艱難梭菌抗原的製作方法

2023-06-12 14:04:41 2

艱難梭菌抗原的製作方法
【專利摘要】本發明提供了用於在脊椎動物受試者中治療或預防艱難梭菌(Clostridium?difficile)感染的組合物和方法。所述方法用於向所述脊椎動物受試者施用有效減少或消除或預防艱難梭菌細菌感染的復發和/或誘導針對該蛋白的免疫應答的量的組合物。還提供了在脊椎動物中治療或預防艱難梭菌感染的方法。
【專利說明】艱難梭菌抗原
【技術領域】
[0001]本發明涉及用於在脊椎動物受試者中治療或預防革蘭氏陽性細菌艱難梭菌(Clostridium difficile)的感染的組合物和方法。提供了以有效減少、消除或預防感染復發的量向所述脊椎動物受試者施用蛋白質的方法。提供了在生物體中治療或預防艱難梭菌感染的方法。
【背景技術】
[0002]艱難梭菌是一種人類腸道共生革蘭氏陽性細菌，以2-5%的種群量存在。艱難梭菌具有二態生活周期，能夠作為休眠但仍有傳染性的芽孢和作為代謝活性的產毒素營養細胞存在。腸道中少量艱難梭菌的存在是無症狀的；然而，細菌過度生長能夠引起嚴重的和危及生命的疾病，特別是在老年人中。當正常腸道菌群被抗生素治療消滅時，可能發生艱難梭菌的過度生長。因此，艱難梭菌是抗生素相關腹瀉的主要原因，並且能夠引起假膜性結腸炎(廣泛的結腸炎症)。病原性艱難梭菌菌株產生幾種已知毒素。兩種這樣的毒素，即腸毒素(毒素A)和細胞毒素(毒素B)，造成在感染的患者中觀察到的腹瀉和炎症。
[0003]住院或留居在療養院中增加了艱難梭菌感染的風險。據估計，在住院最多2周的患者中染得艱難梭菌的比率為13%，在住院超過4周的患者中為50%。因此，艱難梭菌是常見的醫源性病原體，並且在全世界是住院患者發病和死亡的主因。由於艱難梭菌這種生物體形成耐熱芽孢，艱難梭菌能夠在醫院或療養院環境中長時間殘留。一旦芽孢被攝入，由於它們的耐酸性，它們能夠存活地通過胃。一旦進入結腸，芽孢可以在暴露於膽汁酸後萌發成營養細胞。
[0004]艱難梭菌感染在最初治療後的復發是常見問題，因為在25%的進行過首次感染髮作治療的患者中發生疾病的復發。這主要是由於該生物體能夠作為芽孢保持在休眠且耐抗生素的狀態中這一事實。
[0005]當前用於治療艱難梭菌感染的療法針對生物體生活周期的營養階段。這些治療包括抗生素例如萬古黴素或甲硝噠唑。氟喹諾酮類抗生素例如環丙沙星和左氧氟沙星的使用不幸地導致新的高毒力的且耐抗生素的艱難梭菌菌株的出現。其他的特別是用於預防復發的治療包括預防性途徑，例如使用益生菌以利用非致病生物體例如嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)或布拉氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)恢復腸道菌群。通過鑑定影響代謝功能或必需毒力因子的突變，已開發出基於鼠傷寒菌(Typhimurium)的活疫苗。Clin.Microbiol.Rev.5 (1992) 328-342。
[0006]到目前為止，在疫苗方面的嘗試集中於A和B毒素以及營養細胞表面蛋白(SLPA)，它們都是由代謝活性細菌產生的蛋白質。因此，所有當前療法解決由營養階段細菌造成的原發感染，而不針對由休眠但仍有感染性的芽孢引起的復發。有鑑於可能出現由毒性越來越高且耐藥的艱難梭菌菌株引起的傳染病，對於在靶向艱難梭菌生活周期的頑固芽孢期的基礎上的用於治療或預防與所述生物體相關的疾病的發生及其復發的有效疫苗組合物或抗體治療仍存在未滿足的需求。[0007]發明概沭
[0008]本文描述了用於在脊椎動物受試者中治療或預防艱難梭菌感染的組合物和方法。
[0009]在第一方面，本發明提供了含有結合艱難梭菌芽孢多肽或片段的抗體或片段的組合物，其中所述芽孢多肽或片段可以是BclAl、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpAHMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD 或 FliD。
[0010]在第二方面，本發明提供了含有結合艱難梭菌芽孢多肽或片段的抗體或片段的組合物，其中所述芽孢多肽或片段可以具有與SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 或 SEQ IDNO:10中所示的胺基酸序列至少80-95%同一的胺基酸序列。
[0011]在第三方面，本發明提供了結合艱難梭菌芽孢多肽或片段的分離的抗體或片段，其中所述多肽或片段可以是BclAl、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD 或 FliD。
[0012]在第四方面，本發明提供了結合艱難梭菌芽孢多肽或片段的抗體或片段，其中所述多肽或片段可以具有與 SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5, SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9 或 SEQ ID NO:10 中所示的胺基酸序列至少80-95%同一的胺基酸序列。
[0013]在所述前四個方面 的各種實施方式中，所述抗體或片段可以是多克隆抗體、單克隆抗體、人抗體、完整免疫球蛋白分子、scFv、嵌合抗體、Fab片段、F(ab』 )2或二硫鍵連接的Fv0
[0014]在所述前四個方面的其他實施方式中，所述抗體或片段可以具有重鏈免疫球蛋白恆定結構域，其可以是人IgM恆定結構域、人IgGl恆定結構域、人IgG2恆定結構域、人IgG3恆定結構域、人IgG4恆定結構域或人IgAl/2恆定結構域。
[0015]在所述前四個方面的其他實施方式中，所述抗體或片段可以具有輕鏈免疫球蛋白恆定結構域，其可以是人IgK恆定結構域或人IgX恆定結構域。
[0016]在所述前四個方面的再進一步的實施方式中，所述抗體或片段可以以至少I X IO9M或至少I X IO10M的親和常數(Kaff)結合抗原。
[0017]在所述前四個方面的其他實施方式中，所述抗體或其片段可以抑制或延遲芽孢萌發。
[0018]在所述第一和第二方面的某些實施方式中，所述組合物也可以含有結合艱難梭菌毒素A、毒素B的抗體或結合毒素A和毒素B的抗體的組合。在所述第一和第二方面的其他實施方式中，所述組合物還可以含有抗生素例如甲硝噠唑或萬古黴素。
[0019]所述前四個方面的組合物可以通過向需要這樣的治療的患者施用有效減少或預防與艱難梭菌相關疾病的量的組合物而使用在治療所述疾病的方法中，所述量可以是I至100毫克每千克受試者體重的範圍內的量。所述組合物可以靜脈內(IV)、皮下(SC)、肌肉內(IM)或口服施用。
[0020]在前四個方面的其他實施方式中，所述組合物可通過向動物施用有效量的所述組合物而用於被動免疫的方法中。
[0021]在第五方面，本發明提供了通過以在受試者中有效誘導免疫應答的量向所述受試者施用一定量的艱難梭菌芽孢多肽或片段或變體和藥學上可接受的佐劑在所述受試者中誘導免疫應答的方法，所述芽孢多肽或片段或變體可以是BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD 或 FliD。
[0022]在第六方面，本發明提供了通過以在受試者中有效誘導免疫應答的量向所述受試者施用艱難梭菌芽孢多肽或片段或變體和藥學上可接受的佐劑在所述受試者中誘導免疫應答的方法，所述芽孢多肽或片段或變體可以具有與SEQ ID N0:U SEQ ID NO:2、SEQ IDN0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的胺基酸序列至少80-95%同一的胺基酸序列。
[0023]在第七方面，本發明提供了難過以在需要治療的受試者中有效減少或預防感染的量向所述受試者施用一定量的艱難梭菌芽孢多肽或片段或變體和藥學上可接受的佐劑在所述受試者中減少或預防艱難梭菌感染的方法，所述芽孢多肽或片段或變體可以是BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA 旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD 或 FliD。
[0024]在第八方面，本發明提供了以在需要治療的受試者中有效減少或預防感染的量向所述受試者施用艱難梭菌芽孢多肽或片段和藥學上可接受的佐劑在所述受試者中減少或預防艱難梭菌感染的方法，所述芽孢多肽或片段可以具有與SEQ ID NO:U SEQ ID NO:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的胺基酸序列至少80-95%同一的胺基酸序列。
