薴麻微衛星dna標記的製作方法

2023-06-29 02:50:16 2

專利名稱:薴麻微衛星dna標記的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子標記技術，具體涉及一種薴麻的DNA分子遺傳標記。
背景技術：
微衛星(又稱為簡單重複序列，SSR)是由1～6個核苷酸組成的短序列串聯重複多次而組成的一段DNA，廣泛分布於真核基因組中。微衛星序列兩側有保守的DNA序列，根據其兩側的保守序列設計引物，可用PCR擴增出微衛星位點的序列。由於微衛星中重複單元的重複的次數不同，因而擴增出的微衛星序列的長度呈現多態性(即SSRLP或SSR)。由於其具有多態性豐富、重複性高、共顯性遺傳等優點，被廣泛應用於遺傳圖譜的構建、基因定位、遺傳關係分析，品種鑑定等領域。如用微衛星標記分析薴麻品種的親源關係(Zhou等，2005，Progress in Natural Science，15137-142)、用微衛星DNA標記進行豬品種分類的專利申請「適於豬品種分類的豬微衛星DNA標記」(公開號CN 1370834A)。
薴麻(又稱為「中國草」，種名為Boehmeria nivea(L.)Gaud)屬於蕁麻科薴麻屬，是我國重要的纖維經濟作物。薴麻的品種分類、遺傳關係分析等一般是根據形態、生理指標進行，準確度低、且受生長季節、發育時期等的限制。薴麻的分子標記的研究起步較晚，有研究者嘗試用RAPD(隨機擴增多態性DNA)標記進行了薴麻品種親源關係分析，取得了成功(郭安平.RAPD.湖南農業大學博士學位論文，1999.)。但是，RAPD標記在絕大多數情況下是顯性標記，不能區別純合基因型與雜合基因型。如何解決薴麻品種分類、遺傳關係分析中存在的準確度低及受生長季節、發育時期限制的問題，是開展薴麻研究迫切需要解決的技術。

發明內容
本發明旨在分離克隆微衛星DNA標記，建立薴麻的微衛星DNA的技術體系並利用這些分子標記進行品種分類、遺傳關係分析和輔助育種。
實現上述發明目的的技術方案包括薴麻(CT/AG)n微衛星富集文庫的構建、含微衛星序列的陽性克隆的篩選及測序，得到15個含有(CT/AG)n微衛星克隆，確定了15個多態性豐富的微衛星標記BN19、BN20、BN21、BN22，BN23，BN24、BN25、BN26、BN27、BN28、BN29、BN30、BN31、BN32、BN33；BN19為674個核甘酸、BN20為571個核甘酸、BN21為653個核甘酸、BN22，BN23，BN24均為760個核甘酸、BN25為529個核甘酸、BN26為472個核甘酸、BN27為338個核甘酸、BN28為366個核甘酸、BN29為542個核甘酸、BN30為670個核甘酸、BN31為1068個核甘酸、BN32為649個核甘酸、BN33為326個核甘酸。



圖1是用BN19位點的特異性引物擴增25個薴麻品種DNA的PAGE電泳圖圖2是用BN20位點的特異性引物擴增25個薴麻品種DNA的PAGE電泳圖圖3是用BN21位點的特異性引物擴增25個薴麻品種DNA的PAGE電泳圖圖4是用BN22位點的特異性引物擴增25個薴麻品種DNA的PAGE電泳圖圖5是用BN23位點的特異性引物擴增25個薴麻品種DNA的PAGE電泳圖圖6是用BN24位點的特異性引物擴增25個薴麻品種DNA的PAGE電泳圖圖7是用BN25位點的特異性引物擴增25個薴麻品種DNA的PAGE電泳圖圖8是用BN26位點的特異性引物擴增25個薴麻品種DNA的PAGE電泳圖圖9是用BN27位點的特異性引物擴增25個薴麻品種DNA的PAGE電泳圖圖10是用BN28位點的特異性引物擴增25個薴麻品種DNA的PAGE電泳圖圖11是用BN29位點的特異性引物擴增25個薴麻品種DNA的PAGE電泳圖圖12是用BN30位點的特異性引物擴增25個薴麻品種DNA的PAGE電泳圖圖13是用BN31位點的特異性引物擴增25個薴麻品種DNA的PAGE電泳圖圖14是用BN32位點的特異性引物擴增25個薴麻品種DNA的PAGE電泳圖圖15是用BN33位點的特異性引物擴增25個薴麻品種DNA的PAGE電泳圖具體實施方式
1薴麻(CT/AG)n微衛星富集文庫的構建(1)按郭安平等方法(參見郭安平等，1997，中國麻作，194-10)提取薴麻基因組DNA。用限制性內切酶Mse I酶切薴麻基因組DNA，酶切產物在1.2％瓊脂糖凝膠上電泳，紫外光下切下300-1000bp大小的DNA片段並用凝膠回收試劑盒(購自Qiagen公司)純化回收的酶切產物。
(2)將鹼基互補的寡核苷酸PHC-1(5』-AGATGGAATTCGTACACTCGT-3』)和磷酸化的寡核苷酸PHC-2(5』-phos-TAACGAGTGTACGAATTCCATCT-3』)等摩爾混合，95℃變性5分鐘，60℃退火1小時，形成具有MseI粘性末端的接頭。
(3)將酶切產物和接頭用T4DNA連接酶連接。連接產物用等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提一次，離心收集上清液。在上清液中加0.3M醋酸鈉(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉澱，70％乙醇清洗一次，真空抽乾DNA後溶於50μl無菌水中。
