用10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤治療甲氨蝶呤抗性病症的方法
2023-06-12 16:44:16
專利名稱：用10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤治療甲氨蝶呤抗性病症的方法
用10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤治療甲氨蝶呤抗性病症的方法
背景技術：
甲氨蝶呤(methotrexate，也稱為「MTX」)作為組合化學療法方案的一部分用於治療多種癌症。它是包括急性淋巴母細胞性白血病在內的多種贅生性病症的治療劑。甲氨蝶呤還用作一些自體免疫性疾病的治療劑，所述自體免疫性疾病包括重症肌無力、多肌炎、皮肌炎、包涵體肌炎、強直性脊柱炎、克羅恩氏病(Crohn' s disease)、牛皮癬、膿皰性牛皮癬、牛皮癬性關節炎、類風溼性關節炎、韋格納氏肉芽腫病(Wegener' s granulomatosis)和硬皮病。10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤(包括「10-炔丙基-ΙΟ-dAM」、「普拉曲沙(pralatrexate) 」、「外消旋 PDX，，、「 (2S) _2_[ [4_[ (IRS) _1_[ (2，4- 二氨基蝶啶 _6_ 基)甲基]丁 _3_炔基]苯甲醯基]氨基]戍二酸」、「(2RS) _2_[ [4_[ (IRS) _1_[ (2，4-二氨基蝶 啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲醯基]氨基]戊二酸」和「PDX」)是已經過測試並且發現適用於治療癌症的化合物。10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤已得到美國食品藥物管理局(U. S. Food and Drug Administration, FDA)批准作為復發性和難治性周圍T細胞淋巴瘤的治療劑。同時還在對10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤在淋巴瘤、肺癌、膀胱癌和乳癌中的使用進行研究。10-塊丙基-10-去氮雜氨基蝶呤最初由DeGraw等，"Synthesis andAntitumorActivity of 10-Propargyl-10-deazaaminopterin, " J. Med. Chem. 36:2228-2231 (1993)公開並且顯示可充當酶二氫葉酸還原酶(「DHFR」)的抑制劑和充當鼠類L1210淋巴細胞性白血病細胞系的生長抑制劑。另外，使用鼠類E0771乳腺腫瘤模型也得到關於該化合物的抗腫瘤性質的一些結果。美國專利號6，028，071和PCT公布號WO 1998/02163公開了高度純化的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤組合物在異種移植物模型中進行測試時具有對抗人腫瘤的功效。利用10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤進行的後續研究已顯示其在單獨使用和與其它治療劑組合時都是有用的。舉例來說，Sirotnak等，Clinical Cancer Research,第6卷，3705-3712 (2000)報導了共同施用10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤與丙磺舒(probenecid, cMOAT/MRP樣質膜ATP酶的一種抑制劑)會大大增強10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤對抗人實體腫瘤的功效。已顯示，10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤和10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤與鉬基化學治療劑的組合對間皮瘤是有效的。(Khokar等，Clin.Cancer Res. 7:3199-3205 (2001))。與吉西他濱(gemcitabine, Gem)共同施用以治療淋巴瘤已公開在W0/2005/117892中。美國專利號6，323，205中公開了 10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤與紫杉酚的組合是有效的。還已顯示，10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤有效用於治療T細胞淋巴瘤，參見美國專利號7，622，470。其它研究已顯示一種通過測定由樣本表達的還原型葉酸載體-I蛋白(RFC-I)的量來評估淋巴瘤對用10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤治療的敏感性的方法，其中所表達RFC-I的水平較高指示對10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的敏感性較高，公開於PCT公布號WO 2005/117892中。
10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤被稱為抗葉酸劑/抗代謝物。葉酸通路在細胞生長和增殖中起關鍵作用(Appling, 1991 ；0din等，2003)。葉酸(葉酸鹽)通過還原型葉酸載體I (RFC-I)進入細胞，由葉醯聚穀氨酸合成酶(FPGS)聚穀氨酸化，並且被還原成二氫葉酸，二氫葉酸進一步由二氫葉酸還原酶(DHFR)轉化成四氫葉酸(THF)。此通路中所涉及的不同酶和轉運體是一類重要的細胞毒性劑(即抗葉酸劑)的靶標。甲氨蝶呤是此類別的第一藥劑之一併且首先被用於治療兒童期急性淋巴母細胞性白血病(Farber等，1948)。從那以後，甲氨蝶呤被廣泛地用於血液系統和實體癌症，並且已合理設計出了多代新型抗葉酸劑以利用葉酸通路的多個方面(例如，用於結腸直腸癌的雷替曲塞(raltitrexed) (Cocconi等，1998)和用於惡性胸膜間皮瘤(Vogelzang等，2003)與非小細胞肺癌(NSCLC) (Hanna等，2004)的培美曲塞(pemetrexed))。在大多數腫瘤細胞中，RFC-1介導葉酸類似物的內化。一旦進入細胞，這些類似物就結合二氫葉酸還原酶(DHFR)，由此消耗嘌呤和胸苷生物合成所需要的細胞內還原型葉酸池，或者這些類似物將在與DHFR結合之前就被代謝成聚穀氨酸鹽。聚穀氨酸化由葉醯基-聚穀氨酸合成酶(FPGS)催化。葉醯基-聚穀氨酸水解酶(FPGH，也稱為Y-穀氨醯基水解酶[GGH])介導這些細胞內聚穀氨酸化的抗葉酸劑的裂解並且因此介導其後續清除。胸苷酸合成酶(TS)和甘氨醯胺核糖核苷酸甲醯基轉移酶 (GARFT)也在葉酸代謝中涉及作為「再循環」酶(因此直接影響可用於DNA合成的核苷酸池)。甲氨蝶呤是一種抗葉酸劑。