豬瘟病毒抗體、豬藍耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體的elisa檢測試劑盒的製作方法

2023-06-12 20:50:41 1

專利名稱：豬瘟病毒抗體、豬藍耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體的elisa檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本實用新型屬於獸類疫病檢測技術領域，具體涉及一種能同時對豬瘟病毒抗體、豬藍耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體進行批量檢測的ELISA檢測試劑盒，可用於動物疫病流行病的檢測與調查。
背景技術：
豬瘟、豬藍耳病和豬偽狂犬病都是流行於獸類中的烈性傳染病，嚴重威脅畜牧業的正常發展，養殖場的獸類一旦感染這些病毒，將造成嚴重的經濟損失。豬瘟(classical swine fever，CSF)是對養豬業危害最為嚴重的疫病之一。在危害級別上，它是我國一類動物疫病，OIE法定報告的動物疫病。豬瘟是由黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒(CSFV)引起的一種急性、發熱、接觸性傳染傳染病，具有高度傳染性和致死性。1885年首先在美國發現，以後傳播到世界各大洲，中國大部分省都有發生。其主要通過直接接觸，或由於接觸汙染的媒介物而發病，消化道、鼻腔黏膜和破裂的皮膚均是感染途徑。豬藍耳病是由豬藍耳病病毒引起以妊娠母豬繁殖障礙及各種年齡豬，特別是仔豬的呼吸道疾病為特徵的一種嚴重的傳染性疫病，PRRS現已遍布於全世界主要養豬國家和地區，已經成為威脅養豬業健康發展的主要疫病之一。豬偽狂犬病是由偽狂犬病毒引起的一種豬類傳染性病。豬發生偽狂犬病後，其臨診症狀因日齡而異，成年豬一般呈隱性感染，懷孕母豬可導致流產、死胎、木乃伊胎和種豬不育等綜合症侯群。15日齡以內的仔豬發病死亡率可達100%，斷奶仔豬發病率可達40%，死亡率20%左右。偽狂犬病的發生具有一定的季節性，多發生在寒冷的季節，但其他季節也有發生。由此可見，豬瘟病毒、豬藍耳病病毒和偽狂犬病毒的侵入會對畜牧業造成嚴重的危害，這也間接導致了肉類市場供求關係混亂、肉類產品出口受阻、政府財政負擔加重和公眾恐慌，因此，使用豬瘟、豬藍耳病、豬偽狂犬病的相關疫苗進行免疫注射，並對免疫效果進行在線監測以確定其是否產生相應的抗體保護水平具有非常重大的意義。

實用新型內容本實用新型目的在於提供一種同時、批量、有效地檢測豬瘟病毒抗體、豬藍耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體的ELISA檢測試劑盒。為了實現上述目的，本實用新型採用如下技術方案:一種豬瘟病毒抗體、豬藍耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體的ELISA檢測試劑盒，該試劑盒有一個盒體，其中，所述盒體內設有抗原包被反應板、豬瘟抗體陽性對照血清、豬藍耳病抗體陽性對照血清、豬偽狂犬病抗體陽性對照血清、豬瘟抗體陰性對照血清、豬藍耳病抗體陰性對照血清、豬偽狂犬病抗體陰性對照血清、20X濃縮洗滌液、樣品稀釋液、酶標結合物、顯色劑A、顯色劑B和終止液。[0010]具體的，所述抗原包被反應板的規格為96孔(96T)，從左至右被均分為檢測區1、檢測區II和檢測區III三個區域，每個區域有32T ;所述檢測區I包被豬瘟病毒蛋白抗原，檢測區II包被豬藍耳病病毒蛋白抗原，檢測區III包被豬偽狂犬病病毒蛋白抗原。所述的酶標結合物為酶標記的抗豬IgG。上述的豬瘟病毒蛋白抗原、豬藍耳病病毒蛋白抗原和豬偽狂犬病病毒蛋白抗原均為高純度的原核表達蛋白，可按照本領域常規技術製備或購買市售產品均可。盒體內可分為抗原包被反應板和試劑反應體系兩部分；抗原包被反應板可以用PS材質的酶標板製成，試劑反應體系的包裝瓶可以是聚丙烯瓶。