[0025]在第五至第八方面的各種實施方式中，所述藥學上可接受的佐劑是白介素12或熱休克蛋白。在其他實施方式中，所述施用是口服、鼻內、靜脈內或肌肉內施用。在其他實施方式中，所述變體是突變體，其可以是融合蛋白。所述融合蛋白可以含有艱難梭菌毒素A或B的序列，例如TcdA的N-末端催化結構域、TcdB的N-末端催化結構域、TcdB的C-末端片段4或TcdA的C-末端受體結合片段。或者，所述融合蛋白可以是蛋白質BclAl、BclA2、BclA3、Alr、SlpA 旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn_S0D 或 FliD 及其片段中任一種，或具有 SEQ ID NO:USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO -J、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10 中所示的胺基酸序列的蛋白質及其片段，與所述蛋白質組的另一個成員的融合體。
[0026]在第九方面，本發明提供了含有有效免疫量的分離多肽或片段或變體和藥學上可接受的載體的組合物，其中所述組合物在受試者中有效誘導針對艱難梭菌感染的免疫應答，並且其中所述分離的多肽或片段或變體含有艱難梭菌芽孢多肽或片段，其可以是BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA 旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD 或 FliD。
[0027]在第十方面，本發明提供了含有有效免疫量的分離多肽或片段或變體和藥學上可接受的載體的組合物，其中所述組合物在受試者中有效誘導針對艱難梭菌感染的免疫應答，並且其中所述分離的多肽或片段或變體具有與SEQ ID NO=USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 或SEQ ID NO:10中所示的胺基酸序列至少80-95%同一的胺基酸序列。
[0028]在所述第九和第十方面的各種實施方式中，所述組合物還含有藥學上可接受的佐劑，其可以是水包油型乳液、ISA-206、Quil A、白介素12或熱休克蛋白。在這些方面的進一步實施方式中，所述變體是突變體，其可以是融合蛋白。所述融合蛋白可以含有艱難梭菌毒素A或B的序列，例如TcdA的N-末端催化結構域、TcdB的N-末端催化結構域、TcdB的C-末端片段4或TcdA的C-末端受體結合片段。或者，所述融合蛋白可以是蛋白質BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA 旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD 或 FliD 及其片段中任一種，或具有 SEQ ID NO:USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:
5、SEQID NO:6、SEQ ID NO -J、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10 中所示的胺基酸序列的蛋白質及其片段，與所述蛋白質組的另一個成員的融合體。
[0029]在第十一方面，本發明提供了通過以在需要治療的受試者中有效減少或預防感染的量向所述受試者施用一定量的編碼艱難梭菌芽孢多肽或片段或變體的核酸和藥學上可接受的佐劑在所述受試者中減少或預防艱難梭菌感染的方法，所述多肽或片段或變體可以是 BclAl、BclA2、BclA3、Alr、SlpA 旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn_S0D 或 FliD。[0030]在第十二方面，本發明提供了通過以在需要治療的受試者中有效減少或預防感染的量向所述受試者施用一定量的編碼艱難梭菌芽孢多肽或片段或變體的核酸和藥學上可接受的佐劑在所述受試者中減少或預防艱難梭菌感染的方法，所述芽孢多肽或片段或變體具有與 SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:
6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 或 SEQ ID NO:10 中所示的胺基酸序列至少80-95%同一的胺基酸序列。
[0031]在所述第十一和第十二方面的各種實施方式中，所述藥學上可接受的佐劑可以是水包油型乳液、ISA-206、Quil A、白介素12或熱休克蛋白。在這些方面的進一步他實施方式中，所述變體是突變體，其可以是融合蛋白。所述融合蛋白可以含有艱難梭菌毒素A或B的序列，例如TcdA的N-末端催化結構域、TcdB的N-末端催化結構域、TcdB的C-末端片段4或TcdA的C-末端受體結合片段。或者，所述融合蛋白可以是蛋白質BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA 旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH 和 Fe-Mn-SOD 及其片段中任一種，或具有 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6,SEQ ID N0:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10 中所示的胺基酸序列的蛋白質及其片段，與所述蛋白質組的另一個成員的融合體。
[0032]在第十三方面，本發明提供了編碼艱難梭菌芽孢多肽或片段或變體的分離的核酸，所述芽孢多肽或片段或變體可以是BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA旁系同源物、SlpAHMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD 或 FliD。
[0033]在第十四方面，本發明提供了編碼艱難梭菌芽孢多肽或片段或變體的分離的核酸，其中所述核酸編碼與 SEQ ID NO:USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5,SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9 或 SEQ ID NO:10 中所示的胺基酸序列至少80-95%同一的胺基酸序列。
[0034]在所述第十三和第十四方面的各種實施方式中，所述變體是突變體，其可以是融合蛋白。所述融合蛋白可以含有艱難梭菌毒素A或B的序列，例如TcdA的N-末端催化結構域、TcdB的N-末端催化結構域、TcdB的C-末端片段4或TcdA的C-末端受體結合片段。或者，所述融合蛋白可以是蛋白質BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD 或 FliD 及其片段中任一種，或具有 SEQ ID NO:U SEQ ID NO:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQID NO:9和SEQ ID NO:10中所不的氣基酸序列的蛋白質及其片段,與所述蛋白質組的另一個成員的融合體。
[0035]在所述第十三和第十四方面的再進一步的實施方式中，所述核酸包含在表達載體中，其可以是細菌或哺乳動物表達載體。哺乳動物表達載體的實例包括含有CMV啟動子的表達載體。其他哺乳動物表達載體包括pcDNA3002Neo或pET32a。細菌表達載體的實例包括pET32a。在這些方面的某些實施方式中，所述表達載體可以包含在宿主細胞中，例如在哺乳動物細胞表達的情況下的HEK293F、NSO-U CHO-KU CHO-S或PER.C6，以及在細菌表達的情況下的大腸桿菌(E.coli)。
[0036]附圖簡沭
[0037]圖1A示出了用Asc I和Hpa I對BclA3_pcDNA3002Neo的限制性消化以證實質粒中BclA3插入片段的存在。從pcDNA3002Neo質粒切除的BclA3的預期大小為1.6kb，且pcDNA3002Neo質粒為6.8kb。(第I道:未消化的BclA3_pcDNA3002Neo質粒；第2道:消化的 BclA3-PcDNA3OO2Neo 質粒)。
[0038]圖1B示出了純化的BclA3蛋白的SDS-PAGE和western印跡分析。使用AktaPurifier，將BclA3轉染的上清液在HisTRAP Ni柱上純化。將洗脫的蛋白在濃縮前以15 μ L的體積上樣到SDS-PAGE凝膠上(左)。(第I道:純化的BclA3蛋白)。所述蛋白質的預期大小為44kDa。第二塊凝膠(右)以Syg蛋白質跑樣，轉移到硝酸纖維素膜上並用針對所表達蛋白質的His標籤的抗體探測(第I道:純化的BclA3蛋白-8 μ g)。[0039]圖2A示出了用AscI和HpaI對Alr_pcDNA3002Neo的限制性消化以證實質粒中Alr插入片段的存在。從pcDNA3002Neo質粒切除的Alr的預期大小為1.3kb，和空pcDNA3002Neo質粒為6.8kb。(第I道:未消化的Alr_pcDNA3002Neo質粒；第2道:消化的Alr-pcDNA3002Neo 質粒)。