基於對細胞系的測試，認為10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤與甲氨蝶呤具有類似的細胞毒性型態，10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的效力經常是甲氨蝶呤的3倍至19倍。甲氨蝶呤抗性通常因為DHFR基因的突變和擴增而發生。存在細胞可能獲得針對此葉酸拮抗劑的作用的免疫力的三種已知途徑。細胞中甲氨蝶呤的濃度可通過將該藥物移進和移出細胞的轉運系統的改變而減少。舉例來說，如果細胞藉以吸收甲氨蝶呤的轉運體的數量減少，那麼將會在細胞中存在較少甲氨蝶呤。此外，細胞中藥物的濃度可以由聚穀氨酸化和代謝作用的速率改變來調控。當藥物的聚穀氨酸化較慢或者代謝較快時，其可能更易於從細胞中除去，從而降低其在細胞中的濃度和活性。DHFR基因的擴增引起所存在DHFR的量增加並且已顯示與對甲氨蝶呤治療的反應降低有關。甲氨蝶呤必須與DHFR結合方能阻止DHFR的活性。如果遺傳改變以減少甲氨蝶呤結合的方式改變DHFR的結合區，那麼DHFR可能繼續活化葉酸並且治療的有效性將降低。所有這些結果都與對甲氨蝶呤的抗性增加有關。甲氨蝶呤抗性可能快速獲得並且可以導致治療失敗。因此，克服獲得性甲氨蝶呤抗性的方法將是有用的。發明概述在一個實施方案中，本發明包括一種治療個體的甲氨蝶呤抗性病症的方法。此方法可包括向所述個體施用有效量的包含10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤或它的藥學上可接受的鹽的組合物。在另一個實施方案中，本發明包括一種治療需要甲氨蝶呤抗性瘤形成治療的個體的方法，其中所述方法包括向所述個體施用有效量的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤或它的藥學上可接受的鹽。在一些實施方案中，所述病症為癌症。在其它實施方案中，所述病症為炎症性病症。在一個實施方案中，組合物被配製用於靜脈內施用。在另一個實施方案中，組合物被配製用於口服施用。附圖簡述圖I示出適用於製備10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的合成方案；圖2示出10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤和其它葉酸抑制劑對所測試的15種癌細胞系的敏感性；圖3示出當用10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤或甲氨蝶呤處理時，未處理、經過10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤適應(DU-PDX)和經過甲氨蝶呤適應(DU-MTX)的DU-145細胞的IC5tl ；圖4示出當用10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤或甲氨蝶呤處理時，未處理、經過 10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤適應(HEP-PDX)和經過甲氨蝶呤適應(HEP-MTX)的HEP2細胞的IC5tl ；圖5示出10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤抗性細胞系中葉酸基因的相對mRNA表達；圖 6 示出 DU145 和 HEP2 敏感性以及 DU-PDX、DU-MTX, HEP-PDX 和 HEP-MTX 10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤和甲氨蝶呤抗性細胞系中的DHFR蛋白的蛋白質印跡； 圖 7 示出 DU145 和 HEP2 敏感性以及 DU-PDX、DU-MTX, HEP-PDX 和 HEP-MTX 10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤和甲氨蝶呤抗性細胞系中的DHFR的mRNA表達。發明詳述癌症患者中與療法有關的一個持續問題是對療法的反應的個體差異和腫瘤內導致化學療法抗性的遺傳改變。化學療法涉及施用通常靶向快速分裂的細胞的藥物。多種化學治療藥物幹擾細胞分裂之前的DNA複製，所述藥物包括抗葉酸劑。儘管化學治療劑已有許多進步，但癌細胞，尤其是晚期癌症的遺傳不穩定性導致了藥物抗性癌症的高發生率。在本發明中，由DU145(前列腺)和HEP2 (頭頸部)癌細胞系產生具有獲得性甲氨蝶呤和10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤抗性的細胞系。對10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的抗性為親本細胞的200倍以上的同時，具有獲得性10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤抗性的DU-PDX和HEP-PDX細胞對甲氨蝶呤展示出交叉抗性；DU_MTX和HEP-MTX細胞仍對10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤展不出顯著的敏感性。觀察到對10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤與對甲氨蝶呤的獲得性抗性的機制不同。獲得性10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤抗性在DU-PDX與HEP-PDX細胞系中與RFClmRNA表達顯著減少有關，另外，還觀察到MDRlmRNA表達少量增加。本發明還顯示在10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤抗性細胞中FPGS mRNA表達稍有減少，表明了聚穀氨酸化在10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤抗性中的作用。三十年前進行的研究發現，獲得性甲氨蝶呤抗性的常見機制是DHFR基因擴增和由此而引起的酶過度表達(由Assaraf2007 ；Chen等，1995評述)。因此，在以逐漸遞增濃度的甲氨蝶呤選擇所培養的腫瘤細胞系時，獲得性抗葉酸劑抗性經常歸因於DHFR基因擴增。實際上，在本發明中，具有獲得性甲氨蝶呤抗性的細胞系HEP-MTX展示出與它的親本對應物相比，DHFR蛋白表達顯著增加，表明在此模型中可能有DHFR基因擴增。此種蛋白質增加未在10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤抗性細胞系中觀察至IJ。這些發現結果表明在這些細胞系中甲氨蝶呤抗性與10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤抗性的分子機制不同。如果癌症的生長速率由於與治療劑接觸而與它在不與治療劑接觸的情況下的生長相比受到抑制，那麼所述癌症對所述治療劑「有反應」或對治療有「良好反應」。癌症的生長可以多種方式測量，例如可以測量腫瘤的尺寸或適於所述腫瘤類型的腫瘤標記的表達。這些標準定義了所測量的反應的類型以及疾病進展時間的表徵，疾病進展時間是腫瘤對治療劑的敏感性的另一個重要的量度。