(4)用生物素標記的寡核苷酸探針(CT)15與連接產物DNA片段雜交。具體操作為在總體積100μl雜交液(6×SSC，0.1％SDS)中加入500ng連接產物和100pmol生物素標記的寡核苷酸探針，並在95℃下變性10min，60℃雜交1小時。
(5)加入100μl(10μg/μl)磁珠(Dynabeads M-280，購自Dynal Biotech公司)，並在室溫放置30分鐘。
(6)用磁鐵吸附磁珠，棄上清。磁珠用400μl洗滌緩衝液(6×SSC，0.1％SDS)在60℃下洗滌15分鐘，然後在室溫下用分別用2×SSC和1×SSC溶液洗滌兩次，並棄上清。
(7)最後加入50μl無菌水，在90℃下保溫10分鐘，小心吸取上清，上清液即為含有(GA)n重複序列的單鏈DNA片段。以PHC-1為引物，以單鏈DNA片段為模板進行PCR擴增獲得雙鏈目的片段。
(8)將擴增產物純化後連接到pMD18-T載體(購自大連寶生物公司)上，然後將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化菌液塗抹在含有IPTG和X-gal的LB固體培養基平板上進行藍白斑篩選。
2.含微衛星序列的陽性克隆的篩選、測序及微衛星引物的設計(1)挑取白色菌落並接種到3ml LB培養液中，於37℃培養過夜，然後提取質粒。
(2)質粒DNA為模板，採取PIMA方法(參見Lunt等，1999，Molecular Ecology，8891-894)篩選含有(CT/AG)n微衛星序列的陽性克隆。
(3)將陽性克隆測序，分析是否含有(CT/AG)n重複序列。通過測序，共得到了16個含(CT/AG)n微衛星序列的陽性克隆。
(4)根據微衛星重複序列兩側的保守序列設計引物。
3.利用薴麻微衛星DNA標記分析薴麻品種間的遺傳差異將上述微衛星標記用於25個薴麻品種的分類，確定了15個多態性豐富、適於薴麻品種分類的微衛星標記BN19、BN20、BN21、BN22，BN23，BN24、BN25、BN26、BN27、BN28、BN29、BN30、BN31、BN32、BN33(表1)。具體操作過程如下(1)按郭安平等方法(參見郭安平等，1997，中國麻作，194-10)提取各個薴麻品種的DNA作為模板，進行PCR。
(2)分別用BN19、BN20、BN21、BN22，BN23，BN24、BN25、BN26、BN27、BN28、BN29、BN30、BN31、BN32、BN33。15個位點的15對引物(引物序列見表1)擴增這25個品種薴麻的DNA。
(3)將PCR產物在6％變性聚丙烯凝膠上電泳，然後進行銀染並拍照，得到圖1-18。
(4)結果分析每個樣品的擴增條帶按有或無記錄，擴增條帶存在時賦值為1，否則賦值為0。採用SPSS10.0 for windows統計分析軟體中的系統聚類分析程序，距離測量選用相關係數距離法，用類間平均連鎖法(Between-groups linkage)進行聚類分析並建立系統樹。
具體分析方法參見《系統與進化植物學中的分子標記》(鄒喻蘋、葛頌、王曉東編，科學出版社，2001年)中的方法進行。
由附圖1-15可看出，本發明的15個微衛星點的序列長度在供試的25個品種中都出現多態性，由此可見，本發明的這15個微衛星標記能用於薴麻的品種分類和遺傳關係分析。
表1引物特性表引物序列，退火溫度，片段大小


表1中F表示5』端引物，R表示3』端引物。
本發明提供了15個薴麻微衛星位點的DNA序列及擴增上述15個薴麻微衛星位點的引物序列和擴增方法，15個薴麻微衛星位點用於薴麻品種分類、遺傳關係分析和標記輔助育種，重複性好，是一種可靠有效的分子標記。
序列表110中國農業科學院麻類研究所120薴麻微衛星DNA標記16013170PatentIn version 3.32101211674212DNA213薴麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)220
221重複單元222(193)..(272)220
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220
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221重複單元222(331)..(346)220
221重複單元222(349)..(376)
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221重複單元222(26)..(43)40013attctctctc ttcaaaggta aagtttctct ctctctctct ctcctttttt ttttctgtga 60atgtatagta atggaatgaa tgtcaagaaa ccatgctcat gcaagttctg cgatgatagt 120tttggtgacg ggtttcgctt ctgttctctt agtttgtgcc gaatttagca ttttcgtagg 180catttcttag ggtcggaagg tagtgattgg agattctagt ttcggtaatg gcggatcttt 240aggttctact ctctgattgt ggtttttttc tgtatggttg tgttcgttgc gtgttggatc 300tgtgggaaat tttggatttt ttttgg 326
