懸浮液，使用氣霧劑暴露室(aerosol exposure chamber)對動物進行攻擊。感染過程的 參數經調整致使每隻動物吸入並保留大約10-15個活的烈性生物體。屍體剖檢在細菌攻擊四周後，通過腹膜內注射致死量的戊巴比妥鈉處死動物。檢查其胸腔 與腹膜腔，並移除肺和脾以評估感染的程度。保護水平依據細菌學、組織病理學和溼組織 重量確定。對於細菌學，將肺右下葉和部分脾臟分別在無菌鹽水溶液中勻漿化，並接種於 M7H10瓊脂板上。活細菌數在37°C下培育三周後計數。對於組織病理學，將組織保存於福 爾馬林溶液中，包埋於石蠟中，並以5μπι切片。將所述切片裝載於玻璃載玻片上並用蘇木 精-曙紅染色。顯微鏡檢由病理學家進行，其對任何動物所接受的處理都為盲的(blind)。統計學將對PPD的結核菌素反應的尺度與肺和脾中經對數變換的細菌數假定為正態 分布的，並通過ANOVA分析。處理間的差異通過最小二乘法顯著性差異多重比較方法 (least-squares significant difference multiple comparisonmethod)石角定。白勺才既 率水平(probability level) (P < 0. 05)視為統計學上顯著的。結果為說明受益於納米和微米尺寸細菌形態的有效氣霧劑疫苗的可行性，用恥垢分枝 桿菌製備了幹細菌粉。以相對大的比例添加胺基酸亮氨酸以減少乾粉狀態下的細菌-細 菌物理相互作用。對不同粉末的視覺評定(圖20)確認存在獨立的乾燥細菌，其形成大約 1-4 μ m長度和大約200-400nm直徑的棒狀結構，而所述亮氨酸顆粒形成球狀顆粒，其平均 幾何直徑為2. 3士 1. 2 μ m，如對100%亮氨酸粉末通過光散射定徑所確定的。所述球狀亮氨 酸顆粒充當物理緩衝物以防止細菌-細菌相互作用。所述棒狀細菌似乎充當最小的亮氨酸 顆粒的「清除劑(scavenger) 」(圖20)，而它們似乎不頻繁與接近平均幾何大小，亦即，大於 Iym的亮氨酸顆粒相關聯。評估了所述不同的幹細菌粉末的氣霧劑性質，如圖21所示。95 5亮氨酸恥垢 分枝桿菌粉末的MMAD相對於更大或更小的亮氨酸恥垢分枝桿菌比例而言為最小。進一步地，如該圖中水平虛線所表示的(純亮氨酸粉末的平均幾何直徑)，該MMAD與95 5(和 70 30)粉末的幾何直徑在統計學上相同，而在更大或更小的亮氨酸恥垢分枝桿菌比例 時則超過了亮氨酸的幾何直徑。該差異反映了空氣傳播的聚集物趨向於相對於幾何直徑增 加空氣動力學直徑，所述趨勢常見於大多數幹顆粒氣霧劑形式(參見Fuchs，N.A. ,Sizeand Shape of Aerosol Particles，in Mechanics of Aerosols，1964，Oxford, England Pergamon Press，pp.1-20)。為評估自適用於低收入環境下的新生兒的吸入器裝置遞送幹細菌形式的能力，排 出劑量性能使用四種不同的安慰劑粉末配製劑自圖18中所示的嬰兒吸入器測試。結果揭 示了對於除最低亮氨酸恥垢分枝桿菌比例的所有比例，自所述嬰兒吸入器的排出劑量較 大，對於99%亮氨酸為99. 05士6. 01%，對95%亮氨酸為92. 59士 16. 73%，對70%亮氨酸為 85. 17士9. 23%，而對 50%亮氨酸僅為 68. 02士6. 43%。已知這些結果，設計了用BCG替代恥垢分枝桿菌的TB疫苗乾粉(95 5亮氨 酸BCG)。