對10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤具有反應性的特性是一種可變的特性，其中不同的癌症在不同的條件下對給定的治療劑顯示出不同水平的「反應性」。另外，反應性的量度可以使用除腫瘤生長尺寸以外的其它標準來評估，包括患者生活品質、轉移程度等。此外，臨床預後標記和變量可以在適用情況下進行評估。如果癌症的生長速率由於與諸如10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的治療劑接觸而在與它在不與所述治療劑接觸的情況下的生長相比時未受到抑制或受到極低程度的抑 制，那麼所述癌症對於所述治療劑「無反應」或具有「較差反應」，或對治療存在較差反應。如上所述，癌症的生長可以多種方式測量，例如，可以測量腫瘤的尺寸或適於所述腫瘤類型的腫瘤標記的表達。對治療劑無反應的特性是一種高度可變的特性，其中不同的癌症在不同的條件下對給定的治療劑顯示出不同水平的「無反應性」。另外，無反應性的量度可以使用除腫瘤生長尺寸以外的其它標準來評估，包括患者生活品質、轉移程度等。此外，臨床預後標記和變量可以在適用情況下進行評估。這種無反應性或較差反應性癌症可能無反應或最初有反應，但後來獲得了抗性。抗性或無反應性可針對其它更敏感的癌症或腫瘤細胞系或針對相同類型的癌症或腫瘤細胞系進行測量。這些類型的癌症也可以稱為對特定化學治療劑具有「抗性」的癌症，如甲氨蝶呤抗性癌症可能最初對甲氨蝶呤具有抗性，或者可能在用甲氨蝶呤或另一種化學治療劑進行的一次治療過程或多次治療過程中獲得了對甲氨蝶呤的抗性。所述抗性可能是由葉酸通路蛋白、葉酸輸入通路之一中的蛋白質的一處突變或多處突變所致，或者由與對甲氨蝶呤的反應相關的任何其它蛋白質所致。因此，在一個實施方案中，本發明包括一種治療個體的甲氨蝶呤抗性病症的方法，其中所述方法包括向所述個體施用有效量的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤和它的藥學上可接受的鹽。腫瘤獲得對原先對它們具有毒性的藥物作用的抗性的能力可以產生抗性。這種獲得性抗性可能由染色體破壞引起。滲透性降低是固有抗性的常見形式。藥物的變更或者失活也許是藥物抗性的最常見機制。藥物抗性還可能由其所作用的目標位點改變引起。諸如癌症的病症獲得甲氨蝶呤抗性的情形可通過主治醫師或本領域的其他技術人員進行評價來確定，並且包括治療時病症消退或靜止，接著在一定時間的治療期後病症進展。已觀察至IJ，在包括癌症在內的許多病症中，多種病症對治療表現出獲得性抗性。因此在另一個實施方案中，本發明涉及一種治療在用甲氨蝶呤治療期間獲得了甲氨蝶呤抗性的葉酸通路依賴性疾病或惡性腫瘤的方法，所述方法包括施用治療有效量的包含10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤或它的藥學上可接受的鹽的組合物。「治療」可以意指使用療法來預防或抑制進一步腫瘤生長，以及引起腫瘤收縮，和提供更長的存活時間。治療還意圖包括預防腫瘤轉移。如果癌症或腫瘤的至少一種症狀(如由反應性/無反應性、進展時間或本領域中所已知和本文中所描述的指標所確定)得到減輕、終止、減緩、最小化或抑制，那麼所述腫瘤「受到抑制」或「得到治療」。如本文所進一步描述，按照使用治療方案(例如10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤)進行的治療腫瘤的任何症狀(身體或其它方面)的任何改善都在本發明的範圍內。因此，一般來說，本文所使用的術語「治療」意指減輕症狀、在暫時或永久的基礎上消除癌症或炎症性病症的病因、減緩症狀的出現和/或病症的進展，或者預防疾病(即，防治性治療)。接受防治性治療的受試者一般為由於例如遺傳易感性、飲食、暴露於致病原、暴露於病原體等而有癌症或炎症性病狀風險的哺乳動物。在本發明的一個實施方案中，用於本發明方法的組合物可以包括10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤，包括「高度純化」的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤，和10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的非對映體。如本發明說明書和其權利要求書中所用，「高度純化」的組合物含有大致上不含會干擾10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的抗腫瘤活性的其它葉酸衍生物(尤其是10-去氮雜氨基蝶呤)的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤。本發明範圍內的組合物可以包括用於將10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤配製成適用於治療用途的劑量單位形式的載體或賦形劑，以及另外的非葉酸治療劑。10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤在碳10 (ClO)和碳19 (C19)位置含有不對稱中·心。在一個實施方案中，10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤包括ClO手性中心R構型與S構型的約I: I外消旋混合物，和彡98. 0%的C19手性中心的S型非對映體。10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤包括ClO非對映體I3DX-IOa [S構型]化學名稱(2S) -2- [ [4- [ (IS)-I-[ (2，4- 二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁 -3-炔基]苯甲醯基]氨基]戊二酸，和rox-iob [R構型]化學名稱(2S)-2-[[4-[(lR)-l-[(2，4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁 _3_炔基]苯甲醯基]氨基]戊二酸。10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可以使用DeGraw等的美國專利號5，354，751的實施例7中公開的方法合成，所述美國專利涉及製造10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤並且以引用方式整體併入本文。10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤還可通過美國專利號6，028，071，尤其實施例I中呈現的方法來合成，所述美國專利以引用方式併入本文。為了產生10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的非對映體，可如本文和其它處所教導合成10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤，並且最終產物或較早中間產物隨後可以被用作起始物質來分離ClO非對映體。