預測患者治療藥物耐受性的體外試驗系統的製作方法

2023-05-31 17:48:01 1

專利名稱：預測患者治療藥物耐受性的體外試驗系統的製作方法
技術領域：
本發明一般涉及體外分析方法。具體地說，本發明涉及預測患者對特定治療藥物，包括免疫治療藥物如IL-2突變蛋白的耐受能力的方法。
背景技術：
白介素-2(IL-2)是天然殺傷細胞(NK)和T-細胞增殖和功能的強效刺激物(Morgan等，(1976)，Science 1931007-1011)。這種天然存在的淋巴因子單獨或與淋巴因子激活的殺傷(LAK)細胞或腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)聯合(使用)顯示對各種惡性腫瘤具有抗腫瘤活性(參見，例如Rosenberg等，(1987)，N.Engl.J.Med.，316889-897；Rosenberg，(1988)，Ann.Surg.，208121-135；Topalian等，(1988)，J.Clin.Oncol.6839-853；Rosenberg等，(1988)，N.Engl.J.Med.，3191676-1680；和Weber等，(1992)，J.Clin.Oncol.，1033-40)。在轉移性黑色素瘤和腎細胞癌患者中，當使用Proleukin(一種從Chiron Corporation，Emeryville，CA商品化可購得的IL-2製劑)時，IL-2的抗腫瘤活性得到最充分的描述。其它疾病，包括淋巴瘤也顯示對IL-2治療有反應(Gisselbrecht等，(1994)，Blood，83(8)2020-2022)。
也可使用具有抗腫瘤活性的許多其它治療藥物來治療癌症。這些藥物包括白介素如IL-3、IL-4、幹擾素(IFN)-α、GM-CSF、抗神經節苷抗體、環孢素A、環磷醯胺、絲裂黴素C、FK973、野百合鹼吡咯和阿糖胞苷；以及許多免疫毒素，例如由蓖麻毒蛋白A鏈(RTA)、封端的蓖麻毒蛋白(blR)、皂草素(SAP)、美洲商陸抗病毒蛋白(PAP)和假單胞菌外毒素(PE)構建的免疫毒素。
然而，許多這些治療劑的治療應用受到其差的耐受性和毒性的限制。例如，高劑量IL-2免疫治療常伴隨著嚴重的毒副作用，最顯著的有血管滲漏症候群(VLS)、嚴重的流感樣症狀(發熱、寒顫、嘔吐)、低血壓和神經變化(參見，例如Duggan等，(1992)，J.Immunotherapy，12115-122；Gisselbrecht等，(1994)，Blood，832081-2085；和Sznol與Parkinson，(1994)，Blood，832020-2022)。採用如上所述的其它化學治療藥物時也可觀察到VLS。VLS的機制可能是由於活化的PBMC與內皮細胞相互作用所介導的內皮損傷。細胞因子、炎症介質或藥物固有的結構基序的產生(Baluna和Vitetta(1997)Immunopharmacology 37117-132；Baluna等，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 963957-3962)。雖然尚不清楚毒性和VLS的確切機制，但累積的數據提示，由於激活單核細胞/巨噬細胞的致炎細胞因子如IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-1β和IL-6的過度產生，IL-2-誘導的天然殺傷(NK)細胞觸發了劑量限制性毒性(DLT)，誘導一氧化氮(NO)產生，導致後續內皮細胞的損傷(Dubinett等，1994；Samlowski等，1995)。
已開發了幾種IL-2突變蛋白用來克服天然分子所顯示的毒性。這些突變蛋白的例子參見2004年3月5日提交的共同擁有、共同待批的美國臨時專利申請序列號60/550,868。