[0040]圖2B示出了純化的Alr蛋白質的SDS-PAGE分析。使用Akta PurifierJ^AlrR染的上清液在HisTRAP Ni柱上純化。將含有和不含巰基乙醇(2ΜΕ)的洗脫蛋白質以2 μ g的量上樣到SDS-PAGE凝膠上(左)。(第I道:純化的Alr蛋白質_2 μ g ;第2道:純化的Alr蛋白質-2 μ g+2ME)。所述蛋白質的預期大小為45kDa。第二凝膠(右)以~30 μ g蛋白質跑樣以加大蛋白+/-2ME之間的差異(第3道:純化的Alr蛋白質-2 yg ;第4道:純化的Alr蛋白質-2yg+2ME)。
[0041]圖2C示出了純化的Alr蛋白的western印跡分析。使用Akta PurifierJ^Alr轉染的上清液在HisTRAP Ni柱上純化。將含有和不含β-巰基乙醇(2ΜΕ)的洗脫蛋白質以2yg的量上樣到SDS-PAGE凝膠上，然後轉移到硝酸纖維素膜上並用抗his抗體(1:3000)探測(第2道:純化的Alr蛋白質-2 μ g ;第3道:純化的Alr蛋白質_2 μ g+2ME)。所述蛋白質的預期大小為45kDa。
[0042]圖3A顯示了用AscI和HpaI對SlpA para-pcDNA3002Neo的限制性消化以證實質粒中SlpA旁系同源物插入片段的存在。從pcDNA3002NeO質粒切除的SlpA旁系同源物的預期大小為1.9kb，和空pcDNA3002Neo質粒為6.8kb。(第I道:未消化的SlpApara-pcDNA3002Neo 質粒；第 2 道:消化的 SlpA para-pcDNA3002Neo 質粒)。
[0043]圖3B示出了純化的SlpA旁系同源物的SDS-PAGE和western印跡分析。使用AktaPurifier，將SlpA旁系同源物轉染的上清液在HisTRAP Ni柱上純化。將含有和不含β-巰基乙醇(2ΜΕ)的洗脫蛋白質以2 μ g的量上樣到SDS-PAGE凝膠上(左和中)。(第I道:純化的SlpA旁系同源物蛋白質_2μ g ;第2道:純化的SlpA旁系同源物蛋白質_2 μ g+2ME)。所述蛋白質的預期大小是84kDa。在另一凝膠(右)中以2yg蛋白質跑樣，將其轉移到硝基纖維素膜上，並用針對所表達蛋白質的His標籤的抗體探測(第4道:純化的SlpA旁系同源物蛋白質-2 μ g)。
[0044]圖4A示出了用AscI和HpaI對CD1021_pcDNA3002Neo的限制性消化以證實質粒中CD1021插入片段的存在。從pcDNA3002Neo質粒上切除的CD1021的預期大小為1.8kb，和空 pcDNA3002Neo 質粒為 6.8kb。(第 I 道:未消化的 CD1021_pcDNA3002Neo 質粒；第 2 道:消化的 CDlO21-PcDNA3OO2Neo 質粒)。
[0045]圖 4B 示出了純化的 CD1021 的 SDS-PAGE 分析。使用 Akta Purif ier，將 CD1021 轉染的上清液在HisTRAP Ni柱上純化。將洗脫蛋白質以2 μ g的量上樣到SDS-PAGE凝膠上(第I道:純化的⑶1021蛋白質；第2道:純化的⑶1021蛋白質+2ME)。所述蛋白沒有糖基化時的預期大小為65kDa。
[0046]圖4C示出了純化的⑶1021的western印跡分析。另一凝膠以2 μ g蛋白質跑樣，將其轉移至硝基纖維素膜上，並用針對所表達蛋白質的His標籤的抗體探測(左側印跡上的第I道:純化的⑶1021蛋白質+2ME ;右側印跡上的第I道:純化的⑶1021蛋白質)。 [0047]圖5示出了重組艱難梭菌毒素A片段4和毒素B片段I區域和完整Ted A和B毒素的SDS-PAGE分析。(A)膠體藍染色的SDS-PAGE凝膠上的毒素A片段4 (第I道)。毒素A片段4的預期大小為114kDa。(B)抗His抗體探測的western免疫印跡上的毒素B片段I (第I道)。毒素B片段I的預期大小為82kDa。(C)膠體藍染色的SDS-PAGE凝膠上的完整毒素B (第I道)和完整毒素A (第2道)。毒素A的預期大小為308kDa,毒素B的預期大小為270kDa。
[0048]圖6示出了純化的FliD的SDS-PAGE。使用Akta Purif ier，將FliD轉染的上清液在HisTRAP Ni柱上純化。將洗脫蛋白質以2 μ g的量上樣到SDS-PAGE凝膠上(第I道:純化的FliD蛋白質+2ME ;第2道:純化的FliD蛋白質)。所述蛋白質沒有糖基化時的預期大小為55kDa。
[0049]圖7示出了檢測小鼠血清中的⑶1021抗體與來自於菌株ATCC43255的分離的艱難梭菌芽孢的結合的ELISA結果。
[0050]圖8示出了檢測小鼠血清中的FliD抗體與來自於菌株ATCC43255的分離的艱難梭菌芽孢的結合的ELISA結果。
[0051]圖9示出了檢測小鼠血清中的Alr抗體與來自於菌株ATCC43255的分離的艱難梭菌芽孢的結合的ELISA結果。
[0052]圖10示出了檢測小鼠血清中的BclA3抗體與來自於菌株ATCC43255的分離的艱難梭菌芽孢的結合的ELISA結果。
[0053]圖11示出了檢測小鼠血清中的FliD抗體與純化的艱難梭菌FliD蛋白質的結合的ELISA結果。
[0054]圖12示出了檢測小鼠血清中的Alr抗體與純化的艱難梭菌Alr蛋白質的結合的ELISA結果。
[0055]圖13示出了檢測小鼠血清中的BclA3抗體與純化的艱難梭菌BclA3蛋白質的結合的ELISA結果。
[0056]圖14示出了檢測小鼠血清中的⑶1021抗體與純化的艱難梭菌⑶1021蛋白質的結合的ELISA結果。[0057]圖15示出了檢驗抗芽孢抗體對ATCC43255芽孢萌發的抑制效應的萌發分析的結
果O
[0058]圖16示出了艱難梭菌芽孢抗原的考馬斯藍染色。
[0059]圖17示出了用兔抗艱難梭菌芽孢pAb探測的艱難梭菌芽孢抗原的Western印跡。
[0060]圖18示出了用來自於Alr免疫小鼠的血清探測的艱難梭菌芽孢抗原的Western印跡。
[0061]圖19示出了用來自於BclA3免疫小鼠的血清探測的艱難梭菌芽孢抗原的Western印跡。 [0062]圖20示出了用來自於CD1021免疫小鼠的血清探測的艱難梭菌芽孢抗原的Western 印跡。
[0063]圖21示出了用來自於FliD免疫小鼠的血清探測的艱難梭菌芽孢抗原的Western印跡。
[0064]詳細描沭
[0065]總的來說，本發明涉及用於在脊椎動物受試者中預防或治療革蘭氏陽性生物體艱難梭菌的細菌感染的組合物和方法。提供了用於誘導針對艱難梭菌感染的免疫應答的方法。所述方法用於向需要的脊椎動物受試者施用有效量的蛋白質或藥劑以減少、消除或預防艱難梭菌的細菌感染或帶菌狀態。
[0066]提供了用於在受試者中誘導針對艱難梭菌細菌的免疫應答的組合物和方法，包括以在受試者中有效誘導免疫應答的量向受試者施用包含分離的多肽(例如艱難梭菌芽孢抗原)和佐劑的組合物。所述方法可用於產生抗體，其用於被動免疫或作為疫苗的組分以防止艱難梭菌的感染或感染復發。
[0067]應該理解，本發明不限於特定方法、試劑、化合物、組合物或生物系統，它們當然可以改變。還應該理解，本文中使用的術語僅僅是出於描述特定方面的目的，並且不打算是限制性的。當在本說明書和隨附的權利要求書中使用時，單數形式「一」、「一個」或「該」包括複數指稱物，除非內容明確指明不是如此。
[0068]當在本文中用於指稱可測量的值例如量、時間長度等時，術語「約」意味著涵蓋與指定值有± 20 %或± 10 %、更優選地± 5 %、甚至更優選地± I %、且更優選地±0.1%的變異，因為這樣的變異適合於執行所公開的方法。
[0069]除非另有定義，否則在本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員所通常理解的相同含義。儘管在實踐中可以使用與本文所描述的相似或等同的任何方法和材料來測試本發明，但在本文中描述了優選的材料和方法。
[0070]「脊椎動物」、「哺乳動物」、「受試者」、「哺乳動物受試者」或「患者」可互換使用，且是指哺乳動物例如人類患者和非人類靈長動物，以及實驗動物例如兔、大鼠和小鼠、奶牛、馬、山羊和其他動物。動物包括所有脊椎動物例如哺乳動物和非哺乳動物，例如小鼠、綿羊、狗、奶牛、禽類、鴨、鵝、豬、雞、兩棲動物和爬行動物。
[0071]術語「佐劑」是指以非特異性方式起作用以提高對特定抗原或抗原組合的免疫應答的藥劑，因此例如減少任何給定組合物中所需的抗原的量和/或降低產生針對目標抗原的充分免疫應答所需的注射頻率。參見例如A.C.Allison J.Reticuloendothel.Soc.(1979)26:619-630。這樣的佐劑在下面進一步描述。術語「藥學上可接受的佐劑」是指能夠安全地施用於受試者並可接受用於製藥應用的佐劑。