本實用新型採用酶聯免疫間接法，將豬瘟病毒蛋白抗原、豬藍耳病病毒蛋白抗原、豬偽狂犬病病毒蛋白抗原分別包被到包被反應板的三個檢測區域內，所包抗原可分別與待檢樣品中的特異性抗體反應，形成抗原-抗體複合物被吸附到固相包被反應板上，再加入酶標結合物(酶標記的抗豬IgG)，形成固相病毒抗原-病毒抗體-抗豬抗體-HRP免疫複合物。如果待檢樣品中含有相應的抗體，加入顯色劑後即為酶催化顯色，為陽性，反之為陰性。本實用新型所述試劑盒通過對包被反應板的抗原包被濃度和酶標記結合物濃度的調整，使其能夠產生特異性顯色，從而進行豬瘟病毒抗體、豬藍耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體的檢測。該試劑盒能同時對豬瘟病毒抗體、豬藍耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體進行批量檢測，具有靈敏度高、特異性好、快速檢測大批量樣品等優點，可用於動物疫病流行病的檢測與調查。

圖1為本實用新型所述試劑盒的橫切面剖視圖，即盒體內設置的組成及位置示意圖；圖中，I為抗原包被反應板；5為ImL豬瘟抗體陽性對照血清；6為ImL豬藍耳病抗體陽性對照血清；7為ImL豬偽狂犬病抗體陽性對照血清；8為ImL豬瘟抗體陰性對照血清；9為ImL豬藍耳病抗體陰性對照 血清；10為ImL豬偽狂犬病抗體陰性對照血清；11為50mL 20 X濃縮洗滌液；12為IlmL樣品稀釋液；13為IImL酶標結合物；14為6mL顯色劑A ; 15為6mL顯色劑B ;16為6mL終止液；17為盒體；圖2為圖1中的抗原包被反應板的結構示意圖，圖中，I為抗原包被反應板；2為檢測區I ;3為檢測區II ；4為檢測區III。
具體實施方式
以下結合附圖對本實用新型做進一步詳細說明，但本實用新型的保護範圍不限於此。如圖1和2所示，一種豬瘟病毒抗體、豬藍耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體的ELISA檢測試劑盒，該試劑盒有一個盒體17，其中，所述盒體17內設有抗原包被反應板1、豬瘟抗體陽性對照血清5、豬藍耳病抗體陽性對照血清6、豬偽狂犬病抗體陽性對照血清7、豬瘟抗體陰性對照血清8、豬藍耳病抗體陰性對照血清9、豬偽狂犬病抗體陰性對照血清10、20X濃縮洗滌液11、樣品稀釋液12、酶標結合物13、顯色劑A 14、顯色劑B 15和終止液16。所述抗原包被反應板I的規格為96T，從左至右被均分為檢測區I 2、檢測區II 3和檢測區III 4三個區域，每個區域有32T;所述檢測區I 2包被豬瘟病毒蛋白抗原，檢測區II 3包被豬藍耳病病毒蛋白抗原，檢測區III 4包被豬偽狂犬病病毒蛋白抗原。抗原包被反應板I為PS材質的酶標板。本實用新型所述試劑盒採用酶聯免疫間接法製備，具體製備工藝如下:(I)抗原包被反應板I的製備:將96T酶標板從左至右均分為檢測區I 2、檢測區II 3和檢測區III 4共三個檢測區(見圖2)。其中，用抗原稀釋液稀釋豬瘟病毒蛋白抗原使其終濃度為2Pg/mL，按IOOPL/孔包被檢測區I 2 ;用抗原稀釋液稀釋豬藍耳病病毒蛋白抗原使其終濃度為1.2Pg/mL，按IOOPL/孔包被檢測區II 3 ;用抗原稀釋液稀釋豬偽狂犬病毒蛋白抗原使其終濃度為1.5Pg/mL，按ΙΟΟμ ν孔包被檢測區III 4 ;然後用封板膜封板2 — 8°C過夜。次日，洗板I次，按150μ 7孔加入封閉液，37°C封閉2h ;然後吸出孔內液體，置37°C烘箱中烤乾，最後用鋁箔袋熱封裝袋保存。上述抗原稀釋液、封閉液的具體組分配比如下:A抗原稀釋液:每IOOOmL純化水中含碳酸鈉1.70g和碳酸氫鈉2.86g。B封閉液:每IOOOmL純化水中含牛血清白蛋白6g、蔗糖40g、胰蛋白腖IOg和proclin300 ImL0(2)豬瘟抗體陽性對照血清5的製備:將豬瘟抗體陽性血清0.5mL加入到濃度
0.01mol/L、pH 7.2的PBS緩衝液中，最終定容至IOOmL,然後按ImL/瓶的規格進行分裝。(3)豬藍耳病抗體陽性對照血清6的製備:將豬藍耳病抗體陽性血清0.5mL加入到濃度0.01mol/L、pH 7.2的PBS緩衝液中，最終定容至IOOmL,然後按ImL/瓶的規格進行分裝。 (4)豬偽狂犬病抗體陽性對照血清7的製備:將豬偽狂犬病抗體陽性血清0.5mL加入到濃度0.0lmol/L、pH7.2的PBS緩衝液中，最終定容至IOOmL,然後按ImL/瓶的規格進行分裝。(5)豬瘟抗體陰性對照血清8的製備:將豬瘟抗體陰性血清ImL加入到濃度
