調節性抗原傳遞系統(rads)的製作方法
2023-05-31 13:29:36 1
專利名稱：調節性抗原傳遞系統(rads)的製作方法
發明的背景
涉及政府資助款
本發明是在政府的支持下進行的、資助款號為DE06669、AI24533、AI38599和USDA 9902097。政府在本發明中有一定的權利。
發明背景(1)發明領域
本發明涉及製備疫苗和重組DNA表達產物地材料和方法，更具體而言，本發明涉及經遺傳工程減毒的致病微生物，這些微生物可用於表達抗原和在攜帶質粒的基因上編碼的其它重組產物。(2)相關領域的描述
所引用的參考文獻如下
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美國專利第5389368號；
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美國專利第5656488號；
美國專利第5672345號；
美國專利第5840483號；
美國專利第5855879號；
美國專利第5855880號；
美國專利第5888790號；
美國專利第6024961號。
相關領域
經遺傳工程改造的微生物具有廣泛的應用和重要性。這些微生物的一個重要的用途是作為產生免疫反應的活疫苗。當活疫苗產生高水平的抗原時，它們是最有效的。但是，高水平表達的重組抗原的合成可能對微生物是有害的。鑑於此，已鑑別調節性(與組成性相對立)表達系統，並將其用在感興趣的重組基因可操作性地連接於控制元件的情況中，該控制元件使得該重組基因僅在被誘導、去抑制或激活時大量表達。例子包括cspA基因啟動子、phoA基因啟動子、PBAD(在araC-PBAD系統中)、trp啟動子、tac啟動子、trc啟動子、λPL、P22PR、mal啟動子和lac啟動子。這些啟動子在低溫、低磷酸鹽水平，在阿拉伯糖的存在下、在低色氨酸水平的存在下和在乳糖(或其它lac誘導子)的存在下介導轉錄。
經遺傳工程改造的微生物的一個重要用途是作為誘導免疫的活疫苗。例如可參見美國專利6024961、4888170、5389368、5855879、5855880、5294441、5468485、5387744、5840483、5672345、5424065、5378744、5888790、5424065、5656488、5006335、5643771、5980907、5851519和5527529，本文將所有這些專利的內容納入作為參考。當將經遺傳工程改造的微生物用作脊椎動物的活疫苗時，必須考慮到某些因素。為了提供比非活疫苗更好的益處，活疫苗微生物必須粘附、侵入並在脊椎動物的淋巴組織中生存，並將脊柱動物中的這些免疫效應位點長時間地暴露給抗原。通過這種連續的刺激，與非活疫苗相比，脊椎動物的免疫系統對抗原的反應性更高。因此，優選的活疫苗是脊椎動物的減毒病原體，尤其是在腸相關的淋巴組織(GALT)或支氣管相關的淋巴組織(BALT)集結的病原體。這些減毒的病原體相比於非活疫苗的另一優點是，這些病原體具有精巧的機制來達到淋巴組織，從而可有效地暴露在脊椎動物的免疫系統中。相反，如果疫苗被動地暴露在免疫系統中，或者如果由宿主機制將疫苗攜帶到免疫系統中，則非活疫苗僅提供一種免疫刺激。
例如，如美國專利第5888799號中所述，可在致病菌中引入突變，從而使其減毒，以便注射動物宿主後不引起疾病症狀，但該細菌仍保留附著、侵入以及在該動物宿主的淋巴組織中集結足夠的時間，以誘導針對該減毒的細菌的免疫反應的能力。可對這些減毒的細菌疫苗株進行遺傳工程改造，以使其表達從異源的致病菌、病毒、真菌或寄生菌得到的存在於質粒載體上或插入染色體中的基因編碼的外來抗原。可以活疫苗的形式將這些重組的減毒細菌疫苗傳送到免疫個體的黏膜表面，以使該重組細菌在免疫的脊椎動物的這些淋巴組織中成為生產外來抗原並引起初級和/或保護性免疫反應的工廠，從而使免疫的動物宿主在受到其抗原由該重組的減毒細菌疫苗表達的病原體感染時能夠生存。
可通過引入允許諸如脂多糖之類的表面分子合成在革蘭氏陰性菌內的環境調節的突變對細菌減毒，如受galE突變體影響(美國專利第5006335號)。引入利用特殊的營養性需求〔如核酸的組成如嘌呤、細胞壁的組成如二氨基庚二酸(DAP)(美國專利第4888170號)〕或者利用由該突變產生的對芳族胺基酸和維生素的需求〔如由aro突變引起的需求(美國專利第5643771號)〕的突變也可對細菌減毒。通過使影響其它基因的總調節的基因突變也可實現其它方式的減毒。因此，在基因中具有腺苷酸環化酶cya和cAMP受體蛋白crp突變的突變體是減毒的且具有免疫原性(美國專利第5294441號、第5389368號、5468485號、5855879號和5855880號)。類似地，也已經使用phoPQ雙組分調節系統(美國專利第5424065號)中的突變和諸如ompR(美國專利第5527529號)、hemA(Benjamin等，1991，Microb.Pathog.，11289-295)和htrA(美國專利5980907號)之類的突變來提供減毒的但具有免疫原性的細菌。致病菌所有的減毒的突變體，其免疫原性不一定是在相同的程度上。因此，有可能引入使細菌減毒但削弱該減毒的細菌在淋巴組織中集結的能力，從而減少該細菌的免疫原性的突變，如rpoS。參見美國專利第6024961號。因此，一些減毒機制使疫苗過度減毒，使候選疫苗或者不能達到淋巴組織中，或者不能在淋巴組織中維持足夠的程度或持續時間，以誘導其抗原由該重組的減毒細菌疫苗表達的野生型病原體的保護性免疫反應。
由於誘導表達的外來抗原的免疫反應與重組的減毒細菌疫苗表達的抗原水平成比例(Doggett等，1993，Infect.Immun.，611859-1866；Schodel等，1994，Infect.Immun.，621669-1672；Srinivasan等，1995，Biol.Reprod.，53462-471)，所以將外來抗原的基因放在多拷貝的質粒載體上優於將外來抗原的基因插入減毒的細菌疫苗載體的染色體中。這是因為外來抗原表達的水平通常與減毒細菌宿主內表達的外來抗原的基因的拷貝數成比例。
由於含有質粒的重組減毒細菌疫苗產生大量的對該疫苗沒有益處的抗原，所以質粒載體常常在免疫後隨著時間而丟失(Curtiss等，1988，Vaccine，6155-160)。在許多例子中，從免疫的脊椎動物分離得到的重組減毒細菌疫苗，有10％或以下在3或4天後保留了質粒。當發生這種質粒丟失時，免疫反應更直接針對這種減毒的細菌宿主疫苗本身而不是針對表達的外來抗原。這個問題通過建立平衡致死宿主-載體系統而得以解決，如美國專利第5672345和5840483號中所述。在該系統中，在減毒細胞疫苗的染色體中引入突變，以阻止必需的細胞壁成分二氨基庚二酸(DAP)的合成，這種成分在環境中並不常見，並且在動物組織中完全是缺乏的。在不存在DAP的情況下，需要DAP的細菌由於DAP的量少而死亡、裂解。細菌還含有一種質粒載體，該載體含有一個在染色體中補充該突變的基因。因此，含有質粒的菌株能合成DAP，並在無外源DAP提供的情況中生存，這與免疫的脊椎動物中發生的情況一樣。然後會發生免疫的脊椎動物中內部淋巴器官的集結。一個這樣的系統使用β-天冬氨酸半醛脫氫酶基因(asd基因)的缺失突變，和除了引起外來抗原表達的元件外還含有野生型asd基因的質粒載體(Nakayama等，1988，Bio/Tech.，6693-697；Galan等，1990，Gene，9429-35)。除了編碼外來抗原的Asd+質粒載體外，這些Δasd細菌株還含有上述減毒性突變。當口服使用時，這些平衡致死宿主-載體疫苗以類似於減毒的細菌相同的方式有效地附著、侵入和集結在淋巴組織中，但不表達外來抗原。這種平衡致死宿主-載體系統的另一重要的益處是在質粒載體上缺乏抗生素抗性基因，因為活疫苗不允許含有這類基因。
如上所述，針對外來抗原的免疫應答的水平通常與重組的減毒細菌疫苗的表達水平成正比。遺憾的是，外來抗原的超表達常常是毒性的，這樣它減少了生長的速率，以及由此減少了減毒的細菌疫苗在淋巴組織中集結的能力。結果，其免疫原性被大大減少。因此，需要使疫苗在淋巴組織中的集結能力和生長能力之間有一種平衡，靠這種能力來生產外來抗原。
在使用重組減毒的細菌疫苗中的另一重要問題是在給予動物或人這些疫苗後，它們隨糞便排出並在環境中生存，以致潛在地導致不需要免疫的個體被免疫的可能性。這個問題對於農業疫苗來說尤為重要，因為這類疫苗是在飼料和/或飲用水中給予，或者通過噴射的方法給予，這樣可能會使疫苗在環境中持續存在，並使需要免疫的動物以外的其它動物暴露於該疫苗。因此，我們對重組減毒的細菌疫苗構建設計了環境限制性生存系統(ELVS)，如WO96/40947所述，本文將其納入作為參考。在該發明的一些實施例中，將疫苗株構建為在容許環境中表達必需的基因但不表達致死基因，但在進入非容許環境中，如在糞便排出後的環境溫度，這種株會停止表達必需的基因，而開始表達致死基因，導致該疫苗構建物死亡。在其它實施例中，涉及在允許環境中(如疫苗株在發酵罐中生長期間)必需基因表達和致死基因不表達的疫苗遏制的特徵，在該疫苗進入非容許環境(如免疫的動物宿主)後維持了一段時間。這種延遲發作的環境限制性生存系統使該疫苗能在必需基因不表達和致死基因表達產生的死亡發生之前附著、侵入和集結在淋巴組織中。雖然在WO96/40947中描述了必需基因和致死基因的許多例子，但是，其中一種優選調節的必需基因是編碼β-天冬氨酸半醛脫氫酶的asd基因，該酶是細菌細胞壁剛性層的必需成分且在環境中(尤其是在動物宿主中)得不到的DAP的生物合成所需的。該文中優選的致死基因是從那些在微生物的胞質中表達時導致該細菌裂解的細菌病毒得到的基因。在那些發明中獲得生物學遏制的一個方法，是使用逃逸型質粒載體作為平衡致死宿主-載體系統(以維持該質粒)和ELVS，以提供生物學遏制。如該文中所述，在容許環境(如發酵罐)中，細菌將維持非常低的質粒拷貝數，甚至不表達質粒編碼的外來抗原。但是，在進入非容許環境(如免疫的動物宿主)中後的一段時間，該系統使質粒拷貝數非常明顯地增加，致死基因的拷貝數增加，引起噬菌體誘導的裂解。由於對外來抗原特異的基因拷貝數增加的緣故，在細菌可能因裂解而死亡並釋放出外來抗原時，出現外來抗原的過量生產，從而增強了免疫反應的誘導。
基於上述討論，需要一種活疫苗，該疫苗能有效地在接種的動物中集結，並在淋巴組織中生長，而不引起疾病，該疫苗還具有在體內生產大量的抗原以誘導有效的免疫反應的能力。本發明基於逃逸型載體(RAV)的使用和功能，通過利用調節性傳送系統(RADS)滿足上述需求。發明概要
因此，簡言之，本發明者已成功地發現在細菌表達細胞中，優選是在致病微生物的減毒衍生物的活細菌疫苗中，可有利地使用含有新穎的逃逸型載體(RAV)和至少一種可激活的染色體衍生的阻遏物的新穎的調節性抗原傳送系統(RADS)，其中，染色體外的載體的拷貝數應隨激活性刺激的撤回引起的載體的去阻遏而大大地增加。RADS的可去阻遏的逃逸特徵是由染色體的可激活阻遏物結合RAV的元件衍生得到的。RAV的必需元件是(a)產生低拷貝數的複製的第一起點(ori)，其中第一起點較佳使用DNA聚合酶III產生載體複製；(b)第二起點，它可操作性地連接於被染色體編碼的阻遏物阻抑的第一啟動子，其中該第二起點較佳使用DNA聚合酶I產生載體複製；(c)外源基因，可操作性地連接於也優選被染色體編碼的阻遏物阻抑的第二啟動子。作為一種疫苗，RADS能使免疫的脊椎動物淋巴組織有效暴露於大劑量的載體編碼的外源基因產物中，這些產物是隨刺激的撤回而產生的。作為一種疫苗，它提供的另一個優點是RADS微生物在體外在低拷貝數控制下生長，然後在脊椎動物接種後轉變成逃逸型狀態，以在體內引起增加抗原產生的能力。在阻遏的逃逸型狀態下，RADS微生物被極大地削弱，這是由於非常高的質粒複製活性和非常高的外源基因產物產生的緣故。由於其處於削弱的狀態，阻遏的RADS微生物通常不能長時間地生存。因此，RADS以固有的遏制系統為特徵，當不暴露於阻遏物基因激活的刺激物時，即使在WO96/40917中所公開的環境限制性生存系統(ELVS)中，在可阻遏的質粒衍生的噬菌體裂解基因缺乏的情況下，該RADS微生物也不能生存。
該微生物在暴露於阻遏性環境刺激後，它向阻遏的逃逸型狀態轉變可被延遲。在這種「延遲型RADS」中，RAV上可抑制的啟動子繼續抑制逃逸型狀態和抗原的產生一段時間，即使在抑制性刺激不再繼續的情況下。可操作性連接於RADS染色體上的阻遏物並可用於延遲型RADS的可激活的啟動子的一個例子是araC-PBAD啟動子，該啟動子對阿拉伯糖響應。當這類啟動子在RADS中連接於阻遏物，這樣阿拉伯糖的存在抑制了逃逸型狀態時，RADS細菌向沒有阿拉伯糖的環境(如當在脊椎動物中接種時)的轉移並沒有抑制高拷貝數起點，直到仍存在於該細菌內的阿拉伯糖發生了擴散或者被該微生物代謝為止。通過使微生物產生消除其代謝該激活性刺激物的能力的突變可有利地增加這種延遲。這在說明性例子中可以實現，該例子使用在araCBAD操縱子中的突變來消除微生物代謝阿拉伯糖的能力。由於代謝激活子的能力被消除，所以這種增強的延遲系統中增加的延遲是因為對逃逸型狀態的抑制不再受到激活子的代謝影響。因此，抑制僅僅依賴於激活子(阿拉伯糖)擴散到微生物外。改變和/或延遲逃逸型複製和/或外源基因表達的其它方法也已公開。
延遲型RADS對活細菌疫苗特別有用，因為它使細菌在轉變成高拷貝數狀態並生產高水平抗原之前有時間在脊椎動物的淋巴組織中集結。因此，延遲型RADS在鼻內給予的疫苗中非常有效。當如上述通過阻止阻遏物代謝的突變增強延遲時，對於口服疫苗來說，這種延遲使該疫苗足以被消化，並在抑制的逃逸型狀態允許生產大量的抗原之前，使疫苗足以在腸相關的淋巴組織(GALT)中集結。因此，高水平抗原可直接被傳送給GALT，引起非常有效的免疫反應。
本發明的RADS可與用於削弱優選的致病活疫苗的毒性的已知突變一起使用。RADS也完全與質粒維持系統如美國專利第5672345號中公開的平衡致死系統匹配。
因此，在一個實施例中，本發明涉及含有調節性抗原傳送系統(RADS)的微生物。該RADS包含(a)一種載體，該載體含有(1)插入編碼所需的基因產物的基因的位點，(2)使用DNA聚合酶III產生載體複製的第一複製起點(ori)，和(3)使用DNA聚合酶I產生載體複製的第二起點。此外，該第二起點可操作性地連接於可被第一阻遏物抑制的第一控制序列，並且該逃逸型載體不含有噬菌體裂解基因。該RADS還含有編碼操作性連接於第一可激活控制序列的的第一阻遏物的基因。較佳的是，該載體還含有編碼插入(a)所述的位點的所需基因產物的基因，其中，編碼該所需基因產物的基因可操作性地連接於第二控制序列。所述第一控制序列和第二控制序列可以是相同的或不同的序列。優選的阻遏物是LacI阻遏物和C2阻遏物，第二控制序列可被第二阻遏物抑制。
較佳的是，上述微生物是致病菌的減毒衍生物。還有，載體較佳是質粒，所需的基因產物是抗原。最佳的是，微生物是沙門氏菌屬(Salmonella spp.)。優選的可激活的控制序列是araCPBAD。
上述微生物可包括一個平衡致死宿主-載體系統，該系統在染色體上缺乏功能性必需基因，在載體上缺乏該必需基因的重組功能性拷貝。該必需基因較佳是asd基因。在一個實施例中，該asd基因被操作性連接於araCPBAD的阻遏物基因的插入滅活。該微生物還可包含在天然基因中滅活的突變，該基因選自cya、crp、phoPQ、ompR、galE、cdt、hemA、aroA、aroC、aroD和hirA。
在上述微生物中，第一起點較佳是pSC起點，第二起點較佳是pUC起點；第一控制序列較佳是P22 PR，第一阻遏物較佳是C2阻遏物。此外，第二控制序列較佳是Ptrc，第二控制序列較佳被第二阻遏物抑制，該第二阻遏物較佳是LacI阻遏物。本發明較佳的逃逸型載體的一個例子是具有編碼抗原的基因的pMEG-771。該逃逸型載體以及其它說明性載體的改變也在本發明的範圍之內。用於本發明的抗原例子是Ery65和SeM。
