一種模塊化生物樣本分析晶片的製作方法
2023-06-12 14:41:56
本發明屬於生物檢測
技術領域：
，尤其涉及一種模塊化生物樣本分析晶片。
背景技術：
：進入21世紀，生物晶片技術迎來了高速的發展，自動列印或光引導化學合成技術在矽片、玻璃、凝膠或尼龍膜等材料上製造的微陣列生物分子晶片，實現對化合物、蛋白質、核酸、細胞或其它生物組分的檢測已經廣泛報導。目前的生物晶片的製備技術主要是將蛋白等分子偶聯或包被於基板上進行檢測，專利200710134477.9公開了一種共價偶聯包被的晶片，專利US20040009528A1公開了一種帶有巰基的共價包被的晶片，而這些方法都是直接包被於晶片的基片上，而在檢測過程抗體的包被量一般都通過點樣機把待偶聯的分子配置成溶液，點樣在晶片上進行包被，專利01105795.5公開了一種利用高速點樣方法製備生物晶片的方法，但是利用點樣的方法對機器的要求極高，即使最好的機器也會有故障或者加樣失敗的情況，而且這種情況很難檢測，同時每個液滴與基板之間都是一個獨立的偶聯反應體系，專利200510013108.5公開了利用光刻技術對基板進行加工，保留有效的反應面積對技術進行了一定的改進，但是仍然解決不了點樣精度和反應體系獨立的問題，理論上每個點樣點都是一個包被體系，這從原理上限制了生物晶片在定量檢測的應用潛力，這也是生物晶片目前的主要應用痛點。技術實現要素：本發明實施例提供一種模塊化生物樣本分析晶片。本發明改變傳統的點樣思路，發明了一種模塊化高精度分析晶片，旨在解決目前生物樣本分析晶片對點樣機器要求高、點樣精度不高和反應體系不夠獨立的問題。本發明實施例是這樣實現的，一種模塊化生物樣本分析晶片，包括親水表面的基板材料、分析模塊；所述的親水表面的基板材料用於支撐、固定和集成分析模塊；所述分析模塊組裝於基板材料上；所述的分析模塊表面上包被有捕獲分子；所述分析模塊表面和組裝分析模塊後的基板材料表面至少包含一種封閉組分，所述的閉組分用於避免蛋白或其他生物及有機分子的非特異性吸附；所述的分析模塊為包被完成後組裝於基板材料上。本發明中的親水性基板可以為基板材料本身親水或疏水材料改性後親水或經過試劑或封閉劑處理變為親水性質，親水性質和封閉兩個過程均可降低非特異性結合和幹擾。所述的基板材料為金屬材料、玻璃材料、矽材料或高分子塑料材料的基板材料中的一種。所述親水表面為基板材料本身親水、疏水材料改性後親水或經過封閉劑處理變為親水性質的親水表面。所述的捕獲分子用於捕獲生物樣品中的待分析物質，所述捕獲分子為自蛋白、糖蛋白、多肽、核酸、有機小分子、多糖或抗體類生物分子。所述的分析模塊選自於表面具有羧基、氨基、氯甲基、環氧烷基、生物素、醛基或巰基修飾的具備偶聯生物分子能力的材料；具備偶聯生物分子能力的金屬材料；以及表面具備生物分子吸附能力的聚苯乙烯、尼龍或醋酸纖維素材料中的一種。所述的封閉分子為牛血清白蛋白、吐溫、脫脂奶粉、酪蛋白、胺基酸或木糖醇類具有疏水結合特性的生物或有機分子。所述的模塊化生物樣本分析晶片進一步作為模塊組裝在更大的基板上組成新的晶片。所述的模塊化生物樣本分析晶片，還包括用於內參的參比模塊，參比模塊直接標記有待測物或待測物的類似物，用於對晶片和對檢測信號進行參比。