[0072]當在本文中使用時，「定植」是指哺乳動物的腸道中艱難梭菌的存在。
[0073]「帶菌狀態」是細菌例如艱難梭菌可以在正常受試者中生長而不引起受試者患病的過程。帶菌狀態是環境、宿主和病原體的非常複雜的相互作用。各種因素控制無症狀帶菌狀態與疾病狀態。因此，本發明的一個方面包括治療或預防帶菌狀態。
[0074]「治療」或「處理」是指⑴阻止感染或重新感染，例如預防，或(ii)減輕或消除目標疾病的症狀，即治療。「治療」或「處理」可以是指施用包含目標多肽例如艱難梭菌芽孢抗原或針對這些抗原產生的抗體的組合物。使用所述組合物治療受試者可以預防或降低感染的風險和/或誘導針對目標多肽的免疫應答。治療可以是預防性的(以阻止或延遲疾病的發作，或阻止其臨床或亞臨床症狀的表現)或者可以是在疾病表現後治療性地抑制或改善症狀。
[0075]「預防」或「防止」是指用多肽或抗體組合物的預防性給藥或疫苗接種。
[0076]「治療有效量」或「有效減少或消除細菌感染的量」或「有效量」是指足以預防艱難梭菌細菌感染，或改善(例如減輕、減少、降低)與艱難梭菌細菌感染相關的至少一種症狀，或誘導針對艱難梭菌抗原的免疫應答的多肽或抗體的量。組合物的施用不是必須消除艱難梭菌細菌感染的症狀，只要化合物施用的益處超過害處即可。同樣地，當在本文中用於指稱艱難梭菌細菌感染時，術語「治療」不打算指受試者必需從感染治癒或其所有臨床徵兆被消除，只要通過組合物的施用實現受試者狀況的一些緩解或改善即可。
[0077]當在本文中使用時，術語「免疫應答」是指免疫系統細胞對在免疫細胞中產生生物化學變化的外部或內部刺激(例如抗原、細胞表面受體、細胞因子、趨化因子和其他細胞)的反應，其引起免疫 細胞遷移、殺死靶細胞、細胞吞噬作用、抗體產生、免疫應答的其他可溶性效應物等。
[0078]「保護性免疫」或「保護性免疫應答」意指受試者對組合物發起主動免疫應答，以使得在隨後暴露於艱難梭菌細菌或細菌激發後，受試者能夠對抗感染。因此，保護性免疫應答一般在受試者中降低隨後暴露於艱難梭菌細菌時引起的發病和死亡的發生率。保護性免疫應答一般也減少艱難梭菌細菌在受試者中的定植。
[0079]「主動免疫應答」是指受試者對抗原例如艱難梭菌芽孢抗原的免疫原性反應。具體來說，該術語意指在受試者群體中具有一定益處的對隨後暴露於艱難梭菌細菌或抗原的任何水平的保護，不論所述保護採取的是降低死亡率、減少症狀例如胃脹或腹瀉、防止復發還是降低疾病的任何其他有害效應等的形式，也不論所述保護是部分的還是完全的。「主動免疫應答」或「主動免疫」的特徵在於「在遇到免疫原後宿主組織和細胞的參與。它一般涉及淋巴網狀組織中具有免疫能力的細胞的分化和增殖，其導致抗體的合成或細胞介導的反應性的發生或兩者。」 Herbert B.Herscowitz, 「Immunophysiology:CellFunction and Cellular Interactions in Antibody Formation,，，Immunology:BasicProcessesl 17 (Joseph A.Bellanti ed., 1985)。換句話說,主動免疫應答由宿主在由於感染或在本發明的情形中由於組合物的施用而暴露於免疫原後發動。主動免疫可以與被動免疫形成對照，後者通過「預先形成的物質(例如抗體、轉移因子、胸腺移植物、白介素-2)從主動免疫的宿主向未免疫宿主的轉移」來獲得。同上。
[0080]「被動免疫」一般是指將預製抗體的形式的主動體液免疫力從一個個體轉移到另一個個體。因此，被動免疫是可以通過抗體轉移獲得的短期免疫的形式，所述抗體可以以幾種可能的形式施用，例如作為人類或動物血漿或血清、作為用於靜脈內(IVIG)或肌肉內(IG)使用的合併的動物或人類免疫球蛋白、作為來自於被免疫受試者或從疾病恢復的供體的高滴度動物或人類IVIG或IG以及作為單克隆抗體。被動轉移可以預防性地用於阻止疾病發作，以及可用於幾種類型的急性感染的治療。通常，源自於被動免疫的免疫力僅僅持續短時間，並提供即時保護，但是身體不發生記憶，因此患者具有晚些時候被相同病原體感染的風險。
[0081]多肽
[0082] 術語「多肽」或「肽」是指胺基酸聚合物，不論聚合物的長度如何；因此，肽、寡肽和蛋白質包括在多肽的定義中。該術語也不指定或排除多肽的表達後修飾，例如，包含糖基、乙醯基、磷酸酯基、脂基等的共價連接的多肽明確地被術語多肽所涵蓋。在所述定義中還包括含有一種或多種胺基酸類似物(包括例如非天然存在的胺基酸、僅天然存在於非相關生物系統中的胺基酸、來自於哺乳動物系統的修飾胺基酸等)的多肽、具有取代的鍵的多肽以及本領域中已知的天然存在和非天然存在的其他修飾。
[0083]術語「分離的蛋白質」、「分離的多肽」或「分離的肽」是就其來源或衍生源來說，(I)不伴有在其本原狀態下與其天然相伴的組分，(2)不含來自於同一物種的其他蛋白質，(3)由來自於不同物種的細胞表達，或(4)自然界中不存在的蛋白質、多肽或肽。因此，化學合成或在不同於其天然來源細胞的細胞系統中合成的肽與其天然相伴組分「分離」。也可以使用本領域公知的蛋白質純化技術，通過分離而使蛋白質基本上不含天然相伴的組分。
[0084]在本發明的意義中，術語「多肽」、「蛋白質」、「肽」、「抗原」或「抗體」包括一般在能夠在受試者中誘導免疫應答或在抗體的情況下結合抗原方面表現出生物活性的變體、類似物、直系同源物、同源物和衍生物及其片段。
[0085]本發明的多肽包括源自於艱難梭菌芽孢抗原或其片段的胺基酸序列，其對應於天然存在的蛋白質或對應於變體蛋白質的胺基酸序列，即其中少數胺基酸被置換、添加或缺失但其保留基本上相同的免疫性質的天然存在蛋白質的胺基酸序列。此外，這樣的衍生部分可以被胺基酸進一步修飾，特別是在N-和C-末端，以使得多肽或片段在構象上受限和/或允許在完成適當的化學作用後偶聯到免疫原性載體上。本發明的多肽涵蓋源自於艱難梭菌芽孢抗原的胺基酸序列的功能活性變體多肽，其中胺基酸已被缺失、插入或置換而基本上不損害其免疫性質，即這樣的有功能活性變體多肽保留了基本的肽生物學活性。通常，這樣的功能變體多肽具有與例如SEQ ID No:1至4中的胺基酸序列同源、優選地高度同源的胺基酸序列。
[0086]在一種實施方式中，這樣的功能活性變體多肽顯示出與選自SEQ ID No:l至4的胺基酸序列至少 60%,65%,70%,75%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性。多肽的序列相似性，其也被稱為序列同一性，通常使用序列分析軟體來測量。蛋白質分析軟體使用為各種置換、缺失和其他修飾(包括保守胺基酸置換)指派的相似性量度值來匹配相似的序列。例如，GCG含有程序例如「Gap」和「Bestfit」，其可以使用預設參數來確定密切相關的多肽(例如來自於不同物種的同源多肽)之間或野生型蛋白與其突變蛋白之間的序列同源性或序列同一性。參見例如GCG6.1版。也可以使用GCG6.1版中的程序FASTA，使用預設或推薦的參數來比較多肽序列。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供了質詢和檢索序列之間的最佳重疊區域的比對和百分序列同一性(Pearson,Methods Enzymo1.183:63-98(1990)；Pearson, Methods Mol.Biol.132:185-219 (2000))。當將本發明的序列與含有來自於不同生物體的大量序列的資料庫進行比較時，可選的算法是電腦程式BLAST、特別是blastp或 tblastn，其使用預設參數。參見例如 Altschul 等，J.Mol.Biol.215 =403-410 (1990)；Altschul 等，Nucleic Acids Res.25:3389-402(1997)。
[0087]功能活性的變體包含天然存在的功能活性的變體例如等位基因變體和種變體，以及可以通過例如誘變技術或通過直接合成來產生的非天然存在的功能活性的變體。
[0088]功能活性變體可以表現出例如與本文公開的艱難梭菌芽孢抗原的胺基酸序列至少 60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性，並仍保留生物活性。當這種比較需要比對時，將序列進行比對以獲得最大同源性。變異位點可以發生在序列中的任何位置，只要生物活性與本文公開的艱難梭菌芽孢抗原基本上相似，例如誘導免疫應答的能力。關於如何得到表型沉默的胺基酸置換的指導提供在Bowie等，Science, 247:1306-1310(1990)中，其教導為了研究胺基酸序列對改變的耐受性，存在兩種主要策略。第一種策略利用進化過程中自然選擇的胺基酸置換的耐受性。通過對不同物種中的胺基酸序列進行比較，可以確認在物種之間保守的胺基酸位置。這些保守的胺基酸對蛋白質功能可能是重要的。相反，其置換被自然選擇所耐受的胺基酸位置表示了對蛋白質功能來說不關鍵的位置。因此，可以修飾耐受胺基酸置換的位置而仍維持修飾多肽的特定免疫原性活性。
