用於乳腺癌和前列腺癌診斷和治療的癌性疾病調節抗體的製作方法

2023-07-01 14:44:11

專利名稱：：用於乳腺癌和前列腺癌診斷和治療的癌性疾病調節抗體的製作方法用於乳腺癌和前列腺癌診斷和治療的癌性疾病調節抗體發明領域本發明涉及癌性疾病調節抗體(CDMAB)的分離和製備，以及CDMAB在診斷和治療過程中的應用，任選地與一種或多種化學治療劑聯合使用。本發明還涉及利用本發明的CDMAB的結合分析。
背景技術：
：每個患有癌症的個體都是獨特的，由於個體的差異，其患有的癌症也不同於其他人所患的癌症。儘管如此，目前的治療採用相同的方式治療患有同期同類型腫瘤的所有患者。至少30%的這些患者的一線治療是失敗的，這樣就造成更多輪次的治療，增加了治療失敗、肺瘤轉移及最終死亡的可能性。一種優越的治療方式應該是針對特定個體的個體化治療。目前唯一採用個體化治療的方式是外科手術。化療和放療不能針對患者量身定做，而在大多數情況下，手術本身並不足以治癒癌症。隨著單克隆抗體的問世，發展個體化治療方法的可能性變得更為現實，因為每種抗體能對應單一的抗原決定簇。而且，製備針對多個抗原決定簇的集群(constellation)的抗體組合成為可能，該抗原決定簇集群唯一確定了某一特定個體的腫瘤。認識到癌細胞和正常細胞的顯著差異在於癌細胞含有轉化細胞特異別轉化細胞的單克隆抗體；這樣就產生了單克隆抗體能夠作為"魔術子彈(MagicBullets)"消除癌細胞的觀點。依照本發明公開的方法分離出的單克隆抗體已經顯示出能夠以有利於患者的方式調節癌性疾病進程，如通過降低腫瘤負荷；並且在本文中這些單克隆抗體將分別被稱為癌性疾病調節抗體(CDMAB)或"抗癌"抗體。目前，癌症患者通常可以選擇的治療方式很少。目前的癌症治療方美國第5,750,102號專利公開了一種方法，其中用可以從患者的細胞或組織中克隆的MHC基因轉染來自患者肺瘤的細胞。然後用這些轉染的細胞給患者接種。美國專利4,861,581公開了一種方法，它包括的步驟有獲取單克隆抗體，該抗體對哺乳動物腫瘤細胞和正常細胞的細胞內成分是特異的，對外部成分沒有特異性；標記單克隆抗體；將該標記的抗體與哺乳動物的組織接觸，該哺乳動物已接受殺滅胂瘤細胞的治療；以及通過測量該標記抗體與退化的肺瘤細胞的細胞內成分的結合來確定治療的效果。在製備針對人類細胞內抗原的抗體時，專利權所有人認識到肺瘤細胞是這類抗原的一個方便來源。美國專利5,171,665提供了一種新型抗體及其製備方法。具體地，該專利敘述了一種單克隆抗體的製備，該抗體有與人類腫瘤(例如腸癌和肺癌)相關的蛋白抗原牢固結合的特性，而與正常細胞的結合程度弱得多。美國專利5，484，596提供了一種癌症治療的方法，所述方法包括手術去除人類癌症患者的胂瘤；處理腫瘤組織以獲得肺瘤細胞；照射胂瘤細胞，使其能成活但不致瘤；用這些細胞來製備抑制原發性肺瘤復發、同時抑制腫瘤轉移的患者疫苗。該專利講述了能夠與腫瘤細胞表面抗原反應的單克隆抗體的研製。如在第4欄，第45行等處提到的，專利權所有人在開發單克隆抗體中應用了自體肺瘤細胞，該單克隆抗體對人類腫瘤表現出活性特異的免疫治療。美國專利5,693,763講述了人類癌細胞的糖蛋白抗原特性，其不依賴於起源的上皮組織。美國專利5,783,186涉及能誘導表達Her2的細胞發生凋亡的抗-Her2抗體、產生該抗體的雜交瘤細胞系、用該抗體和包括所述抗體在內的藥物組合物治療癌症的方法。美國專利5,849,876描述了產生單克隆抗體的新的雜交瘤細胞系，該抗體針對從肺瘤和非胂瘤組織來源中純化的粘液素抗原。美國專利5，869，268涉及一種製備產生特異針對目標抗原的抗體的人類淋巴細胞的方法，製備單克隆抗體的方法及該方法製備的單克隆抗體。該專利特別涉及用於癌症診斷和治療的抗-HD人類單克隆抗體的製法已經改善了總體存活率和發病率。然而，對特定的個體來說，這些改善的統計數據與他們個人情況的改善並無必然關係。因此，如果提出一種方法學，使醫生能夠在同組患者中，獨立於其他患者治療每例腫瘤，這就使根據個人進行量身定做的獨特治療成為可能。理論上，這樣一種治療過程可以增加治癒率，產生更好的效果，從而滿足長期的需要。從歷史上來看，多克隆抗體的應用在治療人類癌症的方面取得的成功有限。一直用人類的血漿來治療淋巴瘤和白血病，但極少有延長的好轉或反應。而且，這種治療方法重複性差，與化療相比，沒有更多的益處。像乳癌、黑色素瘤和腎細胞癌等實體胂瘤也用人類血液、黑猩猩的血清、人類血漿和馬血清來治療過，但相應的結果是不可預測和無效的。有很多用單克隆抗體治療實體腫瘤的臨床試驗。在20世紀80年代，就有至少四項針對人類乳腺癌的臨床試驗，在使用了針對特定抗原或基於組織特異性的抗體的至少47個患者中，只產生了一名應答者。直到1998年，才有了成功的臨床試驗，該試驗聯合使用人源化的抗Her2抗體與順鉑。在這項試驗中，對37個患者的反應進行了評估，大約有四分之一的患者有部分反應，另外一半有輕微的或穩定的病情發展。研究結腸直腸癌的臨床試驗涉及到針對糖蛋白和糖脂耙標的抗體。對腺癌有某些特異性的諸如17-lA等抗體已經進入了II期臨床試驗，其中60多例患者中，只有一例患者產生了部分反應。在其他的試—瞼中，17-1A的使用在額外採用環磷醯胺實驗方案的52例患者中，只產生了l例完全反應，2例輕微反應。其他涉及17-1A的臨床試驗得到與此相似的結果。最初被批准用來成像的人源化鼠單克隆抗體也沒能使肺瘤消退。到目前為止，還沒有對結腸直腸癌有效的抗體。同樣地，對於肺癌、腦癌、子宮癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌的結果同樣不好。用抗CD3單克隆抗體治療黑色素瘤取得了一些有限的成功。因此，可以看到，儘管在作為人類臨床試驗的先決條件的、動物實驗研究中獲得成功，但所測試的抗體在極大程度還是無效的。現有專利備。美國專利5，869，045涉及與人類癌細胞反應的抗體、抗體片段、抗體偶聯物和單鏈免疫毒素。這些抗體的作用機制是雙重的，其中該分子可以與人類癌細胞表面的細胞膜抗原反應，而且該抗體能夠進一步內化入癌細胞內，隨後結合，這對形成抗體-藥物，抗體-毒素的偶聯物尤其有用。未經修飾的抗體在特定濃度下，也表現出細胞毒特性。美國專利5,780,033公開了用於腫瘤治療和預防的自體抗體的用途。不過，這種抗體是來自老年哺乳動物的抗核自身抗體。這裡，自身抗體是指一種存在於免疫系統的天然抗體。因為自身抗體來自"老年哺乳動物，，，所以就不要求自身抗體真正來自受治患者。此外，該專利公開了來自老年哺乳動物的天然單克隆抗核自身抗體及產生單克隆抗核自身抗體的雜交瘤細胞系。發明概述本發明的發明人之前已經被授予發明名稱為"個體化患者特異抗癌抗體"的美國專利6,180,357，該專利要求保護篩選用於癌性疾病治療的個體化抗癌個性抗體的方法。本發明採用了美國專利6,180,357中講述的生產患者特異性抗癌抗體的方法，用以分離編碼癌性疾病調節單克隆抗體的雜交瘤細胞系。這些抗體可以針對一種腫瘤被專門製備，從而使癌症治療的個性化成為可能。在本發明公開的內容中，具有殺滅細胞(細胞毒性的)或抑制細胞生長(細胞生長抑制的)特性的抗癌抗體將在下文中被稱為細胞毒性的。這些抗體能夠用於幫助癌症的分期和診斷，也可以用於治療腫瘤轉移。個性化抗癌治療的前景會給患者的治療方式帶來變化。一種可能的臨床情境是在腫瘤出現時就取樣併入庫。通過該樣品，能夠從預存在的癌性疾病調節抗體組對該腫瘤進行分型。患者將被常規分期，但可用的抗體可以對患者進一步分期。用現有的抗體可以直接對該患者進行治療，展示庫並結合本發明公開的篩選方法製備。製備的所有抗體都將被加入到抗癌抗體庫中，因為其他肺瘤可能攜帶一些與被治療肺瘤相同的抗原表位。根據本方法製備的抗體可以用於治療許多患有與這些抗體結合的腫瘤的患者。除抗癌抗體之外，患者可以選擇接受目前推薦治療作為多模式治療方案的一部分。通過本方法分離的抗體對於非癌細胞相對無毒性這一事實允許大劑量使用抗體組合，要麼單獨應用，要麼與傳統的治療聯合應用。