在另一實施例中，微生物中的所需基因可操作性連接於真核生物控制序列。在這些實施例中，微生物較佳還含有ΔendA突變。
本發明的微生物還可具有延遲型RADS特徵。延遲型RADS特徵較佳是由以下的改變而產生(a)延遲由代謝或洩漏而產生的激活子分子丟失的突變；(b)增加阻遏物濃度的突變或插入；(c)包含具有一種以上阻遏物的結合位點的載體控制序列和/或編碼作用於載體控制序列的阻遏物分子的載體序列。
本發明還涉及生產所需基因產物的方法。該方法包括以下順序的步驟(a)將編碼所需基因產物的基因工程改造到上述任何一種微生物的載體中，其中該微生物含有在第一環境條件下抑制第二起點表達的控制序列，但第二起點的表達在第二環境條件下被去抑制；(b)在第一環境條件下培育上述微生物；(c)在第二環境下培育該微生物足夠長的時間，以產生所需的基因產物。優選的第一環境條件包括阿拉伯糖的存在，優選的第二環境條件包括阿拉伯糖的缺乏。在體外培養條件下可獲得該第一環境條件，在脊椎動物中可獲得該第二環境條件。用於本方法的微生物還可在araCBAD操縱子和/或araE基因中含有滅活性缺失。
本發明還涉及用於免疫脊椎動物的疫苗，其中，該疫苗含有上述任何一種微生物，並存在於藥學上可接受的載體中。
在另一實施例中，本發明還涉及誘導脊椎動物中誘導免疫保護的方法。該方法包括對該脊椎動物給予上述疫苗。
本發明還涉及一種向脊椎動物傳送所需的基因產物的方法。該方法包括對該脊椎動物給予任一種上述微生物。
因此，應注意的是，本發明可獲得的幾個優點有，本發明提供用於生產所需的基因產物的載體和微生物，如在活細菌疫苗中一樣，其逃逸條件受到去抑制組成型載體複製和基因產物生產的環境條件影響；本發明提供含有上述微生物的疫苗，以用於較好地刺激針對抗原基因產物的免疫保護；本發明提供一種使用上述疫苗誘導針對抗原基因產物的免疫保護的方法；本發明提供一種將所需基因產物傳送給脊椎動物的方法。附圖的簡要描述及圖注
圖1描述RAV pMEG-546和pMEG-771以及維持它們所需的必需染色體缺失/插入。
圖2描述維持作為調節性抗原傳送系統(RADS)的成分的RAV所需的各種缺失和缺失/插入突變，以及適合於使疫苗株減毒以使它們無毒但維持免疫原性的缺失突變。
圖3描述可活動的自殺性載體pMEG-375。
圖4描述自殺性載體pMEG-611，它用於傳送ΔasdA 19∷TTaraCPBADc2TT。
圖5描述用於傳送ΔilvG3∷TTaraCPBADlacITT的自殺性載體pMEG-249。
圖6描述用於傳送ΔaraBAD1923的自殺性載體pYA3484。
圖7描述用於傳送ΔaraE25的自殺性載體pYA3485。
圖8描述用於傳送ΔphoP1918的自殺性載體pMEG-550。
圖9描述用於傳送ΔphoP24的自殺性載體pMEG-368。
圖10描述從pMEG-283產生RAV pMEG-546，和從pMEG-645和pMEG-104產生pMEG-771。
圖11描述將pMEG-771修改成在P22 PR之後但在pUC RNAII之前包括lacRB(結合LacI阻遏物)位點，以產生pYA3535。
圖12描述在asd位置上用TTaraCPBADc2GTGasd衍生得到的RAV pMEG-771。
圖13描述對Ery65抗原特異的RAV pMEG-525。
圖14顯示證明編碼Ery65的RAV的拷貝數增加的試驗結果。所顯示的質粒DNA是在稀釋1-1000倍的含有或不含有阿拉伯糖的Luria肉湯培養基中生長的鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)MGN-966(pMEG-283)載體和MGN-966(pMEG-525)+Ery65或者豬霍亂沙門氏菌(S.choleraesuis)MGN-2267(pMEG-546)載體和MGN-2267(pMEG-525)+Ery65。
圖15顯示與圖14相同試驗的結果，但是，此結果證明Ery65蛋白的增加依賴鼠傷寒沙門氏菌MGN-966(pMEG-525)和豬霍亂沙門氏菌MGN-2267(pMEG-525)在稀釋到1-1000倍的含有或不含有阿拉伯糖的Luria肉湯培養基中的生長。
圖16顯示表達Ery65的鼠傷寒沙門氏菌株MGN-966(pMEG-525)的生長和MGN966(pMEG-283)載體在稀釋到1-1000倍的含有或不含有阿拉伯糖的Luria肉湯培養基中的對照生長。
圖17描述從免疫了載體對照MGN-966(pMEG-283)和表達Ery65抗原的MGN-966(pMEG-525)的小鼠中獲得的血清的western印跡分析。
圖18描述了對馬鏈球菌(Streptococcus equi)M蛋白(SeM)特異的RAV pMEG-573。
圖19是含有具有在各種啟動子的控制下抗原表達的不同Asd+載體的鼠傷寒沙門氏菌株MGN-4598(pMEG-825)P22PRSeM、MGN-4598(pMEG-826)P22PtrcSeM、MGN-2238(pMEG-575)λPLSeM的SeM表達與RADS、MGN-4598(pMEG-573)+SeM的表達的比較。其結果由在稀釋1-1000倍的存在或不存在阿拉伯糖的Lennox肉湯培養基中生長6小時時的菌株的總蛋白質的PAGE進行考馬斯染色或Western印跡所顯示。
圖20描述具有araCPBADGTGasd的Asd+載體pYA3530。
圖21描述具有araCPBADc2GTGasd的Asd+載體pYA3531。
圖22描述基於RAV的DNA轉移載體。
圖23描述用於傳送ΔendA3的自殺性載體pMEG-776。發明的詳細描述A.定義
表示微生物的「重組宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」以及其它這樣的術語在文中交換使用，指可被或者已經用作重組載體或其它轉移的DNA的受體的細胞，包括轉染的原始細胞的子代。應理解，由於偶然的或故意的突變的緣故，單親本細胞的後代在基因組或總DNA補足物上並不一定與原始的親本完全相同。
「子代種群」指從單一的重組細菌細胞中繁殖得到的培養物中活細菌細胞的種群。除非另有說明，否則當種群中大多數缺少天然必需的基因但由重組基因補充該天然基因的細胞能在特殊的環境〔如缺乏二氨基庚二酸(DAP)〕中生存，並繼續在該染色體外載體上維持和/或表達所需的基因時，染色體外載體上的重組基因在子代種群中是「穩定地維持的」。較佳的是，種群中至少有90％的細胞在穩定地維持的環境中生存，更佳的是至少有99％的細胞生存。
「控制序列」指影響它們可操作性連接的編碼序列的表達所需的DNA序列。因此，控制序列提供阻遏物、激活子、增強子、RNA聚合酶和其它轉錄因子的作用位點。這類控制序列的非限制性例子是啟動子和核糖體結合位點。
使基因產物在細菌中表達的控制序列與真核生物中基因表達所需的控制序列明顯不同，以至於原核生物控制序列通常不在真核細胞中起作用，反之亦然。術語「控制序列」可包括原核生物和真核生物的控制序列。
「調節子基因」是編碼控制另一基因的合成速率的蛋白質的基因。調節子基因的一個例子是編碼阻遏物的基因。
「阻遏物」在本文中是指由調節子基因合成，並結合於操縱子位點，阻斷該操縱子的轉錄的蛋白質。
「誘導子」在本文中指將可激活的控制序列誘導成活性的小有機分子。
「可操作性連接」指一種並列方式，這種並列使所述成分處於一種使它們能以它們預期的方式起作用的關係之中。控制序列「可操作性地連接」於編碼序列在細胞中以該控制序列的存在可影響該編碼序列的表達的方式存在。
「革蘭氏陰性菌」包括球菌、非腸桿菌、腸桿菌和螺菌。革蘭氏陰性菌屬的非限制性例子包括奈瑟氏菌屬(Nersseria)、螺菌(Spirillum)、巴氏菌屬(Pasteurella)、布魯氏菌屬(Brucella)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、弗朗西絲氏菌屬(Francisella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、博德特氏菌屬(Bordetalla)、大腸桿菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、弧菌屬(Vibrio)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、歐文氏菌屬(Erwinia)、擬桿菌屬(Bacteroides)、醋桿菌屬(Acetobacter)、氣桿菌屬(Aerobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、固氮菌屬(Azotobacter)、螺菌(Spirilla)、沙雷氏菌屬(Serratia)、弧菌屬(Vibrio)、粘球菌屬(Myxococcus)、根瘤菌屬(Rhizobium)、衣原體屬(Chlamydia)、立克次氏體屬(Richettsia)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、疏螺旋體屬(Borrelia)和密螺旋體屬(Trepanema)。
革蘭氏陽性菌包括球菌、非芽孢桿菌屬和芽孢桿菌屬。革蘭氏陽性菌屬的非限制性例子包括放線菌屬(Actinomyces)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、利斯特氏菌屬(Listeria)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)和鏈黴菌屬(Streptomyces)。
「分枝桿菌屬」是在它們的與眾不同的染色特性基礎上定義的，即它們能在長鏈(大約60個碳原子)黴菌酸的存在下抵抗酸化的有機溶劑的脫色作用。
「突變」指多核苷酸序列的改變，其特徵在於有一個或多個核苷酸鹼基發生改變，或者有一個或多個核苷酸插入序列中，或者有一個或多個核苷酸被從序列中缺失，或者這些情況的組合。
「基因」是遺傳的生物學單元。通常，基因是編碼RNA分子或多肽的多核苷酸序列，或者是該序列的突變。基因可以是天然產生的能表達為活性的或無活性的多肽的序列。基因還可包含突變，例如點突變、插入或者缺失，這樣它不能被表達，或者它表達一種改變的或截短的多肽或RNA分子。基因可以由重組DNA方法產生。或者，可採用已知的合成方法合成基因。
大多數的(91％)結構基因使用甲硫氨酸的密碼子ATG作為第一密碼子。但是，它們當中有很少一部分(8％)使用GTG作為起始密碼子，甚至更少一部分(1％)使用TTG作為起始密碼子，但未曾使用CTG作為起始密碼子。當轉錄信使RNA時，轉錄在+1核苷酸位點上開始，在轉錄終止子後終止。
「天然基因」是出現在野生型生物的染色體上的基因，例如，編碼野生型大腸桿菌或沙門氏菌中的β-天冬氨酸半醛脫氫酶(Asd)的基因。
「重組基因」在本文中定義為存在於較大的核苷酸序列中，在自然中未發現它的形式，它也不在該較大的序列中的可鑑別的核苷酸序列。重組基因可以是如插入染色體中的非天然位置上的野生型基因，或者天然位置中野生型基因的突變體形式，或者是與其它非天然序列一起插入其天然位置中的野生型基因，以至於在質粒和染色體之間發生低頻率的同源重組。重組基因還可包括具有控制區域的編碼區域，有了這個控制區域，該編碼區域不會天然產生。在本文中，重組基因是具體的遺傳工程操作的產物。
在本文中使用的突變株的基因符號是Berlyn所述的(Neidhardt等，1996，第109章)和Sanderson等(Neidhardt等，1996，第110章)。轉座子使用的符號，尤其是Tn10，採用的是Altman等(Neidhardt等，1996，第141章)中使用的符號。
「複製子」是自主複製DNA。自主複製由複製起點引起。例子包括質粒載體和細菌染色體。
「逃逸型載體」(「RAV」)是染色體外複製核酸，如含有兩個複製起點的質粒。一個複製起點使用DNA聚合酶III產生低的拷貝數，較佳是產生載體複製；另一複製起點較佳使用DNA聚合酶I產生載體複製，該載體可在微生物中以低拷貝數或高拷貝數進行複製，依賴於控制拷貝數的控制序列的狀態。
用本發明的疫苗處理的「個體」在本文中包括所有的脊椎動物，例如哺乳動物，包括家畜和人；各種類的鳥，包括家養的鳥類，尤其是那些具有農業重要性的鳥類。此外，軟體動物和其它某些無脊椎動物具有簡單的免疫系統，也包括在「個體」的定義之中。
「轉化」或「轉染」在本文中指外源多核苷酸插入宿主細胞中，這與插入方法無關，如直接攝取(自然地或通過電穿孔法)、轉導或結合。外源多核苷酸可以作為質粒維持，或者可在宿主基因組內整合。
「疫苗」指一種設計用來刺激活生物體的免疫系統，以提供針對未來的傷害的保護作用的製劑。特殊的疫苗在任何特殊的動物中可能是有效的，也可能無效。免疫指使生物體對疾病產生免疫的過程。
「免疫系統」在本文中指解剖學特徵和多細胞動物與抗原反應的機制。人們已經知道，脊椎動物體液免疫系統引起與抗原特異性結合的抗體的產生。由此產生的抗體可能屬於免疫學類別中的任一類，如免疫球蛋白A、D、E、G或M。特別感興趣的是刺激免疫球蛋白A(IgA)產生的疫苗，因為這是溫血動物的分泌系統產生的主要的免疫球蛋白。但是，本發明的疫苗並不限於刺激IgA產生的那些疫苗。例如，下文描述的天然疫苗有可能產生除了IgA形成以外的一系列其它免疫反應，例如，細胞免疫。已很好研究了針對抗原的免疫應答，並進行了廣泛的報導。Roitt、Brostoff和Male《免疫學》〔Immunology，第四版，C.V.Mosby InternationalLtd.，London(1998))作出了免疫學綜述。除非另有說明，否則疫苗是表達或傳送抗原或編碼抗原的遺傳物質到需要的免疫系統中的活細菌。
「免疫原性」在本文中指能引起免疫應答。
脊椎動物是脊索動物門的主要分類之一脊椎動物亞門的任何成員，包括魚類、兩棲動物類、爬行動物類、鳥類和哺乳動物類，所有這些動物的特徵表現為分段的多骨或軟骨質的脊椎柱。所有的脊椎動物種類都具有功能性的免疫系統，並對抗原產生細胞和/或體液免疫應答。因此，所有的脊椎動物都能對疫苗反應。雖然最常見的是將疫苗給予哺乳動物，如人或狗(狂犬病疫苗)，但是，商業上產生的其它種類的脊椎動物的疫苗，如魚類和鳥類也在本發明的範圍之內。
「病原體」在本文中是能引起疾病或削弱正常生理功能的的微生物，或者是引起疾病的微生物的減毒衍生物。
「減毒的」指具有減少病原體在個體中引起疾病症狀和疾病的能力，但不消除該減毒的細菌附著、侵入和維持在個體內的適當的淋巴組織中的潛力的突變的病原體。減毒的微生物用於如將生物體暴露於特殊的基因產物(如抗原或治療性蛋白質)較長的一段時間。「減毒的」不是指該屬或種的微生物從未起病原體的作用，而是指所使用的具體微生物對於被測試的具體的動物是減毒的。本發明的減毒的宿主細胞可能屬於通常致病的屬或種。減毒株不能誘導通常與其致病的對應物相關的疾病的一系列的症狀。有時使用「無毒力的」來替換「減毒的」。
在本發明中，感興趣的淋巴組織包括腸相關的淋巴組織(GALT)、支氣管相關的淋巴組織(BALT)、鼻相關的淋巴組織(basal-associated lymphoid tissue，NALT)、黏膜相關的淋巴組織(MALT)和結締組織相關的淋巴組織。
「微生物」在本文中包括細菌、病毒、原生動物和單細胞真菌。
「DNA疫苗載體」在本文中指在細菌細胞中繁殖的質粒DNA分子，該分子具有編碼所需基因產物的基因序列，此序列可操作性地連接於真核生物控制序列，這樣所需的基因產物僅在該DNA疫苗載體通過接種(免疫作用)以內化方式引入真核生物細胞後表達。可採用注射、噴槍對要免疫的個體給予DNA疫苗載體，或較佳使用減毒細菌將入口處的DNA免疫載體釋放入免疫的個體的縮主細胞中。例如可參見Hermann等，1991，《用於黏膜免疫的DNA疫苗》(DNA Vaccines forMucosal Immunity)，第809-816頁，第二版的《黏膜免疫》(MUCOSALIMMUNITY)，Ogra、Mestecky、Lamm、Strober、Bienenstock和McGhee編輯，Academic出版社，San Diego，1628頁；Ulmer等(1996)。B.總述