[0089]第二種策略使用遺傳工程以在克隆基因的特定位置處引入胺基酸變化，以鑑定對蛋白質功能來說關鍵的 區域。例如，可以使用定點誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham等，Science, 244:1081-1085 (1989))。然後可以測試得到的變體多肽的特定生物學活性。
[0090]按照Bowie等，這兩種策略揭示出蛋白質對胺基酸置換的驚人的耐受性。作者還指出在蛋白質中某些胺基酸位置處可能容許哪些胺基酸改變。例如，埋得最深或最內部(在蛋白質的三級結構內)的胺基酸殘基要求非極性側鏈，而一般來說表面或外部側鏈的很少特徵是保守的。
[0091]將突變引入到蛋白質的胺基酸中的方法對於本領域技術人員來說是公知的。參見例如 Ausubel 主編的 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons,Inc.(1994) ;T.Maniatis,E.F.Fritsch 和 J.Sambrook,Molecular Cloning:A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)。
[0092]也可以使用可商購的試劑盒例如「QuikChange定點誘變試劑盒」 (Stratagene)或直接通過肽合成來引入突變。通過替換對多肽功能沒有顯著影響的胺基酸產生肽的功能活性變體可以由本領域技術人員來實現。
[0093]可以在本發明的多肽中進行的一種類型的胺基酸置換是保守胺基酸置換。「保守胺基酸置換」是將胺基酸殘基用具有相似化學性質(例如電荷或疏水性)的側鏈R基團的另一種胺基酸殘基置換的胺基酸置換。一般來說，保守胺基酸置換不顯著改變蛋白質的功能性質。在兩個或以上胺基酸序列通過保守置換而彼此不同的情況下，序列百分同一性或相似性程度可以向上調整以對於置換的保守性質進行校正。進行這種調整的手段對於本領域技術人員來說是公知的。參見例如Pearson, Methods Mol.Biol.243:307-31 (1994)。[0094]具有化學性質相似的側鏈的胺基酸組的實例包括:1)脂族側鏈:甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；2)脂族羥基側鏈:絲氨酸和蘇氨酸；3)含有醯胺的側鏈:天冬醯胺和穀氨醯胺；4)芳香族側鏈:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)鹼性側鏈:賴氨酸、精氨酸和組氨酸；6)酸性側鏈:天冬氨酸和穀氨酸；以及7)含硫側鏈:半胱氨酸和甲硫氨酸。優選的保守胺基酸置換組是:纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、穀氨酸-天冬氨酸和天冬醯胺-穀氨醯胺。
[0095]或者，保守置換是在Gonnet 等，Science256:1443-45(1992)中公開的 PAM250 對數似然性矩陣中具有正值的任何改變。「輕度保守」置換是在PAM250對數似然性矩陣中具有非負值的任何改變。[0096]也可以使用雜交技術分離功能活性變體。簡單來說，使用與編碼目標肽、多肽或蛋白例如艱難梭菌芽孢抗原的全部或部分核酸序列具有高同源性的DNA來製備功能活性肽。因此，本發明的多肽還包括功能上等同並且由與編碼任一種艱難梭菌芽孢抗原的核酸或其互補序列雜交的核酸分子編碼的實體。本領域技術人員可以使用容易獲得的密碼子表方便地確定編碼本發明的肽的核酸序列。如此，這些核酸序列未在本文中給出。
[0097]編碼功能活性變體的核酸分子也可以使用編碼目標肽、多肽、蛋白質、抗原或抗體例如艱難梭菌芽孢抗原的核酸分子DNA的一部分作為探針，通過基因擴增方法例如PCR來分離。
[0098]出於本發明的目的，應該考慮到本發明的幾種多肽、蛋白質、肽、抗原或抗體可以組合使用。可以設想所有可能的組合類型。例如，可以使用包含一種以上多肽(優選選自本文中公開的艱難梭菌芽孢抗原)的抗原。在某些實施方式中，抗原可以包括一種或多種芽孢抗原與源自於營養細胞的抗原例如毒素A或B組合。同樣的序列可以以幾個拷貝使用在相同多肽分子上，或者其中不同胺基酸序列的肽可以使用在相同多肽分子上；不同的肽或拷貝可以彼此直接融合或用適當的連接物分隔開。當在本文中使用時，術語「多聚化的(多)肽」是其中指胺基酸序列不同或相同的多肽存在於單一多肽分子上的兩種組合類型。因此，在單一多聚化多肽分子上可以存在2至約20個相同和/或不同的肽。
[0099]在本發明的一種實施方式中，本發明的肽、多肽、蛋白質或抗原源自於天然來源，或者從細菌來源分離。因此，可以使用標準的蛋白質純化技術從來源分離本發明的肽、多肽、蛋白質或抗原。
[0100]或者，本發明的肽、多肽和蛋白質可以化學合成或使用重組DNA技術產生。例如，本發明的肽、多肽或蛋白質可以通過本領域公知的固相程序來合成。適合的合成可以利用「T-boc」或「F-moc」程序來進行。環狀肽可以通過固相程序，在全自動裝置中使用公知的「F-moc」程序和聚醯胺樹脂來合成。或者，本領域技術人員應該了解手動執行所述過程所必需的實驗室程序。用於固相合成的技術和程序描述在E.Atherton和R.C.Sheppard的「Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach，，，IRL at Oxford UniversityPress 出版(1989)和 D.Andreau 等的 「Methods in Molecular Biology, Vol.35:PeptideSynthesis Protocols」 (M.W.Pennington 和 B.M.Dunn 主編)，第 7 章 pp91_171 中。
[0101]或者，可以使用本領域公知的技術將編碼本發明的肽、多肽或蛋白質的多核苷酸引入到能夠在適合的表達系統中表達的表達載體中，然後分離或純化表達的目標肽、多肽或蛋白質。在本領域中可獲得多種細菌、酵母、植物、哺乳動物和昆蟲表達系統，並且可以使用這些表達系統中的任一種。任選地，可以將編碼本發明的肽、多肽或蛋白質的多核苷酸在無細胞翻譯系統中翻譯。
[0102]對應於艱難梭菌芽孢抗原的核酸序列也可用於設計寡核苷酸探針和用於篩選基因組或cDNA文庫中來自於其他艱難梭菌變體或甚至其他細菌物種的基因。用於製備寡核苷酸探針和DNA文庫以及通過核酸雜交對它們進行篩選的基本策略對於本領域的普通技術人員來說是公知的。參見例如DNA Cloning:Vol.1,同上；Nucleic Acid Hybridization,同上；01igonucleotide Synthesis,同上；Sambrook等，同上。一旦通過陽性雜交鑑定來自被篩選文庫的克隆，其可以通過限制性酶分析和DNA測序來證實特定文庫插入片段含有艱難梭菌基因或其同源序列。然後可以使用標準技術進一步分離該基因，並且如果需要，使用PCR方法或限制性酶來刪除全長序列的部分。
[0103]或者，可以通過合成而不是克隆來製備編碼目標蛋白質的DNA序列。DNA序列可以被設計成具有適用於特定胺基酸序列的密碼子。一般來說，如果序列被用於表達，人們應該選擇對於目標宿主來說優選的密碼子。通過標準方法從製備的重疊寡核苷酸組裝完整序列，並將其組裝成完整的編碼序列。參見例如Edge (1981) Nature292:756 ；Nambair等，(1984)Science223:1299 ；Jay 等，(1984) J.Biol.Chem.259:6311。 [0104]一旦所需蛋白質的編碼序列已被製備或分離，可以將它們克隆到任何適合的載體或複製子中。大量克隆載體對於本領域技術人員來說是已知的，適合的克隆載體的選擇是選擇的問題。用於克隆的重組DNA載體和它們可以轉化的宿主細胞的實例包括噬菌體λ (大腸桿菌)、pBR322(大腸桿菌)、pACYC177(大腸桿菌)、ρΚΤ230(革蘭氏陰性細菌)、PGV1106 (革蘭氏陰性細菌)、pLAFRl (革蘭氏陰性細菌)、pME290 (非大腸桿菌的革蘭氏陰性細菌)、pHV14(大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis))、pBD9 (芽孢桿菌)、PIJ61 (鏈黴菌)、pUC6 (鏈黴菌)、YIp5 (酵母菌)、YCpl9 (酵母菌)和牛乳頭瘤病毒(哺乳動物細胞)。參見Sambrook等，同上；DNA Cloning，同上；B.Perbal，同上。可以將基因置於啟動子、核糖體結合位點(用於細菌表達)和任選的操縱子(在本文中合稱「控制」元件)的控制之下，以便在用含有該表達構建物的載體轉化的宿主細胞中將編碼所需蛋白質的DNA序列轉錄成RNA。編碼序列可以含有或可以不含信號肽或前導序列。前導序列可以在翻譯後加工中被宿主移除。參見例如美國專利號4，431，739,4, 425，437,4, 338，397。載體的實例包括 pET32a(+)和 pcDNA3002Neo。