高治療指數也允許短期內的重複治療，從而降低了治療抗性細胞出現的可能性。另外，本發明還包括將標準的化學治療物質，例如放射性核素，與本發明的CDMAB偶聯，從而使所述的化療作用集中。如果患者的初期治療產生耐藥性或發生了轉移，可以重複腫瘤特異性抗體的製備過程進行再次治療。而且，該抗癌抗體可以與從該患者體內獲得的紅細胞偶聯，重新輸注到患者體內用於治療轉移腫瘤。目前幾乎沒有有效的治療轉移癌的方法，而轉移通常預示著導致死亡的不良結果。然而，轉移癌通常血供豐富，通過紅細胞來運輸抗癌抗體可以使抗體富集在腫瘤部位。即便在轉移之前，大多數癌細胞也要依賴於宿主的血供來存活，與紅細胞偶聯的抗癌抗體對原位腫瘤同樣有效。可選^^地，所述抗體可以與其他的血細胞，比如淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞、自然殺傷細胞等偶聯。抗體有五類，每類都與其重鏈所賦予的功能相關。通常認為通過抗體依賴性細胞毒性作用或補體依賴性細胞毒性作用來介導棵抗體的癌細胞殺傷功能。例如，鼠IgM和lgG2a抗體能夠通過結合補體系統的C-l組分來活化人類補體，從而活化導致肺瘤裂解的補體活化的經典途徑。對於人類抗體，最有效的補體激活抗體通常是IgM和IgGl。鼠IgG2a和IgG3同種型抗體可以有效地召集具有Fc受體的細胞毒細胞，其導致單核細胞、巨p藍細胞、粒細胞和某些淋巴細胞的細胞殺傷作用。人的IgGl和IgG3同種型抗體介導ADCC。抗體介導的癌症殺傷功能的另一可能機制是使用能夠催化細胞膜及其相關糖蛋白或糖脂中不同的化學鍵水解的抗體，即所謂的催化抗體。抗體介導癌細胞殺傷的還有另外兩種被更廣泛接受的機制。第一種是抗體做為疫苗誘導機體產生針對位於腫瘤細胞上的假定抗原的免疫反應。第二是抗體用於靶向生長受體並幹擾其功能或者下調該受體以使其功能有效喪失。因此，本發明的目的是釆用特定個體來源的細胞製備癌性疾病調節抗體方法，該抗體對癌細胞有細胞毒性，而同時對非癌細胞相對無毒，該方法是為了分離雜交瘤細胞系和該雜交瘤細胞系編碼的相應的分離的單克隆抗體及其抗原結合片段。本發明的另外目的涉及癌性疾病調節抗體和其抗原結合片段。本發明的另外目的是製備癌性疾病調節抗體，其細胞毒性通過抗體依賴性細胞毒性作用介導。本發明的另外目的是製備癌性疾病調節抗體，其細胞毒性通過補體依賴性細胞毒性作用介導。本發明的另外目的是製備癌性疾病調節抗體，其細胞毒性是其催化細胞的化學鍵的水解的能力的作用。本發明的另外目的是製備癌性疾病調節抗體，其用於癌症診斷、預後和監測的結合分析。本發明其它的目的和優點通過本發明下述的說明、舉例和實施方案將變得顯而易見。附圖簡JH兌明圖1包括1A245.6抗體、兩種抗體的同種型對照抗體以及抗-EGFR抗體針對幾種癌細胞系和非癌細胞系的代表性流式細胞術(FACS)直方圖。圖2包括7BD-33-11A抗體、1A245.6抗體的同種型對照抗體、抗EGFR抗體以及抗EGFR抗體的同種型對照抗體針對幾種癌細胞系和非癌細胞系的代表性FACS直方圖。圖3包括11BD-2E11-2抗體、兩種抗體的同種型對照抗體以及抗-EGFR抗體針對幾種癌細胞和非癌細胞系的代表性FACS直方圖。圖4是特定抗體治療時，腫瘤體積隨時間變化的圖解分析。圖5是抗體對MB231人類乳腺癌腫瘤體積的影響隨時間變化的圖解分析。圖6是定量抗體治療的存活百分比隨時間變化的圖解分析。發明的詳細描述一般而言，下面用於概述、描述、實施例和權利要求書中的字詞或短語通常都有其指定的含義。術語"抗體"使用其最寬泛的涵義，且特別包括，例如單克隆抗體(包括激動劑、拮抗劑和中和抗體，去免疫的、鼠的、嵌合的或人源化的抗體)、攜帶有多表位特異性的抗體組合物、單鏈抗體、抗體的免疫偶聯物和抗體片段(見下文)。本發明中使用的術語"單克隆抗體"指從基本同質的抗體群中荻得的抗體，即構成該群抗體的個別抗體是相同的，除了可以少量存在的可能自然發生的變異。單克隆抗體高度特異性的針對單一抗原位點。而且，與包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體製劑相比，每一種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。除了特異性之外，單克隆抗體的優勢還在於其合成可以不受其他抗體的汙染。修飾語"單克隆的，，指從基本同質的抗體群中獲得的抗體的特徵，而不能解釋為需要通過任何特定的方法來生產該抗體。例如，本發明中使用的單克隆抗體可以通過由Kohlerda/.，Atowe，256:495(1975)首次描述的雜交瘤(鼠或人)方法製備或由重組DNA方法製備(參見，例如，美國專利第4,816,567號)。還可以使用在例如ClacksonWa/.'A^mm，352:624-628(1991)和Marks"a/'/Mo/.說'o/，222:581-597(1991)中描述過的技術，從噬菌體抗體庫中分離"單克隆抗體"。"抗體片段"包括完整抗體的一部分，優選包括其抗原結合區域或可變區。抗體片段的實例包括非全長的抗體、Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙體(diabodies);線性抗體；單鏈抗體分子；單鏈抗體、單結構域抗體分子、融合蛋白、重組蛋白和由抗體片段形成的多特異性抗體。"完整"抗體指包括抗原結合可變區，以及輕鏈恆定區(QJ和重鏈恆定區Ch1，Ch2和Ch3的抗體。恆定區可以是天然序列的恆定區(例如，人天然序列恆定區)或其胺基酸序列的變體。優選地，所述完整抗體有一個或多個效應器功能。依據其重鏈恆定區的胺基酸序列，完整的抗體可以分為不同的"種類"。有五大類完整的抗體IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中的幾類可以進一步分為"亞類，，(同種型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。與不同種類抗體對應的重鏈恆定區分別被稱為a，S，e,y和p。不同種類的免疫球蛋白的三維空間構型和亞單位結構是公知的。抗體"效應器功能"指那些由抗體Fc區引起的(天然序列的Fc區或胺基酸序列變異的Fc區)的生物活性。抗體效應器功能的例子包括Clq結合；補體依賴性細胞毒性作用；Fc受體結合；抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(ADCC);吞噬作用；細胞表面受體的下調(例如B細胞受體；BCR)等。"抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用"和"ADCC"指細胞介導的反應，在所述反應中表達Fc受體(FcR)的非特異性的細胞毒細胞(例如自然殺傷(NK)細胞，噬中性粒細胞和巨噬細胞)識別靶細胞上結合的抗體，並隨後導致靶細胞的裂解。介導ADCC的主要細胞，NK細胞，只表達FcyRIII,而單核細胞表達FcyRI、FcyRII和FcyRIII。Ravetch和Kinet，j朋w.Wev./mmw朋/9:457-92(1991)的第464頁的表3總結了造血細胞的FcR表達。為了測定目標分子的ADCC活性，可以進行例如在美國專利5,500,362或5,821,337描述的體外ADCC活性分析。用於這類分析的效應細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細胞。可選4奪地或附加地，可以在體內評價目標分子的ADCC活性，例如在諸如Clynesa/.屍A^4S(USA)95:652-656(1998)中公開的動物模型中。"效應器細胞"指表達一種或多種FcRs並執行效應器功能的白細胞。優選地，這些細胞至少表達FcyRIII,並執行ADCC效應器功能。介導(NK)細胞、單核細胞、細胞毒T細胞和中性粒細胞；優選PBMC和NK細胞。效應器細胞可以/人其天然來源中分離，例如/人本文中描述的血液或PBMCs中分離。