除非另有指明，本發明的實踐使用細胞培養、分子生物學、微生物學、重組DNA操作、免疫學和動物科學的常規技術，這些技術都在本領域熟練的技術人員所掌握的範圍之內。這些技術在文獻中有充分的解釋。例如可參見《DNA克隆》(DNA CLONING)，第I和第II卷(D.N.Glover編輯，1985)；《寡核苷酸合成》(OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS)(M.J.Gait編輯，1984)；《核酸雜交》(NUCLEICACID HYBRIDIZATION)(B.D.Hames和S.J.Higgins編輯，1984)；B.Perbal，《分子克隆實踐指南》(A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING)(1984)；叢書，《酶學方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)(Academic Press，Inc.)；《載體分子克隆載體及其用途的研究》(VECTORSA SURVEY OF MOLECULARCLONING VECTORS AND THEIR USES)(R.L.Rodriguez和D.T.Denhardt編輯，1987，Butterworths)；Sambrooks等(1989)，《分子克隆——實驗室手冊》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory出版社；Sambrook等(1989)，《分子克隆——實驗室手冊》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory出版社；以及Ausubel等(1995)，《精編分子生物學實驗指南》(SHORT PROTOCOLS IN MOLECULARDIOLOGY)，John Wiley和Sons。
本發明是以下述發現為基礎通過利用可被誘導以增加載體拷貝數的載體控制元件，可方便地增加攜帶載體的重組所需的基因產物在微生物中的生產。
本發明涉及調節性抗原傳送系統(RADS)，該系統利用含有染色體外載體(稱為逃逸型載體，RAV)和編碼其合成是在可激活的控制序列的控制之下進行的至少一種阻遏物的基因的微生物。RAV的必需元件是(a)編碼可操作性連接於控制序列的所需基因產物的基因，(b)使用DNA聚合酶I產生載體複製的第一複製起點(「ori」)，(c)利用DNA聚合酶III產生載體複製的第二起點。該第二起點可操作性連接於被阻遏物抑制的第一控制序列。
在RADS中，微生物被維持在第一控制序列被抑制的條件下。由於第一控制序列控制第二起點的利用，所以在這些維持條件下的複製被第一起點控制。
但是，在阻遏物沒有對第二起點產生影響的條件下，第二起點可發生去抑制作用，載體複製的控制轉移到第二起點。然後，該第二起點產生未控制的載體複製，從而產生非常大量的載體和在該載體上編碼的所需基因產物。
如下文所進行的進一步討論，RADS微生物的優選用途是作為活細菌疫苗。在這些實施例中，所需的基因產物是抗原。
在RADS中，通過控制載體拷貝數至少可部分控制所需基因產物的表達水平。通過使用RAV上一種以上複製起點控制拷貝數。
眾所周知，起點是染色體外載體的染色體上的區域，在該區域啟動DNA複製。關於細菌中質粒複製的綜述，可參見Helinski等，第2295-2324頁，《大腸桿菌和沙門氏菌，細胞和分子生物學》(Escherichia coli and Salmonella，Cellular andMolecular Biology)，第二版，Neidhardt等編輯，1996。在ColE1型質粒中，複製由長700個鹼基的前引物RNA(稱為RNA II)的合成啟動。RNA II的轉錄在該起點上遊的555個鹼基處開始。轉錄後，RNA II的3′端在該起點與質粒形成雜交體。這種RNA-DNA雜交體的斷裂發生在複製起點處，斷裂使用作宿主DNA聚合酶I催化的DNA合成的引物的3′-羥基暴露。ColE1型的複製子並不限定必需的複製蛋白質，但是，它們確實需要DNA聚合酶I。ColE1型質粒中的複製控制通常通過不穩定的RNAI轉錄子的結合來調節，該轉錄子與RNAII前引物轉錄子互補。RNAI的轉錄是趨異轉錄，但在RNAII編碼區域內。在質粒上的其它地方由rop編碼的蛋白質提供額外的調節水平，該蛋白質與RNAI和RNAII轉錄子相互作用，以阻止DNA複製。通過用強的調節啟動子替換RNAII的天然啟動子，已獲得所述的RAV，該RAV能產生過量的RNAII轉錄子，從而在不存在新的啟動子的阻遏物時，ColE1型複製子的複製不受控制。
用於本發明的起點的選擇並沒有狹隘的限制，條件是第一起點通過DNA聚合酶III(如大腸桿菌中dnaE基因的產物)產生複製，第二起點通過DNA聚合酶I(如大腸桿菌中polA基因的產物)產生複製。較佳的是，第一起點產生低拷貝數的載體，以使該載體的複製產生的任何不利減少到最小程度。優選的第一起點是pSC起點，已知此起點在大腸桿菌或沙門氏菌中每個染色體DNA等效物產生約6-8個載體拷貝。優選的第二起點是pUC起點。
第二起點可操作性連接於被阻遏物抑制的啟動子。用於此目的的優選啟動子是被LacI阻遏物抑制的Plac或Ptrc和被C22阻遏物抑制的P22 PR。
LacI阻遏物和C22阻遏物是優選的阻遏物。較佳的是，這些阻遏物在微生物的染色體上編碼。阻遏物基因可操作性連接於可激活的控制序列，這使得該阻遏物僅在控制序列的誘導子存在時才會合成。如下文更充分的討論，優選的可激活的控制序列是araCPBAD，它被阿拉伯糖激活。因此，在使用araCPBAD控制阻遏物合成的RADS微生物中，阿拉伯糖的存在激活了阻遏物的表達，該阻遏物阻止第二起點的利用。然後在第一起點的控制下進行載體複製。但是，當阿拉伯糖不存在時，不再產生阻遏物，第一控制序列被去抑制，使得載體的複製失控。阿拉伯糖的調節也是有用的，因為游離的阿拉伯糖通常在自然中是得不到的。例如，阿拉伯糖在鳥類和脊椎動物組織中是缺乏的。
阿拉伯糖的調節對於延遲型RADS特別有用。如下文更充分的討論，在延遲型RADS中，高拷貝數起點的誘導在啟動後被延遲。這種系統對活的細菌疫苗是有用的，這種疫苗通常在逃逸型質粒複製未啟動的條件下在培養物中生長(如與阿拉伯糖一起)。然後可將細菌接種入脊椎動物中。在這樣一個系統中，接種的細菌在生產大量抗原的逃逸型質粒複製啟動之前集結在淋巴組織中。由高拷貝數起點延遲逃逸型載體複製的啟動，可避免由產生高抗原水平和高載體水平引起的對細菌集結能力的幹擾。araC-PBAD控制阻遏物的合成，以允許第二起點在不存在阿拉伯糖時啟動逃逸型複製的延遲型系統是有效的，因為一旦不再提供阿拉伯糖，需要時間來使阿拉伯糖的濃度下降到足以使AraC蛋白開始作為阻遏物的濃度。但是，這種延遲不會很長，因為araCBAD操縱子有效地代謝阿拉伯糖，從而快速地(在約15分鐘內)將阿拉伯糖的水平減少到不發生阻遏物合成的點。儘管如此，這種短的延遲系統允許足夠延遲逃逸型複製的啟動，以提供一個優點，如與鼻內接種的例子相同，在疫苗被快速傳送給淋巴組織的活細菌疫苗中。但是，在口腔接種中，逃逸型複製可能會在疫苗到達GALT之前就已經開始。在這種情況下，逃逸型載體產生的許多抗原並沒有暴露於淋巴組織，從而浪費了。因此，對於需要較長延遲的情況，如口腔給予活細菌疫苗，可利用增強延遲的RADS。在該系統中，通過利用在控制使誘導子降解的酶的生產的操縱子中具有滅活的突變的微生物來延長暫時的存活時間。當阿拉伯糖是誘導子時，通過使araCBAD操縱子中滅活的缺失突變，可消除其代謝。這種缺失阻止阿拉伯糖的代謝，導致阿拉伯糖暴露後阿拉伯糖在細胞內的較高水平減少。這導致阿拉伯糖水平下降到足以使AraC蛋白開始作為阻遏物的水平之前有較長的延遲。這種增強的延遲足以使口腔給予的含有增強的延遲型RADS系統的疫苗在逃逸型載體複製啟動之前在GALT中集結。
RAV的一個例子是質粒載體pMEG-771(圖1)。pMEG-771必須維持在具有兩種阻遏蛋白的基因的細菌株中，這兩種蛋白是lac操縱子的P22 C2阻遏物和LacI阻遏物，它們的合成由araCPBAD控制序列調節，這樣c2和lacI基因的轉錄依賴於生長培養基中阿拉伯糖的存在。在阿拉伯糖的存在時，araC基因產物是引起從連接於它的任何結構基因的PBAD開始進行轉錄的轉錄激活子。在不存在阿拉伯糖時，araC基因產物作為PBAD的阻遏物，以阻止與PBAD啟動子融合的結構基因的轉錄。在包含pMEG-771的細菌株的染色體內，是缺失/插入突變ΔasdA19∷TTaraCPBADc2TT和ΔilvG3∷TTaraCPBADlacITT。當該菌株在阿拉伯糖存在的情況下生長時，c2阻遏物基因被表達，C2阻遏物與P22 PR結合，以阻止與PR融合的pUC RNAII基因的轉錄。該RNAII基因指定起始RNA在DNA聚合酶I(由染色體polA基因編碼)的存在下，在pUC起點上啟動複製。該質粒利用pSC101複製子的控制繼續複製，這樣每個染色體DNA等效物有約6個質粒拷貝。當該菌株在阿拉伯糖存在的條件下生長時，它還可以生產大量的LacI阻遏蛋白。在這種狀況下，lacI基因產物與PTRC結合，並抑制由此啟動子啟動的轉錄，這樣插入NcoI到HindIII之間的多克隆位點中的任何外源基因序列都不能合成。在這個例子中，菌株在培養條件下(如在發酵罐中)過度生長，由於低質粒拷貝數和不能表達大量的外源蛋白的緣故，對維持pMWG-771質粒載體的能量需求減少到最小程度。但是，當疫苗株給予經免疫的動物宿主時，沒有外源的阿拉伯糖，並且由於分解代謝或者可能洩漏到細胞外的原因，細菌疫苗細胞內的阿拉伯糖消失了。在這些情況下，C2和LacI阻遏蛋白的合成停止，細胞內這些阻遏物的密度下降，使得不僅需要pUC RNA II序列的轉錄來啟動從pUC起點開始的、以完全未調節的方式進行的質粒複製，而且還需要啟動外來抗原的基因的轉錄。由於質粒拷貝數隨從PTRC開始的外源基因轉錄的增加而增加的緣故，從而大大地增加了所需基因產物生產的總水平。
先前在WO96/40947中描述了RADS的一些元件。具體可參見該出版物的圖8。但是，在該系統中，RAV主要用於阻止細菌疫苗在非容許環境(如30℃以下)中維持生存力，因為在從體溫的到環境溫度後，攜帶載體的基因產物cI857起作用，這樣c2阻遏物基因表達停止，導致裂解基因的去抑制。
pMEG-771中舉例說明的RAV利用各種調節元件，這些調節元件單獨工作，或者與其它調節元件一起工作，以獲得所需的結果。RADS中使用的調節元件並沒有嚴格的限制在pMEG-771及其相關的宿主(araCPBAD、PR、PTRC、lacI阻遏物、C2阻遏物)中使用的那些元件；這些元件可以替換其它具有類似功能的元件，如下文所述以及本領域已知的。
通常，本發明RADS中的基因可採用下述方法進行調節1)將編碼序列連接到在容許或非容許條件下促進或阻止轉錄的控制序列；2)調節反過來促進或阻止RAV和/或宿主染色體的基因轉錄的反調節元件的表達；3)適應或改變對RAV和/或宿主染色體的基因起作用的反調節元件，在高拷貝數或低拷貝數條件下將其激活或滅活；或者採用這些方案的組合。本發明的RAV需要各種啟動子來協調該系統不同元件的表達。一些元件，如溫度敏感的阻遏物或環境特異性調節元件，使用可誘導的、可去抑制的或可激活的啟動子。用作RAV中的調節元件的優選啟動子是cspA基因啟動子、phoA基因啟動子、PBAD(在araC-PBAD系統中)、trp啟動子、tac啟動子、trc啟動子、λPL、P22 PR、mal啟動子和lac啟動子。這些啟動子分別在低溫、低磷酸鹽水平、存在阿拉伯糖、存在低水平色氨酸以及存在乳糖(或其它lac誘導子)的情況下介導轉錄。這些啟動子的每一種以及它們的調節系統都是周知的。
反調節元件.在本文中，「反調節元件」指調節基因表達的分子或複合物。例子包括在控制序列中與操縱子結合的阻遏物、啟動轉錄的激活子以及結合併阻止mRNA翻譯的反義RNA。對於本發明的RADS中的用途，調節啟動子的表達被啟動子調節蛋白調節。這些啟動子調節蛋白可起到激活或抑制由該啟動子起始的轉錄的作用。優選的反調節元件是介導cspA基因啟動子、phoA基因啟動子、PBAD(在araC-PBAD系統中)、trp啟動子、tac啟動子、trc啟動子、mal啟動子和lac啟動子的調節的蛋白質。
另一類型的反調節元件是RNA聚合酶。通過將RADS的基因連接於僅被特殊的RNA聚合酶識別的啟動子可調節這些基因。通過調節該特殊的RNA聚合酶也可調節該基因的表達。例如，T7 RNA聚合酶需要特殊的啟動子序列，該序列不被細菌的RNA聚合酶識別。T7 RNA聚合酶基因可放在宿主細胞中，並被調節成僅在容許的或非容許的環境中表達。T7 RNA聚合酶的表達將反過來表達連接於T7 RNA聚合酶啟動子的任何基因。如何使用T7 RNA聚合酶調節感興趣的基因的表達的描述，包括用於這種調節的核酸序列的描述出現在Studier等，MethodsEnzymol.，18560-89(1990)中。
另一類反調節元件是反義RNA。反義RNA與要調節的基因的核酸序列(稱為靶序列)互補。反義RNA和靶序列之間的雜交阻止該基因的表達。通常使用與基因的m RNA互補的反義RNA，其主要的效果是阻止該mRNA的翻譯。通過控制該反義RNA的表達可調節RADS的基因表達。反義RNA的表達反過來阻止感興趣的基因表達。如何使用反義RNA調節感興趣的基因表達的描述出現在美國專利第5190931中。
其它類型的反調節元件是團體(quorum)傳感裝置的元件。當細胞種群達到高密度時，一些細胞使用團體傳感來誘導基因的表達。團體傳感系統由可擴散的化合物激活，該化合物與調節蛋白相互作用，以誘導特殊的基因表達〔Fuqua等，J.Bacteriol.，176269-275(1994)〕。現在有可擴散的化合物(稱之為自身誘導子)直接與轉錄激活子相互作用的證據。這種相互作用使得該激活子與DNA結合，並激活轉錄。各團體傳感轉錄激活子通常僅被特殊的自身誘導子激活，雖然該激活子可誘導一種以上基因。還已顯示，團體傳感調節僅需要轉錄激活子和含有該激活子的功能性結合位點的基因〔Gray等，J.Bacteriol.，1763076-3080(1994)〕。這表明團體傳感調節可適用於本發明RADS中的基因調節。例如，編碼團體傳感轉錄激活子的基因可在RADS宿主中表達，RADS的其它基因可處於被該團體傳感轉錄激活子控制的啟動子的控制之下。這將或導致該RADS基因在同源的自身誘導子存在時表達，而該自身誘導子不存在時不表達。在這種控制下的基因在本文中稱為處於團體控制之下。在RADS宿主產生自身誘導子的情況中，被團體控制的基因將在細胞密度高時表達，並且將在細胞密度低時不表達。RADS中的任何基因可處於團體的控制之下，包括必需的基因、致死基因、複製基因和調節基因，這些在WO96/40947中描述。對於RADS的操作，可通過如內源基因(即，對自身誘導子的合成負責的基因)的作用，由該RADS宿主提供自身誘導子，或者在培養基中提供誘導子，或者兩者。在後一種情況中，培養基中提供的自身誘導子模擬高細胞密度的容許條件。或者，可以RADS的元件形式引入生產或合成該自身誘導子的基因。這種自身誘導子基因被認為是用於本文的調節基因。