權利要求
1.一種薴麻微衛星標記，其特徵在於，所述微衛星標記的編號分別為BN19、BN20、BN21、BN22、BN23、BN24、BN25、BN26、BN27、BN28、BN29、BN30、BN31、BN32、BN33其核甘酸序列是BN19taaattgtga aggccatttt gggccttcac tttgttgaat gcccaaccca tttatgggcc 60taacagcaag aaagctgtga aggctatttt cgaccttgtt ctagcgcctc ataagtggct 120aacgcccatt tgtatcttgg ccaaatgtgt aagaaggcct tgaacctagt agtgggccac 180ttaattactc aaagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag 240agagagagag agagagagag agagagagag aggggttttc tgagatgggc tagctcaaag 300tcaggtgggc ctggcgttgg cccgaaatga ccaaactcga cccgacccgg aagtgaccaa 360cctcgggtca agaagtgaca cgtggacaga agtacctaac tgtcagcctc aggtaatttc 420atggaagtgg ataaagaaac agagagagag agagagcgcg agattttagc gccttttaac 480cagacacaac cgttccaagt tttgaaaagc gctataaggg tgaatctgct ccacgacaga 540ttcgatttca tcattacttt cgaacccaaa agacttcaat tgacgaaagc cttctttatc 600taattgataa acaatatttt tgacacccgc aaatccatat aagtgcaata cttcagattt 660tttcacgatc attt 674BN20taaggcttgt tggacctcca agtgagtccc taatacttat tataatatat tatatgttca 60aatactcagt tgggatcaaa acaactttgt tagagtcgct tcggagccaa aaaactattt 120tgaaggctat atttcgacaa aactagttat aacgatttac tttttgcgcg aaataaattt 180ttaagcttgg agtagtcaag agtggttgaa gctctaacca ctagagattt tgagaagcgc 240acagtatgag cgaaaatggg cttgtgggtt ttggtgtaga tggcaaagga aggtgaagaa 300caagcgtaga atgtcgaagc agagaacgcc atcgaagggg agagagagag agagagagag 360agagagagag agagagagag agagagagag aattctagaa aatctcttac ttgcttttta 420cttgtaatct ccagattagc aaagtcgaca cgtggcgcaa cggacatccc gagttgggat 480acccagtcac gtgcctcacg tgaagttggg acaaaatttt gtcccaacat ttacatttag 540cataagatag tgttactgtg atatcccgat t 571BN21caagtgaata tcaagcatat agcttcttct ttctctctct cgtttccctt tttcccttct 60tttcaggaca tttcagatac tttctggttt tatccaatgt tgcacaaaag aaaatatgat 120tcactaacat gtcaatacgg gaaagagaac tcaatcaaat caaatcaaat caaacgatat 180cacagacaac aatcacgtat catgaattac tggtcacaca tattcttgtg atagtcaaga 240ctagatcaag aaatcatgca ttttcctttt atacatagca gagaaaacct tagacttgta 300tatatgtctg tgtgtgtgtg tgtgtgtgag agagagagag agagagagag agagagagag 360agagagagag agagagagag 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ctcacatcgg aagaaaaagc 360agaaaaggtg aggctcagac ggagagtggg agtgggtatg gccatatctg ttttagtgtt 420ttcggattgg aagtggcatt cactgccact gctgactttg atacgcagag cacaacgcaa 480cacagaatga agttcgggcg