或者，可以採用手性合成，其中由多種起始物質中的任一種直接製備大致上純的PDX-IOa和/或rox-10b。可以採用本領域中已知的用於分離對映體或非對映體的手性柱來分離最終10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤或較早中間體的非對映體。適用於分離非對映體的手性柱包括可從日本的大賽璐化學工業株式會社(Daicel ChemicalIndustries Ltd.，Japan)獲得的手性柱CHIRALPAK AD，使用乙醇作為流動相。在一些實施方案中，葉酸通路依賴性疾病或病症是癌症。在其它實施方案中，葉酸通路依賴性疾病或病症是炎症性病症。在一些實施方案中，癌症或炎症性病症是最初對甲氨蝶呤至少在一定程度上敏感，然後獲得甲氨蝶呤抗性的病症。確定葉酸通路疾病或病症是否對甲氨蝶呤具有固有或獲得性抗性的方法可由本領域的技術人員確定，並且可以包括諸如培養或獲得相關細胞(如來自患者的腫瘤細胞)並且測定與對甲氨蝶呤的抗性和/或敏感性相關的各種葉酸通路酶的表達水平的方法。另一所述方法為測定和/或監測患者對甲氨蝶呤治療的反應以揭示固有或獲得性抗性。可對相關細胞進行基因型分析或表型分析以測定指示甲氨蝶呤抗性的標記的相對表達。
在一個實施方案中，用於本發明的表型測定包括從患者獲得腫瘤外植體，培養所述外植體的部分，從所述外植體培育出相關細胞的單層，使所述單層暴露於藥物候選物，以及評估藥物候選物改變腫瘤細胞表型的能力。本發明的基因型分析通過任何已知的方法來完成。優選方法包括將從患者獲得的細胞的基因型或其部分與已知與一般或特定同所評價的治療候選物相關的藥物抗性有關的基因型進行比較。舉例來說，患者細胞中存在已知或懷疑會賦予對治療候選物的抗性的多態變體將會將所述候選物從針對所述細胞的潛在治療劑中篩選出去。患者細胞的遺傳特徵通過下文所述的本領域已知的方法(例如測序、多態現象)進行測定。患者基因型對藥物抗性的影響可通過參考將與抗性相關的已知突變或多態現象分類的遺傳資料庫或文庫來確定。雖然不受任何機制束縛，但細胞中與對甲氨蝶呤的抗性或獲得性抗性有關的突變的實例包括但不限於DHFR mRNA和/或蛋白質表達相對於敏感性細胞或相對於獲得抗性之前的細胞有所增加。在一些實施方案中，癌症或炎症性病症對甲氨蝶呤具有獲得性抗性。欲治療的癌 症包括例如前列腺癌、乳癌、黑色素瘤、肺癌和T細胞淋巴瘤。對於T細胞淋巴瘤，存在多種適於使用本發明的非對映體治療的病狀，並且所述病狀包括(a)淋巴母細胞性淋巴瘤，其中惡性腫瘤在來自胸腺的原始淋巴祖細胞中發生；(b)成熟或周圍T細胞贅生物，包括T細胞前淋巴細胞性白血病、T細胞粒狀淋巴細胞性白血病、侵襲性NK細胞白血病、皮膚T細胞淋巴瘤(蕈樣肉芽腫/塞扎裡綜合症(Sezary syndrome))、退行性大細胞淋巴瘤、T細胞型、腸病型T細胞淋巴瘤、成人T細胞白血病/淋巴瘤(包括與HTLV-I相關者)和血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤，和皮下脂膜炎性T細胞淋巴瘤；以及(c)最初累及淋巴結副皮質區並且從未生長成真正的濾泡型態的周圍T細胞淋巴瘤。欲治療的其它癌症包括血液系統惡性腫瘤、頭頸癌、胃腸道癌症、卵巢癌和骨肉瘤。 本文所用的術語「炎症性病症」是指由炎症引起或者症狀包括炎症的任何病症。舉例來說，由炎症引起的炎症性病症可以是敗血性休克，並且症狀包括炎症的炎症性病症可以是類風溼性關節炎。本發明的炎症性病症包括但不限於心血管疾病、類風溼性關節炎、多發性硬化症、克羅恩氏病、炎症性腸病、全身性紅斑狼瘡、多肌炎、敗血性休克、移植物抗宿主疾病、哮喘、鼻炎、牛皮癬和溼疹。在一個實施方案中，欲治療的炎症性病症包括類風溼性關節炎和青少年類風溼性關節炎。本文所用的術語「患者」或「哺乳動物」是指歸類為哺乳動物的任何動物，包括人、家畜和農畜，以及動物園或伴侶動物，如狗、馬、貓、牛等。哺乳動物優選為人。用於本發明用途的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤通常將如本領域中所已知以對正進行治療的患者提供最有效的治療(從功效和安全性的觀點來看)的給藥方案向患者施用。在進行本發明的治療方法時，根據本發明用於甲氨蝶呤抗性病症和/或10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤敏感性癌症的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可以本領域中已知的任何有效方式施用，如通過口服、局部、靜脈內、腹膜內、肌肉內、關節內、皮下、鼻內、目艮內、陰道、直腸、顱內或皮內途徑，這取決於所治療癌症的類型和開處方的醫師基於例如公布的臨床研究的結果所作出的醫學判斷。根據本發明用於甲氨蝶呤抗性病症和/或10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤敏感性癌症的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可以被配製成藥物製劑的一部分。具體劑型將取決於施用方法，但可以包括片劑、膠囊、口服液和可注射溶液用於口服、靜脈內、肌肉內、顱內或腹膜內施用等。劑量可表示為mg/m2。或者，劑量可通過本領域的技術人員可接受的任何方式表示為毫克/公斤體重。一種獲得以毫克/公斤體重表示的等同劑量的方法包括應用轉換因子O. 025mg/kg,對於普通人來說約等同於lmg/m2。根據此計算，150mg/m2的劑量約等同於約3. 75mg/kg0適用於治療甲氨蝶呤抗性病症和/或10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤敏感性癌症的腫瘤學的劑量包括以下給藥方案。在一個實施方案中，這些劑量是靜脈內劑量。舉例來說，每天每平方米體表面積約IOmg至120mg的劑量(每天每公斤體重約O. 25mg至3mg)為適當的。以下劑量也是適合的每周一次30mg/m2(約O. 75mg/kg)持續3周接著停藥一周、每周一次30mg/m2(約O. 75mg/kg)持續6周接著停藥一周，或按每周一次持續6周的時程逐漸遞增10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的劑量。適當時可基於患者耐受性和惡性腫瘤的類型使用較低劑量。當使用頻率較低的施用時可利用較高劑量。因此，在一般意義上，10mg/m2至275mg/m2(約O. 25mg/kg至約6. 9mg/kg)的劑量適用於各種給藥時程，例如約 100mg/m2至275mg/m2(約2. 5mg/kg至約6. 87mg/kg)之間每兩周一次的劑量，和約10mg/m2至150mg/m2(約O. 25mg/kg至約3. 75mg/kg)之間或者更具體來說約10mg/m2與60mg/m2之間每周一次的劑量。使用與美國專利號6，323，205中所描述的方案類似的方案來確定適合劑量在本領域的技能範圍內。在一個實施方案中，根據本發明用於甲氨蝶呤抗性病症和/或10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤敏感性癌症的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可以每劑約10mg/m2至約275mg/m2(約0. 