0.0lmol/L、pH7.2的PBS緩衝液中，最終定容至IOOmL,然後按ImL/瓶的規格進行分裝。(6)豬藍耳病抗體陰性對照血清9的製備:將豬藍耳病抗體陰性血清ImL加入到濃度0.01mol/L、pH7.2的PBS緩衝液中，最終定容至IOOmL,然後按ImL/瓶的規格進行分裝。(7)豬偽狂犬病抗體陰性對照血清10的製備:將豬偽狂犬病抗體陰性血清ImL加入到濃度0.0lmol/L、pH7.2的PBS緩衝液中，最終定容至IOOmL,然後按ImL/瓶的規格進行分裝。(8) 20X濃縮洗滌液11的製備:將4g磷酸二氫鉀、58g十二水磷酸氫二鈉、160g氯化鈉、IOmL吐溫-20和ImL Proclin 300加入到純化水中，最終定容至1L，然後按50mL/瓶的規格進行分裝。(9)樣品稀釋液12的製備:將1.28磷酸二氫鈉g、0.41g磷酸氫二鈉、20.09g氯化鈉、ImL吐溫_20、50mL新生牛血清、0.2g指示劑、ImL曲拉通X-100和ImL Proclin 300力口入到純化水中，最終定容至1L，然後按IlmL/瓶的規格進行分裝。(10)酶標結合物13的製備:將2.42g三羥甲基氨基甲烷(Tris)、0.8g酶穩定劑、IOOmL新生牛血清、1.5mL曲拉通X_100、8.5g氯化鈉、ImL Proclin 300、Ig紅色染料、
1.65mL濃鹽酸和0.5mL HRP-抗豬IgG抗體加入到純化水中，最終定容至1L，然後按IlmL/瓶的規格進行分裝。[0032](11)顯色劑A 14的製備:將檸檬酸2.10g，結晶乙酸鈉12.25g，過氧化脲0.6g加入到純化水中，最終定容至1L，然後按6mL/瓶的規格進行分裝。(12)顯色劑B 15的製備:將檸檬酸2.1Og7EDTA 0.3g, TMB-HCl 0.6g加入到純化水中，最終定容至1L,然後按6mL/瓶的規格進行分裝。(13)終止液16的製備:將濃硫酸108.5mL緩慢溶於純化水中，定容至1000ml，然後按6mL/瓶的規格進行分裝。(14)組盒:每個試劑盒配備I塊抗原包被反應板、I瓶豬瘟抗體陽性對照血清、I瓶豬瘟抗體陰性對照血清、I瓶豬藍耳病抗體陽性對照血清、I瓶豬藍耳病抗體陰性對照血清、I瓶豬偽狂犬病抗體陽性對照血清、I瓶豬偽狂犬病抗體陰性對照血清，I瓶20 X濃縮洗滌液、樣品稀釋液I瓶，I瓶酶標結合物、I瓶顯色劑A、1瓶顯色劑B和I瓶終止液，組成一個試劑盒。本實用新型採用高純度的豬瘟病毒蛋白、豬藍耳病病毒蛋白和豬偽狂犬病病毒蛋白作為包被抗原進行特異性的豬瘟病毒抗體、豬藍耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體的檢測。其原理是:將豬瘟病毒蛋白抗原、豬藍耳病病毒蛋白抗原、豬偽狂犬病病毒蛋白抗原分別包被到抗原包被反應板I的檢測區I 2、檢測區II 3和檢測區III 4中，所包抗原可分別與待檢樣品中的特異性抗體反應，形成抗原-抗體複合物被吸附到固相包被反應板上，再加入酶標記的抗豬IgG，形成固相病毒抗原-病毒抗體-抗豬抗體-HRP免疫複合物。如果待檢樣品中含有相應的抗體，加入顯色劑後即為酶催化顯色，為陽性；反之為陰性。該試劑盒的使用說明，其具體操作步驟如下:(I)配洗液:將50ml的20X濃縮洗滌液加純化水稀釋至1000ml，充分搖勻後備