團體傳感轉錄激活子基因以及生產它們的同源自身誘導子的基因的例子是luxR和luxI(Gray等，J.Bacteriol；1763076-3080(1994)，；lasR和lasI(Gambello和Iglewski，J.Bacteriol.，1733000-3009(1991)〕、traR和traI〔Piper等，Nature，362448-450(1993))、rhlI和rhlR(Latifi等，Mol Microbiol，17(2)333-343(1995)〕和expR和expI(Pirhonen等，EMBO J，122467-2476(1993)〕。這些配對的自誘導子包括N-(3-氧基己醯基)高絲氨酸內酯(VAI；針對LuxR)、N-(3-氧基十二烷醯基)高絲氨酸內酯(PAI，針對LasR)和N-(3-氧基-辛醯基)高絲氨酸內酯(AAI；針對TraR)。由團體傳感轉錄激活子誘導的一些啟動子是luxI啟動子、lasB啟動子、traA啟動子和traI啟動子。
可採用團體控制以多種方式來影響調節的抗原傳送，例如，通過獲得所需的基因產物如抗原的生產，和在如發酵罐中的高細胞密度的容許條件下以相反的表達模式不表達高拷貝數起點引物RNA II序列，這種模式在如細胞被引入動物或被釋放到環境中時隨著細胞密度的下降而出現。另一例子是，可使調節基因如c2處於團體的控制之下。然後，可使RADS的其它元件處於調節基因的產物的控制之下，如使用P22PR。該調節基因將在自身誘導子的存在下表達，在自誘導子的缺乏下不表達。在調節基因是c2和RADS基因連接於P22PR時，該RADS將在自身誘導子不存在時表達(因為沒有產生C2蛋白)，而在自身誘導子存在時被抑制。在必需的基因或複製基因處於團體的控制之下時(自誘導子誘導表達)，較佳的是自身誘導子在容許的條件下存在，而在非容許條件下缺乏。當調節基因處於團體控制之下時，在容許或非容許條件下自身誘導子的存在與否將取決於該調節基因的產物是陽性的還是陰性的調節子。
反調節元件，如阻遏物或反義RNA，可由染色體或質粒表達。但是，為了限制系統的質粒部分的大小和複雜性，較佳的是由細菌的染色體表達這些調節元件。
溫度敏感性調節.調節微生物在人和其它溫血動物中生長的優選類型是溫度調節。這是以哺乳動物和鳥類中存在的高而恆定的體溫與微生物被排放到周圍環境中的低而可變的溫度的對比為基礎的。為此，優選的RADS表達確保在約37℃存活的基因。較佳的是，當將RADS給予動物時，任何以溫度為基礎的調節都應考慮靶動物的正常體溫。例如，雞的體溫是41.5℃，豬的體溫在40℃左右。
Neidhardt等〔Annu.Rev.Genet.，18295-329(1984)〕描述了適合用於RADS的溫度調節的基因表達。已存在很好定義的熱激基因，這些基因在高溫時強烈地表達。雖然這些基因的表達是溫度調節的，但是在限制性溫度時常常有一些低基礎水平的表達〔Jones等，J.Bacteriol.，1692092-2095(1987)〕。具有較嚴謹控制的溫度調節的啟動子在下列文獻中描述到Tobe等，Mol.Micro.，5887-893(1991)，Hromockyi等，Mol.Micro.，62113-2124(1991)，和Qoronfleh等，J.Bacteriol.，1747902-7909(1992)。
對於所需的基因如抗原，可在相同的質粒上、分離的質粒上或者染色體上的其它地方使用弗氏志賀氏菌(S.flexneri)virB啟動子和弗氏志賀氏菌virF基因和啟動子〔Hormockyi等(1992)；Tobe等(1991)〕。也可使用用於溫度調節的耶爾森氏(Yersinia)菌屬兩組分系統，它涉及溫度調節的陽性激活子virF的結構基因〔Lambert de Rouvroit等，Molec.Microbiol.，6395-409(1992)〕與yopH或yadR基因的啟動子，其中有或沒有由ymoA編碼的組蛋白樣修飾〔Cornelis，《細菌感染的分子生物學》(Molecular Biology of Bacterial Infections)劍橋大學出版社，劍橋，1992〕。志賀氏菌屬virF基因相等於鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis)中的lcrF〔Hoe等，J.Bacteriol.，1744275-4286(1992)〕。可通過使用溫度敏感型的阻遏物使許多其它的阻遏物-啟動子組合以溫度特異性的方式表達基因。已經建立獲得溫度敏感突變體阻遏物的方法。
通過使基因連接於冷激啟動子或冷敏感啟動子，也可獲得冷特異性表達。冷激啟動子可從已知的冷激基因獲得。已描述了具有啟動子的冷激基因(Jones等，1987)。有用的冷激啟動子的一個例子是從cspA獲得的啟動子〔Vasina和Baneyx，Appl.Environ.Micro.，621444-1447(1996)〕。可使用啟動子探針載體鑑別具有溫度特異性表達的啟動子。這些載體從不必要的基因上側接有DNA，該DNA可易於被選擇或使用如生色底物進行鑑別。通過篩選鼠傷寒沙門氏菌lacZ融合庫中缺乏冷敏感的β-半乳糖苷酶的表達，可以鑑別其用於該必需基因表達的其它冷特異性啟動子(Tanabe等，J.Bacteriol.，1743867-3873(1992)〕。
較不複雜的優選系統涉及λ噬菌體啟動子λPL和λPR與溫度敏感阻遏物CI857之間的相互作用。這個系統已由如Lieb，J.Mol.Biol.，16149-163(1966)描述。λ噬菌體啟動子λPL和λPR和它們的突變體溫度敏感阻遏物CI857提供了一種在表達載體中使用的嚴密的調節系統，以提供毒性基因的受控表達〔O′Connor和Timmis，J. Bacteriol.，1694457-4462(1987)〕，並且還可用於調節起始子RNAII的合成，以啟動在高拷貝數質粒載體的DNA聚合酶I依賴性起點上進行的RNA複製。cI857基因產物被合成，但在37℃失活，尤其是在鳥類和一些哺乳動物中發現甚至在更高的溫度也是失活的；合成該產物，但它在30℃以下主動地抑制其轉錄被λPL或λPR控制的基因的表達。
如果遇到從RADS的控制序列中洩漏表達的話，可以幾種方式消除這種表達。例如，通過使cI857基因處於強的啟動子(如Ptrc)的控制之下，可增加所產生的CI阻遏物的水平，從而提供過量的熱敏感阻遏物。此外，可將CI阻遏物的更多位點引入λPR的操縱子區域中，以減少在非容許的溫度起始的轉錄，或者將其工程改造到啟動子元件的下遊區域中，以阻止在較低溫度下的轉錄。此外，可由取向與λPR相反方向的不同的調節啟動子轉錄該調節基因的反義RNA。
阿拉伯糖調節.如先前所討論，當微生物從容許環境移到非容許的環境中時，用於引發表達開關的優選調節系統是araC-PBAD系統。該araC-PBAD系統是嚴密的調節表達系統，該表達系統已表現出作為由加入低水平的阿拉伯糖誘導的強啟動子的作用〔參見Guzman等，J.Bacteriol.，177(14)4121-4130(1995)〕。該araC-araBAD啟動子是控制araBAD在一個方向上表達，而araC基因在另一方向上表達的雙向啟動子。為了方便，將介導araBAD基因表達、被araC基因產物控制的araC-araBAD啟動子稱為PBAD。對於在本文所述的載體和系統中的應用，應使用具有araC基因和araC-araBAD啟動子的表達盒。此盒在本文中稱為araC-PBAD。AraC蛋白是PBAD的陽性和陰性調節子。在阿拉伯糖存在的情況下，AraC蛋白是使PBAD表達的陽性調節元件。在阿拉伯糖缺乏的情況下，AraC蛋白抑制PBAD的表達。這可能會導致PBAD在表達水平上有1200倍的差異。
腸細菌含有與大腸桿菌的araC-araBAD系統同源的阿拉伯糖調節系統。例如，在大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌AraC蛋白之間的胺基酸序列水平上具有同源性，在DNA水平上同源性較少。但是，在AraC蛋白的活性上有高的特異性。例如，大腸桿菌AraC蛋白僅激活大腸桿菌PBAD(在阿拉伯糖的存在下)而不是鼠傷寒沙門氏菌的PBAD。因此，RADS可使用從多種腸細菌獲得的多種阿拉伯糖調節序列，以區別地調節相同系統中的不同成分。
麥芽糖調節.當需要高拷貝數時用於引發表達開關的另一優選的調節系統是malT系統。malT編碼MalT，MalT是4種麥芽糖反應性啟動子(PPQ、PEFG、PKBM和PS)的陽性調節子。malT和mal啟動子的組合產生一種嚴密調節的表達系統，該系統已顯示出作為由加入麥芽糖誘導的強啟動子的作用〔參見Schleif，《兩種陽性調節系統——ara和mal》(Two Positively Regulated Systems，ara and mal)，第1300-1309頁，《大腸桿菌和沙門氏菌及分子生物學》(Escherichia coli and SalmonellaCellular and Molecular Biology)，第二版，Neidhardt等編輯，ASM出版社，華盛頓哥倫比亞特區，1996)。與araC-PBAD系統不同，malT由在功能上未連接於其它mal啟動子的啟動子(PT)表達。PT並不受MalT的調節。malEFG-malKBM啟動子是控制malKBM基因在一個方向上表達，而malEFG基因在另一方向上表達的雙向啟動子。為了方便起見，將malEFG-malKBM介導malKBM基因表達並被malT基因產物控制的部分稱為PKBM，將malEFG-malKBM啟動子介導malEFG基因的表達並由malT基因產物控制的部分稱為PEFG。完全誘導PKBM需要存在PEFG的MalT結合位點。對於在本文所述的載體和系統中的用途，應使用具有malT基因和mal啟動子中的一種的盒。這個盒在本文中稱為malT-Pmal。在麥芽糖的存在下，MalT蛋白是使Pmal表達的陽性調節元件。
有了阿拉伯糖和araC-PBAD，用麥芽糖進行的調節可用於延遲型RADS。這是因為一旦不再提供麥芽糖，需化一定的時間使麥芽糖的濃度下降到足以消除MalT蛋白引起的誘導作用的程度。為了延長暫時存活的時間，較佳的是與麥芽糖調節的RADS一起使用的菌株含有mal操縱子的一個或多個元件的缺失。這種缺失阻止了麥芽糖的代謝，導致細胞內較高的麥芽糖水平。這導致在麥芽糖的水平下降到足以消除MalT蛋白引起的誘導作用的程度之前有較長的延遲。麥芽糖的調節也是有用的，因為游離的麥芽糖通常在自然中是得不到的。延遲的死亡
作為快速誘導高拷貝數起點的另一選擇，RADS可被設計成使宿主微生物在抑制高拷貝數起點的因素消失後維持有限時間的生存。這在本文中稱為延遲型RADS，其結果產生RAV，該RAV在宿主暴露於環境信號以轉移到高拷貝數起點之後暫時地繼續處於較低拷貝數起點的控制之下。延遲型RAV高拷貝數的優選機制是在反調節元件上的鹼基調節，該元件必須在RAV可以轉變成逃逸型狀態之前被降解或稀釋。在這種系統中，在將宿主微生物從高拷貝數被抑制的環境轉移到高拷貝數被誘導的環境中之後，停止產生維持低拷貝數狀況的反調節元件。但是，只要當時存在的該反調節元件已經是足量的，則低拷貝數的狀態可有效地維持。根據該反調節元件的代謝和現有的反調節元件的量與維持低拷貝數狀態所需的反調節元件的量之間的關係，在轉移到高拷貝數環境中後，該低拷貝數狀態可維持幾代。這種短暫的低拷貝數狀態是有用的，例如，可用於使宿主微生物在高拷貝數的環境(如，沒有阿拉伯糖)如動物中集結，但並不是無限期地維持。這樣，即使沒有WO96/40947中所述的噬菌體裂解基因，RADS也是一個遏制系統。延遲型RADS在所需基因產物對宿主細胞有害時也是有用的，如實施例3。此外，延遲型RADS可用於使平衡致死宿主系統的必需基因(如asd)依賴於可激活的控制序列(如araCPBAD)，以在免疫(在這個例子中沒有阿拉伯糖)後為細胞壁提供一種弱化作用。參見實施例5。
用於延遲型RADS中的優選反調節元件由AraC蛋白及其誘導子阿拉伯糖組成。AraC蛋白將繼續抑制操作性連接於PBAD的高拷貝數起點，直到阿拉伯糖的濃度降到臨界水平以下為止。載體
在本文中，「載體」指自主複製核酸單元。本發明可使用任何已知類型的載體，包括病毒、粘粒、質粒和質粒載體。最優選的載體類型是質粒載體。
本領域已周知，質粒和其它載體具有各種各樣的啟動子、多克隆序列等，可使用這些複製子，從而使合成的外來抗原的量可由基因拷貝的相對數量控制。例如，可以構建具有p15A、pBR和pUC複製子的載體，所有這些都依賴於編碼用於它們的複製的DNA聚合酶I的polA基因。通過使載體在具有溫度敏感的polA突變(如x 1891，見表1)的宿主中生長，檢查作為溫度函數的載體維持，從而可測定載體的複製是否依賴於DNA聚合酶I。較佳的是，RAD系統中使用的載體系統不使用抗生素抗性來選擇載體的維持。
優選的載體具有RAV的所有的必需元件，即(a)編碼所需基因產物並操作性連接於控制序列的基因，(b)在微生物中產生低或中間拷貝數的載體的複製起點(「ori」)，和(c)產生高拷貝數的起點。是任何特殊的RADS的一部分的其它元件可存在於載體上或其它匹配的載體上，或者宿主微生物的染色體上。
轉移載體.微生物寧可具有用於轉移並在其所處的環境中的其它細胞中表達的RAV，也不願直接表達表達產物。在本文中，轉移載體是可從RADS微生物轉移到細胞中，並指導由其編碼的表達基因的表達的表達載體。轉移載體可含有任何表達基因，包括編碼抗原的基因、免疫調節子、酶和調節受體細胞中基因表達或細胞活性的表達產物。
轉移載體的優選受體是用該載體處理的動物的細胞。為此，含有RAV轉移載體的RADS微生物可給予動物。較佳的是，為傳送該轉移載體，該微生物侵入動物的細胞中。為此，較佳的是，一旦該微生物進入動物的細胞中就裂解。引起這種裂解的優選方法是ELVS系統，如WO96/40947中所述。在該系統中，攜帶載體的致死基因如噬菌體裂解基因lys 13和lys 19可操作性連接於P22 PR，染色體編碼的C2阻遏物則可操作性連接於araCPBAD。將菌株引入沒有阿拉伯糖的環境(如接種的動物)中，結果產生使所存在的C2阻遏物被稀釋，直到致死基因產物殺死細胞。此外，具有含轉移載體的RAV的RADS可被設計成ELVS，這種ELVS由於插入染色體中的調節裂解基因的緣故而發生裂解。裂解基因的這種表達具有延遲的表達，這樣裂解僅在具有轉移載體的脊椎動物細胞進入真核細胞並產生逃逸型載體複製之後才發生。還可參見實施例6，該實施例描述適用於RADS的新穎的轉移載體。當正確地設計ELVS系統時，該系統完全與RADS系統匹配，並且可能享有控制元件。在這個例子中，細胞的裂解，如由ELVS引起的裂解，將在受體細胞內釋放轉移載體。對於受體細胞中轉移載體上基因的表達，較佳的是表達基因被操作性連接於表達控制序列上，而該表達控制序列在該受體細胞中可操作。例如，在受體細胞是動物細胞時，較佳的是表達基因可操作性地連接於動物中起作用的啟動子，並具有確保mRNA的聚腺苷酸化的序列。工程改造這些序列的方法在本領域中是已知的。
轉移載體還可含有在受體細胞中可操作的複製序列。這使轉移載體進行複製，使該轉移載體上的表達基因產生增加的或較長的表達。轉移載體對於真核細胞中需要糖基化或翻譯後修飾的抗原和其它蛋白質的表達特別有用。通過這種方式，具有RAV/ELVS載體的細菌細胞可通過使轉移載體表達蛋白質而用於傳送一種需要真核生物加工的蛋白質。
轉移載體的優選用途是用於刺激動物中的免疫反應的RADS中。為此，較佳的是細菌是無毒力的沙門氏菌、志賀氏菌、耶爾森氏菌或侵入性大腸桿菌，它們將侵入動物的細胞中，然後裂解釋放出設計用於在這些細胞中表達的轉移載體。這可用於刺激針對病毒、寄生蟲或針對配子抗原的免疫反應中，在該配子抗原中，該抗原通常以一些方式進行糖基化或翻譯後修飾，這種糖基化或修飾僅在抗原產物在真核細胞內合成時才能完成。
通過使其包含endA突變、recBC中的突變(有或沒有sbc抑制基因突變)和/或其它核酶基因中的突變，可改善轉移載體的轉移效率。這些突變可減少轉移載體在細菌細胞裂解後的降解。它還有可能影響細胞類型和含有該轉移載體的微生物會附著並侵入的黏膜表面。這可通過阻斷或開啟特異性粘附素和/或侵染素的表達而實現。