在密封容器(sealed enclosure)中在冷藏(4°C )條件下九個月的穩定性 研究後，對所述TB氣霧劑疫苗的物理和生物活性性質進行經時評估。在冷藏條件下， 所述疫苗MMAD保持恆定，在第一天以2. 1 士 1.2μπι起始，而在第九個月以1.9 士 1. Iym 結束。類似地，所述細菌的存活力，以CFU測定，在統計學上保持不變，從第一天的 4.8X105±8.8X104CFU/mg 到第九個月結束時的 4. 5 X IO4士 1. 2X104CFU/mg。在用2X IO6CFU的BCG通過皮下、皮內或肺部途徑免疫的豚鼠中，結核菌素反應的 尺寸是相當的(表5)。在此劑量下，動物產生延遲型超敏反應的能力不受免疫途徑的影響。 然而，用2X IO5CFU的BCG經肺部途徑免疫的動物較之通過皮下途徑接受同樣劑量的動物 而言顯示皮膚反應尺寸的減小。如所期待一般，在未經處理的對照動物中未在PPD注射的 位點觀察到皮膚反應。圖5.在使用BCG的不同配製劑通過不同途徑免疫後六周豚鼠中對100結核菌素 單位的PPD的延遲超敏反應(平均值士標準偏差，η = 6) *P < 0. 05在免疫十周後和感染攻擊四周後，經BCG溶液免疫的動物肺中的細菌負荷 (bacterial burden)顯著小於未經處理的對照，與劑量(2X IO5或2X IO6CFU)或施用途徑 (皮下或皮內)無關(圖22)。此外，在接受BCG的胃腸外免疫的動物肺中的細菌負荷是相 當的，與劑量(2X IO5或2X IO6CFU)、施用途徑(皮下或皮內)或者劑型(顆粒或溶液的皮 下施用)無關。值得注意的是，通過肺部途徑用2X105CFU的BCG顆粒免疫的動物肺中的 細菌負荷顯著低於通過胃腸外途徑(無論溶液或顆粒)免疫的動物。此外，通過肺部途徑 用2 X IO6CFU的BCG顆粒免疫的動物的肺細菌負荷顯著低於用2 X IO5CFU的BCG顆粒免疫 的動物或通過胃腸外途徑(無論溶液或顆粒)免疫的動物的細菌負荷。這說明用此種穩定 粉末疫苗的肺部免疫在預防結核感染方面具有很大潛力。在用不同劑型的BCG免疫的動物 間，脾的細菌負荷無顯著差異(圖22)。肺部細菌學的結果得到了肺部組織病理學結果的印證。在對肺部組織進行組織病 理學分析後的發現在通過胃腸外途徑用2 X IO6CFU的BCG免疫(無論用皮內或皮下，溶液或 顆粒)的動物之間是相當的。在這些動物中少於5%的肺組織受小到中等肉芽腫影響，而少 於25%受極小到輕度壞死影響。與之相對，未經處理的動物中至少20%的肺組織受中等大 小的肉芽腫影響，其絕大部分展示輕度壞死。組織病理學分析亦揭示了在通過肺部途徑用 2 X IO6CFU的BCG顆粒免疫的動物中少於1 %的肺組織受小肉芽腫影響，且其完全不展示幹 酪樣(cascous)壞死(圖23A-23D)。類似地，在用2 X IO5CFU的BCG免疫的動物中，與通過 皮下途徑免疫的不同，通過肺部途徑免疫的動物的肺中的肉芽腫不展示乾酪樣壞死。與之相當的趨勢亦見於脾組織中。當未經處理的動物幾乎90%的脾白髓受中等到 大肉芽腫影響展示輕度乾酪樣壞死，而在經胃腸外免疫的動物中少於10%的脾白髓受小到 中等肉芽腫影響，展示極小的乾酪樣壞死。此外，在用2 X IO6CFU的BCG顆粒通過肺部途徑 免疫的動物中，少於的脾白髓受小肉芽腫影響，其沒有壞死，從而確認了細菌學的結果， 即證明本方法對預防結核有效。其它實施方案已描述了本發明的多種實施方案。儘管如此，應理解可在不背離本發明的宗旨和 範圍的前提下進行多種修飾。相應的，其它實施方案亦包含於權利要求的範圍內。