[0105]允許相對於宿主細胞的生長調控蛋白質序列的表達的其他調控序列也可能是需要的。調控序列對於本領域技術人員來說是已知的，且其實例包括對化學或物理刺激(包括調控化合物的存在)做出響應以引起基因表達的啟動或關閉的調控序列。載體中也可以存在其他類型的調控元件，例如增強子序列。
[0106]在插入到載體例如上述克隆載體中之前，可以將控制序列和其他調控序列與編碼序列連接。或者，可以將編碼序列直接克隆到已經含有控制序列和適合的限制性位點的表達載體中。
[0107]在某些情況下，可能必需修飾編碼序列以便可以將其以適合的定向連接於控制序列，即維持正確的閱讀框。也可能希望產生蛋白質的突變體或類似物。突變體或類似物可以通過刪除一部分編碼蛋白質的序列、通過序列的插入和/或通過置換序列內的一個或多個核苷酸來製備。用於修飾核苷酸序列的技術例如定點誘變描述在例如Sambrook等，同上；DNA Cloning,同上；Nucleic Acid Hybridization,同上中。
[0108]然後使用表達載體來轉化適宜的宿主細胞。多種哺乳動物細胞系在本領域中是已知的，並包括可以從美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)獲得的永生化細胞系，例如但不限於中華倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(例如H印G2)、Madin-Darby牛腎(「MDBK」)細胞、HEK293F細胞、NS0-1細胞以及其它細胞。同樣地，細菌宿主例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和鏈球菌(Streptococcus spp.)可以與本發明的表達構建體一起使用。可用於本發明中的酵母宿主包括但不限於釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色假絲酵母(Candida albicans)、麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、吉利蒙德畢赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶羅維亞酵母(Yarrowia Iipolytica)。用於杆狀病毒表達載體的昆蟲細胞包括但不限於埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜猜銀紋夜蛾(Autographa caiifornica)、家香(Bombyx mori)、黑腹果妮(Drosophila melanogaster)、菲律賓實妮(Spodoptera frifiperda)和粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)。
[0109]具有目標多核苷酸例如艱難梭菌芽孢抗原的表達載體也可以是本領域技術人員通常用於需要的宿主的DNA疫苗接種的載體。DNA疫苗接種可以以任何方式使用，例如用於首次宿主抗原性激發和/或用於目標抗原的加強激發。DNA疫苗接種和相關技術的一般特徵在本領域中是公知的。也可以使用用於測量針對目標抗原的免疫應答是否已經產生和/或在宿主中是否已經建立針對細菌激發的保護的公知技術容易地確定DNA載體的適合劑量。
[0110]取決於所選的表達系統和宿主，可以通過將用上述表達載體轉化的宿主細胞在使得目標蛋白得以表達的條件下進行培養來產生本發明的蛋白質。然後從宿主細胞分離該蛋白質並對其進行純化。適合的生長條件和回收方法的選擇在本領域的技術範圍之內。
[0111]艱難梭菌芽孢抗原蛋白質序列也可以使用已知胺基酸序列或源自於目標基因的DNA序列的胺基酸序列，通過化學合成例如固相肽合成來產生。這樣的方法對於本領域技術人員來說是已知的。對於固相肽合成技術參見例如J.M.Stewari^PJ.D.Young, Solid PhasePeptide Synthesis,第二版,Pierce Chemical C0., Rockford, IL (1984)以及 G.Barany 和R.B.Merrifield,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,E.Gross和 J.Meienhofer主編，Vol.2, Academic Press, New York, (1980), pp.3-254 ;對於經典的溶液合成，參見M.Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984)以及 E.Gross 和 J.Meienhofer 主編，The Peptides:Analysis, Synthesis, Biology,同上，Vol.1。如果所研究的抗原的小片段能夠在目標受試者中引起免疫應答，則肽的化學合成可能是優選的。
[0112]本發明的多肽還可以包括作為存在多基因、可選轉錄事件、可選RNA剪接事件和可選翻譯和翻譯後事件的結果而產生的多肽。多肽可以表達在引起與肽在原始細胞中表達時存在的基本上相冋的翻譯後修飾的系統例如培養細胞中，或者表達在引起當在原始細胞中表達時存在的翻譯後修 飾(例如糖基化或切割)中發生改變或省略的系統中。[0113]本發明的肽、多肽、蛋白質或抗原可以作為融合蛋白來產生，所述融合蛋白含有不是本文公開的艱難梭菌芽孢抗原序列的一部分的其他不同胺基酸序列，例如胺基酸連接物或信號序列或免疫原性載體，以及可用於蛋白質純化的配體例如穀胱甘肽-S-轉移酶、組氨酸標籤和葡萄球菌蛋白A。融合蛋白中可以存在一種以上本發明的多肽。異源多肽可以融合到例如本發明的肽、多肽或蛋白質的N-末端或C-末端。本發明的肽、多肽、蛋白質或抗原也可以作為包含同源胺基酸序列的融合蛋白來產生。可用於本發明的實施中的融合蛋白的實例包括但不限於本文描述的艱難梭菌芽孢抗原與艱難梭菌毒素A或B的部分，例如Tcd A的N-末端催化結構域、Tcd B的N-末端催化結構域或TcdB的C-末端片段4的融合體。也可以將艱難梭菌芽孢抗原或其片段彼此融合以形成適合用於本發明中的融合蛋白。
[0114]梭菌芽孢蛋白
[0115]在本發明的實施中可以使用多種艱難梭菌芽孢蛋白質中的任一種。這樣的芽孢蛋白質可以通過搜索已知的艱難梭菌序列，包括最近已被測序的多種菌株的完整基因組序列來鑑定。可用於本發明的實施的芽孢蛋白質的進一步的實例也描述在文獻中。參見例如Henriques 和 Moran, Annual Rev.Microbiol.,61:555-88 (2007)。艱難梭菌芽抱蛋白質的代表性實例包括下面所描述的那些。
[0116]BclA蛋白(包括BclAl、BclA2和BclA3)是膠原蛋白樣蛋白質，其參與艱難梭菌芽孢的外孢壁的形成。外孢壁包圍芽孢外被並造成芽孢抗性。諸如表面暴露的外孢壁蛋白的革巴標是用於治療的良好的潛在革巴標。例如，BclA蛋白在炭痕芽抱桿菌(Bacillusanthracis)中具有直系同源物，並且已顯示用BclA進行的免疫通過抑制萌發在動物中顯示出針對炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)芽孢定植的保護作用。可以在本發明的實施中使用的艱難梭菌BclA序列的代表性實例包括但不限於具有下列NCBI登記號的蛋白質:FN545816(對於 BclAU A2 和 A3 分別為 402547-404145,3689444-3691084 和3807430-3809466 區)。
[0117]艱難梭菌中的Alr (丙氨酸消旋酶)蛋白是一種外孢壁酶，其參與將萌發與營養限制培養基中存在的芽孢數量相 關聯的群體感應類型的機制。在芽孢桿菌物種中也存在直系同源蛋白質，其中所述蛋白已被顯示存在於芽孢形成的晚期，並且對於抑制過早萌發從而提高細菌的存活率來說是必需的。可以在本發明的實施中使用的艱難梭菌Alr序列的代表性實例包括但不限於NCBI登記號為FN545816 (3936313-3937470區)的蛋白質。
[0118]SlpA蛋白編碼S-層，其是芽孢上的主要表面抗原。已顯示，SlpA蛋白在患者中誘導強的血清 IgG 應答(參見 Kelleher D.等，J.Med.Micr0.，55:69-83 (2006))。所述蛋白被分成N-末端(LMW)部分和C-末端(HMW)部分。SlpA HMW蛋白高度保守，並因此作為靶是有吸引力的。