已開發了體外模型，用來檢測VLS的機制。例如，Damle和Doyle在J.Bacteriol.(1989)1422660-2669中描述了一種體外試驗系統，用來檢測IL-2-活化的殺傷(IAK)淋巴細胞和許多細胞因子對穿過內皮細胞單層的經內皮大分子通量的作用。該系統測定穿過人臍帶內皮細胞的FITC-白蛋白通量。Kotasek等，Cancer Res.(1988)485528-5532描述了一種體外試驗，用來測定淋巴因子活化的細胞介導的細胞毒機制，也採用內皮細胞單層。Lindstrom等，Blood(1997)902323-2334，描述了一種用於毒素介導的VLS的體外模型，採用生長在微孔支持物上，並在存在或不存在蓖麻毒蛋白毒素A鏈的情況下，低壓下培養的人內皮細胞。
雖然採用了這些試驗系統來研究VLS的機制，但迄今尚未採用這些系統來預測患者對各種治療，例如採用修飾的淋巴因子和化學治療免疫毒素的免疫治療的耐受性。
發明概述本發明提供一種用於預測患者對特定治療藥物如免疫治療藥物的耐受能力的簡單有效的體外分析方法，從而預測這種分子的治療應用。該方法利用檢測蛋白質通過內皮細胞單層的滲漏的分析系統，作為受試治療耐受性的預測因子。這種分析尤其適合在人體中預測各種免疫治療的耐受性，因為人的DLT(發熱/寒顫，VLS和低血壓)都與致炎細胞因子和一氧化氮(NO)的產生具有衍生相關性。
因此，在一個實施方式中，本發明涉及一種預測患者對選定治療藥物耐受或不耐受的體外方法。該方法包括(a)提供貼附於粘附基質的內皮細胞的融合單層；(b)使該單層與以下成分接觸(i)選定的治療藥物或淋巴因子活化的殺傷(LAK)細胞製劑，其中，通過用治療藥物或LAK細胞的上清液激活外周血單核細胞產生LAK細胞；和(ii)可檢測的標記大分子，其中，當融合單層保持完整時，所述融合單層可基本上保留該可檢測的標記大分子；(c)在該單層的完整性受損時，可檢測的標記大分子能通過該融合單層和粘附基質的條件下，孵育步驟(b)的單層一段時間；和(d)檢測穿過融合單層和粘附基質的大分子，作為患者對特定治療藥物耐受或不耐受的指標。
在該方法的某些實施方式中，治療藥物是免疫治療劑如IL-2突變蛋白，或免疫毒素，或小分子化學治療劑。
在其它實施方式中，本方法中使用的粘附基質包括膠原基質。
在又一些實施方式中，本方法中使用的內皮細胞是人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)。
在其它實施方式中，本方法中使用的可檢測的標記大分子是可檢測的標記白蛋白，例如標記的牛血清白蛋白(BSA)。BSA可被螢光標記，例如用FITC標記。
在又一些其它的實施方式中，本發明涉及預測患者對IL-2突變蛋白耐受或不耐受的體外方法。該方法包括(a)提供貼附於粘附基質的內皮細胞融合單層；(b)使該單層與以下成分接觸(i)淋巴因子活化的殺傷(LAK)細胞製劑，其中，通過用IL-2突變蛋白激活外周血單核細胞產生LAK細胞，和(ii)可檢測的標記大分子，其中，融合單層保持完整時，所述融合單層可基本上保留該可檢測的標記大分子；(c)在該單層的完整性受損時，可檢測的標記大分子能通過該融合單層和粘附基質的條件下，孵育步驟(b)的單層一段時間；和(d)檢測穿過融合單層和粘附基質的大分子，作為患者對IL-2突變蛋白耐受或不耐受的指標。
在某些實施方式中，本方法中使用的粘附基質包括膠原基質。
在另一些實施方式中，本方法中使用的內皮細胞是人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)。
在其它實施方式中，本方法中使用的可檢測的標記大分子是可檢測的標記白蛋白，例如標記的BSA。BSA可被螢光標記，例如用FITC標記。
在另一個實施方式中，本發明涉及預測患者對IL-2突變蛋白耐受或不耐受的體外方法。該方法包括(a)提供貼附於粘附基質如膠原基質的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的融合單層；(b)使該單層與以下成分接觸(i)淋巴因子活化的殺傷(LAK)細胞製劑，其中，通過用IL-2突變蛋白激活外周血單核細胞產生LAK細胞，和(ii)螢光標記的白蛋白；(c)在該單層的完整性受損時，標記螢光白蛋白能通過該融合單層和粘附基質的條件下，孵育步驟(b)的單層一段時間；和(d)檢測穿過融合單層的螢光標記的白蛋白，作為患者對IL-2突變蛋白耐受或不耐受的指標。