已知許多載體可用於DNA免疫或引入動物的細胞中。這些載體可用作含有具有ELVS的RAV的微生物中的轉移載體。在這個例子中，RADS提供一種將這些載體引入細胞中的有用的方法。用於轉移載體上表達基因的表達的優選啟動子是腺病毒、皰疹病毒和巨細胞病毒啟動子。通過將細菌啟動子放在真核細胞啟動子的上遊，也可增加表達基因的表達，這樣該細菌株已經表達一些表達產物。這種表達產物會在該細菌裂解後釋放。
用在或用於構建環境限制性存活系統中的優選的細菌宿主/株和載體列在表1和2中。
表1
細菌株
質粒載體(表2)
如先前所討論，本發明的宿主細胞還具有編碼所需的基因產物如多肽或mRNA的多核苷酸的所需的重組基因。所需基因的選擇並沒有狹窄的限制，可包括編碼如病毒、細菌、真菌或寄生蟲抗原等的基因。
為了使所需的基因用於本發明，該基因必須被表達。基因表達指，由該基因所處的細胞的生化機制將DNA鹼基序列中編碼的信息轉化成RNA分子、多肽或其它生物分子形式的自然產物。如此產生的生物學分子稱為基團產物。術語「基因產物」在此指任何生物產物或由基因表達產生的產物。基因產物可以是如RNA分子、肽，或者在該基因的原始產物如酶或其它分子的控制下產生的產物，即代謝產物。例如，基因可首先控制RNA分子的合成，該RNA分子通過核糖體的作用翻譯成在該基因所處的原始細胞的外部環境中控制聚糖形成的酶。所述的RNA分子、酶和聚糖都是本文所述的基因產物，其中的任一種以及其它類型的基因產物。如糖蛋白和多糖，如果被引入動物的免疫系統中則起到抗原的作用。蛋白基因產物包括糖蛋白和脂蛋白是用作疫苗中的抗原的優選基因產物。
本發明的優選實施例涉及上述作為活疫苗成分的RADS微生物的用途。在這些例子中，可需的重組基因將編碼真菌、細菌、寄生蟲或病毒疾病製劑的抗原。活疫苗針對疾病製劑的局部免疫是重要的，且可能在第一道防線的情況下特別有用。但是，在這個例子中，對於要接種的個體有必要使宿主細胞減毒。
較佳的是，用於活疫苗中的宿主細胞是病原體的減毒衍生物。最佳的是，減毒的衍生物能附著、侵入和保留在腸道相關的淋巴組織(GALT)或支氣管相關的淋巴組織(BALT)中。這種減毒的宿主細胞是優選的，因為已知它們能維持在接種的動物中，導致該動物對抗原長時間暴露。已知這種長時間的暴露在誘導針對抗原的免疫原性應答是非常有效的。
可採用任何已知的方法對微生物進行減毒，包括化學誘變和使用各種重組基因。減毒的優選方法使宿主細胞不能回復到致病的狀態。對宿主細胞進行減毒的最佳方法是採用重組方法引入穩定的突變或基因插入。這些方法的非限制性實施例包括(1)引入對芳族胺基酸和維生素產生需求的突變，這些芳族胺基酸和維生素從這種途徑中的前體衍生得到(Stocker等，1983，Dev.Biol.Stand.，5347-54；Hioseth和Stocker，1981，Nature，291238-9)；(2)用於全局調節子的突變基團，如cya和cyp(美國專利第5389368號、第5855879號、第5855880號、第5294441號和第5468485號)、phoP(美國專利第5424065號)、ompR(Dorman等，1989，Infect.Immun.，572136-40)和poxA(美國專利申請08/829402)；(3)用於脂多糖(LPS)合成的突變基團，如galE(Germanier等，1975，J.Infect.Dis.，131533-8)；雖然單單這種可能是不夠的(Hone等，1988，Infect.Immun.，561325-33)；(4)使深部組織的集結需要的突變基因，如cdt(美國專利第5387744號)；或者(5)阻止高溫時需要的蛋白酶的基因表達，如htrA(Johnson等，1991，Mol.Microbiol.，5401-7)。
一旦被減毒，這些微生物可用作疫苗的免疫原性組分以誘導針對該微生物的免疫性。因此，具有上文所述的宿主細胞的特徵的任何微生物的使用，包括無毒力的，都包括在本發明中，它們包括但不限於大腸桿菌屬、沙門氏菌屬、大腸桿菌一鼠傷寒沙門氏菌雜交體、志賀氏菌屬、耶爾森氏菌屬、巴斯德氏菌屬(Pasteurellaspp.)、軍團菌屬(Legionella spp.)或布魯氏菌屬(Brucella spp.)。優選的微生物是沙門氏菌屬的成員，如鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌(S.typhi)、副傷寒沙門氏菌(S.paratyphi)、雞沙門氏菌(S.gallenarum)、腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)、豬霍亂沙門氏菌(S.choleraesius)、亞利桑那沙門氏菌(S.arizona)或者都柏林沙門氏菌(S.dublin)。
活細菌抗原傳送系統.用作抗原傳送系統的優選宿主是腸細菌。在本文中，術語「抗原傳送系統」和「抗原傳送微生物」指產生抗原或具有編碼抗原的轉移載體的微生物。在本文中，「腸細菌」指任何腸桿菌科(Enterobacteriaceae)細菌。本文所述的許多優選基因和調節元件在大多數腸細菌中都是可操作的，因此可使用許多很好發展的大腸桿菌和沙門氏菌調節系統。最佳的是，細菌宿主是致病的沙門氏菌的減毒衍生物。
在本文所述的系統的一個實施例中，附著、侵入和維持在腸相關的淋巴組織(GALT)或支氣管相關的淋巴組織(BALT)中的致病微生物的減毒衍生物被用作用於刺激針對病原體或變應原的免疫反應的基因產物的載體。減毒並不意味著該屬或種的微生物不再引起疾病，而是指所使用的特定的微生物對被治療的特定的動物是減毒的。微生物可屬於通常致病的一個屬乃至一個種，但必須屬於減毒的菌株。「致病」指能引起疾病或削弱正常的生理功能。減毒株不能誘導通常與其有毒性的致病對應物相關的疾病的一系列症狀。本文使用的微生物包括細菌、原生動物、寄生蟲、單細胞真菌和多細胞真菌。
志賀氏菌或腸侵染性大腸桿菌可用在抗原傳送系統中，因為它們侵入結腸黏膜可刺激靠近該結腸的淋巴組織，從而在生殖道中刺激強的黏膜免疫應答。由於解剖學特徵如淋巴結和淋巴管接近結腸的緣故，所以直腸免疫也是有效的。
為了使疫苗有效的誘導抗體，抗原物質必須以接種的動物產生抗體的機制開始起作用的方式釋放。因此，基因產物的微生物載體必須被引入動物中。雖然給予疫苗的其它方法，如靜脈內、肌肉內、皮下注射或乳房內或陰莖內或陰道內給藥也是可以的，但如先前所述，為了刺激GALT或BALT細胞產生優選的反應，較佳是將微生物或基因產物直接引入腸道或支氣管中，如通過口服、胃插管或以鼻內的方式。
當減毒的微生物用作疫苗時，需要讓動物的免疫系統可以獲得抗原。當載體微生物死亡而使抗原分子釋放時可實現這種獲得。當然，也可以使用沒有發生裂解而釋放出周質的內容物的「洩漏性」減毒突變體。或者，可選擇一種控制抗原生產的基因，該由載體細胞得到的抗原在細胞死亡之前出現在細胞外的環境中。
抗原.活的重組RADS微生物能用於傳送能在宿主微生物中表達的任何產物。用於此目的的優選的表達產物是抗原。例如，抗原可以從細菌、病毒、真菌和寄生病原體得到，以分別保護細菌、病毒、真菌和寄生蟲感染；從配子得到，條件是它們是配子特異性的，以阻斷受精；從腫瘤抗原得到，以阻止癌症。特別地，從新鑑別的生物體或與新發現的疾病或致病條件相關的、或者新的或突然出現的動物或人的病原體(包括那些現在已經知道的或在將來鑑別的)都可用在RADS中。此外，用於RADS中的抗原並不限於致病的生物體。Schodel(1992)和Curtiss(1990)先前已經描述了抗原的選擇和重組表達。通過構建也表達細胞因子、佐劑和其它免疫調節劑的基因的菌株，可增強和/或調節微生物的免疫原性。
用於抗原來源的微生物的一些例子如下。這些包括用於控制由鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)和其它的耶爾森氏菌種如假結核耶爾森氏菌(Y.pseudotuberculosis)和小腸結腸炎耶爾森氏菌(Y.enterocolitica)引起的瘟疫的微生物；由淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoea)引起的淋病的微生物；由蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)引起的梅毒；由砂眼衣原體(Chlamydia trachomatis)引起的性病以及眼睛傳染病。A群和B群的鏈球菌種類，如那些引起咽喉炎或心臟病的種類，和豬紅斑丹毒絲菌(Erisipelothrix rhusiopathiae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、肺炎枝原體(Mycoplasma pneumoniae)和其它枝原體種類、流感嗜血菌(Hemophilus influenza)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、麻瘋分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、博德特氏菌屬、大腸桿菌、馬鏈球菌、肺炎鏈球菌、流產布魯氏菌、溶血巴斯德氏菌(Pasteurellahemolvtica)和多殺巴斯德氏菌(P.multocida)、霍亂弧菌(Vibrio cholera)、志賀氏菌屬、博德特氏菌屬、巴爾通氏體屬(Bartonella)、幽門螺桿菌(Heliobacter pylori)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、假單孢菌屬(Pseudomonas)、莫拉氏菌屬(Moraxella)、布魯氏菌屬(Brucella)、弗朗西斯氏菌屬(Francisella)、氣單孢菌屬(Aeromonas)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、梭菌屬(Clostridium)、立克次氏體屬(Rickettsia)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、考克斯氏體屬(Coxiella)、埃裡希氏體屬(Ehrlichia)、利斯特氏菌屬(Listeria)和侵肺軍團菌(Legionella pneumophila)是在本發明範圍之內的其它例子的細菌，從它們這裡也可獲得抗原基因。病毒抗原也可以用於RADS中。病毒抗原可用於直接針對病毒(DNA或RNA病毒)的抗原傳送微生物中，例如，從乳多空病毒(Papovavirus)、腺病毒(Adenovirus)、皰疹病毒(Herpesvirus)、痘病毒(Poxvirus)、細小病毒(Parvovirus)、呼腸孤病毒(Reovirus)、小核糖核酸病毒(Picornavirus)、粘病毒(Myxovirus)、副粘病毒(Paramyxovirus)、黃病毒(Flavivirus)或逆轉錄病毒(Retrovirus)。還可以使用致病的真菌、原生動物和寄生蟲的抗原的抗原傳送微生物。
某些疫苗實施例包括使用含有其所需基因編碼變應原的RADS系統的微生物。這種疫苗可用於設計特異性地使變應性宿主脫敏的暴露療法中。變應原是在暴露於動物中引起變態反應的物質。變態反應，也稱為I型超敏反應或速髮型超敏反應，在脊椎動物免疫反應中表現為IgE生產連帶某些細胞免疫反應的特徵。許多不同的物質可以是變應原，如動物頭皮屑和花粉，單個動物的變態反應，就任何特定的變應原來說，可能是不同的。在通常顯示變態反應的動物中有可能誘導針對變應原的耐受。誘導耐受的方法是周知的，一般包括以增加的劑量將變應原給予動物。
重組減毒的沙門氏菌能刺激針對外來抗原以及針對作為該外來抗原的來源的強的黏膜、全身以及細胞免疫反應。並不需要抗原基因如在親本生物體中存在的那樣是完整的基因，其完整的基因能產生或調節大分子如功能性多肽的生產。僅需要該基因能作為在生產抗原性產物中用作指南的模板。該產物可以是其確切形式在親本生物體中尚未發現的產物。例如，編碼含有100個胺基酸殘基的多肽抗原的功能性基因可以被部分轉移到載體微生物中，這樣可由宿主細胞的細胞機制產生僅有75個乃至10個胺基酸殘基的肽。或者，如果已知特定的抗原或片段的胺基酸序列，則有可能採用自動基因合成儀、PCR等化學合成該DNA片段或者類似物，並將所述DNA序列引入適當的表達載體中。在波譜的另一端是編碼幾種基因產物的DNA的長部分，這些產物中的一個或者全部都可以是抗原性的。
多抗原也可由重組的無毒力沙門氏菌株表達。此外，由B細胞表位組成或者確定免疫反應所需的抗原區域的抗原乃至抗原部分，可以表達為與載體蛋白融合的產物，該載體蛋白含有強的混雜的T細胞表位，和/或作為佐劑，和/或促進該抗原的呈遞，以在所有的情況中增強針對抗原或其組成部分的免疫反應。對DNA序列進行遺傳工程加工，指定這類融合蛋白被減毒株表達，從而可容易地實現上述目的。雖然其它的表位呈遞系統在本領域中是已知的，但與破傷風毒素(tenustoxin)片段C、CT-B、LT-B以及B型肝炎核心病毒的融合對於這些目的特別有用。
為了使表達基因有效引起免疫反應，該表達基因必須被表達，這可如上面所述實現。為了使抗原傳送微生物有效免疫個體，抗原物質必須以使接種動物的免疫系統運作的方式釋放。因此，活的無毒力微生物必須被引入動物中。雖然給予抗原傳送微生物的其它方法，如靜脈內、肌肉內、皮下注射或乳房內、腹膜內或陰道內給藥也是可以的，但如先前所述，為了刺激GALT或BALT細胞產生優選的反應，較佳是將微生物或基因產物直接引入腸道或支氣管中，如通過口服、鼻內、胃插管或以氣溶膠的方式。
抗原傳送組合物.抗原傳送微生物的優選用途是作為刺激針對所傳送的抗原的免疫反應的疫苗。在合適的動物宿主中口服活的重組沙門氏菌疫苗株會導致在腸道相關的淋巴組織(GALT)或派伊爾氏結的集結，這種集結將會誘導針對沙門氏菌抗原和由該重組的沙門氏菌合成的外來抗原的統一的黏膜免疫反應(Curtiss等，Adv.Exp.Med.Biol.，25133-47(1989)〕。疫苗株進一步滲入腸繫膜的淋巴結、肝和脾增強了針對沙門氏菌抗原和由該重組沙門氏菌生產的外來抗原的全身性和細胞免疫反應的誘導〔Doggett和Curtiss(1992)〕。因此，口服給予重組的無毒力沙門氏菌疫苗將刺激免疫系統的所有三個分支，當針對集結在和/或穿過黏膜表面侵入的傳染病製劑的免疫時尤為重要。
疫苗指用於刺激活的生物體的免疫系統以使其產生免疫反應的製劑。較佳的是，疫苗足以刺激活生物體的免疫系統，以提供針對將來的傷害的保護。免疫指誘導持續的高水平抗體和/或細胞免疫反應的過程，其中，在所述免疫反應中，T淋巴細胞可殺死病原體和/或激活該生物體中從事這種工作的其它細胞(如巨噬細胞)，所述其它細胞針對該生物體先前所暴露的病原體或抗原。雖然「免疫系統」可包括單細胞生物體在外來實體的存在下產生的反應，即幹擾素生產，但是，在本文中，該詞語限制在由多細胞生物體針對侵入該生物體中或其細胞外體液中的抗原物質而作出反應的解剖學特徵和機制。由此產生的抗原可能屬於任何一個免疫學類別，如免疫球蛋白A、D、E、G或M。特別感興趣的是刺激免疫球蛋白A(IgA)的生產，因為免疫球蛋白A是溫血動物的分泌系統產生的主要的免疫球蛋白，雖然本文所述的疫苗並不限於刺激IgA生產的那些疫苗。例如，本文所述的天然的疫苗有可能產生除了IgA形成以外的大範圍的其它免疫反應，例如，細胞免疫性和體液免疫性。已很好研究並廣泛報導了針對抗原的免疫應答。在下列文獻中提供了免疫學的綜述Paul編輯的《基礎免疫學》(Fundamental Immunology)，第四版，PhiladelphiaLippincott-Raven；Sites等，《基礎和臨床免疫學》(Basic andClinical Immunology)(Lange Medical Books，Los Altos，CA，1994)；和Orga等，《黏膜免疫學手冊》(Handbook of Mucosal Immunology)(Academic出版社，SanDiego，CA，1994)。Ogra等編輯(1999)的《黏膜免疫學》(Mucosal Immuology)(第二版，Academic出版社，San Diego)也描述了黏膜免疫性。