[0119]SlpA旁系同源物蛋白是艱難梭菌菌株630中與高麗SlpA亞基的胺基酸序列近緣的一大類開放閱讀框(旁系同源物)。該胺基酸序列與枯草芽孢桿菌的兩種細胞壁結合蛋白N-乙醯胞壁醯-L-丙氨酸醯胺酶(CWLB/LytC)及其增強子(CWBA/LytB)45%同源的(包括保守置換)。序列同源性具有功能相關性，因為艱難梭菌高MWSLP亞基顯示出醯胺酶活性。通過與枯草芽孢桿菌的相似性，已表明同源性結構域介導對細胞壁的錨定，並因此鑑定了一類細胞壁組分。與此相一致的是，許多slpA旁系同源物編碼典型的信號序列，表明它們是分泌的或膜結合的。在迄今為止鑑定到的29個slpA旁系同源物中，有12個定位在slpA周圍的密集排列的簇中，並全都以相同方向轉錄，表明了協同調控和相關功能的可能性。已顯示，在營養生長期間，緊鄰slpA的3』的6個slpA樣基因(0RF2至7)進行轉錄。C0G2247是推測的細胞壁結合結構域。可以在本發明的實施中使用的艱難梭菌slpA序列的代表性實例包括但不限於NCBI登記號為FN545816 (3157304-3159175，3162172-3164448區)的蛋白質。下面在實施例3中示出了 COG2247，一種推測的細胞壁結合結構域。
[0120]⑶1021(CotH)蛋白是在艱難梭菌芽孢上發現的一種假設蛋白質，已經針對其產生了抗體。由於這種蛋白質是表面暴露的，使其成為用於治療的良好靶標。可以在本發明的實施中使用的艱難梭菌CD1021序列的代表性實例包括但不限於NCBI登記號為AM180355 (1191725-1193632 區)的蛋白質。
[0121]IunH編碼肌苷水解酶，一種存在於炭疽芽孢桿菌外孢壁中的酶，在艱難梭菌中具有該酶的直系同源物。已提出這種酶在芽孢萌發的啟動中發揮作用。可以在本發明的實施中使用的艱難梭菌IunH序列的代表性實例包括但不限於NCBI登記號為FN545816 (1866580-1867548 區)的蛋白質。[0122]Fe-Mn-SOD或超氧化物歧化酶(SOD)是催化超氧化物至氧和過氧化氫的歧化作用的一類酶，因此是細胞中的重要抗氧化防禦者。許多細菌含有這種酶的帶有鐵和錳的形式。可以在本發明的實施中使用的艱難梭菌Fe-Mn-SOD序列的代表性實例包括但不限於NCBI登記號為NC_013316 (1802293-1802997區)的蛋白質。
[0123]fliD基因編碼艱難梭菌的鞭毛帽蛋白(FliD)。已顯示這種蛋白在體外和體內具有粘附性質，特別是已顯示在與黏膜的粘附中有作用。已顯示，與患有CDAD的患者組相比，在對照組中針對FliD的抗體水平明顯更高，表明這種蛋白質能夠誘導可能在宿主防禦機制中發揮作用的免疫應答。獨立的研究顯示，該蛋白質存在於測試的17個臨床分離株中的15個中，表明它存在在大多數菌株中。同一項研究還顯示，在具有不同臨床分離株的17位患者中，15位具有針對FliD的抗體。可以在本發明的實施中使用的艱難梭菌FliD序列的代表性實例包括但不限於具有下列NCBI登記號的蛋白質:Q9AHP4、AF297024、AF297025、AF297026、AF297027 和 AF297028。
[0124]表1提供了可以在本發明的實施中使用的艱難梭菌芽孢抗原蛋白質的示例性胺基酸序列。應該理解，下面提供的示例性序列的變體和片段也被本發明所涵蓋。
[0125]
【權利要求】
1.一種組合物，其包含結合艱難梭菌(C.difficile)芽孢多肽或其片段的抗體或其片段，其中所述多肽或其片段選自BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA旁系同源物、SlpA HMW,CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD 和 FliD0
2.一種組合物，其包含結合艱難梭菌芽孢多肽或其片段的抗體或其片段，其中所述多肽或其片段包含與 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 或 SEQ ID NO:10 中所示的胺基酸序列至少80-95%同一的胺基酸序列。
3.一種分離的抗體或其片段，其結合艱難梭菌芽孢多肽或其片段，其中所述多肽或其片段選自 BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA 旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH, Fe-Mn-SOD和 FliD0
4.一種抗體或其片段，其結合艱難梭菌芽孢多肽或其片段，其中所述多肽或其片段包含與 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 或 SEQ ID NO:10 中所示的胺基酸序列至少80-95%同一的胺基酸序列。
5.權利要求1-4任一項的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段是多克隆抗體。
6.權利要求1-4任一項的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段是單克隆抗體。
7.權利要求1-4任一項的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段是人抗體。
8.權利要求1-4任一項的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段選自:(a)完整免疫球蛋白分子;(b) scFv ； (c)嵌`合抗體；(d)Fab片段；(e)F(ab』 )2 ;和(f) 二硫鍵連接的Fv。
9.權利要求1-4任一項的抗體或其片段，其包含選自下列的重鏈免疫球蛋白恆定結構域:(a)人IgM恆定結構域；(b)人IgGl恆定結構域；(c)人IgG2恆定結構域；(d)人IgG3恆定結構域；(e)人IgG4恆定結構域；和(f)人IgAl/2恆定結構域。
10.權利要求1-4任一項的抗體或其片段，其包含選自下列的輕鏈免疫球蛋白恆定結構域:(a)人IgK恆定結構域；和(b)人Ig λ恆定結構域。
11.權利要求1-4任一項的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段以至少IX IO9M的親和常數(Kaff)與抗原結合。
12.權利要求1-4任一項的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段以至少IX IOkiM的親和常數(Kaff)與抗原結合。
13.權利要求1-2任一項的組合物，其還包含選自結合艱難梭菌毒素Α、毒素B的抗體及結合毒素A和毒素B的抗體組合的成員。
14.權利要求1-2任一項的組合物，其還包含抗生素。
15.權利要求14的組合物，其中所述抗生素是甲硝噠唑或萬古黴素。
16.一種治療艱難梭菌相關疾病的方法，所述方法包括向需要的受試者施用有效減輕或預防所述疾病的量的權利要求1-2任一項的組合物。
17.一種治療艱難梭菌相關疾病的方法，所述方法包括向需要的受試者施用有效減輕或預防所述疾病的量的權利要求3-4任一項的組合物。
18.一種治療艱難梭菌相關疾病的方法，所述方法包括向需要的受試者施用有效減輕或預防所述疾病的量的權利要求13的組合物。
19.權利要求16的方法，其中所述組合物靜脈內(IV)、皮下(SC)、肌肉內(IM)或口服施用。
20.權利要求17的方法，其中所述組合物靜脈內(IV)、皮下(SC)、肌肉內(IM)或口服施用。
21.權利要求18的方法，其中所述組合物靜脈內(IV)、皮下(SC)、肌肉內(IM)或口服施用。
22.權利要求16的方法，其中所述組合物以I至100毫克每千克受試者體重的範圍的量施用。
23.權利要求17的方法，其中所述組合物以I至100毫克每千克受試者體重的範圍的量施用。
24.權利要求18的方法，其中所述組合物以I至100毫克每千克受試者體重的範圍的量施用。
25.一種被動免疫方法，所述方法包括向動物施用有效量的權利要求1-2任一項的組合物。
26.一種被動免疫方法，所述方法包括向動物施用有效量的權利要求3-4任一項的抗體或其片段。
27.一種在受試者 中誘導免疫應答的方法，所述方法包括以在所述受試者中有效誘導免疫應答的量向所述受試者給藥艱難梭菌芽孢多肽或其片段或變體和藥學上可接受的佐劑，所述多肽或片段或變體選自BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA旁系同源物、SlpA HMW,CD1021、IunH, Fe-Mn-SOD 和 FliD0
28.一種在受試者中誘導免疫應答的方法，所述方法包括以在所述受試者中有效誘導免疫應答的量向所述受試者施用艱難梭菌芽孢多肽或其片段或變體和藥學上可接受的佐劑，所述多肽或片段或變體包含與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 或 SEQ ID NO:10中所示的胺基酸序列至少80-95%同一的胺基酸序列。