術語"Fc受體"或"FcR"用於描述結合於抗體Fc區的受體。優選的FcR是天然序列的人類FcR。而且，優選的FcR是結合於IgG抗體(y受體)的受體，並包括FcyRI、FcyRII和FcyRIII亞類的受體，其包括這些受體的等位基因變體和選4奪性的剪切形式。FcyRII受體包括FcyRIIA("激活性受體")和FcyRIIB("抑制性受體")，兩者的胺基酸序列相似，區別主要在於其胞漿區。激活性受體FcyRIIA在其胞漿區含有免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受體FcyRIIB在其胞漿區含有免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)。(參見Dagron，v4ww,iev./附m做o/.15:203-234(1997)中的綜述M)。在Ravetch和Kinet,j畫.腸./m腦"o/9:457-92(1991);Capelda/"7m/wwwo/we^20tis14:25-34(1994)禾口deHaasefa/"J丄a6.C7/.A/ed.126:330-41(1995)中對FcR進行了綜述。其他FcR，包括將來要被確認的FcR,都包括在本發明中的術語"FcR"中。該術語也包括負責將母體的IgG轉運到胎兒體內的新生受體，FcRn(Guyer"/，《//wmw"o/.117:587(1976)和Kim^a/"五mk//m附m"o/,24:2429(1994))。"補體依賴性細胞毒性作用"或"CDC"指分子在補體存在下，裂解靶細胞的能力。補體激活途徑通過補體系統的第一組分(Clq)與和同類抗原形成複合物的分子(比如，抗體)的結合啟動。為了評價補體激活，可以進行如在Gazzano-Santoroe,a/.'/7WeAoA202:163(1996)中描述的CDC分析。術語"可變的"指可變區某些部分的序列在抗體間高度不同，並用於每一種特定抗體與其特定抗原的結合及其特異性。然而，變異並不是均勻分布在抗體的可變區域內。它集中在輕鏈和重鏈可變區的三個所謂的高度可變區的片段內。可變區內保守性較高的部分被稱為骨架區(FRs)。每個天然的重鏈和輕鏈可變區，包含主要採用P-片層構型的四個FR，由三個高度可變區連接在一起，形成環狀連接，在一些情況下形成部分〉片層結構。每條鏈的高度可變區通過FRs以密切靠近的方式結合在一起，並與另一條鏈的高度可變區一起，促成抗體的抗原結合部位的形成(參見Kabatetal,Xe，eMceso/o/7mm柳o/og7'c"/7wfemy/(免疫學目標蛋白的序列)，第5版.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Md.pp15-17;48-53(1991))。恆定區並不直接參與抗體與抗原的結合，而是呈現各種效應器功能，例如在抗體依賴性的細胞毒效應(ADCC)中抗體的參與。本發明中使用的術語"高度可變區"指抗體中負責與抗原結合的胺基酸殘基。高度可變區通常包括"互補決定區"或"CDR"的胺基酸殘基(例如輕鏈可變區的胺基酸殘基24-34(Ll)、50-56(L2)和89-97(L3)及重鏈可變區的胺基酸殘基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3);Kabatetal,5^wewceyo/q/"7mmimo/og/ca//j^ems^(免疫學目標蛋白的序列)，第5版.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Md.pp15-17;48-53(1991))和/或"高變環"區的胺基酸殘基(例如輕鏈可變區的殘基2632(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重鏈可變區的26-32(Hl)、53-55(H2)和96-101(H3);ChothiaandLeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987》。"骨架區"或"FR"殘基指除了本發明定義的高變區殘基之外的那些可變區的殘基。抗體經木瓜蛋白酶水解產生兩個相同的被稱為"Fab"片段的抗原結合片段和一個殘餘的"Fc"片段，每個"Fab"片段都有單一的抗原結合部位，"Fc"片段的名稱反映了其易結晶的能力。胃蛋白酶處理抗體產生一個F(ab')2片段，其有兩個抗原結合部位，且仍能夠與抗原交聯。"Fv"是含有完整的抗原識別和抗原結合部位的最小抗體片段。該區域由以緊密、非共價結合的一條重鏈和一條輕鏈可變區的二聚體構成。以這種每個可變區的三個高變區相互作用的構型決定Vh-Vl二聚體表面的抗原結合部位。六個高變區域共同賦予了抗體的抗原結合特異性。然而，即便單一的可變區(或只含有三個抗原特異性高變區的Fv的一半)仍能夠識別和結合抗原，儘管比完整結合位點的親和性低。Fab片段也含有輕鏈恆定區和重鏈的第一恆定區(CH1)。Fab'片段不同於Fab片段之處在於其重鏈CHI區的羧基末端多了幾個胺基酸殘基，包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸。Fab'-SH在本發明中指代Fab',其中恆定區的半胱氨酸殘基至少攜帶一個游離的巰基。最初的F(ab')2抗體片段以Fab'片段對產生，之間有鉸鏈的半胱氨酸。其他的抗體片段的化學偶聯也是公知的。來自任一脊推動物的抗體的"輕鏈"基於其恆定區的胺基酸序列，都可以歸於兩種截然不同的所謂kappa(k)和lambda(人^連中的一種。"單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體的Vh和Vl區，其中這些區域存在於單一的多肽鏈上。優選地，Fv多肽還包含VH和Vt區之間的多肽連接子，其使scFv形成適於抗原結合的結構。關於scFv的綜述參見Pliickthunin77ze/Vzar顧co/ogyo/Mo"oc/。Ma/^4""'6oflfes(單克隆抗體藥理學)，vol.113,RosenburgandMooreeds.，Springer-Verlag，NewYork,pp.269-315(1994)。術語"雙體(Diabodies)"指帶有兩個抗原結合位點的小型抗體片段，該片段在同一多肽鏈上(V『V0包含與輕鏈可變區(VJ結合的重鏈可變區(Vh)。通過使用因過短而不能使同一條鏈上的兩個區域配對的連接子，使這些區域被迫與另一條鏈上的互補區域配對，由此產生了兩個抗原結合位點。例如在EP404,097;WO93/11161;和Hollinger"A^//jcat/.6W.90:6444-6448(1993)中對雙體作了更詳細的描述。"分離"抗體是指從其天然環境的組分中鑑別、分離和/或回收的抗體。其天然環境下的汙染成分是指幹擾抗體診斷或治療作用的物質，可以包括酶、激素和其它的蛋白質或非蛋白質溶解物。因為缺乏抗體的天然環境中的至少一種組分，分離抗體包括重組細胞內部的原位抗體。但是，通常分離抗體會經過至少一步的純化步驟來製備。"結合"目的抗原的抗體是指對該抗原有充分親和力的抗體，以致該抗體在耙定表達該抗原的細胞時，可以作為治療或診斷試劑。如果抗體能結合抗原性部分，它通常會優先結合其抗原性部分，而不是其它受體，這不包括諸如非特異性的Fc接觸的偶然結合或與其他抗原共有的翻譯後修飾成分結合，該抗體不會與其他蛋白有明顯的相互作用。檢測與目的抗原結合的抗體的方法在本領域中是公知的，可以包括但並不局限於例如FACS、細胞ELISA和Western印跡等分析。正如本發明中使用的，"細胞"、"細胞系"、"細胞培養物，，的表述可以交替使用，所有這些用法都包括其子代。也可以理解為由於人為的或非人為的突變，所有的子代在DNA組成上不可能完全相同。在原始轉化細胞內篩選的有相同功能或生物學活性的突變子代包括在內。根據有意使用的不同指代的上下文，指代是清楚的。"