gcgatggatg gcttggggtt tctcgagacg atgggcggtg 540gtcggagggg aaggtacgcc gcgattctca gcggcagagg cgacggcgtt cggcagtgat 600tttgggtggt tcaattttgg gtttctctcg gaaaaagatg gcggtgaccg actttgttgc 660cggcagttgg ataacaaaga tcgagagaga gagagagaga gagagagaga gagagtgagt 720acgctgttcc tggaagtagt agtttccttg gaggcgacag ccgaggcgat cgatggcttg 780gccggtctcg cggatccaga atccgacggt gtaggttgct ttgcccaaag tcccatctta 840gcgagctcgg agtcgtcgtc ttcagtgggg atttaggttt ctgagtcaaa cagaccaaga 900ttttgatttc gggagaagag aaatgatacc cgagaaagcg ggggattggg gtataaaacg 960acgactcacc ggtcgtggat gttttttttt gacaattacg tgattcccat tttaccaggg 1020gacgaattca tctatcctaa agattccgta ccgactcaat tcaacttg 1068BN32taatcgcctt actagttgct gtactgatat acttgggagc gaagaaaaga aaaatgatca 60agctcaagga gaaattcttt gtagaaaatg gaggattgat gttacaacaa caacttgcta 120gtagaagacc 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2.根據權利要求
1所述的薴麻微衛星標記，其特徵在於所述BN19、BN20、BN21、BN22-23-24、BN25、BN26、BN27、BN28、BN29、BN30、BN31、BN32、BN33十五個位點的引物序列為BN19-FGCT AAC GCC CAT TTG TAT CTT GBN19-RGGC CCA CCT GAC TTT GAG CBN20-FTGG CAA AGG AAG GTG AAG AAC AAGBN20-RTGA GGC ACG TGA CTG GGT ATC CBN21-FAGA TGC TTT TGG CTA TGCBN21-RTCA AAC GAT ATC ACA GAC AACBN22-FGCC CAG GAA GCC ATT GAA GCBN22-RGAC GAC GGC AAT GGC TCT CABN23-FTGC CGT CGT CTC TGC CAT TAT CGBN23-RGCC CCA CCC AGC CCT ATC TTC ABN24-FCTT CTT CGTCGG ATT CTT GTT CBN24-RGCT TTT CTC TTC TCC TTC TTG TTTBN25-FCTC TCT CAA CTC ATA CCA ATA ATBN25-RAGA GAA CAG CCA ACA TCA ABN26-FCGT GCC TAT GAC TTC GTT TCT CBN26-RTTT CCA ATA ATT CAG CCT TCA CTTBN27-FGGA CAT AAG AAC CCC CAA CAC TBN27-RGGC CAC CCT ATA AAT ATC CTT CACBN28-FTTC CGA TGA CAA ACC ACT GCTBN28-RACA CTC ACC AAC CCA TTA CAT CACBN29-FCTT GCC GCT TCT TCA GTA GGT CTGBN29-RGGC ATT TTC CAA GGG CAC AABN30-FAAT TAG CAG AGA AAA GGG CAG TTBN30-RAAA GCG TGC GTC AAC ATT CABN31-FAAG GTA CGC CGC GAT TCT CBN31-RTGG GCA AAG CAA CCT ACA CCBN32-FCGC CAC AAACAA TTA CCA CCA ABN32-RAAT AGG ACA ACC CCA TGA GAG CACBN33-FAAG GTA AAG TTT CTC TCT CTC TCBN33-RAGA ATC TCC AAT CAC TAC CTT
專利摘要
本發明涉及一種薴麻的DNA分子遺傳標記，提供了15個薴麻微衛星位點的DNA序列及擴增上述15個薴麻微衛星位點的引物序列和擴增方法，15個薴麻微衛星位點用於薴麻品種分類、遺傳關係分析和標記輔助育種，重複性好，是一種可靠有效的分子標記。
文檔編號C12P19/00GKCN1814787SQ200510032422
公開日2006年8月9日 申請日期2005年11月24日
發明者揭雨成, 蔣彥波, 周建林, 張健 申請人:中國農業科學院麻類研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan