產紫杉醇微生物飽和突變體庫的構建和高產紫杉醇菌株的選育方法
2023-06-28 11:23:31
專利名稱：產紫杉醇微生物飽和突變體庫的構建和高產紫杉醇菌株的選育方法
技術領域：
本發明屬於工業微生物和藥用微生物領域，涉及一種利用包括轉座子突變方法構建產紫杉醇微生物飽和突變體庫和利用紫杉醇抗體酶聯免疫篩選高產紫杉醇突變菌株的方法。
背景技術：
紫杉醇(taxol)是在20世紀60年代早期從太平洋紫杉中分離出來的一種二帖類生物鹼，經對其化學、藥理方面的研究，表明其具有廣泛的抗癌活性，如對乳腺癌、子宮癌等多種癌症都具有較好的療效。1992年美國FDA正式批准其上市，從此，紫杉醇成為抗癌新藥的熱點。過去這種藥靠從紅豆杉樹中提取，但由於該樹種十分稀少，生長緩慢，瀕臨滅絕，這種藥化學結構複雜，分子量大，難以用化學合成法合成，細胞培養也未產業化，因此該藥價格十分昂貴，國際市場上其針劑純品價格高達600萬美元/kg。1993年，美國科學家發現紅豆杉內生真菌也能產紫杉醇。這為解決紫杉醇藥源危機提供了理想的途徑。1996年，加拿大Novopharm製藥公司應用Alternaria alternta菌種發酵生產紫杉醇技術取得歷史性進展，並達到工業化要求，使得加拿大成為世界上第一個成熟應用真菌發酵生產紫杉醇的國家。真菌發酵生產紫杉醇是最理想但也異常艱難的科研開發之路。國內華菌公司於97年粗篩到3株紫杉醇的內生真菌；後經誘變、育種終於在98年獲得了高產菌Phargen AA-013，菌種表達率高達120～227mg/L。周東坡教授採用從紅豆杉樹中分離得到的真菌，通過發酵法產生紫杉醇，搖瓶水平可高達400μg/L，比國際最高水平高出2倍多，發酵液中紫杉醇產率達到448.52ug/L。
為了產業化，除了優化產紫杉醇微生物的培養基和條件、還需要進一步提高產紫杉醇微生物的產量，利用各種育種方法可能獲得紫杉醇高產菌株。突變體庫就是由某種方法產生的、包含各種不同基因突變的群體。飽和突變體庫是指理論上該基因組的每個基因都發生了突變的突變體庫。根據公式P＝1-(1-(L/C)cf可以預測構建飽和突變體庫所需的克隆數，P是發現任意一個基因插入突變的概率，L代表基因的平均長度，C是單倍體基因組的大小，n是插入突變的克隆數，f是每個克隆平均插入位點數。
轉座系統在當代遺傳學和分子生物學研究中有很大的應用價值.它不僅能作為反向遺傳學的工具，將外源基因轉入受體基因組而使受體產生表型的變化，同時，其又因為能通過隨機的插入突變使內源基因失活而成為正向遺傳學研究中的新寵。轉座子是美國遺傳學家McClintock在20世紀40年代首先在玉米中發現的可從染色體的一個位置跳到另一位置，乃至從一條染色體跳到另一染色體上的特殊基因，廣泛存在於幾乎所有原核和真核生物中。在結構上，轉座子具有共同特徵，即兩端是重複序列，有轉座酶的識別位點，中間是結構基因，編碼轉座酶和另外一些蛋白質。根據轉座機制，轉座子分為兩大類一類是DNA介導轉座的轉座子，以複製或直接切除兩種方式獲得可移動片段，重新插入基因組DNA中，有人形象地稱它們的轉座為剪切和粘貼模式(cut-and-pastemode)。這類轉座子一般包括兩種結構形式，如玉米的Ac/Ds。Ac編碼轉座酶，能自行轉座，稱為自主轉座元件；Ds多是Ac的缺失體，完全或部分失去了編碼轉座酶的基因，不能編碼轉座酶，但仍保留有兩側的重複序列，能被轉座酶識別，因此能在Ac編碼的轉座酶的作用下轉座，稱為非自主轉座元件，類似的還有玉米的En/Spm和Mu等。另一類是RNA介導轉座的逆轉座子，通過轉錄合成mRNA，再逆轉錄合成新的轉座元件整合到基因組中完成轉座，每轉座一次拷貝數增加一份，被稱為複製和粘貼模式(cut-and-paste mode)。它們在基因組中拷貝數高，是構成基因組的主要成分(通常超過總DNA的一半)。
轉座子標籤法利用轉座子能整合進入昆蟲或微生物基因組中，常常能破壞一個正常基因的功能，導致一種或幾種突變表型標記，形成所謂轉座子標籤(transposon tag)。通過這種轉座子標籤，可跟蹤雜交後代，並以轉座子作探針，從基因組文庫中定位基因，對基因進行突變和標記，最終達到分離和克隆基因的目的。這種方法被稱為「轉座子標籤法」(transposon tagging)。轉座子標籤的設計基本原則是只保留轉座子上，完成轉座過程的必需片段，同時加入篩選標記與報導基因。報導基因不含有啟動子，只有在轉座標籤插入ORF(open reading frames)，在其啟動子控制下報導基因得以表達，因而用於檢測直接插入基因內部的標籤。篩選標記和常規質粒一樣有抗性標記和營養缺陷型標記兩種。通過分離轉座子和突變基因的側翼區可鑑定該基因。轉座子基因標籤法已用於克隆絲狀真菌基因。轉座子標籤法已經用於克隆絲狀真菌基因。常用的有2種途徑1、將構建的帶有轉座子的載體，轉化入異源寄主，從而克隆目標基因。2、利用寄主的內生同源轉座子克隆基因，不必構建載體。轉座子標籤法已被用於果蠅分離出了十幾個基因，在哺乳動物中利用反轉錄轉座子載體也分離定位了一些基因，在植物中利用玉米Ac/Ds系統，不僅在玉米而且在異源植物中也得到了廣泛應用。作為生物標籤的一種，除了不需要知道基因的產物，也無須了解基因的表達特點以外，轉座子的優點表現在(1)插入是完整的元件，便於分子分析(2)可從插入位點切除，產生回復突變，我們不僅可據此確認真正由轉座子引起的突變，還可進一步驗證突變基因的功能；(3)通過不斷跳動產生新的突變，相對較少的起始轉化系就可獲得整個基因組的飽和突變，大大減少了工作量；(4)還可以應用於轉化效率不高的微生物，通過雜交或繁殖獲得新的插入突變。
標記系統轉座子捕捉插入突變載體如果左右邊界內只包含一個選擇標記基因的載體。在用這類載體建立的突變體庫中，能得到部分基因功能缺失的突變體(loss-of-functionmutant)，但不能得到有功能冗餘及致死效應的基因的突變體，也很難研究具有高度多效性的基因。插入突變只有產生了明顯表型變化時才能被發現利用，然而在真核生物中，多數基因在被插入或破壞時，並沒有明顯的表型變化，其中包括功能冗餘基因、多發育階段表達基因和受環境條件誘導的基因。轉座子捕捉就是為了標記和克隆這些基因設計的，在非自主轉座元件上融合進一個表達受外界轉錄信號調節的報告基因，在適當的時候，報告基因表達，不僅能反應轉座子的位置，而且它的表達模式還能反應標記基因的表達活性及調節。為了彌補這方面的不足，開發出了轉座子捕捉系統如增強子捕捉(enhancer trap)、啟動子捕捉(promoter trap)和基因捕捉(gene trap)三種模式。這三種載體通過插入的報告基因的表達來研究被插入基因的表達模式，而且對致死基因也可以在雜合狀態下進行研究。Enhancer trap中的報告基因與一個微小的啟動子相連，單獨靠它無法啟動報告基因的表達，或者表達效率很低。只有插入到基因組的合適位置，利用被插入基因的增強子才能使報告基因表達。所以，報告基因的表達與否，一方面反映了轉座子插入的位置，另一方面反映了被插入基因的表達特性。例如，報告基因呈現時空特異性表達，則可以推斷被插入的基因是時空特異性表達的。Promoter trap和enhancer trap類似，不同在於promoter trap中沒有啟動子部分。Gene jrap與promotertrap類似，不過在gene trap中報告基因前多了個剪切接受位點(splice acceptor)，當其插入到一個基因的內含子時，能與被插入基因外顯子同時轉錄，被插入基因表達時，報告基因也能表達。激活標籤則是在靠近轉座子邊界處有四個串聯的CaMV35S增強子，當其插入到一個基因的附近引起該基因的過量表達，可以產生獲得功能性(gain-of-function)的突變體。mariner轉座子在許多昆蟲中大量存在，不易分清到底是哪一個拷貝引起的基因突變(外源轉座子和內源轉座子)，從而不能將突變表型與突變基因快速聯繫起來，而且尋找整合的後代也需要大量的工作。因此，尋找一種較易識別定位轉座子的插入位置，鑑定轉座子整合後代的標記基因非常重要。水母的綠色螢光蛋白基因(GFP)是一個很好的選擇標記。通過將GFP基因插入到mariner轉座子中間，隨著mariner轉座子一起整合到基因組中，可在螢光顯微鏡下觀察到綠色螢光的有無，以此來尋找整合後代和分析轉座子整合插入的初步位置。
激活標籤對於那些插入突變不能導致明顯表型變化的基因，還可以用激活標籤進行標記，做法就是使DNA或轉座子帶上強啟動子，增強靶位點附近基因的轉錄，使它們過表達或異位表達。除了增強基因表達，激活標籤還和一般標籤一樣，插入一個基因內部時，會造成基因斷裂，引起插入突變。如果激活標籤反向插入到基因上遊，有時會通過反義表達造成基因沉默。多種功能合而為一，大大提高了激活標籤標記基因的效率，再加上轉座子不斷跳躍的特點，可以預計，帶有激活標籤的轉座子必將成為功能基因組研究的最有效工具之一。與轉座子結合的睡美人轉座酶可以將特殊基因轉移進目標生物體內。通過擴增旁側序列就能很快的找到引起突變體的遺傳基礎。對於旁側序列的分析，目前反向PCR(inverse PCR)或TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)等方法使用得比較普遍。
在功能基因組時代，研究大量基因需要系統進行，因此建立涵蓋廣泛的突變體庫非常必要。目前PCR檢測是反向遺傳學最有效的途徑，通過建立插入突變側翼序列庫就變得尤為重要，在整個微生物功能基因組序列已知的基礎上，只需把插入突變側翼序列與基因組序列加以比較就能很容易地找出突變的基因，並在染色體上繪出插入位點的位置。這樣任何一個基因的插入突變都可以通過計算機確認，因此側翼序列庫將是反向遺傳學研究的最有效的工具，不僅能確認突變，而且能發現新的基因。
發明內容
本發明的目的在於提供，1.一種構建產紫杉醇微生物飽和突變體庫的方法；2.一種從突變體庫篩選紫杉醇產量變異菌株的方法，其特徵是利用紫杉醇抗體進行酶聯免疫檢測。
實現上述目的的基本技術路線為總體技術方案是利用轉座子、化學物質如NTG、EMS、羥胺等和物理因素如UV、輻射等、生物因素如mu噬菌體、質粒、轉座子和插入序列等構建產紫杉醇微生物在基因組規模的飽和突變體庫，尤其是利用轉座子突變系統構建。
1.菌株及其培養本技術方案採用的菌株包括但不限於下列產紫杉醇微生物，Taxomycesandreanae(紫杉黴屬)、Monochaetia sp(盤單毛孢屬)、Fusarium lateritium(鐮刀黴屬)、Alternaria sp(交鏈孢屬)、Pestalotiopsis microspora(盤多拉毛黴屬)、Pestalotiopsismicrospora(盤多拉毛黴屬)、Sumatrana Pithomyces sp(髓黴屬)、Pestalotiopsismicrospora(盤多拉毛黴屬)、Pestalotiopsis microspora(盤多拉毛黴屬)、Pestalotiopsisguepinii(盤多拉毛黴屬)、conia sp(黑團孢黴屬)、Cephalosporium spp(頭孢黴屬)、Martensiomyces spp(輪柄梳黴屬)、Mycelia sterlia(無孢類群)、Tubercularia sp(瘤座孢屬)、Nodulisporium sylviforme(多節孢屬)、Pleurocytospora taxi(側孢座腔菌屬)、AlternariaTaxi(鏈格孢屬)、Rhizoctonis sp(絲核菌屬)、penicillium(青黴屬)、Trichoderma(木黴屬)、Mucor(毛黴屬)、Chaetomium(毛殼孢屬)等。
2.培養基和生長條件為常規的PDA固體培養基和PDB液體培養基。
3.轉座子和轉座子標籤法構建產紫杉醇微生物的飽和突變體庫本技術方案採用的轉座子包括但不限於restless轉座子，impala/fot1轉座子，MAGGY轉座子、基於細菌中的Tn3轉座子、Mu噬菌體和酵母的Ty成分等改造的用於轉座子標籤法元件。該技術具有快速、準確、規模化尋找與某一表型相關的基因的操作特點，技術簡單。Tn3成分是TnA家族成員，長度為4957bp，其轉座必需片段為內部解離位點(res位點)、重組酶作用位點(lox位點)及38bp的末端倒轉重複序列。同時含有編碼轉座酶的tnpA基因和編碼解旋酶的tnpR基因等。本技術方案採用的mTn3轉座子標籤之一是mTn-sacB/gfp，它保留了Tn3轉座子的38bp的末端重複序列、res位點與lox位點，並加入了Amp抗性標記、sacB反選擇標記和沒有啟動子的報導基因GFP。也可以根據特定菌株的性質，更換篩選標記或報導基因。mTn3轉座子標籤結構簡單，屬於隨機性的轉座子標籤，可能是真菌基因功能研究中應用最廣泛的一種標籤，適用於大規模構建突變體、探尋功能基因。
Mu噬菌體和miniMu噬菌體標籤Mu噬菌體是一種以大腸桿菌為宿主的溫和噬菌體。它的DNA為線性分子，能隨機地插入寄主染色體中，與其他轉座子不同的是，它不含有末端倒轉重複序列。miniMu噬菌體標籤自身長度較小，卻可以融合較大的DNA片段(最大到39kb)，因而可以與各種目的載體進行連接。除了存在個別插入熱點(hot spot)外，miniMu噬菌體標籤對染色體的插入基本上是完全隨機的。該標籤體系的應用程式與mTn3轉座子標籤大體相同。
4.基因組DNA的製備採用常規方法製備菌體基因組DNA。
5.發酵實驗250ml三角瓶裝入50ml培養基，滅菌，冷卻後接入0.5cm2的菌絲塊，於30°搖床培養，6.生物量測定取一定體積培養液於4000r min、離心5-15min，傾去上清液，用蒸餾水洗滌2-3次，收集菌體，烘至恆重，再稱重。50-98h不等。苯丙氨酸在培養基滅菌後冷加入。
7.酶聯免疫方法篩選紫杉醇產量變異的突變體按本技術領域一般技術人員熟悉的方法，將紫杉醇與適當的分子，如牛血清白蛋白、生物素等結合，免疫兔子或大鼠，製備抗血清，檢測血清的效價，利用抗血清和酶標儀、96孔或384孔，甚至更多孔的酶標板，檢測突變菌株的紫杉醇產量。
發明效果利用本技術方案涉及的轉座子，包括Tn3等，對產紫杉醇的出發菌株，構建了飽和的突變體庫，利用紫杉醇抗體酶聯免疫方法快速、相對低成本地篩選到了紫杉醇產量提高的菌株。
具體實施例方式
實施例1.菌株及其培養Penicillium(青黴屬)真菌在常規的PDA固體培養基和PDB液體培養基生長，產紫杉醇的歐文氏菌屬細菌等在LB肉湯培養基中培養。
2.轉座子和轉座子標籤法構建產紫杉醇微生物的飽和突變體庫轉座子標籤中真菌分別採用restless轉座子、impala160和基於細菌中的Tn3轉座子、細菌採用Tn3轉座子。轉座子標籤的篩選標記為sacB反選擇標記、URA和沒有啟動子的報導基因GFP。按照本領域技術人員熟悉的分子生物學技術，擴增轉座子標籤，採用適當的限制性內切酶切割含有篩選標記和轉座酶的片段，分別轉化青黴或歐文氏菌。
Mu噬菌體和miniMu噬菌體標籤Mu噬菌體是一種以大腸桿菌為宿主的溫和噬菌體。它的DNA為線性分子，能隨機地插入寄主染色體中，與其他轉座子不同的是，它不含有末端倒轉重複序列。miniMu噬菌體標籤自身長度較小，卻可以融合較大的DNA片段(最大到39kb)，因而可以與各種目的載體進行連接。除了存在個別插入熱點(hot spot)外，miniMu噬菌體標籤對染色體的插入基本上是完全隨機的。該標籤體系的應用程式與mTn3轉座子標籤大體相同。根據公式P＝1-(1-(L/C)cf可以預測構建飽和突變體庫所需的克隆數，P是發現任意一個基因插入突變的概率，L代表基因的平均長度，C是單倍體基因組的大小，n是插入突變的克隆數，f是每個克隆平均插入位點數。計算預測的克隆數和實際克隆數，利用轉座子標籤方法獲得了預期的克隆數。
也可以採用帶有5-FU抗性基因的片段插入impala160的NheI限制性內切酶位點，獲得pNIpyr。電轉化完整的孢子，將NdeI-酶切的pNIpyr導入孢子。即0.5微克線性化的質粒和500萬個孢子放在0.2-cm電轉化槽(Bio-Rad)，1-kV脈衝(Bio-Rad電轉化儀400，25μF)。或者採用本領域一般技術員熟悉的化學方法進行轉化。
根據特定的表型分離轉化子。Southern分析基因組的分子特徵。
4.基因組DNA的製備採用常規方法製備菌體基因組DNA。
5.發酵實驗250ml三角瓶裝入50ml培養基，滅菌，冷卻後接入0.5cm2的菌絲塊(真菌)或菌落(細菌)，於30°(真菌)或37°(細菌)搖床培養適宜的時間。
6.生物量測定取一定體積培養液於4000r min、離心5-15min，傾去上清液，用蒸餾水洗滌2-3次，收集菌體，烘至恆重，再稱重。50-98h不等。苯丙氨酸在培養基滅菌後冷卻加入。
7.酶聯免疫方法篩選紫杉醇產量變異的突變體按本技術領域一般技術人員熟悉的方法，將紫杉醇與適當的分子，如牛血清白蛋白、生物素等結合，免疫兔子或大鼠，製備抗血清，檢測血清的效價，利用抗血清和酶標儀、96孔或384孔，甚至更多孔的酶標板，檢測突變菌株的紫杉醇產量變異的菌株。
權利要求
1.一種構建產紫杉醇微生物飽和突變體庫的方法，其特徵是利用帶有顏色標記、抗性基因或營養缺陷型標記的基因的轉座子體內或體外轉座產紫杉醇的微生物。
2.權利要求1所述的構建產紫杉醇微生物飽和突變體庫的方法，其特徵在於產紫杉醇的微生物包括細菌、真菌和放線菌。
3.權利要求2所述的構建產紫杉醇微生物飽和突變體庫的方法，其特徵在於真菌包括青黴屬、麴黴屬。
4.權利要求2所述的構建產紫杉醇微生物飽和突變體庫的方法，其特徵在於細菌包括歐文氏菌。
5.一種從突變體庫篩選紫杉醇產量變異菌株的方法，其特徵是利用紫杉醇抗體進行酶聯免疫檢測。
全文摘要
本發明涉及一種利用包括轉座子突變方法構建產紫杉醇微生物的飽和突變體庫和利用紫杉醇抗體酶聯免疫篩選高產紫杉醇突變菌株的方法。
文檔編號G01N33/535GK1800363SQ20051005745
公開日2006年7月12日 申請日期2005年12月21日 優先權日2005年12月21日
發明者謝建平, 胡昌華, 廖國建, 餘豔, 劉雪梅 申請人:西南大學