用。`(2)編號:每次試驗應在抗原包被反應板的檢測區1、檢測區II和檢測區III上分別設空白對照孔I L，陰性對照孔2孔，陽性對照孔2孔，其餘為待檢樣品孔。(3)加樣品稀釋液:用加樣器在抗原包被反應板的待檢樣品孔中加入樣品稀釋液，每孔100μ I ;空白對照孔、陰性對照孔及陽性對照孔不加樣品稀釋液。(4)加樣:分別於各待檢樣品孔加入待檢樣品10μ 1，檢測區I上的陰性對照孔加入豬瘟抗體陰性對照血清100 μ 1，陽性對照孔加入豬瘟抗體陽性對照血清100 μ I。檢測區II上的陰性對照孔加入豬藍耳病抗體陰性對照血清100 μ 1，陽性對照孔加入豬藍耳病抗體陽性對照血清100μ I。檢測區III上的陰性對照孔加入豬偽狂犬病抗體陰性對照血清100 μ 1，陽性對照孔加入豬偽狂犬病抗體陽性對照血清100 μ I。空白對照孔不加樣。(5)溫育(一):充分混勻，貼上封板膜，37±2°C溫育30分鐘。(6)洗板(一):洗板機洗或手洗5次。(7)加酶標結合物:除空白對照孔以外，各孔中加入酶標結合物100 μ I。(8)溫育(二):貼上封板膜，37±2°C溫育30分鐘。(9)洗板(二):洗板機洗或手洗5次。(10)加顯色劑:每孔加入顯色劑A 50 μ 1，全部加完後再在每孔中加入顯色劑B50 μ 1，混勻。(11)溫育(三):37 ±2 °C 顯色 10 分鐘。(12)終止:顯色完畢後立即於每孔加50 μ I終止液，混勻。[0050](13)測定:終止後應在10分鐘內完成判讀。對空白對照孔調零，用酶標儀在450nm波長處測定吸光值0D。或使用雙波長測定吸光值，測定波長為450nm，參考波長可選630nm或 655nm。(14)結果判定:試劑盒閾值=0.1+陰性對照OD平均值。若陰性對照OD平均值^ 0.05則按實際值計算；若陰性對照OD平均值試劑盒閾值，結果判為陽性。按照各個檢測區的陰性對照OD平均值分別計算出相對應的閾值，即可通過各個檢測區待檢樣品孔的OD值與該檢測區的閾值進行比較，判定各樣品的結果。本實用新型試劑盒能同時對豬瘟病毒抗體、豬藍耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體進行批量檢測，具有靈敏度高、特異性好、快速檢測大批量樣品等優點，可用於動物疫病流行病的檢測與調 查。
權利要求1.一種豬瘟病毒抗體、豬藍耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體的ELISA檢測試劑盒，該試劑盒有一個盒體，其特徵在於，所述盒體內設有抗原包被反應板、豬瘟抗體陽性對照血清、豬藍耳病抗體陽性對照血清、豬偽狂犬病抗體陽性對照血清、豬瘟抗體陰性對照血清、豬藍耳病抗體陰性對照血清、豬偽狂犬病抗體陰性對照血清、20X濃縮洗滌液、樣品稀釋液、酶標結合物、顯色劑A、顯色劑B和終止液。
2.如權利要求1所述豬瘟病毒抗體、豬藍耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體的ELISA檢測試劑盒，其特徵在於，所述抗原包被反應板的規格為96孔，從左至右被均分為檢測區1、檢測區II和檢測區III三個區域，每個區域有32孔；所述檢測區I包被豬瘟病毒蛋白抗原，檢測區II包被豬藍耳病病毒蛋白抗原，檢測區III包被豬偽狂犬病病毒蛋白抗原。
3.如權利要求1所述豬瘟病毒抗體、豬藍耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體的ELISA檢測試劑 盒，其特徵在於，所述的酶標結合物為酶標記的抗豬IgG。
專利摘要本實用新型涉及一種豬瘟病毒抗體、豬藍耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體的ELISA檢測試劑盒，該試劑盒有一個盒體，其中，所述盒體內設有抗原包被反應板、豬瘟抗體陽性對照血清、豬藍耳病抗體陽性對照血清、豬偽狂犬病抗體陽性對照血清、豬瘟抗體陰性對照血清、豬藍耳病抗體陰性對照血清、豬偽狂犬病抗體陰性對照血清、20×濃縮洗滌液、樣品稀釋液、酶標結合物、顯色劑A、顯色劑B和終止液。該試劑盒能同時批量檢測出待檢樣品是否含有豬瘟病毒抗體、豬藍耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體，具有靈敏度高、特異性好、快速檢測大批量樣品等優點。
文檔編號G01N33/569GK203101397SQ20132009100
公開日2013年7月31日 申請日期2013年2月27日 優先權日2013年2月27日
發明者趙林萍, 曾小宇, 張如民, 任寶紅, 李丹, 孫強, 苗銀萍, 王鵬, 李慧英, 王集美, 魯龍, 孫帥嶺, 魏卓, 王思敏, 楊陽, 嶽崢 申請人:鄭州中道生物技術有限公司