權利要求
一種乾粉，其包含含有球狀顆粒的賦形劑和含有棒狀顆粒的細胞材料，其中按重量計70％或更多的粉末包含所述球狀顆粒，且按重量計30％或更少的粉末包含所述棒狀顆粒。
2.權利要求1的乾粉，其中所述細胞材料包含細菌。
3.權利要求2的乾粉，其中所述細菌為結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis) 或耳止櫃分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)細菌。
4.權利要求2的乾粉，其中所述細菌為卡介苗(BacillusCalmette-Guerin(BCG))細菌。
5.權利要求1-4中任一項的乾粉，其中所述賦形劑包括亮氨酸、甘露醇、海藻糖、葡聚 糖、乳糖、蔗糖、山梨醇、白蛋白、甘油、乙醇或其混合物。
6.權利要求1-5中任一項的乾粉，其中所述棒狀顆粒具有約1_4μπι的長度與約 200-400nm 的直徑。
7.權利要求1-6中任一項的乾粉，其中所述球狀顆粒具有約1_4μπι的平均幾何直徑。
8.權利要求1-7中任一項的乾粉，其中所述粉末具有約2-3μ m的質量中值空氣動力學直徑。
9.權利要求1-8中任一項的乾粉，其中所述粉末按重量計包含少於10%的水。
10.一種施用細胞材料的方法，所述方法包括通過吸入對受試者施用包含權利要求 1-9中任一項的乾粉的組合物。
11.一種刺激針對細胞材料的免疫應答的方法，所述方法包括對受試者施用包含權利 要求1-9中任一項的乾粉的組合物。
12.權利要求1-9中任一項的乾粉作為疫苗的用途。
13.一種包含權利要求1-9中任一項的乾粉的藥物組合物。
14.一種方法，包括(a)測定要向患者施用的包含細胞材料的乾粉的顆粒的幾何性狀；並(b)若所述粉末包含按重量計70%或更多的球狀顆粒和按重量計30%或更少的棒狀 顆粒，則選擇所述乾粉作為用於通過吸入施用的組合物。
15.權利要求14的方法，其中所述棒狀顆粒包含所述細胞材料。
16.權利要求14的方法，其中所述細胞材料包含細菌。
17.權利要求16的方法，其中所述細菌為結核分枝桿菌或恥垢分枝桿菌細菌。
18.權利要求16的方法，其中所述細菌為卡介苗(BCG)細菌。
19.權利要求14-18中任一項的方法，其中若所述乾粉包含具有約1-4μ m的長度和約 200-400nm的直徑的棒狀顆粒，則選擇所述乾粉。
20.權利要求14-19中任一項的方法，其中若所述乾粉包含具有約1-4μ m的平均幾何 直徑的球狀顆粒，則選擇所述乾粉。
21.權利要求14-20中任一項的方法，其中若所述乾粉具有約2-3μ m的質量中值空氣 動力學直徑，則選擇所述乾粉。
22.權利要求14-21中任一項的方法，進一步包括將所述乾粉配製為藥物組合物用於 通過吸入施用。
23.一種通過權利要求14的方法製備的藥物組合物。
全文摘要
提供噴霧乾燥的細胞材料的方法和組合物從而允許保存所述細胞材料。在一方面，所述細胞材料與一些賦形劑一同噴霧乾燥。在另一方面，所述細胞材料使用冷凍保護劑進行噴霧乾燥。
文檔編號A61K9/14GK101888831SQ200880119524
公開日2010年11月17日 申請日期2008年10月6日 優先權日2007年10月5日
發明者凱文·K·帕克, 布賴恩·普利亞姆, 戴維·A·愛德華茲, 肖恩·希伊, 黃韻鈴 申請人:哈佛大學的校長及成員們