用本發明的疫苗治療的個體在本文中定義為所有的脊椎動物，例如哺乳動物，包括家畜和人；各種鳥類，包括家養鳥類，尤其是那些農業上具有重要性的鳥類。較佳的是，該個體是溫血動物。
引起免疫反應所需的活重組疫苗的劑量將根據克隆的重組表達產物的抗原性而改變，這個劑量僅需足以誘導現有疫苗的典型的免疫反應的量即可。進行常規的試驗將容易地確立所需的劑量。根據免疫個體的體形大小和年齡口服疫苗的標準的初始劑量是1×107-1×1011CFU。在需要時也可給予多份劑量，以產生所需水平的保護性免疫性。疫苗懸浮於其中的藥學載體可以是用於包囊的任何溶劑或固體物質，它們對於接種的動物是無毒的，並且與該載體生物體或抗原基因產物相容。合適的藥學載體包括液體載體，如生理鹽水和其它濃度為或接近生理濃度的無毒性鹽，以及不用於人的固體載體，如滑石粉或蔗糖，或者動物飼料。如果需要，可加入佐劑以增強免疫原性。當經由支氣管給藥時，疫苗較佳以氣溶膠的形式給與。
還可使用基因產物衍生的病原體與用作載體的致病微生物的減毒衍生物的預先免疫一起進行免疫，以表達病原體的重組基因規定的基因產物。一旦針對該病原體衍生的基因產物被使用表達該病原體衍生的基因產物以刺激GALT或BALT的淋巴細胞的載體微生物進行的免疫啟動時，這種胃腸外的免疫可作為一種激發劑，以增強分泌性免疫反應的表達。該增強的反應已知是次級的、增強的或回憶的應答，結果對該宿主產生長時間的免疫保護。由於存在有利的結果，增強免疫可重複多次。
雖然較佳的是採用常規的方法給予刺激黏膜免疫反應的抗原傳送微生物，即口服、鼻內、陰道內和直腸內給予，但還可通過肌肉內、靜脈內以及其它胃腸外途徑給予這些微生物。還可結合胃腸外給予純化的抗原成分給予抗原傳送微生物。在ELVS被用於控制或治療癌症的情況下，優選的是胃腸外給予ELVS。
RADS適用於有用的宿主菌株.已知鼠傷害沙門氏菌的無毒株在小鼠、雞和豬中是完全地減毒且具有高度的免疫原性，包括針對被10,000倍致死劑量的強毒野生型菌株的感染產生的保護性免疫。類似地，無毒力的豬霍亂沙門氏菌在小鼠和豬中也是減毒和具有免疫原性的，也提供明顯的保護性免疫。已分離出都柏林沙門氏菌的無毒株，並對其進行了測試，發現這種菌株在牛中是無毒性的、免疫原性的和保護性的。也已經構建減毒的傷寒沙門氏菌(S.typhi)，並發現它可在自願接受治療的人中誘導顯著的免疫反應。還已構建霍亂弧菌和弗氏志賀氏菌的減毒衍生物，並將它們用作在自願者中誘導顯著的免疫反應的疫苗。還已給人經口使用牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)BCG株來進行免疫。還已使用單核細胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)作為活疫苗，用於免疫小鼠。除了作為免疫動物和人宿主使其抵抗相關強毒野生型株的感染的疫苗外，通過遺傳工程使上述微生物的無毒衍生物表達外來抗原，從而使這些衍生物也可用作抗原傳送載體。這些抗原可來自細菌、病毒、真菌和寄生病原體，或者它們可以是變應原，或者它們是避孕疫苗中的配子特異的抗原或抗癌症疫苗中的腫瘤抗原。已知使用這些活重組無毒疫苗免疫動物和/或人可誘導針對外來抗原、和分別針對分離得到該外來抗原的基因的病原體、或變應原、或精液或卵細胞、或腫瘤細胞的黏膜、全身性和細胞免疫反應。
通過在各種基因中引入上述或者本領域熟練的技術人員已知的缺失突變，可對細菌病原體進行減毒。這些菌株中的任一種都適用於引入本文所述種類的RADS，雖然可能需要作出修改，以使該系統可在革蘭氏陽性菌中操作。特別要指出的是，這些修改可能需要對Shine-Dalgarno序列進行修改，以允許mRNA的翻譯，以及在啟動子序列中有輕微變化使轉錄更有效，這在本領域是已知的。
可採用任何已知的或標準的技術對動物給予上述類型的活疫苗。這些技術包括口腔消化、胃插管或支氣管-鼻噴射。所有這些方法都使活疫苗容易地到達GALT或BALT細胞中，並誘導抗體形成，並且是優選的給藥方法。其它給藥的方法，如靜脈內注射以使載體微生物到達動物的血流中，也是可接受的。靜脈內、肌肉內或乳房內注射和本發明的其它實施例也是可接受的，如下文所述。
由於優選的給藥方法是口腔消化、氣溶膠噴射和胃插管，所以優選的載體微生物是那些屬於優先地回到接種動物的腸或支氣管的任何淋巴上皮結構的種類的微生物。較佳的是，這些菌株是腸道病原菌株的減毒衍生物，通過對腸道致病原菌株進行遺傳操作而產生。回到派伊爾氏結並由此直接刺激IgA產生的菌株是最佳的。在動物中，這些菌株包括沙門氏菌的特定菌株和回到在派伊爾氏結中的沙門氏菌-大腸桿菌雜交體。
所需的劑量將隨基因產物的抗原性而改變，其量僅需足以誘導已存在的疫苗的典型的免疫反應即可。進行常規的試驗將容易確立所需的量。疫苗的標準起始劑量是每千克體重0.001-0.1毫克抗原，需要的話，量可以增加或者使用多份劑量，以產生所需水平的保護。
疫苗懸浮或溶解於其中的藥學載體可以是任何溶劑或固體物質，或者是將疫苗包囊於對接種的動物是無毒且與該載體生物體或抗原基因產物相容的的材料中。合適的藥學載體包括液體載體，如生理鹽水和其它濃度為或接近生理濃度的無毒性鹽，以及不用於人的固體載體，如滑石粉或蔗糖，或者農畜的飼料。如果需要，可加入佐劑以增強免疫原性。當經由支氣管給藥時，疫苗較佳以氣溶膠的形式給予。
還可使使用基因產物衍生的病原體與用作載體的致病微生物的減毒衍生物的預先免疫一起進行免疫，以表達病原體的重組基因規定的基因產物。一旦針對該病原體衍生的基因產物被使用表達該病原體衍生的基因產物以刺激GALT或BALT的淋巴細胞的載體微生物進行的免疫啟動時，這種胃腸外的免疫可作為一種激發劑，以增強分泌性免疫反應的表達。該增強的反應已知是次級的、增強的或回憶的應答，結果對該宿主產生長時間的免疫保護。由於存在有利的結果，增強免疫可重複多次。
在本發明的其它實施例中，致病的微生物的重組減毒衍生物可用於在動物宿主中表達接種的動物中具有治療性的基因產物。這類產物的非限制性例子包括調節免疫反應的淋巴因子或細胞因子(Saltzman等，1996，Cancer Bio.Ther.Radiol.Pharm.，11145-153；Saltzman等，1997，J.Pediatric.Surg.，32301-306；Whittle等，1997，J.Med.Microbiol.，461029-1038，1997；Dunstan等，1996，Infect.Immun.，642730-2736)；阻止生育的精液特異性和卵細胞特異性自體抗原(美國專利第5656488號)；血製品，如凝血因子；特異性抗原，如與腫瘤或病原體如病毒、真菌、寄生蟲或細菌結合的抗體；生長因子；在宿主中產生不足的必需的酶或結構蛋白；切割或滅活編碼不需要的基因產物的核酸的核酶或反義RNA(如，腫瘤轉移或腫瘤血管生成所需的基因產物，病原體引起基因所需的基因產物)；或者具有將患實體瘤的個體中腫瘤細胞塊內的前體藥物轉變成毒性藥物的潛力的酶(Pawelek等，1997，Cancer.Res.，574537-44)。
因為本發明無毒的微生物能橫穿各種免疫活性結構，包括GALT、腸繫膜淋巴結和脾，所以這些微生物還可通過生產各種免疫調節產物而用於調節免疫系統。因此，編碼免疫調節蛋白或肽的一種或多種基因可以作為所需的基因重組地引入減毒的微生物中，這樣這些微生物能佔據在適當的免疫活性組織中，並表達該重組的所需基因產物，以抑制、增強或改變宿主的免疫系統。免疫調節分子的非限制性例子包括結腸刺激因子(巨噬細胞、粒細胞或它們的混合)、巨噬細胞趨化因子、巨噬細胞抑制因子、白細胞抑制因子、淋巴毒素、母細胞形成因子、幹擾素和白介素。
減毒微生物的衍生物也在本發明的範圍之內。衍生物指無毒株的有性或無性衍生的後代或突變體，包括先前所述的保留了宿主細胞的基本功能的單個或多個鹼基取代、缺失、插入或倒位。
下述例子描述了發明的優選實施例。對於本領域的熟練技術人員來說，在考慮了本文所公開的說明書或實踐之後，將會理解本文的權利要求範圍之內的其它實施例。本說明書及實施例僅僅是例子而已，本發明的範圍和精神實質用實施例後的權利要求限定。
實施例實施例1作為RAV的減毒抗原傳送宿主的細菌宿主菌株的構建
RADS依賴實施例2所述的RAV構建物的存在和染色體缺失突變(常具有插入)的存在，以在容許的和非容許的條件下調節RAV上的基因。圖2中的缺失/插入突變1和2通常是所述的大多數RAV的維持所必需的，雖然缺失/插入突變2對下述實施例中所述的一種RAV的維持和功能是足夠的。最好是施用自殺性載體來實現突變如ΔasdA19∷TTaraCPBADc2TT和ΔilvG3∷TTaraCPBADlacITT的引入。如上所述，araCPBAD調節系統能使阿拉伯糖以游離的糖形式提供，與作為在PBAD啟動子開始轉錄從而在c2和/或lacI mRNA翻譯之後引起阻遏蛋白產物C2和/或LacI的合成的激活子AraC蛋白結合。在WO96/40947中描述了TTaraCPBADc2TT產物的分子構建以及將其插入asd基因的1244bp的缺失中，以及TTaraCPBADlacITT構建的分子遺傳構建以及將其插入ΔilvG3突變中。(應注意的是，ilvG3突變在WO96/40947中被誤寫為ΔrelA3)。這些分子構建物可放在自殺性載體如pMEG-375中(圖3)，該載體具有氨苄青黴素和氯黴素抗性以用於選擇具有插入染色體中的自殺性載體的第一重組子的基因，和編碼蔗糖水解的果聚糖蔗糖酶的sacB基因。後者使得通過第二重組事件對丟失自殺性載體(可能與等位基因取代有關)的重組子進行選擇。該自殺性載體還含有IncP質粒的mob序列，以使它能從具有整合的IncP共軛質粒的菌株中移動並結合。pMEG-375還具有從R6K質粒得到的複製起點，該起點依賴於pir基因，並且它被引入自殺性載體供體株的染色體中如λ噬菌體原噬菌體中的MGN-617(表1)。當ΔasdA19∷TTaraCPBADc2TT被插入pMEG-375中時，將獲得自殺性載體pMEG-611(圖4)。可採用轉化或電穿孔將pMEG-611引入自殺性載體結合的供體株MGN-617(表1)中。MGN-617還具有引起對DAP的強制需求的Δasd突變。因而，可在DAP和遺傳了pMEG-611自殺性載體的接合後體的存在下，通過側接質粒載體上的asd基因的同源序列和那些產生氨苄青黴素和氯黴素抗性存活者的染色體上的序列進行單一的相互交叉，從而可使含有自殺性載體如pMEG-611的MGN-617(圖4)與合適的鼠傷寒沙門氏菌受體菌株如x 3761配對。(DAP並沒有包括在這種選擇培養基中，因此具有自殺性載體的MGN-617細胞被裂解而死亡)。通過在含有氨苄青黴素或氯黴素但缺乏DAP的培養基上進行再劃線分離，可純化這些單一交換的整合子。然後可以製備這些藥物抗性分離物的少量培養物，並置於含有5％蔗糖和DAP的培養基上培育(這樣遺傳了ΔasdA19∷TTaraCPBADc2TT突變的細胞得以生存)。如果自殺性質粒仍存在於細菌染色體中，則這些細胞將被殺死，而如果發生將該自殺性載體切除出染色體的第二交換事件，則細菌將生存並形成集落。如果第二交換事件如第一交換事件中所參與的那樣在asd缺失突變對邊上的發生，則將會發生等位基因的替換，以使染色體中的野生型asd+等位基因被ΔasdA19∷TTaraCPBADc2TT缺失/插入突變替換。通過使用DNA探針和用適當的寡核苷酸進行的PCR，可證明該構建在染色體中穩定存在，包括缺乏野生型asd+等位基因的情況下。現在細菌對DAP具有強制的需求。
將用於等位基因替換以引入ΔilvG3∷TTaraCPBADlacITT缺失/插入突變的自殺性載體描述為pMEG-249(圖5)。pMEG-249的自殺性載體部分與pMEG-611中的稍微不同，不同之處在於雖然該自殺性載體構建物的其它特性是相同的，並且它可從自殺性載體供體株MGN-617連接，但是它沒有氯黴素抗性基因。
如先前所述，具有突變1和2的細菌宿主中的RAV(圖2)在從具有阿拉伯糖的培養基中轉移到沒有阿拉伯糖的培養基中時，它們快速啟動逃逸型複製，並且它們的生長可在兩代內停止。減少阿拉伯糖利用速率的一個方法是包含突變3，即ΔaraBAD1923。這種突變消除了分解阿拉伯糖的酶的結構基因，因而進入細胞內的阿拉伯糖停留在那裡，直到它洩漏出去，或者在接下來的細胞分裂過程中降低濃度。因此，在沒有外源阿拉伯糖的情況下，具有突變1、2和3的細菌株(圖2)將在經歷比如圖1所示的僅有突變1和2的菌株更長的時間之後啟動逃逸型載體複製。圖6描述用於傳送ΔaraBAD1923缺失突變到要構建的菌株的染色體中的自殺性載體pYA3484。實現等位基因交換的方法如上面為ΔasdA19∷TTaraCPBADc2TT缺失/插入突變所作的詳細描述。但是，在含有1％阿拉伯糖的MacConkey-Ara平板上，在存在5％蔗糖存在的情況下進行平板培養(如果該菌株也具有ΔasdA19∷TTaraCPBADc2TT的話，則加入DAP)。通過檢查16小時、37℃培育後的平板，鑑別Ara-非發酵分離物而確認等位基因替換的成功。
如上所述，在具有阻止阿拉伯糖的代謝中斷的突變3的菌株中，在阿拉伯糖存在的條件下生長的細胞攝取的一些阿拉伯糖也有可能洩漏。為此，可利用自殺性載體pYA3485(圖7)將突變7(即ΔaraE25突變，圖2)引入該菌株中。araE基因編碼阿拉伯糖的低親和性轉運蛋白，在該蛋白不存在時，需要較高濃度的阿拉伯糖用於araCPBAD調節信號的表達，但是阿拉伯糖一旦內化，阿拉伯糖將非常無效地從該細菌細胞洩漏出來(Schlief等，第1300-1309頁，在Neidhardt等中)。因此，在除突變1和2(圖2)之外還具有ΔaraBAD1923和ΔaraE25突變的細菌株中，在從有阿拉伯糖的培養基轉移到沒有阿拉伯糖的培養基中，RAV的逃逸型複製會有更長時間的延遲。在構建這種菌株時，需要在ΔaraBAD1923突變之前引入ΔaraE25突變。這是因為具有ΔaraE25突變的細菌仍可發酵阿拉伯糖，在MacConkey-Ara平板上產生顏色變化，但這進展緩慢。為此，重要的是檢測在37℃培育16小時後的MacConkey-Ara平板(含有5％蔗糖、1％阿拉伯糖，如果需要可含有DAP)。較長時間的培育使差別變得不明顯，這是因為具有ΔaraE25等位基因的細胞最終將代謝足夠的阿拉伯糖，產生足夠的酸而產生使該集落與具有野生型araE等位基因的細胞的集落難以區別的的顏色反應。對將ΔaraBAD1923等位基因引入含有ΔaraE25突變的菌株中成功的識別是明確的，因為在ΔaraE25母本中，37℃培育40小時後所檢測的集落具有Ara+表型，而具有ΔaraE25和ΔaraBAD1823突變的雙突變體則不能發酵阿拉伯糖，因而是Ara-表型。
以兩步修改突變3(圖2)，可對菌株作進一步的修改，以使RAV表達獲得更長時間的延遲。首先，修改ΔaraBAD1923等位基因以除去編碼araB基因的幾個N末端胺基酸的序列，用NcoI克隆位點取代，以使其它的基因能插入該位點，產生突變ΔaraBAD1924。關於這一點，應注意的是ΔaraBAD1924突變是阿拉伯糖操縱子除araCPBAD啟動子外的所有部分的缺失。因而，經修改的ΔaraBAD1924等位基因(突變4，圖2)是天然的可使用編碼ATG起始密碼子的NcoI位點插入各種外來基因的染色體內的araCPBAD的等效物。一種這樣的衍生物，即突變5(圖2)編碼P22 c2阻遏物基因。另一例子為圖2中的突變6，這種插入具有c2阻遏物基因和lacI阻遏物，以產生ΔaraBAD1926等位基因。在這兩個例子中，C2或C2和LacI阻遏蛋白的水平應是僅具有如在突變1和2(圖2)中的阻遏物基因的單一拷貝的細胞中存在的濃度的兩倍。這種雙重阻遏物基因將進一步延遲對C2可抑制的pUC RNAII基因和LacI可抑制的用於RAV上的外來抗原的Ptrc控制基因的去抑制的時間。