29.一種在需要的受試者中減少或預防艱難梭菌感染的方法，所述方法包括以在所述受試者中有效減少或預防感染的量向所述受試者施用艱難梭菌芽孢多肽或其片段或變體和藥學上可接受的佐劑，所述多肽或片段或變體選自BclAl、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD 和 FliD。
30.一種在需要的受試者中減少或預防艱難梭菌感染的方法，所述方法包括以在所述受試者中有效減少或預防感染的量向所述受試者施用艱難梭菌芽孢多肽或其片段或變體和藥學上可接受的佐劑，所述多肽或片段或變體包含與SEQ ID NO=USEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3, SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的胺基酸序列至少80-95%同一的胺基酸序列。
31.權利要求27-30任一項的方法，其中所述藥學上可接受的佐劑是白介素12或熱休克蛋白。
32.權利要求27-30任一項的方法，其中所述施用是口服、鼻內、靜脈內或肌肉內施用。
33.權利要求27-30任一項的方法，其中所述變體是突變體。
34.權利要求27-30任一項的方法，其中所述變體是融合蛋白。
35.權利要求34的方法，其中所述融合蛋白包含艱難梭菌毒素A或B的序列。
36.權利要求35的方法，其中所述艱難梭菌毒素A或B的序列選自TcdB的N-末端催化結構域、TcdB的C-末端片段4和TcdA的C-末端受體結合片段。
37.權利要求34的方法，其中所述融合蛋白是BClAl、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD和FliD及其片段組成的組中的成員，或SEQ IDNO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10及其片段組成的組中的成員，與該組的另一個成員的融合體。
38.一種組合物，其包含有效免疫量的分離的多肽或其片段或變體和藥學上可接受的載體，其中所述組合物在受試者中有效地誘導針對艱難梭菌感染的免疫應答，並且其中所述分離的多肽或其片段或變體包含選自BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA旁系同源物、SlpAHMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD和FliD的艱難梭菌芽孢多肽或其片段。
39.一種組合物，其包含有效免疫量的分離的多肽或其片段或變體和藥學上可接受的載體，其中所述組合物在受試者中有效地誘導針對艱難梭菌感染的免疫應答，並且其中所述分離的多肽或其片段或變體包含與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 或 SEQ IDNO:10中所示的胺基酸序列至少80-95%同一的胺基酸序列。
40.權利要求38或39的組合物，其中所述組合物還包含藥學上可接受的佐劑。
41.權利要求40的組合物，其中所述藥學上可接受的佐劑包括水包油乳液。
42.權利要求40的組合物，其中所述藥學上可接受的佐劑是ISA-206和QuilA。
43.權利要求40的組合物，其中所述藥學上可接受的佐劑是白介素12或熱休克蛋白。
44.權利要求38或39的方`法，其中所述變體是突變體。
45.權利要求38或39的方法，其中所述變體是融合蛋白。
46.權利要求45的方法，其中所述融合蛋白包含艱難梭菌毒素A或B的序列。
47.權利要求46的方法，其中所述艱難梭菌毒素A或B的序列選自TcdA的N-末端催化結構域、TcdB的N-末端催化結構域、TcdB的C-末端片段4和TcdA的C-末端受體結合片段。
48.權利要求45的方法，其中所述融合蛋白是BClAl、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD和FliD及其片段組成的組中的成員，或SEQ IDNO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10及其片段組成的組中的成員，與該組的另一個成員的融合體。
49.一種在需要的受試者中減少或預防艱難梭菌感染的方法，所述方法包括以在所述受試者中有效減少或預防感染的量向所述受試者施用一定量的編碼艱難梭菌芽孢多肽或其片段或變體的核酸和藥學上可接受的佐劑，所述多肽或片段或變體選自BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA 旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD 和 FliD。
50.一種在需要的受試者中減少或預防艱難梭菌感染的方法，所述方法包括以在所述受試者中有效減少或預防感染的量向所述受試者施用一定量的編碼艱難梭菌芽孢多肽或其片段或變體的核酸和藥學上可接受的佐劑，所述核酸編碼與SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的胺基酸序列至少80-95%同一的胺基酸序列。
51.權利要求49或50的方法，其中所述變體是突變體。
52.權利要求49或50的方法，其中所述變體是融合蛋白。
53.權利要求52的方法，其中所述融合蛋白包含艱難梭菌毒素A或B的序列。
54.權利要求53的方法，其中所述艱難梭菌毒素A或B的序列選自TcdA的N-末端催化結構域、TcdB的N-末端催化結構域、TcdB的C-末端片段4和TcdA的C-末端受體結合片段。
55.權利要求52的方法，其中所述融合蛋白是BClAl、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-S0D 和 FliD 組成的組中的成員，或 SEQ ID NO =USEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10組成的組中的成員，與該組的另一個成員的融合體。
56.一種分離的核酸，其編碼選自BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA旁系同源物、SlpAHMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD和FliD的艱難梭菌芽孢多肽或其片段或變體。
57.一種分離的核酸，其編碼艱難梭菌芽孢多肽或其片段或變體，其中所述核酸編碼與SEQ ID NO:USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 或 SEQ ID NO:10 中所示的胺基酸序列至少 80-95%同一的胺基酸序列。
58.權利要求56或 57的核酸，其中所述變體是突變體。
59.權利要求56或57的核酸，其中所述變體是融合蛋白。
60.權利要求59的核酸，其中所述融合蛋白包含艱難梭菌毒素A或B的序列。
61.權利要求60的核酸，其中所述艱難梭菌毒素A或B的序列選自TcdA的N-末端催化結構域、TcdB的N-末端催化結構域、TcdB的C-末端片段4和TcdA的C-末端受體結合片段。
62.權利要求59的核酸，其中所述融合蛋白是BClAl、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD和FliD及其片段組成的組中的成員，或SEQ IDNO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10及其片段組成的組中的成員，與該組的另一個成員的融合體。
63.—種表達載體,其包含權利要求56或57的核酸。
64.權利要求63的表達載體，其中所述表達載體是哺乳動物表達載體。
65.權利要求64的表達載體，其中所述哺乳動物表達載體包含CMV啟動子。
66.權利要求63的表達載體，其中所述表達載體是pcDNA3002Neo或pET32a。
67.—種宿主細胞，其包含權利要求63的表達載體。
68.權利要求67的宿主細胞，其中所述宿主細胞是HEK293F、NS0-1、CH0-K1、CH0-S或PER.C6。
69.權利要求63的表達載體，其中所述表達載體是細菌表達載體。
70.權利要求69的表達載體，其中所述表達載體是pET32a。
71.權利要求67的宿主細胞，其中所述宿主細胞是大腸桿菌(E.coli)。
72.權利要求1-4任一項的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段抑制或延遲芽孢萌發。
【文檔編號】C12P21/08GK103608464SQ201180068078
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2011年12月29日 優先權日:2010年12月29日
【發明者】J·貝裡, D·約翰斯通, B·泰伊, M·洛佩斯, J·喬治, 韓笑冰 申請人:卡恩基因公司