25mg/kg至約6. 87mg/kg)的量施用。本發明的方法還包括按以下施用根據本發明用於甲氨蝶呤抗性病症和/或10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤敏感性癌症的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤每周一次；所施用的劑量為約10mg/m2(0. 25mg/kg)或約30mg/m2 (0. 75mg/kg);施用量為每劑約 10mg/m2 至約 150mg/m2(約 0. 25mg/kg 至約 3. 75mg/kg);每兩周一次；以及所施用的劑量為約100mg/m2至約275mg/m2 (約2. 5mg/kg至約6. 9mg/kg)。在一個實施方案中，根據本發明用於甲氨蝶呤抗性病症和/或10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤敏感性癌症的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可以如下量施用約0. 25mg/kg與約4mg/kg之間的量；約0. 75mg/kg與約3mg/kg之間；約I. 0mg/kg與約2. 5mg/kg之間的量；約O. 25mg/kg或約O. 75mg/kg的量(或以體表面積(BSA)計的等同量)。10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可與其它細胞毒性和抗腫瘤化合物組合使用，所述化合物包括長春花生物鹼，如長春花鹼、諾維本(navelbine)和長春地辛(vindesine);核苷酸類似物，如吉西他濱、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷；烷基化劑，如環磷醯胺(cyclophosphamide)或異環磷醯胺(ifosfamide)；順鉬(cisplatin)或卡鉬(carboplatin)；甲醯四氫葉酸；紫杉燒，如紫杉醇(paclitaxel)或多西紫杉醇(docetaxel);抗CD20單克隆抗體，含有或不含放射性同位素；和抗生素，如阿黴素(doxorubicin)和絲裂黴素(mitomycin)。也可使用10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤與這些其它抗腫瘤劑中的多種或與生長因子抑制劑和抗血管生成劑的組合。10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤與其它藥劑可同時施用，或者作為常用治療方案的一部分組合利用，在所述治療方案中10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤與一種或多種其它藥劑在不同時間施用。舉例來說，其它藥劑可在相對於10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤施用之前、之後立即或之後一段時間(例如24小時)施用。因此，除非另外指定，否則出於本申請的目的，術語施用一般指同時施用或指藥物按平行治療方案中的任一順序在所述藥物之間有或無時間間隔的情況下依序施用。對於炎症性病症的治療，10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可以通過口服、肌肉內、靜脈內、動脈內或鞘內途徑給予。對於本領域的技術人員來說將存在其它途徑。對於包括但不限於牛皮癬、類風溼性關節炎和/或青少年類風溼性關節炎在內的炎症性病症的治療，劑量可包括以下。用於成人類風溼性關節炎或多關節型青少年類風溼性關節炎的本發明方法包括每周一次口服施用約Img至約30mg ;在一個實施方案中，每周一次施用約7. 5mg。其它劑量可包括每周一次給予10mg/m2。可逐漸調整劑量以達到最佳反應。在較高劑量下，如超過20mg/m2/wk,或O. 65mg/kg/wk至I. Omg/kg/wk,通過肌肉內或皮下給藥可達成更好的吸收。適當的劑量還可包括每周7. 5mg,或者約O. 5mg與約IOmg之間的分次口服劑量；在一個實施方案中，劑量可為2. 5mg的分次口服劑量，以12小時的時間間隔持續三次給藥，按每周一次的時程給予。劑量在它有效的情況下可以持續，並且包括持續長達兩年和更長時 間的療法。10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤適合與葉酸以及維生素B12補充劑組合使用以減少治療的副作用。舉例來說，可以用葉酸(開始一周每天lmg/m2，隨後用10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤治療，或者在不以體表面積(BSA)計的情況下每天口服(p.o.)lmg);和B12(每月lmg/m2，或者每8-10周肌肉內(I. M.)給予Img(不以BSA計)，或者每天口服Img(不以BSA計))對患者進行治療。在一個實施方案中，根據本發明的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤被配製用於口服施用。在另一個實施方案中，根據本發明的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤被配製用於靜脈內施用。10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可以多種不同劑型施用。舉例來說，10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可以優選口服或胃腸外施用。10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可與各種藥學上可接受的惰性載體一起以片劑、膠囊、錠劑、藥片、硬糖、粉末劑、噴霧劑、霜劑、油膏、栓劑、膠凍、凝膠、糊劑、洗劑、軟膏、酏齊U、糖漿劑等形式施用。所述劑型的施用可以單次或多次給藥進行。載體包括固體稀釋劑或填充劑、無菌水性介質和各種無毒有機溶劑和其它載體。可以對口服藥物組合物適當地進行甜化和/或調味。對於10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的口服施用，將含有一種或兩種活性劑的片劑與各種賦形劑(如微晶纖維素、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸二鈣和甘氨酸)中的任一種以及各種崩解劑(如澱粉(且優選為玉米澱粉、馬鈴薯澱粉或木薯澱粉)、海藻酸和某些複合矽酸鹽)連同造粒粘合劑(如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明膠和阿拉伯膠)進行組合。另外，潤滑劑諸如硬脂酸鎂、月桂基硫酸鈉和滑石粉通常非常適用於壓片的目的。還可採用類似類型的固體組合物作為明膠膠囊中的填充劑；在這方面優選的物質還包括乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇。當希望含水混懸液和/或酏劑用於口服施用時，10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可與各種甜味劑或調味劑、著色物質或染料，並且必要時與乳化劑和/或懸浮劑以及如水、乙醇、丙二醇、甘油和其各種類似組合的稀釋劑進行組合。含有本發明的組合物的片劑可以通過壓制或模製，任選地在一種或多種輔助成分或助劑存在下來製備。壓制的片劑可以通過在適合的機器中壓制任選地與粘合齊U、潤滑劑、惰性稀釋劑、表面活性劑或分散劑混合的呈自由流動形式(如粉末或顆粒)的活性成分來製備。模製的片劑可以通過在適合的機器中模製用惰性液體稀釋劑潤溼的粉末狀化合物的混合物來製備。各片劑優選含有約O. 05mg至約IOg活性成分並且各藥囊或膠囊優選含有約O. 05mg至約IOg活性成分；片劑同樣可適當地含有每粒片劑約2. 5mg活性成分或每粒片劑約7. 5mg0對於10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的胃腸外施用，可以採用溶液，以及包含活性劑或其相應水溶性鹽的無菌水溶液。所述無菌水溶液優選經過適當緩衝，並且還優選用例如足量生理鹽水或葡萄糖賦予等滲性。這些特定水溶液尤其適於靜脈內、肌肉內、皮下和腹膜內注射的目的。油性溶液適於關節內、肌肉內和皮下注射的目的。所有這些溶液在無菌條件下的製備都可通過本領域的技術人員熟知的標準藥學技術容易地完成。出於獸醫學的目的，活性劑可以使用任何形式和通過上文描述的任何途徑單獨或一起向動物施用。在一個優選的實施方案中，10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤以膠囊、大 丸劑(bolus)、片劑、液體藥液形式、通過注射或作為植入物施用。作為替代方案，10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可以與動物飼料一起施用，並且出於此目的，可製備濃縮的飼料添加劑或預混物用於正常動物飼料。根據標準獸醫學規範以常規方式製備所述製劑。本發明還包括一種治療需要甲氨蝶呤抗性瘤形成治療的個體的方法，其中所述方法包括向所述個體施用有效量的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤和它的藥學上可接受的鹽。術語「藥學上可接受的鹽」是指由藥學上可接受的無毒鹼或酸製備的鹽。當本發明的化合物呈酸性時，它的相應鹽可以常規地由藥學上可接受的無毒鹼(包括無機鹼和有機鹼)製備。由所述無毒鹼產生的鹽包括鋁鹽、銨鹽、鈣鹽、銅鹽(銅鹽和亞銅鹽)、鐵鹽、亞鐵鹽、鋰鹽、鎂鹽、錳鹽(錳鹽和亞錳鹽)、鉀鹽、鈉鹽、鋅鹽以及類似鹽。特別優選者是銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、鉀鹽和鈉鹽。在一個實施方案中，鹽是鹽酸鹽。由藥學上可接受的有機無毒鹼產生的鹽還包括伯胺、仲胺和叔胺以及環狀胺和取代胺(如天然存在的和合成的取代胺)的鹽。可以形成鹽的其它藥學上可接受的有機無毒鹼包括離子交換樹脂，如精氨酸、甜菜鹼、咖啡因、膽鹼、N'，N' - 二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基嗎啉、N-乙基哌啶、還原葡糖胺、葡糖胺、組氨酸、海巴明(hydrabamine)、異丙胺、賴氨酸、甲基還原葡糖胺、嗎啉、哌嗪、哌啶、聚胺樹脂、普魯卡因(procaine)、嘌呤、可可鹼、三乙胺、三甲胺、三丙胺、緩血酸胺等。除上述常用劑型外，10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤(包括其各組分的藥學上可接受的鹽、酯、溶劑合物和多晶型物)還可以通過控制釋放方式和/或遞送裝置施用。除非另外指出，否則本發明說明書與權利要求書中所用的表示成分、尺寸、反應條件等的量的所有數值應理解為在所有情況下都被術語「約」修飾。在本申請和權利要求書中，除非另外特別說明，否則單數的使用包括複數。另外，除非另外說明，否則「或」的使用意指「和/或」。此外，術語「包括(including) 」以及其它形式(如「包括(includes)」和「包括(included)」)的使用不具限制性。同樣，除非另外特別說明，否則如「要素」或「組分」的術語涵蓋包含一個單元的要素和組分以及包含超過一個單元的要素和組分。
本發明在某種程度上基於展示了具有獲得性甲氨蝶呤抗性的細胞將仍保留對普拉曲沙的敏感性，而獲得了普拉曲沙抗性的細胞也將獲得甲氨蝶呤抗性的數據。對於普拉曲沙敏感性的預測遺傳因素，由DU145 (前列腺)和HEP2 (頭頸部)癌細胞系產生對所述藥物具有獲得性抗性的兩個細胞系。在對普拉曲沙的抗性為親本細胞的200倍以上的同時，DU-PDX和HEP-PDX對甲氨蝶呤展示出部分交叉抗性。普拉曲沙獲得性抗性與RFC-I表達減少和MDRl表達增加有關。Fotoohi等(2009)描述了在甲氨蝶呤抗性細胞中RFC-I的mRNA水平下調超過兩倍的抗葉酸劑抗性白血病細胞系，強調了內流轉運在抗葉酸劑抗性中的重要作用。類似的數據在早先由Jansen(1998)、Rothen(2004)和Ifergan(2003)使用其它甲氨蝶呤抗性細胞模型獲得。MDRl表達增加似乎並未在所觀察到的獲得性普拉曲沙抗性中起作用，這是因為抑制MDRl並未恢復普拉曲沙敏感性。已顯示，FPGS活性降低在人白血病CCRF-CEM細胞中與獲得性甲氨蝶呤抗性有關(Mauritz，2002)。在一項研究中，在普拉曲沙抗性細胞中觀察到FPGS表達稍有減少，表明了聚穀氨酸化在普拉曲沙抗性中的作用。三十年前進行的研究發現，獲得性甲氨蝶呤抗性的另一個常見機制是DHFR基因擴增和由此而引起的酶過度表達(由Assaraf 2007 ；Chen等，1995評述)。在此研究中，具有獲得性甲氨蝶呤抗性的細胞系HEP-MTX展示出DHFRmRNA和蛋白質表達與它的親本對應物相比顯著·增加。在普拉曲沙抗性細胞系中未觀察到DHFR表達增加。這些發現結果表明在這些細胞系中甲氨蝶呤抗性與普拉曲沙抗性的分子機制不同。因此，本發明顯示，令人驚奇的是，對甲氨蝶呤具有抗性的細胞系對普拉曲沙並不具有抗性和/或對普拉曲沙保留了高得多的原始敏感性。本發明的其它目標、優點和新型特徵對於本領域的技術人員來說在研究以下實施例後將變得顯而易見，所述實施例不意圖具有限制性。另外，如上所述的和如以下權利要求書部分中所要求的本發明的各種實施方案和方面各自將在以下實施例中找到實驗支持。