候選疫苗菌株必須具有使它們對動物或人宿主產生無毒性的突變並仍保留免疫原性。有效使鼠傷寒沙門氏菌和其它沙門氏菌亞種有效減毒的突變，和使它們具有高免疫原性的突變包括在phoPQ操縱子中的突變(美國專利第5424065號；Miller等，1989)，如ΔphoP1918和ΔphoP24突變(圖2中的突變8和9)。用於等位基因替換以引入ΔphoP1918等位基因的自殺性載體在圖8中描述為pMEG-550，用於等位基因替換以引入ΔphoP24的自殺性載體pMG-369在圖9中描述。通過篩選編碼在phoP突變體中不合成的非特異性酸性磷酸酶的phoN基因，可成功地引入任一種上述phoP突變(Kier等，1979)。這可使用生色的磷酸酶底物α-萘基磷酸鹽進行軟瓊脂塗覆檢測來實現(Kier等，1999，J.Bacteriol.，138155-161)。使用揭示缺失的大小的PCR、顯示phoP序列缺乏的DAN探針雜交和篩選與ΔphoP突變相關的表型，可獲得突變體等位基因存在的決定性證據。這些表型包括不能合成非特異性酸性磷酸酶(Kier等，1979)；多粘菌素-B敏感性；對被巨噬細胞殺死的易感性(Fields等，1989)。用於RADS的RAV的構建
去除含有lac啟動子的pMEG-546的EagI-XhoI片段(圖10)，並用pMEG-104的P22 PR(圖10和美國專利申請08/761769中的圖4)替換，獲得了RAV pMEG-771(圖10)。用EagI消化pMEG-546，用T4 DNA聚合酶處理，使其產生鈍性末端，然後用XhoI消化。這除去了Ptrc。然後用HindIII消化pMEG-104，用T4 DNA聚合酶處理，使其產生鈍性末端，然後用SalI消化。此pMEG-104片段含有5S T1T2轉錄終止子和P22 PR，這是連接到剪切的pMEG-546以產生pMEG-771的鈍性末端(圖10)。pMEG-771可使用含有突變1和2(圖2)加上其它突變如3或5或6的宿主菌株，任選地具有實施例1所述的突變，以提供阿拉伯糖調節的逃逸型表達。其它的RAV，如圖1所述的pMEG-546具有被ilvG3∷TTaraCPBADlacITT缺失/插入突變2內編碼的lacI基因產物(圖2)抑制的所有的調節信號。在這個例子中，pUC RNAIIA轉錄子是在lac啟動子(Plac)的控制之下，它在缺乏LacI的條件下具有轉錄活性，導致pUC模式的未調節的複製。此外，pMEG-546中插入外來基因的位點與Ptrc接近，並且在其下遊，該Ptrc是雜交的trp-lac啟動子，它非常有效地啟動轉錄，還可被LacI阻遏蛋白抑制(Brossius，J.等(1984)，Gene，27161-172〕。與pMEG-771一樣，pMEG-546具有pSC101的複製起點，因而，當RAV宿主菌株在具有阿拉伯糖的培養基中生長時，每個染色體DNA等效物僅有5-6個pMEG-546拷貝，並且該菌株生長得非常好，這是由於克隆到Ptrc下遊的多克隆位點中的外來抗原的任何基因的低拷貝數和低表達的緣故。
在疫苗株引入免疫的動物後延遲逃逸型載體複製表達開始的時間的另一方法是增強阻遏物的抑制能力。這種增加的阻遏作用將延遲pMEG-771中(圖1)啟動P22PR之前的時間，以產生pUC RNAII轉錄子。獲得這種結果的一種方法是，將插入LacI阻遏物接合位點(lacRB)作為P22 PR的一部分，這樣P22 C2阻遏物和LacI阻遏物兩者阻斷了導致pUC RNAII轉錄子的合成的轉錄。這種作為pMEG-771的修改的構建物在圖11中描述。
WO96/40947的圖8描述了一種逃逸型裂解遏制載體，該載體具有pMEG-546(圖10)的特徵，但它還含有處於P22 PR控制之下的P22噬菌體裂解基因lys-13和lys-19，這樣通過從有阿拉伯糖的培養基轉移到無阿拉伯糖的培養基中，P22 c2基因的表達停止，導致C2阻遏物減少，RAV上的噬菌體裂解基因的轉錄，最終導致細菌的裂解和死亡。對具有噬菌體裂解基因的高拷貝數質粒即使在嚴格的抑制條件下進行的表達所進行跟蹤觀察，證明出現了一些滲漏轉錄，導致由種群中一些細胞的裂解而死亡。因此，我們通過使DAP合成所需的必需基因asd的合成停止，而採取一種延遲起始的裂解，所述DAP是細菌細胞壁的剛性層的必需組成。通過產生TTaraCPBADc2GTG asd序列可實現上述目的，其中，asd基因的起始密碼子以由ATG換成GTG，以降低asd mRNA翻譯的效率，和合成的Asd酶的水平。pMENG-771的這種修改版本在圖12中描述。特別的是，將pYA3531(圖21)的2.5kb BglII-NdeI TT araCPBADC2 GTG asd DNA片段亞克隆到在位置1和NdeI在位置827用BglII部分消化的pMEG-771(圖1)中。然後，在位於Ptrc啟動子之前的BglII位點上插入合成的轉錄終止子，產生圖12所述的質粒。我們有沒有c2基因的相同的構建物，但c2基因存在於RAV上的P22 PR的附近，這增強了在PR起始的轉錄的抑制效率。為此，回想起在噬菌體如λ和P22中，阻遏物基因鄰近該阻遏物所接合的啟動子，從而增強了抑制的效率。毫無疑問，這是由於蛋白質在多核糖體上合成的緣故，其中，mRNA仍附著在靠近該阻遏物基因產物作用位點的DNA模板上。在阿拉伯糖開始耗盡，且由RAV上的araCPBAD啟動子的轉錄停止時，asd mRNA停止合成，並且由於GUG起始密碼子(在DNA序列中編碼為GTG)的緣故，該mRNA的翻譯效率低，Asd酶變得有限，並且過了少數幾代後，細胞開始遭遇沒有DAP的死亡。當質粒拷貝數從pSC101水平升到超過誘導RAV表達後的每個染色體DNA等效物幾百個質粒DNA拷貝的末調控的水平時，上升所到達的程度還有待評估。進一步減少asd基因mRNA的翻譯效率的額外修改是，將SD序列由AGGA改為AAGA或AGAA。實施例3阻止豬紅斑丹毒絲菌感染和疾病的RADS的構建和評估
豬紅斑丹毒絲菌是豬和火雞的革蘭氏陽性病原體，它引起丹毒病，並且在生命後期可能引起關節炎〔Wood，R.L.(1984)，J.Am.Vet.Med.Assoc.，184944-949〕。先前的工作已鑑別出65kDa表面抗原，稱為Ery65或SpaA.1(Shimoji，Y等，1999，Infect.Immun.，671646-1651)，可將這種抗原與佐劑一起注射到動物中，使其產生針對豬紅斑丹毒絲菌刺激的保護性免疫。還有一種針對Ery65蛋白的單克隆抗體(Mab)，該抗體可使灌注了針對活的豬紅斑丹毒絲菌刺激的Mab的動物產生被動保護(Henderson，L.等，1997；美國專利第5625038號)。
全長ery65基因在大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌中的表達有相當的毒性，可能是因為其信號序列不像它在天然的革蘭氏陽性菌宿主中那樣也在革蘭氏陰性菌中起作用，但更有可能是由於其高度疏水的C末端結構域的緣故，該末端趨於對大腸桿菌和沙門氏菌中的胞質膜有親和力，從而削弱電子轉移和代謝性良好健康。解決這個問題的一個方法是，在RAV上表達Ery65抗原，這樣表達一直被延遲到疫苗株存在於缺乏阿拉伯糖的環境中直到阿拉伯糖耗盡為止，導致阻遏物的減少，便於從pUC起點進行逃逸型複製，和克隆基因插入子的高水平表達。pMEG-525(圖13)是含有Ery65編碼區域的RAV，如包括該信號序列的區域的圖14所示，這個區域被作為從pMEG-446(含有編碼豬紅斑丹毒絲菌E1-6P的erg65的1881bpNcoI-HindIII PCR片段的pYA3332載體)得到的2.5kb BstEII-HindIII片段克隆到BstEII-HindIII消化的逃逸型載體pMEG-283。當pMEG525置於鼠傷寒沙門氏菌或豬霍亂沙門氏菌中時，在從有阿拉伯糖的培養基中轉移到沒有阿拉伯糖的培養基中後，作為時間函數的質粒拷貝數出現時間依賴性的增加。還已了解與編碼MGN-996或MGN-2267中的Ery65抗原(圖14)的RAV pMEG-525相比，具有僅僅控制鼠傷寒沙門氏菌MGN-966中的RAV pMEG-283或豬霍亂沙門氏菌MGN-2267中的pMEG-546的質粒DNA的量大幅度增加。因此，在誘導期間仍觀察到一定程度上的Ery65的毒性。儘管如此，在鼠傷寒沙門氏菌和豬霍亂沙門氏菌中，在從有阿拉伯糖的培養基中轉移到沒有阿拉伯糖的培養基中後，作為時間函數的Ery65蛋白的合成有非常大的增加(圖15)。如圖16所揭示，具有指定了Ery65抗原的RAV的鼠傷寒沙門氏菌株MGN-966(pMEG-525)與含有不編碼外來抗原的對照RAV的同基因株MGN-966(pMEG-283)一樣生長得很好，條件是存在阿拉伯糖。但是，在將在含有0.2％阿拉伯糖的Luria Bertani肉湯中生長了12-16個小時的非充氣培養液稀釋1-1000倍加到沒有阿拉伯糖的Luria Bertani培養基中後，Ery65抗原的表達急劇地減少了生長的速率，最終導致死亡以及活細菌不能繁殖(圖16)。
上述菌株在含有0.2％阿拉伯糖的Luria Bertani肉湯中生長到OD600為1.0，然後鼻內給予重～20gm的甲苯噻嗪和鹽酸氯胺酮鎮靜處理的BALB/c小鼠。在第0天和第31天用～105CFU的鼠傷寒沙門氏菌疫苗株MGN-966(pMEG-525)免疫小鼠，採用Western印跡法對免疫小鼠的血清進行檢測，發現在第28天的單一免疫後對豬紅斑丹毒絲菌的SE-9株抽提物中約65kDa蛋白有強的免疫反應(圖17)。如免疫後第48天所觀察到的，在第31天的加強免疫後，這種抗體反應相當大(圖17)。與僅用載體進行處理的對照小鼠相比，用118CFU的豬紅斑丹毒絲菌株E1-6P皮下致死劑量刺激這些免疫小鼠的結果揭示了100％的保護性，如表3所示。這與先前使用沙門氏菌中的其它表達載體上完整的Ery65抗原進行的研究不同，它不能提供針對Ery65的可檢測的免疫反應或者針對紅斑丹毒絲菌的致死刺激的保護。
表3
用紅斑丹毒絲菌E1-6P進行S.C.刺激後用表達完整的Ery65
的鼠傷寒沙門氏菌RAV免疫的BALB/c小鼠的生存
1 基因型ΔphoP22ΔasdA19(PBADc2)ΔilvG3(PBAD.lacI)
2在第52天用118CFU的E1-6P刺激後實施例4預防馬鏈球菌感染和疾病的RADS的構建
馬鏈球菌引起賽馬和其它馬科動物非常嚴重的疾病，稱為扼死〔Nara，P.等(1983)，Am.J.Vet.Res.，44529-534〕。更糟糕的是會引起免疫複合疾病紫癜出血(Purpura hemorrhagica)，這是馬鏈球菌感染導致生命早期出現的結果(Galan，J.和J.Timoney(1985)，J.Immnology，1353134-3137〕。與A型鏈球菌一樣，馬鏈球菌在表面上產生抗吞噬的M蛋白，從而產生增強馬鏈球菌感染的主要的毒性決定簇。針對馬鏈球菌M蛋白(SeM)的抗體是調理素類，並且促進了成功地吞噬和殺死馬鏈球菌〔Galan，J.和J.Timoney(1985)，Infect.Immun.，47623-628〕。因此，與SeM反應的抗體有可能在預防馬的馬鏈球菌感染中是高度保護性的。編碼馬鏈球菌SeM蛋白的RAV pMEG-573在圖18中描述。通過將側接引物表4
小鼠中針對RAV SeM疫苗株誘導的SeM的平均血清IgI免疫反應
血清的1/100稀釋的ELISA讀數
基於這些信息，使用相同的菌株給予馬，以評估靶動物中針對SeM抗原的血清學免疫反應。在第0天和第14天用各菌株的～108CFU給予馬。然後收集血清和鼻內清洗物，並評估SeM特異性抗體，如表5和表6所示。這些數據揭示，在評估的許多馬中存在比小鼠中更高的SeM抗原背景，這些數據還揭示，在不同的動物之間，在針對SeM的免疫反應中存在較大的變化；但是，在3匹經MGN-4598(pMEG0573)Ara+轉導子免疫的馬和1匹經MGN-4598(pMEG-573)免疫的馬中仍存在明顯的血清IgG反應。針對SeM的鼻清洗物IgA反應(表6)也是類似的，即在免疫前馬中具有高的SeM背景，而兩匹經MGN-4598(pMEG-573)Ara+轉導子免疫的馬和3匹經MGN-4598(pMEG-573)免疫的馬似乎有針對SeM的IgA反應。小鼠研究和馬研究都支持用於鼻內免疫的基於RAV的SeM疫苗的使用，有或沒有改良菌株以消除利用阿拉伯糖的能力。
表4
小鼠中針對RAV SeM疫苗株誘導的SeM的平均血清IgI免疫反應
血清的1/100稀釋的ELISA讀數
基於這些信息，使用相同的菌株給予馬，以評估靶動物中針對SeM抗原的血清學免疫反應。在第0天和第14天用各菌株的～108CFU給予馬。然後收集血清和鼻內清洗物，並評估SeM特異性抗體，如表5和表6所示。這些數據揭示，在評估的許多馬中存在比小鼠中更高的SeM抗原背景，這些數據還揭示，在不同的動物之間，在針對SeM的免疫反應中存在較大的變化；但是，在3匹經MGN-4598(pMEG0573)Ara+轉導子免疫的馬和1匹經MGN-4598(pMEG-573)免疫的馬中仍存在明顯的血清IgG反應。針對SeM的鼻清洗物IgA反應(表6)也是類似的，即在免疫前馬中具有高的SeM背景，而兩匹經MGN-4598(pMEG-573)Ara+轉導子免疫的馬和3匹經MGN-4598(pMEG-573)免疫的馬似乎有針對SeM的IgA反應。小鼠研究和馬研究都支持用於鼻內免疫的基於RAV的SeM疫苗的使用，有或沒有改良菌株以消除利用阿拉伯糖的能力。
表5
馬中針對RAV SeM疫苗株誘導的SeM的平均血清IgI免疫反應
血清的1/10000稀釋的ELISA讀數
表6
馬中針對RAV SeM疫苗株誘導的SeM的平均鼻清洗物IgI免疫反應
鼻清洗物的1/10稀釋的ELISA讀數實施例5用於RADS中的RAV的構建
在W096/40947中，所描述的RAV包含遏制特徵，這樣載體表達作為致死基因的代表的噬菌體裂解基因，或者不表達必需的基因如asd基因。我們已經觀察到，即使在-35或-10啟動子序列不存在的情況下，高拷貝數載體(pBR和pUC)上存在的asd基因也被頻繁地轉錄，以足以產生足夠的Asd蛋白來維持具有Δasd染色體突變的菌株的生命。因此，質粒載體如具有araCPBAD asd構建和pBR起點的pYA3530能在沒有DAP和阿拉伯糖的培養基中生長，因為asd基因常常被轉錄，足以使細胞生產足夠的Asd蛋白，以維持其在缺乏DAP的環境中生長。大多數結構基因(91％)使用ATG密碼子作為甲硫氨酸的第一密碼子。但是，較少一部分(8％)使用GTG作為起始密碼子，更少一部分(1％)使用TTG作為起始密碼子，但從未使用CTG作為起始密碼子。因此，我們使用定點誘變將pYA3450中的asd基因的起始密碼子由ATG變為GTG，產生pYA3530(圖20)。當具有araCPBAD GTGasd序列的pYA3450被引入Δasd株如MGN-023(表1)中時，在缺乏DAP時對阿拉伯糖的存在有強制需求。在pYA3450的另一版本中，我們將P22 c2基因插入PBAD和asd基因之間，以適度減少asd基因表達，同時也引起P22 PR上接近C2阻遏物的抑制位點的質粒序列表達該C2阻遏物(參見實施例2)。這個載體稱為pYA3488，然後對它進行定點誘變，將asd起始密碼子從ATG變為GTG。這產生了pYA3531，見圖21。可將從pYA3530得到的araCPBADGTG asd序列或從pYA3531得到的araCPBADc2GTG asd序列亞克隆到pMEG-771(圖1)中的asd基因位置上，以產生如圖12所述的具有araCPBADc2GTG asd序列的質粒，更具體而言，含有圖12所述質粒的Ptrc MCS 5ST1T2盒的700bp BglII片段被PCR擴增的pVAX1(Invitrogen)的920bp BSG pA DAN片段替換，產生圖22所述的質粒。具有這種構建物的菌株在進入沒有阿拉伯糖的免疫動物或人中後應該需要削弱的細胞壁，因為逃逸型載體複製表達隨著PTRC控制下的外來抗原的過量生產而增強。結果應該是RADS疫菌株具有足夠延遲的RAV表達，這是由於RAV載體上包含c2阻遏物基因以及在宿主染色體中包含突變1和2、3、5或6和7以及8或9(圖2)的緣故，這樣該疫苗株將在缺乏阿拉伯糖的環境中具有足夠的時間和生長機會附著、侵入和集結在淋巴器官中，而不管是鼻內給予還是口腔給予動物或人。實施例6