治療"既指治療性處理，也指預防性或防止性的措施，其目的就是預防或減緩(減輕)目標病理狀態或病症。需要治療的個體包括那些已經存在所述病症的個體，還包括那些將發展為該病症的或欲對其病症進行預防的個體。因此，本文中欲被治療的哺乳動物已經被診斷為患有該病症或傾向於或易感於該病症。術語"癌症"和"癌性(的)"是指或描述哺乳動物的生理狀態，其典型特徵是細胞生長或死亡不受調控。癌症的實例包括但不限於癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴惡性腫瘤。這些癌症更多具體的例子包括鱗狀細胞癌(例如鱗狀上皮細胞癌)，包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌和肺鱗癌在內的肺癌，腹膜癌，肝細胞癌，包括胃腸道癌在內的胃癌，胰腺癌，膠質母細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝臟癌症，膀胱癌，肝細胞瘤，乳腺癌，結腸癌，直腸癌，結腸直腸癌，子宮內膜或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，前列腺癌，外陰癌，曱狀腺癌，肝癌，肛癌，陰莖癌，還有頭頸部癌。"化療劑"是用於癌症治療的化合物。化療劑的實例包括諸如噻替派和環磷醯胺(CYTOXANTM)的烷化劑；例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)、哌泊舒凡(piposulfan)的烷基磺酸酯類；如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替口底(meturedopa)、烏瑞替派(uredopa)的氮丙啶類；包括六曱蜜胺、曲他胺(triethylenemelamine)、三亞乙基磷醯胺、三亞乙基硫代磷醯胺和三曱基奧羅蜜胺(trimethylolomelamine)在內的乙蜂亞胺類(ethylenimines)和曱基蜜胺類(methylamelamine);如瘤可寧(chlorambucil)、萘氮芥、環磷醯胺、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺、氮芥(mechlorethamine)、鹽酸曱氧氮芥、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀、曲磷胺、烏拉莫司汀(umcilmustard)等氮芥類藥物；如卡氯芥、氯脲黴素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司丁、雷莫司汀等硝脲類(nitrosureas);如阿克拉黴素類、放線菌素、安麴黴素、重氮絲氨酸、博來黴素、放線菌素C、加裡剎黴素、洋紅黴素、碳黴素(camomycin)、嗜癌黴素、色黴素、放線菌素D、柔紅黴素、地託咪定、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿黴素、表阿黴素、依索比星、依達比星、麻西羅黴素、絲裂黴素、黴酚酸、諾加黴素、橄欖黴素、灰黴素、potfiromydn、嘌呤黴素、三鐵阿黴素、羅多比星、鏈黑黴素、鏈佐星、殺結核菌素、烏苯美司、淨司他丁、佐柔比星類抗生素；曱氨碟呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)類抗代謝類藥；如二曱葉酸、氨曱喋呤、蝶羅呤、三曱曲沙等葉酸擬似物；如氟達拉濱、6-巰噪呤、硫米噤呤、硫鳥。票呤類噤呤類似物；如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮雜尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU等嘧啶類似物；如卡魯睪酮、屈他雄酮丙酸酯、表硫雄醇、美雄烷、睪內酯酮等男性激素類藥物；如氨魯米特、米託坦、曲洛司坦等抗腎上腺類藥物；如亞葉酸等葉酸補充物；醋葡醛內酯；醛磷醯胺糖苷；氨基乙醯丙酸；安吖咬；bestrabucil;比生群；依達曲沙；地磷醯胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鳥氨酸；依利醋銨；依託格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達明；米託胍腙；米託蒽醌；莫哌達醇；尼曲吖啶；噴司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；足葉草酸；2-乙肼；丙卡巴肼；PSK;雷佐生；西佐喃；鍺螺胺；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；烏拉坦；長春地辛；達卡巴。秦；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴衛矛醇；哌泊溴烷；gacytosine;阿拉伯糖香("Ara-C");環磷醯胺；塞替派；如紫杉醇(TAXOL⑧:Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,NJ.)和多西他賽(TAXOTERE⑧:Aventis,Rhone-PoulencRorer,Antony,France)等紫杉烷類；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥。票呤；巰噤呤；曱氨蝶呤；如順鉑和卡鉑等鉑類似物；長春鹼；柏；依託泊苷(VP-16);異環磷醯胺；絲裂黴素C;米託蒽醌；長春新鹼；長春瑞濱；去曱長春石鹹；諾消靈(novantrone);替尼泊苷；柔紅黴素；氨蝶呤鈉；希羅達；伊班膦酸鈉；CPT-11;拓樸異構酶抑制劑RFS2000;二氟曱基鳥氨酸(DMFO);視黃酸；埃斯波黴素；卡培他濱；以及上述任一種藥物在藥學上可以接受的鹽、酸或衍生物。調節或抑制激素對胂瘤作用的抗激素類藥物也包括在本定義內，像抗雌激素藥物，包括例如它莫西芬、雷洛昔芬、芳香化酶抑制劑4(5)-咪唑、4-鞋基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷諾昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮和託瑞米芬(法樂通)；以及抗雄激素物質，例如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任一種藥物在藥學上可以接受的鹽、酸或衍生物。用於治療目的的"哺乳動物，，指任何一種可以歸於哺乳類的動物，包括人類、小鼠、免疫缺陷鼠(SCID)或棵鼠或品系小鼠、家畜和農場動物及動物園內的動物、體育動物或寵物，比如綿羊、狗、馬、貓、母牛等。優選地，本發明中的哺乳動物指人類。"寡核苷S臾"指短長度、單鏈或雙鏈多聚脫氧核香酸，其通過已知的方法(例如磷酸三酯、亞磷酸鹽、亞磷醯胺化學)，利用例如發表於1988年5月4日的EP266,032中描述的固相技術，或利用Froehleretal,Nucl.AcidsRes.，14:5399-5407,1986描述的脫氧核苷H-磷酸鹽中間物化學合成。然後將其用聚丙烯醯胺凝膠純化。"嵌合"抗體指免疫球蛋白，其部分重鏈和/或輕鏈與來源於特定種屬其餘序列與來源於另一種屬或屬於另一種類或亞類的抗體的對應序列相同或同源，此外還指這些抗體的片段，只要它們能夠表現出所需的生物活性(美國專利4,816,567和MorrisonW"/，A^/.」c"w'ca48,15),能夠識別和結合由ATCCPTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643雜交瘤細胞系產生的單克隆抗體(ATCCPTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643抗體)針對的抗原決定表位。