一種應用上述模塊化生物樣本分析晶片的生物樣本分析方法，包括以下步驟：(1)將捕獲分子包被於具備吸附能力或共價偶聯能力的材料A上或將材料切割成小的模塊進行包被；(2)將切割好的材料A或將材料A進行切割後組裝於基板材料B上，或將材料A組裝於基板B上進行切割，形成分析晶片C，分析晶片C可進一步切割產生多個晶片或由多個分析晶片C進一步組裝在基板上形成的新的分析晶片；(3)分析晶片C用含有封閉組分的試劑進行封閉；(4)將分析晶片C於待檢測分子物接觸；(5)清洗分析晶片C；(6)分析晶片C與含帶有標記的分子試劑接觸；(7)如果步驟(6)的標記分子為螢光分子或量子點則通過光源激發，用信號採集裝置進行檢測；如果步驟(6)的標記分子為酶類或直接發光分子，分析晶片進一步與反應試劑接觸形成發光信號利用信號採集裝置進行檢測。所述的信號採集裝置可以選自CCD(電耦合元件)、PMT(光電倍增管)，PD(光電管)，優選CCD。一種試劑盒，包括(1)上述的模塊化生物樣本分析晶片；(2)清洗用試劑；(3)含有標記的與被檢物有結合能力組分的試劑。(4)如果(3)中的標記為酶類或直接發光分子，則試劑盒進一步包括一種發光反應試劑。本發明與現有技術相比具有如下優點：本發明改變傳統的點樣思路，發明了一種模塊化高精度分析晶片，旨在解決目前生物樣本分析晶片對點樣機器要求高、點樣精度不高和反應體系不夠獨立的問題。本發明的模塊化生物樣本分析晶片包含基板材料用於支撐、固定和集成分析模塊，基板上集成有分析模塊，分析模塊表面上可包被有蛋白、核酸、多肽等生物分子或有機分子作為捕獲分子；分析晶片表面進一步至少包含一種封閉組分，用於避免蛋白或其他生物及有機分子的非特異性吸附，親水性基板可以為基板材料本身親水或疏水材料改性後親水或經過試劑或封閉劑處理變為親水性質，親水性質和封閉兩個過程均可降低非特異性結合和幹擾。附圖說明圖1是模塊化生物樣本分析晶片的包被、切割、組裝、封閉過程示例圖，其中(a)先包被再切割組裝，(b)先切割再包被組裝，(c)組裝的過程中進行切割,(d)組裝後進行切割再組裝。圖2是模塊化生物樣本分析晶片的示意圖。圖3是分析模塊與基板材料的組裝示意圖；其中圖(a)為分析模塊組裝至有凹陷的基板上；圖(b)利用蓋板覆蓋調整分析模塊表面與基板表面齊平。具體實施方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。實施例1本發明提供了一種模塊化生物樣本分析晶片，包括親水表面的基板材料、分析模塊；所述的親水表面的基板材料用於支撐、固定和集成分析模塊；所述分析模塊組裝於基板材料上；所述的分析模塊表面上包被有捕獲分子；所述分析模塊表面和組裝分析模塊後的基板材料表面至少包含一種封閉組分，所述的閉組分用於避免蛋白或其他生物及有機分子的非特異性吸附；所述的分析模塊為包被完成後組裝於基板材料上。本發明中的親水性基板可以為基板材料本身親水或疏水材料改性後親水或經過試劑或封閉劑處理變為親水性質，親水性質和封閉兩個過程均可降低非特異性結合和幹擾。所述的基板材料為金屬材料、玻璃材料、矽材料或高分子塑料材料的基板材料中的一種。所述親水表面為基板材料本身親水、疏水材料改性後親水或經過封閉劑處理變為親水性質的親水表面。所述的捕獲分子用於捕獲生物樣品中的待分析物質，所述捕獲分子為自蛋白、糖蛋白、多肽、核酸、有機小分子、多糖或抗體類生物分子。所述的分析模塊選自於表面具有羧基、氨基、氯甲基、環氧烷基、生物素、醛基或巰基修飾的具備偶聯生物分子能力的材料；具備偶聯生物分子能力的金屬材料；以及表面具備生物分子吸附能力的聚苯乙烯、尼龍或醋酸纖維素材料中的一種。所述的封閉分子為牛血清白蛋白、吐溫、脫脂奶粉、酪蛋白、胺基酸或木糖醇類具有疏水結合特性的生物或有機分子。所述的模塊化生物樣本分析晶片進一步作為模塊組裝在更大的基板上組成新的晶片。