可將編碼各種病原體的抗原的環狀質粒DNA(即所謂的轉移質粒)引入動物宿主中，以刺激針對獲得所述抗原基因的病原體的免疫性的誘導(Ullmer等，ASMNEWS，62476-479，1996；Ullmer等，Curr.Opin.Immunol.，8531-787，1996；Whalen，Emerg.Infect.Dis.，2168-175，1996；Robinson，Vaccine，15785-536，1997)。DNA疫苗使用表達系統，這樣指定一些病原體的抗原的遺傳信息被免疫宿主使用轉錄和翻譯的宿主機制表達。這可能對病毒、真菌和寄生蟲抗原的表達特別重要，這些抗原常常被糖基化，但僅在真核宿主中合成時被糖基化，當在原核宿主如減毒的細菌抗原傳送宿主中表達時從未被糖基化。最初使用注射到肌肉組織中的DNA疫苗，但也使用注射到其它注射位點的DNA疫苗。最近，已使用顆粒槍給予的DNA疫苗，以加速包塗DNA的金珠進入皮膚或黏膜組織中。DNA疫苗載體在發酵罐中生長的重組大腸桿菌株中繁殖，並從重組大腸桿菌株分離。
Sizemore等(Science，270299-302，1995；Vaccine，15804-807，1997)描述了具有Δasd突變的弗氏志賀氏菌2a株15D的使用，該株具有經工程加工以表達大腸桿菌β-半乳糖苷酶的DNA疫苗載體。由於在侵入真核細胞中後因缺乏二氨基庚二酸而導致死亡的Δasd突變的緣故，該志賀氏菌株被減毒。該菌株在培養物中的真核細胞的胞質內或在免疫小鼠附著、侵入和裂解後，能在細胞內傳送DNA疫苗載體。最近，其他人已使用具有DNA疫苗載體的鼠傷寒沙門氏菌株，並採用自發的或動物宿主依賴性的方法引起裂解(Powell等，WO96/34631，1996；Pascal等，Behring.Inst.Mitt.，98143-152，1997；Darji等，Cell，91765-775，1997)。在裂解是自發進行的例子中，需要細菌株具有使該菌株減毒的一種或多種缺失突變。已知志賀氏菌、沙門氏菌和侵入性大腸桿菌具有大幅度增強的附著和侵入覆蓋GALT的M細胞的能力，而不是附著和侵入腸上皮細胞(腸細胞)的能力。在都具有M細胞層的NALT、BALT、CALT或GALT內傳送外來抗原或生產外來抗原導致黏膜免疫反應的誘導以及全身性免疫。因為黏膜免疫反應是針對集結在或侵入黏膜表面的大量的傳染病製劑的保護性措施，所以期望DNA疫苗載體可由沙門氏菌、志賀氏菌、大腸桿菌或這些屬中任何兩種之間的雜交體傳送。這些微生物將具有優異的附著和侵入覆蓋NALT、CALT、BALT和GALT的淋巴組織的M細胞的能力，在那裡它們將得以接近抗原呈遞細胞，如巨噬細胞和樹突狀細胞。由於免疫反應與免疫個體所暴露的抗原的劑量成或多或少的比例，所有期望增加要在真核細胞中表達的外來抗原的編碼序列的拷貝數的傳送DNA疫苗載體的方法，有利於使免疫反應最大程度地誘導。實際上，僅約2％的接受了DNA疫苗載體的真核細胞在功能上表達插入該DNA疫苗載體中的外來基因編碼的基因產物。因此，使用為僅在真核細胞而不在原核細胞中表達插入的外源基因使送修改的逃逸型載體的減毒RADS會明顯地改善DNA疫苗載體免疫的效率。
過去，我們已經使用從市售的pCMV β和pVAX-1得到的DNA疫苗載體，並用鼠傷寒沙門氏菌asd基因替換藥物抗性基因，以減徑作為疫苗的一部分的抗生素抗性基因引入免疫動物和人宿主中的擔心。但在本例中，重要的是設計具有RAV的RADS，以便該系統在質粒載體的逃逸型擴增後將在真核細胞內、在免疫的宿主動物內發生裂解。因此，圖12和實施例5中所描述具有araCPBADP22c2SDGTG asd盒的質粒載體將作為起始質粒構建物。具有突變1即ΔasdA19∷araCPBADc2突變/插入(圖2)的細菌細胞中這種RAV的維持依賴於在阿拉伯糖存在的環境中的生長。在缺乏阿拉伯糖的條件下，逃逸型複製啟動，但Asd酶的合成還是停止，由於無能力合成DAP的緣故使細胞壁削弱。由於DAP轉化成蛋白質合成所需的賴氨酸，DAP庫也快速耗盡了。應指出的是，圖12所述具有質粒的細菌細胞中產生的Asd酶分子的量僅僅足以在加入的DAP缺乏的情況下維持生存。這是由於GTG起始密碼子的緣故而導致asd編碼序列的翻譯效率低。為了構建適合用作轉移RAV的轉移載體，除去PTRC MCS 5S T1T2轉錄終止子盒，用從市售的DNA疫苗載體pVAX-1得到的pCMV MCS牛生長激素多腺苷酸化規格將其替換。從修改的pMEG-771得到的轉移載體如圖22所描述。這種轉移RAV可被引入各種減毒的細菌株中，以產生RADS。該細菌宿主株將具有突變1和2(圖2)，並且根據逃逸型複製的表型表達中所需的延遲水平，該株還可具有突變3、5或6和7(圖2)。為了使該細菌宿主株減毒，一個方法是使其包含減毒突變，如突變8或9(圖2)，雖然也可採用其他各種各樣的減毒突變。當細菌裂解釋放出轉移載體時，如圖22所述的轉移RAV，將遇到周質空間中存在的內切核酸酶I，此酶可以將環狀的質粒DNA切割成線狀的片段，之後該線狀片段受到核酸外切消化。因此，我們克隆了編碼鼠傷寒沙門氏菌SL1344株x 3339的內核酸切酶I的endA基因，得到確定的內部缺失，並構建了一種自殺性載體，稱為pMEG-776，如圖23所述。這種自殺性載體具有產生pMEG-776的pMEG-375(圖3)的所有特徵，並使本領域熟練的技術人員能使用上述方法，通過等位基因替換，將ΔendA突變引入將用於傳送轉移RAD的細菌宿主株的染色體中。
使用Pcmv啟動子後的多克隆位點(MCS)，將圖22中的轉移RAV修改成插入編碼外來抗原的序列。這些外來抗原的基因較佳是從病毒、真菌和寄生蟲病原體獲得，它們在真核宿主內的表達可能將得益於該真核宿主的翻譯後修飾機制。這對於保護性抗原來說特別重要，這類抗原將進行翻譯後修飾，如糖基化。
編碼圖22中所述類型的轉移載體的外來抗原還可由非減毒的細菌宿主生產，如僅具有突變1和2(圖2)但具有消除周質空間中內切核酸酶I的存在的endA3突變的大腸桿菌株。這種構建物可在發酵罐中在阿拉伯糖的存在下生長，逃逸型複製可在去除和/或完全利用阿拉伯糖之後發生，以產生非常大量的質粒DNA，可收集這種DNA，並將其用作如上述通過注射、顆粒槍等進行傳送的DNA疫苗。一個重要的特徵是抗生素抗性基因的缺乏，這種基因可能排除DNA疫苗被發酵罐中細菌繁殖期間使用的抗生素汙染的可能性。
圖22中描述的這類DNA疫苗載體的另一重要利益是存在獨特的CpG序列，該序列已顯示出增強免疫反應(Krieg，J.Lab.Clin.Med.，128128-133，1996)。在許多實驗室中進行的研究已發現，某些CpG序列對於刺激導致高抗體生產的B細胞反應特別重要。為此，許多DNA疫苗載體中含有的卡那黴素的抗生素抗性基因缺乏任何一種這些優選的CpG序列。另一方面，包含在本文所述的載體中的鼠傷寒沙門氏菌asd基因具有兩個天然的CpG序列，該序列強烈地增強DNA疫苗載體的免疫原性。此外，P22 c2基因序列含有額外的兩個天然的CpG序列，該序列也強烈地增強DNA疫苗載體的免疫原性。因此，圖22中所述的轉移RAV具有增強克隆到載體中並在免疫的動物宿主的真核細胞中表達的外源基因的免疫原性的大量特徵。美國專利第5840483中描述了這些DNA疫苗載體中鼠傷寒沙門氏菌asd基因的使用。
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權利要求
1.一種微生物，它含有調節性抗原傳送系統(RADS)，其中，該RADS包括
(a)一種載體，該載體含有(1)插入編碼所需的基因產物的基因的位點，(2)使用DNA聚合酶III產生載體複製的第一複製起點(ori)，和(3)使用DNA聚合酶I產生載體複製的第二起點；
其中，所述第二起點可操作性地連接於可被第一阻遏物抑制的第一控制序列，其中逃逸型載體不含有噬菌體裂解基因；
(b)一種基因，它編碼可操作性地連接於第一可激活的控制序列的第一阻遏物。
2.如權利要求1所述的微生物，其特徵在於，所述微生物還含有一種編碼插入步驟(a)的位點中的所需基因產物的基因，其中該編碼所需基因產物的基因可操作性地連接於第二控制序列。
3.如權利要求2所述的微生物，其特徵在於，所述第一控制序列和第二控制序列是相同的序列。
4.如權利要求2所述的微生物，其特徵在於，所述第一控制序列和第二控制序列是不同的序列。
5.如權利要求1所述的微生物，特徵在於，所述阻遏物選自LacI阻遏物和C2阻遏物，所述第二控制序列可被第二阻遏物抑制。
6.如權利要求2所述的微生物，其特徵在於，
(a)所述載體是質粒；
(b)所述所需基因產物是抗原；
(c)所述微生物是致病菌的減毒衍生物。
7.如權利要求6所述的微生物，其特徵在於，所述微生物是沙門氏菌屬。
8.如權利要求6所述的微生物，其特徵在於，所述第一可激活的控制序列是araCPBAD。
9.如權利要求6所述的微生物，其特徵在於，所述微生物還含有平衡致死宿主-載體系統，該系統在染色體上缺乏功能必需基因，在載體上存在該必需基因的重組功能拷貝。
10.如權利要求9所述的微生物，其特徵在於，所述必需基因是asd基因。
11.如權利要求10所述的微生物，其特徵在於，所述asd基因被插入的可操作性連接於araCPBAD的阻遏物基因滅活。
12.如權利要求6所述的微生物，其特徵在於，所述微生物還含有選自cya、crp、phoPQ、ompR、galE、cdt、hemA、aroA、aroC、aroD和htrA的天然基因中的滅活性突變。
13.如權利要求6所述的微生物，其特徵在於，所述第一起點是pSC起點，所述第二起點是pUC起點。
14.如權利要求6所述的微生物，其特徵在於，所述第一控制序列是P22 PR，所述第一阻遏物是C2阻遏物。
15.如權利要求6所述的微生物，其特徵在於，所述第二控制序列是Ptrc，所述第二控制序列可被第二阻遏物抑制，所述第二阻遏物是LacI阻遏物。
16.如權利要求15所述的微生物，其特徵在於，所述第一控制序列是P22 PR，所述第一阻遏物是C2阻遏物，所述第一起點是pSC起點，所述第二起點是pUC起點。
17.如權利要求16所述的微生物，其特徵在於，所述載體是具有編碼抗原的基因的pMEG-771或其修飾物。
18.如權利要求6所述的微生物，其特徵在於，所述抗原選自Ery65和SeM。
19.如權利要求6所述的微生物，其特徵在於所述所需基因產物可操作性連接於真核的控制序列。
20.如權利要求19所述的微生物，其特徵在於，所述微生物還含有ΔendA突變。
21.一種逃逸型載體，它含有權利要求19的微生物中的載體。
22.如權利要求6所述的微生物，它具有延遲型RADS特徵，其特徵在於，所述延遲型RADS的特徵由選自下述的改變而賦予延遲由代謝和/或滲漏而產生的激活子分子丟失的突變； 增加阻遏物濃度的突變或插入；包含具有一種以上阻遏物的結合位點的載體控制序列和/或編碼作用於載體控制序列的阻遏物分子的載體序列。
23.一種生產所需的基因產物的方法，該方法包括以下步驟
(a)將編碼所需基因產物的基因工程改造到權利要求6所述的微生物的載體中，其中，該微生物含有在第一環境條件下抑制第二起點表達的控制序列，但該第二起點在第二環境條件下的表達被去抑制；
(b)在第一環境條件下培育步驟(a)的微生物；
(c)在第二環境條件下培育具有步驟(a)的逃逸型載體的微生物一段足以產生所需的基因產物的時間。
24.如權利要求23所述的方法，其特徵在於，所述所需的基因產物是抗原。
25.如權利要求24所述的方法，其特徵在於，所述第一環境條件包括存在阿拉伯糖，所述第二環境條件包括缺乏阿拉伯糖。
26.如權利要求25所述的方法，其特徵在於，所述第一環境條件包括體外培育條件，所述第二環境條件包括在脊椎動物內的培育條件。
27.如權利要求26所述的方法，其特徵在於，
(a)所述第一起點是pSC起點；
(b)所述第二起點是pUC起點，該起點可操作性地連接於由P22 PR組成的阻遏控制序列；
(c)所述產物控制序列是Ptrc；
(d)所述微生物包含編碼可操作性地連接於第一可激活的控制序列的第一阻遏物的基因，其中，所述第一阻遏物是C2；
(e)所述微生物包含編碼可操作性地連接於第二可激活的控制序列的第二阻遏物的基因，其中，所述第二阻遏物是LacI；
(f)所述微生物包含沒有功能性asd基因的染色體，所述逃逸型載體包含功能性asd基因；
(g)所述微生物包含選自cya、crp、phoPQ、ompR、galE、cdt、hemA、aroA、aroC、aroD和htrA的天然基因中的滅活性突變。
28.如權利要求27所述的方法，其特徵在於，所述第一環境條件包括存在阿拉伯糖，所述第二環境條件包括缺乏阿拉伯糖。
29.如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述微生物還包括araCBAD操縱子和/或araE基因中的滅活性缺失。
30.如權利要求29所述的方法，其特徵在於，所述所需基因產物選自Ery65和SeM。
31.如權利要求29所述的方法，其特徵在於，所述所需的基因產物可操作性地連接於真核的控制序列。
32.一種用於免疫脊椎動物的疫苗，所述疫苗含有在藥學上可接受的載體中的權利要求6所述的微生物。
33.如權利要求32所述的疫苗，其特徵在於，所述微生物是沙門氏菌屬。
34.如權利要求32所述的疫苗，其特徵在於，
(a)所述第一起點是pSC起點；
(b)所述第二起點是pUC起點，該起點可操作性地連接於由P22 PR組成的阻遏控制序列；
(c)所述產物控制序列是Ptrc；
(d)編碼可操作性地連接於第一可誘導的控制序列的第一阻遏物的基因，其中，所述第一阻遏物是C2；
(e)編碼可操作性地連接於第二可誘導的控制序列的第二阻遏物的基因，其中，所述第二阻遏物是LacI。
35.如權利要求34所述的疫苗，其特徵在於，所述第一可激活的控制序列和第二可誘導的控制序列都是araCPBAD。
36.如權利要求35所述的疫苗，其特徵在於，所述微生物還包含araCBAD操縱子和/或araE基因中的滅活性缺失。
37.一種誘導脊椎動物中的免疫保護的方法，該方法包括對該脊椎動物給予權利要求32所述的疫苗。
38.一種將所需的基因產物傳送給脊椎動物的方法，該方法包括對該脊椎動物給予權利要求1所述的微生物。
全文摘要
我們描述了一種調節性抗原傳送系統(RADS)，它具有(a)一種載體，該載體含有(1)編碼可操作性地連接於控制序列的所需的基因產物的基因，(2)使用DNA聚合酶III產生載體複製的第一複製起點(ori)，和(3)使用DNA聚合酶I產生載體複製的第二複製起點；其中，第二複製起點可操作性地連接於可被阻遏物抑制的控制序列。該RADS微生物還具有編碼一種阻遏物的基因，該基因可操作性地連接於可激活的控制序列。所述RADS在對高拷貝數複製起點的抑制提高後提供了高水平的所需基因產物。該RADS特別可用作活的細菌疫苗。本文還描述了一種延遲型RADS系統，在該系統中在該拷貝數起點被表達之前在抑制提高後有一個延遲。延遲型RADS還特別用作活的細菌疫苗。還描述了用於這些系統的幾種控制元件，以及在用RADS微生物免疫的脊椎動物中提供針對病原體的免疫性的方法。
文檔編號C12N15/63GK1433474SQ0181053
公開日2003年7月30日 申請日期2001年4月30日 優先權日2000年4月28日
發明者R·柯蒂斯三世, S·A·廷格 申請人:華盛頓大學, 梅根保健股份有限公司