本發明中使用的"靶抗原"指ATCCPTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643抗原或其部分。本發明中使用的"免疫偶聯劑"指以化學或生物學方式連接到細胞毒素、放射物質、酶、毒素、抗胂瘤藥或治療劑的諸如抗體的任一分子或配體。只要能夠與其靶標結合，該抗體可以在其分子的任一部位與細胞毒素、放射物質、抗腫瘤藥或治療劑連接。免疫偶聯劑的實例包括抗體毒素化學偶聯劑和抗體-毒素融合蛋白。本發明中使用的"融合蛋白"指任一嵌合蛋白，其抗原結合區與例如毒素、酶或蛋白藥物的生物活性分子連接。為了更充分理解本文中描述的發明，進行下述說明。本發明提供特異識別並結合ATCCPTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643抗原的配體(即ATCCPTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643配體)。本發明的配體可以以任一形式存在，只要其具有一個抗原結合區域，所述配體能竟爭性抑制由雜交瘤細胞ATCCPTA-48卯、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643產生的單克隆抗體與其靶抗原的免疫特異性結合。因此，任一具有與ATCCPTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643相同的結合特異性的重組蛋白(例如，其中抗體與另一種諸如淋巴因子或胂瘤抑制生長因子的蛋白結合所形成的融合蛋白)都屬於本發明的範圍。在本發明的一個實施方案中，所述配體是ATCCPTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643抗體。在其他實施方案中，所述配體是一個抗原結合片段，其可以是具有ATCCPTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643抗體的抗原結合區的Fv分子(例如單鏈Fv分子)、Fab分子、Fab'分子、F(ab')2分子、融合蛋白、雙特異性抗體、異種抗體或任一重組分子。本發明中的配體針對的抗原決定簇是ATCCPTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643單克隆抗體針對的決定簇。本發明中的配體可以被修飾，即通過分子內的胺基酸修飾，產生出衍生分子。也可以是化學修飾。衍生分子要保留多肽的功能特性，也就是說，具有這類取代的分子仍能夠使該多肽與ATCCPTA-48卯、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643抗原或其部分結合。胺基酸取代包括但不必然限於在本領域中公知的"保守"胺基酸取代。舉例來說，被稱為"保守胺基酸取代"的某些胺基酸取代能夠在蛋白質中頻繁出現，但不改變該蛋白質的構象或功能，這是蛋白質化學中已建立的法則。這些改變包括用異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)和亮氨酸(L)的任一種取代這些疏水胺基酸的任何其它一種；天門冬氨酸(D)取代穀氨酸(E)，反之亦然；穀氨醯胺(Q)取代天冬醯胺(N)，反之亦然；以及絲氨酸(S)取代蘇氨酸(T),反之亦然。其他的取代也可以被認為是保守的，取決於特定胺基酸的環境和其在蛋白質三維結構中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)可以經常互換，丙氨酸和纈氨酸(V)也是。相對疏水的蛋氨酸(M)可以經常與亮氨酸和異亮氨酸互換，有時與纈氨酸互換。賴氨酸(K)和精氨酸(R)經常互換，其發生部位胺基酸殘基的明顯特徵是其帶電特性，這兩種胺基酸的不同pK的差別並不明顯。在特定情境下，仍有其他的一些變化可以被認為是"保守的"。給定一種抗體，本領域的技術人員可以生產出竟爭性抑制的配體，例如竟爭性抗體，其可以識別相同的抗原決定簇(Belanger等人，1973)。一種方法是用表達該抗體識別抗原的免疫原產生免疫。該樣本可以包括組織、分離的蛋白或細胞系，但並不局限於這些。利用諸如ELISA、FACS或免疫沉澱的竟爭性分析篩選產生的雜交瘤，所述竟爭分析能鑑別抑制所檢測抗體結合的抗體。另一種方法是利用噬菌體展示抗體庫，淘選識別所述抗原的抗體(Rubinstein等人，2003)。在任何一種情況下，雜交瘤的篩選都是基於其與靶抗原的結合能力竟爭超出原標記抗體。因此，這些雜交瘤的特徵是可以與原始抗體識別相同的抗原，更具體地，可以識別同樣的抗原決定簇。實施例1雜交瘤製備一雜交瘤細胞系7BD-33-11A,1A245.6,11BD-2E11-2雜交瘤根據布達佩斯條約，雜交瘤細胞系7BD-33-11A和1A245.6於2003年1月8日保藏於美國典型培養物保藏中心，位於美國維吉尼亞州20110-2209馬納薩斯大學路10801，保藏號分別為PTA-4890和PTA-4889。依據37CFR1.808的規定，保藏者保證在專利授權時將不可撤銷地取消對公眾獲取該保藏材料的所有限制。才艮據布達佩斯條約，雜交瘤細胞4朱11BD-2E11-2於2003年11月11日保藏於美國典型培養物保存中心，位於美國維吉尼亞州20110-2209馬納薩斯大學路10801，保藏號為PTA-5643。依據37CFR1.808的規定，保藏者保證在專利授權時將不可撤銷地取消對公眾獲取該保藏材料的所有限制。為了製備產生7BD-33-11A抗癌抗體的雜交瘤，在冷PBS中製備抗原，即人類乳腺癌細胞的單細胞懸液。通過以分次劑量皮下和腹腔注射含有20萬至250萬個細胞的100微升抗原-佐劑和弗氏完全佐劑免疫8到9周齡的BALB/c小鼠。初次免疫三周後，用新鮮製備的含有20萬至250萬個細胞的抗原-佐劑以同樣的方式加強免疫小鼠，並在上次加強後兩周再加強一次。在最後一次免疫後的至少兩天，取出脾臟用於融合。通過融合分離的脾細胞以及Sp2/0骨髓瘤伴侶以製備雜交瘤。檢測所述雜交瘤亞克隆融合的上清。為了製備產生1A245.6抗癌抗體的雜交瘤，在冷PBS中製備抗原，即人類乳腺癌細胞的單細胞懸液。通過以分次劑量皮下和腹腔注射含有250萬個細胞的100^t升抗原-佐劑和弗氏完全佐劑免疫8到9周齡的BALB/c小鼠。初次免疫後3周，用新鮮製備的含有250萬個細胞的抗原-佐劑以同樣的方式加強免疫小鼠，2周後、五周後以及上一次加強三周後再加強免疫小鼠。在最後一次免疫後的至少三天，取出脾臟用於融合。將分離的脾細胞與NS0-1骨髓瘤伴侶融合以製備雜交瘤。檢測所述雜交瘤亞克隆融合的上清。為了製備產生11BD-2E11-2抗癌抗體的雜交瘤，在冷PBS中製備抗原，即人類乳腺癌細胞的單細胞懸液。通過以分次劑量皮下和腹腔注射含有20萬至250萬個細胞的100微升抗原-佐劑和弗氏完全佐劑免疫8到9周齡的BALB/c小鼠。初次免疫後兩周或三周，用新鮮製備的含有20萬至250萬個細胞的抗原-佐劑以同樣的方式加強免疫小鼠，並在上次加強後兩周再加強一次。在最後一次免疫後至少兩天，取出脾臟用於融合。將分離的脾細胞與NS0-1骨髓瘤伴侶融合以製備雜交瘤。4企測所述雜交瘤亞克隆融合的上清。為了檢測雜交瘤分泌的抗體是IgG,還是IgM同種型，進行ELISA分析。將4。C包被緩沖液(0.1M碳酸鹽/碳酸氬鹽緩沖液，pH9.2-9.6)中的濃度為2.4嗎/ml的山羊抗小鼠的IgG+IgM(H+L)，按100jul/孔加入ELISA板過夜。該ELISA板用洗滌緩衝液(PBS+0.05%Tween)洗三次。按100|^1/孔加入封閉緩沖液(5%奶洗滌緩沖液)，室溫1小時，隨後用洗滌緩衝液洗三次。按100pl/孔加入雜交瘤上清，將該板室溫孵育l小時。所述板用洗滌緩衝液洗三次，按100pl/孔加入山羊抗小鼠的IgG或IgM辣根過氧化物酶偶聯物的1/5000稀釋液(用含1%牛血清白蛋白的PBS稀釋)。室溫孵育1小時後，該板用洗滌緩衝液洗三次。按100pl/孔加入TMB溶液，室溫孵育1至3分鐘。按100(il/孔加入2MH2S04,終止顏色反應，用Perkin-ElmerHTS7000酶標儀在450nm波長處讀板。如表1所示，7BD-33-llA、1A245.6、11BD-2E11-2雜交瘤主要分泌IgG同種型抗體。經過1至4輪有限稀釋，在細胞ELISA分析中，檢測雜交瘤上清中與草巴細胞結合的抗體。檢測了三種乳腺癌細胞系MDA-MB-231(也被稱為MB-231)、MDA-MB-468(也被稱為MB-468)和SKBR-3。板內的細胞在使用前先固定。室溫下，該板用含MgCl2和CaCl2的PBS洗三次。每孔加PBS稀釋的2%的多聚曱醛100^1，室溫10分鐘，然後棄掉多聚曱醛。再用含MgCl2和CaCl2的PBS在室溫下洗滌該4反三次。每孔加100pl5。/。奶洗滌液(PBS+0.05%Tween)進行封閉，室溫1小時。該板用洗滌液洗三次，按100iil/孔加入雜交瘤上清，室溫孵育l小時。用洗滌緩沖液將該板洗三次，按100pl/孔加入辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗小鼠的IgG或IgM的1/5,000稀釋液(用含1%牛血清白蛋白的PBS稀釋)。室溫孵育l小時後，該板用洗滌緩沖液洗三次，每孔加入100jilTMB底物，室溫孵育1-3分鐘。每孔加入100(il2MH2S04終止反應，用Perkin-ElmerHTS7000酶標儀在450nm波長處讀板。如圖1列表所示，結果表示為與IgG同種型對照(3BD-27)比較高出背景的倍數。7BD-33-11A和1A245.6雜交瘤細胞系產生的抗體與檢測的所有三種乳腺癌細胞系都強烈結合，至少比背景高出6倍。兩種抗體與MDA-MB-231細胞系的結合最強。雜交瘤細胞系11BD-2E11-2產生的抗體也與MDA-MB-231細胞系強烈結合，但是與另外兩種細胞系的結合併沒顯示出比背景強。這些結果表明該抗體識別的表位在MDA-MB-468或SKBR-3細胞上不存在，與7BD-33-11A和1A245.6識別的表位明顯不同。進行抗體結合試驗的同時，在相同的乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468和SKBR-3上，檢測了雜交瘤上清的細胞毒性作用。活/死細胞毒性分析試劑盒購自MolecularProbes公司(Eu，OR)。根據廠商的說明書並作下述的改動後進行分析。在分析前，將細胞根據預先確定的適當密度進行鋪板。兩天後，將100pl來自雜交瘤微孔板的上清轉移到細胞培養板中，在5%C02孵箱中孵育5天。將陽性對照孔吸淨，加入100pi疊氮鈉和/或放線菌酮。因為已知3BD-27單克隆抗體不與檢測的三種乳腺癌細胞繫結合，所以該抗體也被加入作為同種型對照。抗-EGFR抗體(C225)也被用於該分析，以作比較。經過5天的處理後，倒空反應板的液體並吸乾。通過多通道塑料擠瓶，將含MgCl2和CaCl2的室溫DPBS分到每孔中，叩打三次，倒出液體並吸乾。每孔加入50(il用含MgCl2和CaCl2的DPBS稀釋的螢光活/死(Live/Dead)染料，在37。C含5%C02的孵箱內孵育30分鐘。該板置於Perkin-ElmerHTS7000螢光讀板儀內讀數，數據用MicrosoftExcel進行分析，結果在表l中列出。觀察到三種抗體的細胞毒性有所差異。11BD-2E11-2顯示出39-73%殺傷作用，在SKBR-2細胞上觀察到的細胞毒性最高。1A245.6和7BD-33-llA在MDA-MB-231細胞中呈現相似的細胞毒性，但1A245.6對於MDA-MB-468細胞也具有細胞毒性，而7BD-33-l1A則沒有。這表明來源於雜交瘤細胞的抗體能在癌細胞中產生細胞毒性作用。在抗體的結合程度與雜交瘤上清產生的細胞毒性作用之間也存在普遍的聯繫。這種趨向有一些例夕卜，比如儘管11BD-2Ell-2對MB-468和SKBR-3細胞結合微弱，但11BD-2E11-2在MB-468和SKBR-3癌細胞中仍有細胞毒性。這提示該抗體具有在這種細胞類型上無法被細胞ELISA結合分析檢測到的調節活性，或者由於分析本身的限制(例如細胞的固定)而檢測不到其結合。最後，另一個可能性是所述分析在該特定情況下對檢測足以介導細胞毒性作用的結合不是足夠的敏感。另一個例外是儘管7BD-33-11A對MB-468細胞的結合與同種型對照相比高出背景六倍，但該抗體對MB-468細胞的細胞毒性作用較弱。這提出了一種可能性，即結合不一定必然預測抗體與其相關抗原連接的結果。已知的非特異性細胞毒性物質放線菌酮產生了預期的細胞毒性作用。tableseeoriginaldocumentpage24實施例2抗體製備通過在CL-1000瓶(BDBiosciences,Oakville,ON)中培養雜交瘤7BD-33-llA、1A245.6、11BD-2E11-2來製備單克隆抗體，每星期進行兩次收集和再接種。然後用蛋白G瓊脂糖4快流(ProteinGSepharose4FastFlow)(AmershamBiosciences,Baied'Ur伝，QC)進行標準的抗體純化操作。本發明的範圍包括利用人源化的、嵌合的或鼠單克隆抗體。在細胞毒性分析中，7BD-33-llA、1A245.6、11BD-2E11-2與許多陽性對照(抗Fas(EOS9.1，IgM，k,20孩i克/毫升，eBioscience,SanDiego,CA),抗-Her2/neu(IgGl，k，10孩i克/毫升，InterMedico,Markham,ON),抗-EGFR(C225,IgGl，k，5微克/毫升，Cedarlane,Homby，ON),放線菌酮(100微摩爾，Sigma,Oakville，ON)，NaN3(0.1%，Sigma，Oakville,ON))以及陰性對照(107.3(抗-TNP，IgGl，k，20微克/毫升,BDBiosciences,Oakville,ON),G155-178(抗-TNP,IgG2a，k，20孩吏克/毫升，BDBiosciences,Oakville,ON)，MPC-11(抗原特異性未知，IgG2b，k，20微克/毫升)，J606(抗-果聚糖，IgG3，k，20微克/毫升)，IgG緩衝液(2%》比較(表2)。檢測了乳腺癌(MB-231,MB-468,MCF-7)、結腸癌(HT-29，SW1116，SW620)、肺癌(NCIH460)、卵巢癌(OVCAR)、前列腺癌(PC-3)以及非-癌(CCD27sk，Hs888Lu)細胞系(所有這些細胞系都來自ATCC,Manassas,VA)。活/死細胞毒性檢測試劑盒購自MolecularProbes公司(Eugene,OR)。根據廠商的說明書並作下述的改動後進行分析。在4企測前細胞以預確定的合適密度鋪板。2天以後，將100微升純化抗體稀釋到培養基中，然後轉移入細胞板中，在8。/。C02的孵箱中孵育5天。然後倒空培養板並吸乾。通過多通道塑料擠瓶，將含MgCl2和CaCl2的室溫DPBS分到每孔中，。P打三次，倒出液體並吸乾。每孔加入50|il用含MgCl2和CaCl2的DPBS稀釋的螢光活/死染料，在37。C含5%C02的孵箱內孵育30分鐘。該板置於Perkin-ElmerHTS7000螢光讀板儀內讀數，數據用MicrosoftExcel進行分析，結果在表2中列出。數據表示為四次試驗的平均值，每次三個重複，並以如下方式定性四次試驗中四次高於閾細胞毒性(thresholdcytotoxicity)記為(+++),四次試驗中三次高於閾細胞毒性記為(++)，四次試驗中兩次高於閾細胞毒性記為(+)。表2中未標記的細胞表示幾次結果不一致或低於閾細胞毒性的作用。抗體7BD-33-llA和1A245.6在乳腺以及前列腺腫瘤細胞系中顯示出選擇性的細胞毒性，而對非轉化的正常細胞沒有影響。