所述的模塊化生物樣本分析晶片，還包括用於內參的參比模塊，參比模塊直接標記有待測物或待測物的類似物，用於對晶片和對檢測信號進行參比。一種應用上述模塊化生物樣本分析晶片的生物樣本分析方法，包括以下步驟：(1)將捕獲分子包被於具備吸附能力或共價偶聯能力的材料A上或將材料切割成小的模塊進行包被；(2)將切割好的材料A或將材料A進行切割後組裝於基板材料B上，或將材料A組裝於基板B上進行切割，形成分析晶片C，分析晶片C可進一步切割產生多個晶片或由多個分析晶片C進一步組裝在基板上形成的新的分析晶片；(3)分析晶片C用含有封閉組分的試劑進行封閉；(4)將分析晶片C於待檢測分子物接觸；(5)清洗分析晶片C；(6)分析晶片C與含帶有標記的分子試劑接觸；(7)如果步驟(6)的標記分子為螢光分子或量子點則通過光源激發，用信號採集裝置進行檢測；如果步驟(6)的標記分子為酶類或直接發光分子，分析晶片進一步與反應試劑接觸形成發光信號利用信號採集裝置進行檢測。所述的信號採集裝置可以選自CCD(電耦合元件)、PMT(光電倍增管)，PD(光電管)，優選CCD。一種試劑盒，包括(1)上述的模塊化生物樣本分析晶片；(2)清洗用試劑；(3)含有標記的與被檢物有結合能力組分的試劑。(4)如果(3)中的標記為酶類或直接發光分子，則試劑盒進一步包括一種發光反應試劑。一種模塊化生物樣本分析晶片的製備方法，具體步驟如下：首先將捕獲分子包被於具備吸附能力或共價偶聯能力的材料上，該材料可以用相對較大的面積，包被之後將材料進行切割組裝於基板材料之上形成分析晶片，分析晶片可以進一步切割產生多個晶片模塊或多個切割後進一步組裝與基板上(包括但不限於圖1中(d)所示的組裝過程)；或包被之前進行切割，然後進行包被，包被後組裝於基板之上；或包被之後於基板組裝後進一步切割；包括但不限於圖1中(a)，(b)，(c)，(d)所示的晶片製作過程。如圖2所示本發明的模塊化晶片由基板、分析模塊組裝而成，基板材料包括但不限於金屬、玻璃、尼龍、矽、高分子塑料等具備支撐性的材料，基板上可以組裝多個分析模塊，亦可組裝多個由分析模塊和基板組成為單位的多個模塊如圖1中(d)所示，分析模塊表面包被有生物分子，生物分子包括但不限於蛋白、抗體、多肽、胺基酸、糖類、酶類、核酸等生物分子及有機分子，晶片表面進一步包含一種封閉分子，封閉分子用於封閉晶片表面的非特異性結合位點，封閉分子包括不限於BSA，胺基酸，糖，牛奶，酪蛋白，表面活性劑，聚乙二醇、糖醇等具有疏水結合特性的生物分子和有機分子，不同的晶片的分析模塊由同一個反應條件生成，基板可以製作成凹陷結構將晶片置於其上並保持表面的平整如圖3所示。本發明發明的生物樣本的分析方法：(1)將捕獲分子包被於具備吸附能力或共價偶聯能力的材料A上或將材料切割成小的模塊進行包被；(2)將切割好的材料A或將材料A進行切割後組裝於基板材料B上，或將材料A組裝於基板B上進行切割，形成分析晶片C，分析晶片C可進一步切割產生多分析晶片，切割後的晶片C可以進一步組裝在基板上形成的新的分析晶片；(2)分析晶片C用含有封閉組分的試劑進行封閉；(3)將分析晶片C於待檢測分子物接觸；(4)清洗分析晶片C；(5)分析晶片C與含帶有標記的分子試劑接觸；(6)如果步驟6的標記分子為螢光分子或量子點則利用光源激發，使用螢光檢測器進行檢測；(7)如果步驟6的標記分子為酶類或直接發光分子，分析晶片進一步與反應試劑接觸形成發光信號利用發光信號檢測器進行檢測；分析晶片的封閉可以為基板和分析模塊單獨封閉後組裝在一起，亦可分析模塊和基板組裝在一起後進行封閉，標記的分子包括但不限於螢光分子、量子點、可催化底物發光的酶、可以直接通過反應觸發發光的分子。在分析信號的檢測過程，本發明的方法中，如果標記分子的標記物為螢光分子或量子點則需要利用光源進行激發，再利用信號採集的CCD或PMT或PD(光電管)進行信號採集，如果標記的分子為可觸發化學發光的分子，則先進行發光的觸發反應，例如辣根過氧化物酶標記需要與魯米諾底物試劑進行反應來觸發化學發光信號，本發明的晶片基板亦可集成有電極電路用於對晶片上反應產生電信號的檢測。本發明的晶片可以製作一種試劑盒，試劑盒中包含晶片，該晶片上包括了基板和集成的分析模塊，分析模塊包被有捕獲分子，晶片上含有封閉分子可以有效的降低非特異性的結合，試劑盒中包含清洗用試劑，清洗用試劑至少包含一種緩衝鹽和一種防腐組分用於清洗晶片的非特異性結合分子和發光的底物分子，試劑盒中包含標記試劑，該試劑中的標記分子可以與被捕獲分子結合，捕獲分子、被捕獲分子、標記分子形成複合體。如果標記分子為螢光分子或量子點分子直接可以通過光學激發和CCD或PMT或PD(光電管)進行的檢測。如果標記分子的標記物為酶類，如辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶則試劑盒進一步包含一種底物試劑，底物試劑中含有發光底物，如果標記分子的標記物為直接發光分子，如吖啶酯、吖啶磺醯胺、吖啶醯氨或其類似物，則底物試劑中含有反應試劑與直接發光分子反應形成發光信號，通過CCD或PMT進行信號檢測。應用實施例：試劑1:Tris10mL0.01M/L；HCL0.0003N/L；調節pHto8.5,0.22μm過濾器進行過濾試劑2:咪唑2.72g/L；吐溫0.2mL/l；NaCL8.76g/L；pHto8.5，0.22μm,過濾器進行過濾試劑3:0.58g/LNa2HPO4,0.05g/LKCl,0.05g/LK3PO4,2.0g/LNaCl，BSA10g/L，TWEEN4mL/l；pH7.4.,0.22μm過濾器進行過濾試劑4:MabPCT16B5Cat.#4PC47hytest1mg/mL疊氮鈉0.1％試劑5:MabPCT42Cat.#4C10hytest2mg/mL疊氮鈉0.1％試劑6：PCT重組蛋白Cat.#8PC550ng/mL疊氮鈉0.1％試劑7:MabCRPC2Cat.#4C28hytest1mg/mL疊氮鈉0.1％試劑8：MabCRPC6Cat.#4C28hytest2mg/mL疊氮鈉0.1％試劑9CRP抗源Cat.#8C72hytest20ug/mL疊氮鈉0.1％試劑10HNO30.15M；H2O20.7％，Triton-1000.25％；NaOH0.125M；試劑119-(4-氯苯基硫代苯醯氧亞甲基)-10-甲基-9,10-二氫化吖啶-二鈉鹽100mg/L，N，N二甲基吖啶硝酸鹽，1.0mg/L十二烷基硫酸鈉，0.8g/L亞硫酸鈉，5mg/LTWEEN-20，0.31g/L0.26mol/L的Tris緩衝體系PH9.10。應用實施例1取100mmX100mmX1mm的聚苯乙烯塑料板用試劑1清洗烘乾，放置於平皿中，將試劑4蛋白濃度稀釋至20ug/mL，加入平皿中浸沒聚苯乙烯板，室溫2小時，4℃度過夜；用試劑對平板進行清洗，並於潔淨條件下晾乾。雷射精密切割5mmX5mm的小塊(以下簡稱PCT分析模塊)；取100mmX100mmX1mm的聚苯乙烯塑料板用試劑1清洗烘乾，放置於平皿中，將試劑7蛋白濃度稀釋至15ug/mL，加入平皿中浸沒聚苯乙烯板，室溫2小時，4度過夜；用試劑對平板進行清洗，並於潔淨條件下晾乾。雷射精密切割5mmX5mm的小塊(以下簡稱CRP分析模塊)；切割玻璃板成1cmX3cmx2mm小塊作為基板；每個基板上粘附PCT分析模塊和CRP分析模塊，形成分析晶片；分析晶片放置如平皿中注入試劑3進行封閉，室溫3小時取出；取試劑580ul加入600ul試劑1，然後加入150ul的0.5mmol/l吖啶酯,混合，室溫避光20分鐘，加入賴氨酸，180ul試劑1，放置30分鐘，得到吖啶酯標記。PCT-標記試劑，取試劑870ul加入600ul試劑1，然後加入150ul的0.5mmol/l吖啶酯,混合，室溫避光20分鐘，加入賴氨酸，180ul試劑1，放置30分鐘，得到吖啶酯標記。CRP-標記試劑；將PCT-標記試劑和CRP標記試劑按照1：1比例進行混合，獲得PCT-CRP標記試劑；將試劑6稀釋PCT濃度，試劑9稀釋配置：標準溶液1：PCT0.1ng/mLCRP0.5ug/mL；標準溶液2：PCT0.5ng/mLCRP1ug/mL；標準溶液3：PCT1ng/mLCRP2ug/mL；標準溶液4：PCT10ng/mLCRP10ug/mL；標準溶液5：PCT30ng/mLCRP20ug/mL；測試流程如下，用分析晶片浸沒於標準溶液中(作為樣品)，室溫孵育5分鐘，用試劑2清洗晶片兩次，再將分析晶片浸沒於PCT-CRP標記試劑中孵育5分鐘，用清洗試劑2清洗晶片兩次，將晶片置於試劑10中同時進行CCD檢測發光信號。通過標準試劑檢測建立發光信號標準曲線後，用試劑6和試劑9加入血清中，通過稱重法配置獲得，樣本1：CRP2ug/MLPCT0.5ng/mL，樣本2：CRP5ug/MLPCT5ng/mL，樣本3：CRP10ug/MLPCT30ng/mL，重複上述流程用分析晶片對樣本進行測試，測試結果如表1所示：表1CRP(ug/ml)配置濃度晶片1晶片2晶片3晶片4晶片5晶片6晶片7晶片8CV均值樣本122.102.102.042.102.201.902.202.204.86％2.11樣本255.155.155.155.154.854.854.855.153.08％5.04樣本31010.8010.409.409.609.609.809.9010.404.92％9.99PCT(ng/ml)配置濃度晶片1晶片2晶片3晶片4晶片5晶片6晶片7晶片8CV均值樣本10.50.510.480.520.520.530.560.530.485.45％0.51樣本255.155.155.155.005.154.905.155.805.16％5.18樣本33030.9029.1029.1030.9029.1029.1029.1029.102.82％29.55應用實施例2環氧烷基修飾晶片(telecheminternationalCAT：SME225X76mm)用試劑1進行清洗，放置於平皿中，將試劑4蛋白濃度稀釋至20ug/mL，加入平皿中浸沒聚苯乙烯板，室溫2小時，4度過夜；用試劑對平板進行清洗，並於潔淨條件下晾乾。雷射精密切割5mmX5mm的小塊(以下簡稱PCT分析模塊)；環氧烷基修飾晶片(telecheminternationalCAT：SME225X76mm)用試劑1進行清洗，放置於平皿中，將試劑7蛋白濃度稀釋至15ug/mL，加入平皿中浸沒聚苯乙烯板，室溫2小時，4度過夜；用試劑對平板進行清洗，並於潔淨條件下晾乾。雷射精密切割5mmX5mm的小塊(以下簡稱PCT分析模塊)；切割玻璃板成1cmX3cmx2mm小塊作為基板；每個基板上粘附PCT分析模塊和CRP分析模塊，形成分析晶片；取試劑5，300uL，加入14uLSulfo-NHS-LC-BiotinylationKit(THERMO)，37℃孵育39分鐘，加入超濾管中，12000Xg離心10分鐘，移液器混勻再離心10分鐘，加入0.3mL標記緩衝液6000Xg離心10分鐘。收集離心管中的溶液，補充標記緩衝液至0.5mL，加入0.4mL鏈黴親和素標記鹼性磷酸酶(THERMOAPStreptavidin434322)室溫孵育30分鐘。將交聯物過Sephadexg200進行純化，獲得PCT-標記試劑。取試劑8，500uL，加入14uLSulfo-NHS-LC-BiotinylationKit(THERMO)，37℃孵育39分鐘，加入超濾管中，12000Xg離心10分鐘，移液器混勻再離心10分鐘，加入0.3mL標記緩衝液6000Xg離心10分鐘。收集離心管中的溶液，補充標記緩衝液至0.5mL，加入0.6mL鏈黴親和素標記鹼性磷酸酶(THERMOAPStreptavidin434322)室溫孵育30分鐘。將交聯物過Sephadexg200進行純化，獲得CRP-標記試劑。將PCT標記試劑與CRP標記試劑1∶1按比例進行混合；分析晶片放置如平皿中注入試劑3進行封閉，室溫3小時取出；將試劑6稀釋PCT濃度，試劑9稀釋配置：標準溶液1：CRP0.5ug/mL；標準溶液2：PCT0.5ng/mLCRP1ug/mL；標準溶液3：PCT1ng/mLCRP2ug/mL；標準溶液4：PCT10ng/mLCRP10ug/mL；標準溶液5：PCT30ng/mLCRP20ug/mL：測試流程如下，用分析晶片浸沒於標準溶液中(作為樣品)，室溫孵育5分鐘，用試劑2清洗晶片兩次，再將分析晶片浸沒於PCT-CRP標記試劑中孵育5分鐘，用清洗試劑2清洗晶片兩次，將晶片置於試劑11中同時進行CCD檢測發光信號。通過標準試劑檢測建立發光信號標準曲線後，用試劑6和試劑9加入血清中，通過稱重法配置獲得，樣本1：CRP2ug/MLPCT0.5ng/mL，樣本2：CRP5ug/mLPCT5ng/mL，樣本3：CRP10ug/MLPCT30ng/mL，重複上述流程用分析晶片對樣本進行測試，測試結果如表2所示：表2CRP(ug/ml)配置濃度晶片1晶片2晶片3晶片4晶片5晶片6晶片7晶片8CV均值樣本121.921.921.922.082.082.082.081.924.28％2.00樣本254.855.154.855.154.854.854.855.153.13％4.96樣本31010.259.759.759.759.7510.259.759.752.34％9.88PCT(ng/ml)配置濃度晶片1晶片2晶片3晶片4晶片5晶片6晶片7晶片8CV均值樣本10.50.530.480.480.530.530.480.530.485.35％0.50樣本255.154.855.155.155.155.155.154.852.74％5.08樣本33030.8130.8130.8130.8130.8129.1929.1929.192.78％30.20應用實施例3環氧烷基修飾晶片(telecheminternationalCAT：SME225X76mm)用試劑1進行清洗，放置於平皿中，將試劑4蛋白濃度稀釋至20ug/mL，加入平皿中浸沒聚苯乙烯板，室溫2小時，4度過夜；用試劑對平板進行清洗，並於潔淨條件下晾乾。雷射精密切割5mmX5mm的小塊(以下簡稱PCT分析模塊)；環氧烷基修飾晶片(telecheminternationalCAT：SME225X76mm)用試劑1進行清洗，放置於平皿中，將試劑7蛋白濃度稀釋至10ug/mL，加入平皿中浸沒聚苯乙烯板，室溫2小時，4度過夜；用試劑對平板進行清洗，並於潔淨條件下晾乾。雷射精密切割5mmX5mm的小塊(以下簡稱PCT分析模塊)；切割玻璃板成1cmX3cmx2mm小塊作為基板；每個基板上粘附PCT分析模塊和CRP分析模塊，形成分析晶片；分析晶片放置如平皿中注入試劑3進行封閉，室溫3小時取出；將帶有羧基的螢光乳膠微球粒徑100nm，激發波長480nm用pH6.0，50mMMES緩衝液進行清洗，稀釋濃度為0.01mg/mL，取2mL，加入EDC(5mg/mL)200uL，混勻加入sulfo-NHS(2mg/ML)200uL，反應活化反應0.5小時，試劑5加入80uL室溫反應2小時，加入0.01g/mL的乙二胺500uL，反應1小時，離心用緩衝液清洗加入試劑3清洗兩遍，加入緩衝液試劑3，10mL，獲得PCT-微球標記試劑。將帶有羧基的螢光乳膠微球粒徑100nm，激發波長480nm用pH6.0，50mMMES緩衝液進行清洗，稀釋濃度為0.01mg/mL，取2mL，加入EDC(5mg/mL)200uL，混勻加入sulfo-NHS(2mg/ML)200uL，反應活化反應0.5小時，試劑8加入60uL室溫反應2小時，加入0.01g/mL的乙二胺500uL，反應1小時，離心用緩衝液清洗加入試劑3清洗兩遍，加入緩衝液試劑3，10mL，獲得CRP微球標記試劑。將PCT-微球標記涉及與CRP微球標記試劑進行混合獲得PCT-CRP微球標記試劑；將試劑6稀釋PCT濃度，試劑9稀釋配置；標準溶液1：CRP0.5ug/mL；標準溶液2：PCT0.5ng/mLCRP1ug/mL；標準溶液3：PCT1ng/mLCRP2ug/mL；標準溶液4：PCT10ng/mLCRP10ug/mL；標準溶液5：PCT30ng/mLCRP20ug/mL；測試流程如下，用分析晶片浸沒於標準溶液中(作為樣品)，室溫孵育5分鐘，用試劑2清洗晶片兩次，再將分析晶片浸沒於PCT-CRP標記試劑中孵育5分鐘，用清洗試劑2清洗晶片兩次，用雷射激發，同時利用PMT檢測螢光信號。通過標準試劑檢測建立發光信號標準曲線後，用試劑6和試劑9加入血清中，通過稱重法配置獲得，樣本1：CRP2ug/MLPCT0.5ng/mL，樣本2：CRP5ug/MLPCT5ng/mL，樣本3：CRP10ug/MLPCT30ng/mL，重複上述流程用分析晶片對樣本進行測試，測試結果如表3：表3cRP(ug/ml)配置濃度晶片1晶片2晶片3晶片4晶片5晶片6晶片7晶片8CV均值樣本121.862.102.102.141.901.861.861.866.55％1.96樣本255.305.305.205.305.104.705.305.104.705.16樣本3109.409.4010.6010.609.4010.5010.509.406.17％9.98PcT(ng/ml)配置濃度晶片1晶片2晶片3晶片4晶片5晶片6晶片7晶片8CV均值樣本10.50.460.460.460.490.470.540.460.465.95％0.48樣本254.654.654.655.354.655.354.654.656.72％4.83樣本33032.1027.9027.9027.9027.9032.1032.1027.907.37％29.48以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。當前第1頁1 2 3