實施例以下實施例僅出於說明的目的而提供並且不意圖限制本發明的範圍。實施例I :圖I示出適用於製備10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的合成方案。將60%NaH的油分散液(I. 06g，26. 5mmol)於18mL過篩脫水的THF中的混合物冷卻到0°C。用升對酞酸二甲酯(5. 0g,24mmol.，圖I中的化合物I)於無水THF(7mL)中的溶液處理冷混合物，並且將所述混合物在0°C下攪拌I小時。添加炔丙基溴(26. 4mmol)，並且將混合物在00°C下再攪拌I小時，然後在室溫下攪拌16小時。用2.4mL 50%乙酸處理所得混合物，然後傾倒至240mL水中。用乙醚(2X150mL)萃取混合物。合併乙醚萃取物，經過Na2SO4乾燥，並且濃縮成橙黃色油狀物。進行矽膠(600mL 230-400篩目)色譜，用環己烷-EtOAc (8:1)洗脫，得到呈白色固體狀的產物α-炔丙基升對酞酸二甲酯(化合物2) (4. 66)，通過TLC (環己烷-Et0Ac，3:l)顯示所述產物為均質的。然而，對此產物獲得的質譜數據顯示其為想要的產物2與二炔丙基化化合物的混合物。沒有檢測到起始物質I。HPLC顯示單炔丙基化產物與二炔丙基化產物的比率為約3: I。因為二炔丙基化產物不同於化合物1，不會在下一個反應步驟中產生不需要的副產物，所以此物質適於轉化成化合物3。在用於在合成中繼續反應的產物中不存在起始化合物I對於在轉化獲得最終產物期間避免連續形成ΙΟ-dAM是非常重要的，這是因為將ΙΟ-dAM從10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤中完全除去是非常困難的。通過將O. 36g 60%NaH(9mmol)的油分散液與IOmL無水DMF組合形成混合物並且將所述混合物冷卻到0°C -5V。用第一反應的產物(化合物2) (2. 94g，12mmol)於IOmL無水DMF中的溶液逐滴處理冷混合物，然後在(TC下攪拌30分鐘。冷卻到-25 °C後，逐滴添加2,4, 二氨基-6-(溴甲基)-蝶啶氫溴酸鹽-O. 22-丙醇(1.00g，2.9mmOl)於IOmL無水DMF中的溶液，同時使溫度維持在接近_25°C。經過2小時的時間使攪拌過的混合物的溫度上升至-KTC。再在-10°C下持續2小時後，使溫度上升至20°C，在室溫下繼續攪拌超過2小時。然後通過添加固體CO2將反應物調節至pH 7。在真空中濃縮以除去溶劑後，將殘餘物與乙醚一起攪拌並且收集不溶於乙醚的物質，用水洗滌，並且在真空中乾燥，得到1.49g粗產物。將此粗產物溶解於CHCl3-Me0H(10:l)中以便施加至矽膠管柱上。用相同的溶劑系統洗脫，得到10-炔丙基-10-甲氧羰基-4-脫氧-4-氨基-10-去氮雜蝶酸甲酯(化合物3)，根據TLC其為均質的，產率為40%(485mg)。將攪拌過的化合物3(400mg,0. 95mmol)於2_甲氧基乙醇(5mL)中的懸浮液用水 (5mL)，然後用10%氫氧化鈉溶液(3.9mL)處理。在室溫下攪拌混合物4小時，期間形成溶液。用乙酸將溶液調節至pH 8並且在高真空下濃縮。將所得殘餘物溶解於15mL水中並且酸化至PH 5. 5-5. 8，引起沉澱物形成。收集沉澱物，用水洗滌並且在真空中乾燥，回收到340mg化合物4 (91%產率)。HPLC分析指示產物純度為90%。通過在15mL DMSO中在115°C _120°C下加熱10分鐘使化合物4(330mg)脫去羧基。10分鐘後進行HPLC測試，證實了轉化基本上完成。通過在真空中蒸餾(40°C浴槽)除去DMS0。將殘餘物與O. 5NNa0H —起攪拌，得到澄清溶液。用IN HCl酸化至pH 5.0，得到呈黃色固體狀的10-炔丙基-4-脫氧-4-氨基-10-去氮雜蝶酸(化合物5)，產率為70%。HPLC指示此階段的產物純度為90%。使用BOP試劑(六氟磷酸苯並三唑-I-基氧基三(二甲氨基)鱗(287mg，O. 65mmol,奧德裡奇化學公司(Aldrich Chemical Co.))在含有三乙胺(148mg, I. 46mmol)的DMF (IOmL)中使化合物5 (225mg, O. 65mmol)與L-穀氨酸二甲酯鹽酸鹽(137mg，O. 65mmol)偶合。在20°C _25°C下攪拌混合物3小時，然後蒸發至乾燥。將殘餘物與水一起攪拌並且收集水不溶性粗產物，並且在真空中乾燥。通過矽膠色譜(用含有三乙胺(0.25體積%)的CHCl3-MeOH(10:1)洗脫)對粗產物(350mg)進行純化，回收到165mg 10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤二甲酯(化合物6，50%產率)，根據TLC(CHCl3-MeC)H 5:1)其為均質的。將化合物6(165mg，0.326mmol)懸浮於添加有 O. 72mL (O. 72meq) IN NaOH 的 IOmL經過攪拌的MeOH中。在室溫下持續攪拌直至在數小時後形成溶液為止。將溶液在20°C -25°C下保持8小時，然後用IOmL水稀釋。在減壓下蒸發除去甲醇，並且將濃縮了的水溶液在20°C-25°C下再留置24小時。然後，HPLC顯示酯水解完成。用乙酸將澄清的水溶液酸化至PH 4.0，使得10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤以淺黃色固體形式沉澱出，收集、水洗並且在真空中乾燥了的產物重122mg(79%產率)。通過元素分析、質子NMR和質譜進行的測定與指定的結構完全一致。HPLC分析指示純度為98%並且確定所述產物不含10-去氮雜氨基蝶呤。在此情況下，10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的量(如通過HPLC峰面積所測定)接近98%，並且處理軟體未檢測到對應於10-去氮雜氨基蝶呤的峰，儘管在此區域中存在少許基線波動。實施例2 為探究10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤對不同實體腫瘤類型的活性，研究了 15種人實體腫瘤細胞系對10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的細胞毒性活性的敏感性。材料和方法細胞系一組人結腸癌(HT29、HCT116、C0L0205、HCC2998)、乳癌(MCF7、MDA-MB-435)、月市癌(H0P62、H0P92)、卵巢癌(0VCAR3、IGR0V1)、前列腺癌(DU145、PC3)和頭頸癌(SCC61、HEP2、SQ20B)細胞系是購自ATCC(Rockville, MD)和美國國家癌症研究所(NationalCancerInstitute)保藏中心。在補充有10%胎牛血清、2mM穀氨醯胺、100單位πιΓ1青黴素(penicillin)和100 μ M πιΓ1鏈黴素(streptomycin)的RPMI培養基中將細胞培育成單層。 細胞毒性測定所產生的所有數據都是一式兩份進行的三次單獨實驗的結果。使用如先前所述進行的MTT測定(Hansen，1989)來測定細胞活力。簡單來說，將細胞以每孔2X IO3個細胞的密度接種在96孔板中。孵育細胞120小時，然後在37°C下添加0.4mg πιΓ1的MTT染料(3_[4，5- 二甲基噻唑-2-基]-2，5- 二苯基溴化四唑鎗鹽，持續4小時。將單層懸浮於O. Iml DMSO中並且使用微板讀數器測量560nm下的吸光度。陽性和陰性對照組分別包括具有未處理的細胞或含MTT而無細胞的培養基的孔。由線粒體脫氫酶催化黃色水溶性四唑鎗鹽MTT轉化成紫色不溶性甲臢，並且將所述轉化用於估算活細胞的數目。將對應於未處理細胞的對照值視作100%並且經過處理的樣品的活力表示為佔對照組的百分比。IC5tl值測定為使細胞活力降低50%的濃度。為了進行單個藥劑研究，接種細胞並且靜置24小時，之後用遞增濃度的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤處理72小時。孵育後，將細胞回收至不含化合物的培養基中持續48小時，之後使用MTT測定來測定生長抑制作用。