兩種抗體都顯示出比陽性對照抗-Fas抗體高25至50%的殺傷作用。11BD-2E11-2在乳腺和卵巢癌細胞中具有特異的細胞毒性，並且對正常細胞沒有影響。化學細胞毒性試劑誘導了預期的細胞毒性，而用於對比的許多其他的抗體的表現也與預期相同，儘管生物的細胞分析有局限性。總之，三種抗體均顯示出對許多類型的癌細胞都有細胞毒性活性。由於並不是所有的癌細胞類型都是敏感的，抗體在其活性上有選擇性。此外，所述抗體顯示出功能性特異性，因為其在非-癌細胞類型中並沒產生細胞毒性，這在治療情況下是一個4艮重要的因素。tableseeoriginaldocumentpage26用於FACS的細胞的製備如下首先用DPBS(無鈣離子和鎂離子)沖洗單層細胞，然後在37°C用細胞解離緩沖液(INVITROGEN)使細胞脫離培養板。離心之後，在4。C用含MgCl2、CaCl2以及25%胎牛血清的Dulbecco's磷酸鹽緩沖液(洗滌培養基)重懸細胞並計數，分至適當的細胞密度，離心以沉澱細胞並重懸於含20微克/毫升7BD-33-llA、1A245.6、11BD-2E11-2或對照抗體(同種型對照或抗-EGFR)染色培養基(含MgCl2和CaCl2的DPBS)中，冰上放置30分鐘。加入AlexaFluor488-偶聯的二抗之前，用洗滌培養基洗細胞一次。加入溶於染色培養基的AlexaFluor488-偶聯的抗體，i文置20分鐘。用含1孩t克/mL硪化丙咬(propidiumiodide)的染色培養基最後洗一次細胞。通過在使用CellQuest軟體的FACScan(BDBiosciences)上運行樣品來評估流式細胞計數的細胞獲取結果。細胞的前向散射(FSC)和側向散射(SSC)通過調整FSC和SSC檢測器的電壓和振幅設定。三個螢光通道(FL1、FL2和FL3)的檢測器通過運行用純化的同種型對照抗體染色，繼而用AlexaFluor488-偶聯二抗染色的細胞來調整，以使細胞有一個統一的螢光強度大約l-5個單位的波峰。通過FSC設門和碘化丙咬排除來獲取活細胞。對於每一份樣品，獲取大約10,000個活細胞進行分析，結果列於表3中。表3列出高於同種型對照的平均螢光密度的倍增，並如下定性小於5為(-);5至50為(+);50至100為(++);高於100為(+++),括號中為染色細^^的百分比。表3tableseeoriginaldocumentpage277BD-33-11A抗體的代表性直方圖彙編至圖1，1A245.6抗體的代表性直方圖彙編至圖2，11BD-2Ell-2抗體的代表性直方圖彙編至圖3並顯示結合特徵，在某些情況下包含示例的雙峰。11BD-2Ell-2呈現出對於乳腺腫瘤細胞系MDA-MB-231的特異性腫瘤結合。7BD-33-llA和1A245.6呈現對於乳腺(MDA-MB-231和MCF-7)、結腸、肺、卵巢和前列腺來源的癌細胞系具有類似的結合，但對一種乳腺癌細胞系(MDA-MB-468)的結合有所不同。這三種抗體全部都與非-癌細胞結合，但所述結合併不產生細胞毒性作用。這是結合併不必然地預示著抗體與其相關抗原連接的結果的進一步證據，並且是非顯而易見的發現。這表明在不同細胞中細胞毒性作用取決於抗體連接的情形，而並不僅僅取決於抗體結合。實施例3體內試驗參見圖5和圖6顯示的數據，在四至八周齡的雌性SCID小鼠頸背部皮下注射100微升以植入五百萬個MDA-MB-231人乳腺癌細胞。小鼠被隨機分成四個處理組，每組10隻。植入前一天，將30(H鼓升體積的測試抗體11BD2E-ll-2、7BD-33-llA、1A245.6或3BD-27同種型對照抗體(已知不與MDA-MB-231細胞結合)以20mg/kg的量經腹腔給藥，所述液體由含2.7mMKC1，1mMKH2P04，137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀釋液將儲存液稀釋後得到。所述抗體以同樣方式每周給藥一次，一共7周。大約每7天用測徑器測量肺瘤生長，觀察達10周，或直至動物個體達到加拿大動物保護協會(CCAC)的終點。在研究期間記錄動物的體重。研究結束時所有動物都根據CCAC的指導原則被施以安樂死。整個研究中沒有出現臨床毒性症狀。每周一次測量的體重可以作為健康或發育停滯的替代指標。在用同種型對照、3BD-27以及7BD-33-llA、1A245.6或11BD-2Ell-2治療的各組之間，在體重上有最小的差異。在第60天(停止治療後11天)，1A245.6治療組的肺瘤體積是對照組的5.2%(p=0.0002),表明抗體治療在降低胂瘤負荷方面的有效性。那些用7BD-33-llA抗體治療的致癌攜帶癌細胞的小鼠沒有得病，並且沒有肺瘤負荷。11BD-2E11-2治療組在第67天時肺瘤體積縮小(對照的45%)(p=0.08)。這也表明，細胞毒性抗體治療與對照抗體相比，能減小腫瘤負荷。用7BD-33-llA、1A245.6和11BD-2E11-2細胞毒性抗體治療還有相應的存活益處(圖6)。用3BD-27抗體治療的對照組在移植後第74天達到100%的死亡率。相反，7BD-33-11A治療組沒有得病並且1A245.6治療的動物呈現100%的存活率，11BD-2Ell-2治療組存活率為24%。總之，相比對照抗體，細胞毒性抗體治療在公認的人類癌症模型中使肺瘤負荷降低並增加了存活率，這表明這些抗體(7BD-33-llA、1A245.6和11BD-2E11-2)在用於包括人類在內的其他哺乳動物的治療中具有藥理學和藥物學益處。實施例4體內建立的肺瘤試驗將頸背部皮下注射的100微升中的五百萬個MDA-MB-231人乳腺癌細胞植入到五至六周齡的雌性SCID小鼠。每周用測徑器測量腫瘤生長。植入後第34天，當該群小鼠的大多數的腫瘤體積達到100mmS(範圍從50至200mm"時，三個處理組的每組被隨機分入8-10隻小鼠。將150微升的7BD-33-11A、1A245.6測試抗體或3BD-27同種型對照抗體(已知不結合MDA-MB-231細胞)以15mg/kg的量經腹腔給藥，所述液體由含2.7mMKC1,1mMKH2P04,137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀釋液將儲存液稀釋後得到。然後所述抗體以同樣方式給藥，每周三次，總共10次，直至植入後第56天。每7天用測徑器測量腫瘤生長，直至植入後第59天或直到動物個體達到加拿大動物保護協會(CCAC)的終點。在研究期間記錄動物的體重。研究結束時所有動物都根據CCAC的指導原則被施以安樂死。整個研究中沒有出現臨床毒性症狀。每周測量一次體重。同種型對照和7BD-33-llA，或1A245.6抗體治療組之間在體重上沒有顯著差異。由圖4可以看出，才直入後第59天(治療結束後兩天)，7BD-33-llA治療組的肺瘤體積是對照組的29.5%(p=0.0003)。在該組，第59天的數值與第52天比較時，平均腫瘤體積還有衰退的趨勢(pi.25)。同樣，1A245.6抗體治療也顯著地抑制肺瘤生長，並降低腫瘤負荷。用這種抗體處理的攜帶建立的腫瘤的動物的肺瘤體積是用同種型對照抗體處理組的56.3%(p=0.017)。總之，相比對照抗體，7BD-33-llA或1A245.6抗體在公認的人類癌症模型中顯著降低了建立的腫瘤的腫瘤負荷，表明了這些抗體在用於包括人類在內的其他哺乳動物的治療中具有藥理學和藥物學益處。本說明書中提及的所有專利和公開出版物代表了本發明所屬領域的技術人員的水平。所有專利和公開出版物通過引用的方式併入本文，其S1用程度如同每個出版物被特別單獨地指明以引用的方式併入本文。應該明白，儘管本發明以某種形式被說明，但這不是要將本發明限定在本文所描述和顯示的特定形式或布局。對本領域的技術人員顯而易見的是，在不偏離本發明的範圍的前提下還可以做出各種變化，且不應當認為本發明限於本說明書中顯示和描述的內容。本領域的技術人員很容易看出使本發明較好地適合實現所描述的目的並獲得最終結果和益處，以及其中固有的部分。本文中描述的任一寡核苷酸、肽、多肽、生物相關化合物、方法、程序和技術都是優選實施方案中有代表性的，其目的在於示例，並不是限制本發明的範圍。本領域的技術人員能夠想到包括在本發明精神的範疇內的變化和其它用途，並由所附權利要求書的範圍所限定。儘管藉助特定的優選實施方案描述了本發明，但是應理解所要求保護的本發明並不僅僅局限於這些特定的實施方案。事實上，所描述的實施本發明的方式的各種變化，對本領域的技術人員來說是顯而易見的，均在所附權利要求書的範圍內。維吉尼亞州20110-2209馬納薩斯大學路10801電話703-365-2700傳真703-365-2745為專利？呈序的微生物《呆藏耳JU尋國卩示7"p:i人的布達f風其開條約國際表禾艮J居第7.3條發布的微生物《呆藏"i正明以及才-艮J居第10.2條發布的微生物存》'舌聲明(譯文)致(保藏人或代理人名稱及地址)AriusResearchInc.(阿里烏斯研究公司)代理人LisaCechetto55YorkStreet16thFloorToronto,OntarioCanadaM5J1R7(加拿大多倫多)代表AriusResearchInc.(阿里烏斯研究公司)而保藏保藏人標識號專利保藏指定小鼠雜交瘤細胞系7BD-33-11APTA-4890所述保藏附有以下說明的_科學性描述_建議的分類描述。本國際保藏機構T2003年1月8日收到所述保藏，並且所述保藏已被接受。應您的要求L我們旌向您通知30年內對所述菌種的請求。如果布達佩斯條約成員國專利局證明某人有權收到該菌種，或者如果已出版引用該菌種的美國專利，且美國專利與商標局或本保藏人指示ATCC釋放該菌種，那麼將可獲得該菌種。如果該培養物在所述保藏的有效期內死亡或被破壞，那麼您將負有用相同的活培養物代替它的責任。在自保藏日起至少30年內，或者在最近的樣品請求之後5年內，該菌種將被維持，所述時間以較長者為準。美國和其他很多國家都是布達佩斯條約成員國。於2003年1月19日檢測以上所引用培養物的存活。在當天，所述培養物是存活的。國際保藏機構AmericanTypeCultureCollection(美國典型培養物保藏中心)，Manassas,VA20110-2209USA(美國維吉尼亞)ATCC授權代表籤字_日期2003年2月11日FerrisLander先生巻號2056.018維吉尼亞州20110-2209馬納薩斯大學路10801電話703-365-2700傳真703-365-2745為專利，呈序的微生物《呆藏耳又:得國際7"rv:i人的布達f風其/f條約國際表才、艮J居第7.3條發布的微生物^f呆藏i正明以及才、艮J居第10.2條發布的^散生物存^舌聲明(譯文)致(保藏人或代理人名稱及地址)AriusResearchInc.(阿里烏斯研究公司)代理人IisaCechetto55YorkStreet,16thFloorToronto,ONM5J1R7(加拿大多倫多)代表AriusResearchInc.(阿里烏斯研究公司)而保藏保藏人標識號專利保藏指定小鼠雜交瘤細胞系1A245.6PTA-4889所述保藏附有以下說明的_科學性描述_建議的分類描述。本國際保藏機構於2003年1月8日收到所述保藏，並且所述保藏已被接受。應您的要求2￡_我們旌向您通知30年內對所述菌種的請求。如果布達佩斯條約成員國專利局證明某人有權收到該菌種，或者如果已出版引用該菌種的美國專利，且美國專利與商標局或本保藏人指示ATCC釋放該菌種，那麼將可獲得該菌種。如果該培養物在所述保藏的有效期內死亡或被破壞，那麼您將負有用相同的活培養物代替它的責任。在自保藏日起至少30年內，或者在最近的樣品請求之後5年內，該菌種將被維持，所述時間以較長者為準。美國和其他很多國家都是布達佩斯條約成員國。於2003年1月27日檢測以上所引用培養物的存活。在當天，所述培養物是存活的。國際保藏機構AmericanTypeCultureCollection(美國典型培養物保藏中心)，Manassas,VA20110-2209USA(美國維吉尼亞)ATCC授權代表籤字_曰期2003年2月11日FerrisLander先生巻號2056.018權利要求1.單克隆抗體或誘導細胞毒性作用的配體，其特徵在於具有競爭性抑制分離的單克隆抗體與其靶抗原結合的能力，所述分離的單克隆抗體由以PTA-4890保藏於ATCC的克隆編碼。2.由權利要求1所述的抗體或配體，其是人源化的。3.由權利要求1所述的抗體或配體，其是嵌合的。4.引發抗體誘導的選自人乳腺或前列腺腫瘤的組織樣本中癌細胞的細胞毒性作用的方法，所述方法包括提供如權利要求1、2或3中的任一項所述的單克隆抗體或誘導細胞毒性作用的配體，以及將所述單克隆抗體或誘導細胞毒性作用的配體與所述組織樣本接觸。5.如權利要求1、2或3中的任一項所述的單克隆抗體或配體，其與選自細胞毒性部分、酶、放射活性化合物和造血細胞的成員偶聯。6.治療哺乳動物中對於抗體誘導的細胞毒性作用敏感的人類乳腺和前列腺肺瘤的方法，其中所述人類乳腺腫瘤和前列腺肺瘤表達與由保藏在ATCC、保藏號為PTA-4890的克隆編碼的分離的單克隆抗體或其誘導細胞毒性作用的配體特異性結合的抗原，所述方法包括以有效誘導細胞毒性作用的量給予所述哺乳動物權利要求1或2或3中的任一項所述的單克隆抗體或誘導細胞毒性作用的配體，從而降低所述哺乳動物的肺瘤負荷。7.如權利要求6所述的方法，其中所述單克隆抗體或配體與細胞毒性部分偶聯。8.如權利要求7所述的方法，其中所述細胞毒性部分是放射性同位素。9.如權利要求6所述的方法，其中所述單克隆抗體或配體激活補體。10.如權利要求6所述的方法，其中所述單克隆抗體或配體介導抗體依賴的細胞毒性作用。11.單克隆抗體或誘導細胞毒性作用的配體，其特徵在於具有竟爭性抑制分離的單克隆抗體與其靶抗原結合的能力，所述分離的單克隆抗體由以PTA-4889保藏於ATCC的克隆編碼。12.如權利要求11所述的抗體或配體，其是人源化的。13.如權利要求11所述的抗體或配體，其是嵌合的。14.引發抗體誘導的選自人類乳腺或前列腺腫瘤的組織樣本中癌細胞的細胞毒性作用的方法，所述方法包括提供如權利要求11、12或13中的任一項所述的單克隆抗體或誘導細胞毒性作用的配體，以及將所述單克隆抗體或誘導細胞毒性作用的配體與所述組織樣本接觸。15.如權利要求11、12或13中的任一項所述的單克隆抗體或誘導細胞毒性作用的配體，其與選自細胞毒性部分、酶、放射活性化合物和造血細胞的成員偶聯。16.治療哺乳動物中對於抗體誘導的細胞毒性作用敏感的人類乳腺和前列腺肺瘤的方法，其中所述人類乳腺和前列腺腫瘤表達與由保藏在ATCC、保藏號為PTA-4889的克隆編碼的分離的單克隆抗體或其誘導細胞毒性作用的配體特異性結合的抗原，所述方法包括以有效誘導細胞毒性作用的量給予所述哺乳動物如權利要求ll或12或13中的任一項所述的單克隆抗體或誘導細胞毒性作用的配體，從而降低所述哺乳動物的胂瘤負荷。17.如權利要求16所述的方法，其中所述單克隆抗體或配體與細胞毒性部分偶聯。18.如權利要求17所述的方法，其中所述細胞毒性部分是放射性同位素。19.如權利要求16所述的方法，其中所述單克隆抗體或配體激活補體。20.如權利要求16所述的方法，其中所述單克隆抗體或配體介導抗體依賴的細胞毒性作用。全文摘要本發明涉及一種使用新型篩選模式製備患者癌性疾病調節抗體的方法。該方法利用癌細胞的細胞毒性作用作為指標來分離抗癌抗體，使製備諸如以保藏號PTA-4890和PTA-4899保藏在ATCC的雜交瘤所產生的抗體的抗癌抗體成為可能。所述抗體可以用於輔助癌症分期和診斷，還可以用於治療原發性腫瘤，例如前列腺癌或乳腺癌，以及治療腫瘤轉移。所述抗癌抗體能夠與毒素、酶、放射性化合物和造血細胞偶聯。文檔編號C07K16/30GK101437851SQ200780015795公開日2009年5月20日申請日期2007年3月5日優先權日2006年3月7日發明者大衛·S·F·楊,海倫·P·芬德利,蘇姍·E·哈恩申請人:阿里烏斯研究公司