蛋白質印跡分析在含有50mM HEPES(pH 7.6)、150mM NaCl、l%Triton X_100、2mM 釩酸鈉、IOOmMNaF和0. 4mg. πιΓ1苯甲基磺醯氟的緩衝液中使細胞溶解。用等量的蛋白質(20 μ g-50 μ g/泳道)進行SDS-PAGE並且轉移至硝化纖維素膜上。用抗裂解型PARP、抗裂解型胱天蛋白酶3、抗胱天蛋白酶9 (法國Saint Quentin Yvelines的賽信通生物試劑有限公司(Cell Signaling, Saint Quentin Yvelines, France))、抗 DHFR(法國的艾碧康公司(Abeam, France))、抗β-肌動蛋白(法國Saint-QuentinFallavier的西格瑪奧德裡奇公司(Sigma Aldrich, Saint-QuentinFallavier, France))特異性一抗，隨後用連接有過氧化物酶的二抗探測膜並且通過化學發光法進行顯影。圖2示出所測試的15種人癌細胞系對10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的相對敏感性。發現9種細胞系對10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的細胞毒性活性敏感(IC509 μ Μ)。單個藥劑抗增殖作用。在如表I所展示的15種癌細胞系中檢驗普拉曲沙的抗增殖作用。時程實驗顯示，當細胞暴露於普拉曲沙72小時之時達到最佳抗增殖作用(
圖1Α)。普拉曲沙的IC5tl的範圍為O. Ol ±O. 002 μ M(針對前列腺癌細胞系PC3)至>350 μ M(針對MDA-MB-435細胞系)。有趣的是，觀察到以下兩組細胞系的IC5tl相差超過100倍一組包括PC3、SCC61、DU145、HT29、HOP62、SQ20B、HOP92、HEP2 和 IGROVl 細胞展示 IC5(l〈0. I μ M，而 Colo205、HCC2998、MCF7、HCTl 16、0VCAR3 和 MDA-MB-435 細胞顯示 IC5tl 值 >9 μ M。將普拉曲沙的抗增殖作用與甲氨蝶呤和多種常用的抗代謝物(如培美曲塞、5-FU和5' -DFUR、活性卡培他濱(capecitabine)代謝物)的作用進行比較(圖IB和表I)。普拉曲沙的IC5tl平均起來為對於甲氨蝶呤所觀察到的IC5tl的近乎十分之一。這兩種抗葉酸劑的細胞毒性特徵在利用相同的兩組不同的敏感性和抗性細胞系的情況下為類似的。普拉曲沙的細胞毒性特徵不同於5-FU、5^ -DFUR和培美曲塞的細胞毒性特徵，表明普拉曲沙與這些其它抗代謝物之間在代謝、作用機制和/或抗性方面存在差異。有趣的是，在普拉曲沙與培美曲塞(一種被認為主要是胸苷酸合成酶(TS)抑制劑的抗葉酸劑)之間觀察到有限的交叉敏感性。葉酸轉運和代謝中所涉及的基因的表達在該組癌細胞系中分析已知涉及於抗葉酸劑敏感性的基因的表達。通過qRT-PCR測定DHFR、FPGS, TS/TYMS(胸苷酸合成酶)、SCL19AI/RFC-1、GARFT(甘氨醯胺核糖核苷酸甲醯基轉移酶)、SLC25A32 (線粒體葉酸轉運體/載體)和ABC轉運體BI (ABCB1或MDR1)mRNA表達(圖3A)。所述細胞系表達不同水平的這些葉酸通路基因，但在普拉曲沙敏感性與TS、SCL19AI/RFC-1、GARFT, SLC25A32和MDRl的mRNA表達之間未發現明顯相關性。普拉曲沙敏感性細胞表達的DHFR(普拉曲沙的一種靶標)水平相對高於「抗性」組,但並未達到統計顯著性(P=O. 083，圖3A)。普拉曲沙敏感性細胞表達的FPGS mRNA水平顯著高於抗性細胞(t-檢驗，p=0. 002)。總之，發現FPGS mRNA表達與普拉曲沙敏感性(IC5tl)之間趨向於正相關(R2=O. 47，p〈0. 01)，表明聚穀氨酸化在普拉曲沙抗增殖活性中具有重要作用。為了確定葉酸轉運體在普拉曲沙活性中的潛在作用，我們使9種普拉曲沙敏感性細胞系在藥物暴露72小時後獲得的IC5tl值與SCL19A1/RFC-1和SLC25A32的mRNA表達水平相關聯(圖3B)。表達高水平SCL19A1/RFC-1和SLC25A32mRNA的細胞展示出較高的普拉曲沙敏感性，表明SCL19A1/RFC-1和SLC25A32在普拉曲沙的細胞吸收方面具有潛在作用。 表I. 一組人癌細胞系在暴露於普拉曲沙、甲氨蝶呤、5-FU、5' -DFUR或培美曲塞72小時後的細胞毒性(IC50，μ Μ)。
細胞系*普拉曲沙甲氨蝶呤培美曲塞5-FUSt-PFilR
PO0.010.12.71.525
SCOSl0.0110.030.0151.23.2
DU1450.0150.30.048728ΗΤ290.020.220.023316 ΗΟΡ620.0230.150.02978380 SQ20B0.030.260.0251027 ΗΟΡ920,0310,60.0218135 ΗΕΡ20.050.250.186250 IGROVl0-08033300829
權利要求
1.一種治療個體的甲氨蝶呤抗性病症的方法，其中所述方法包括向患有甲氨蝶呤抗性病症的所述個體施用藥學有效量的包含10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤或它的藥學上可接受的鹽的組合物。
2.如權利要求I所述的方法，其中所述病症為癌症。
3.如權利要求2所述的方法，其中欲治療的所述癌症為前列腺癌、T細胞淋巴瘤、乳癌、肺癌、血液系統惡性腫瘤、頭頸癌、胃腸道癌症、卵巢癌和骨肉瘤。
4.如權利要求I所述的方法，其中所述病症為炎症性病症。
5.如權利要求4所述的方法，其中所述炎症性病症為類風溼性關節炎。
6.如權利要求I所述的方法，其中所述組合物被配製用於口服施用。
7.如權利要求I所述的方法，其中所述組合物被配製用於靜脈內施用。
8.一種治療需要甲氨蝶呤抗性瘤形成治療的個體的方法，其中所述方法包括向所述個體施用包含有效量的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤或它的藥學上可接受的鹽的組合物。
9.如權利要求8所述的方法，其中所述病症為癌症。
10.如權利要求9所述的方法，其中欲治療的所述癌症為前列腺癌、T細胞淋巴瘤、乳癌、肺癌、血液系統惡性腫瘤、頭頸癌、胃腸道癌症、卵巢癌和骨肉瘤。
11.如權利要求8所述的方法，其中所述病症為炎症性病症。
12.如權利要求11所述的方法，其中所述炎症性病症為類風溼性關節炎。
13.如權利要求8所述的方法，其中所述組合物被配製用於口服施用。
14.如權利要求8所述的方法，其中所述組合物被配製用於靜脈內施用。
15.如權利要求I所述的方法，其中所述甲氨蝶呤抗性病症為已獲得對甲氨蝶呤的抗性的病症。
全文摘要
本發明涉及一種治療個體的甲氨蝶呤抗性病症的方法，其中所述方法包括向所述個體施用有效量的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤或它的藥學上可接受的鹽。
文檔編號A61K31/495GK102984940SQ201180026765
公開日2013年3月20日 申請日期2011年6月2日 優先權日2010年6月2日
發明者G·J·普隆克 申請人:阿羅斯治療公司