在其它實施方式中，螢光標記的白蛋白是BSA。BSA可被螢光標記，例如用FITC標記。
參考本說明書，本領域技術人員容易明白本發明的這些和其它實施方式。
附圖簡要說明

圖1A-1C描述了在分別來自三位不同對象的刺激培養物上清液的存在下，採用25nM IL-2突變蛋白-刺激的LAK細胞進行實驗的結果。使用螢光強度作為與LAK細胞和上清液孵育22小時後，FITC-BSA穿過HUVEC單層的遷移測定指標。*與培養液對照相比，P值＜0.1，t檢驗配對比較兩樣品的平均值(n＝5)；$與Proleukin相比，P值＜0.1，t檢驗配對比較兩樣品的平均值(n＝5)；與F42E相比，P值＜0.1，t檢驗配對比較兩樣品的平均值(n＝5)；@與rIL-2相比，P值＜0.1，t檢驗配對比較兩樣品的平均值(n＝5)。
圖2A-2C描述了採用分別來自三位不同對象的25nM IL-2突變蛋白-刺激的LAK細胞進行實驗的結果。使用螢光強度作為與不含上清液的LAK細胞孵育22小時後，FITC-BSA穿過HUVEC單層的遷移測定指標。*與培養液對照相比，P值＜0.1，t檢驗配對比較兩樣品的平均值(n＝5)；$與Proleukin相比，P值＜0.1，t檢驗配對比較兩樣品的平均值(n＝5)；與F42E相比，P值＜0.1，t檢驗配對比較兩樣品的平均值(n＝5)；@與rIL-2相比，P值＜0.1，t檢驗配對比較兩樣品的平均值(n＝5)。
圖3A-3C顯示了採用分別來自三位不同對象的25nM IL-2突變蛋白-刺激的LAK細胞的上清液進行實驗的結果。使用螢光強度作為與上清液孵育22小時後，FITC-BSA穿過HUVEC單層的遷移測定指標。*與培養液對照相比，P值＜0.1，t檢驗配對比較兩樣品的平均值(n＝5)；$與Proleukin相比，P值＜0.1，t檢驗配對比較兩樣品的平均值(n＝5)；與F42E相比，P值＜0.1，t檢驗配對比較兩樣品的平均值(n＝5)；@與rIL-2相比，P值＜0.1，t檢驗配對比較兩樣品的平均值(n＝5)。
圖4A-4C顯示了採用25nM IL-2突變蛋白進行三次獨立實驗的結果。使用螢光強度作為與IL-2孵育22小時後，FITC-BSA穿過HUVEC單層的遷移測定指標。*與培養液對照相比，P值＜0.1，t檢驗配對比較兩樣品的平均值(n＝5)；$與Proleukin相比，P值＜0.1，t檢驗配對比較兩樣品的平均值(n＝5)；與F42E相比，P值＜0.1，t檢驗配對比較兩樣品的平均值(n＝5)；@與rIL-2相比，P值＜0.1，t檢驗配對比較兩樣品的平均值(n＝5)。
發明詳述除非另有說明，本發明的實施採用本領域內藥理學、化學、生物化學、重組DNA技術、免疫學的常規技術。文獻中詳細解釋了這些技術。例如，參見《實驗免疫學手冊》(Handbook of Experimental Immunology)，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell編，Blackwell Scientific Publications)；A.L.Lehninger，Biochemistry(Worth Publishers，Inc.，目前的附刊)；Sambrook等，Molecular CloningA LaboratoryManual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan編，Academic Press，Inc.)。
I.定義為了描述本發明，將採用以下術語，其定義如下所述。
應當注意，如說明書和權利要求書所述，除非內容中清楚地另行指出，單數形式「一」、「一個」和「這個」包括複數形式。因此，例如，「一細胞」包括兩個或多個細胞，等等。
術語「包含」涵蓋了「由……組成」和「含有」，例如，組合物「包含」X可以是只由X構成，或是包含一些其它成分，例如X+Y。
術語「基本上」不排除「完全」，例如，組合物「基本上不含」Y可以是完全不含Y。必要時，本發明定義中可省略「基本上」。
術語「來源於」在這裡指分子的來源，而不限於分子製備的方法(例如，化學合成或重組方法)。
術語「免疫治療劑」在這裡指可用於治療癌症的免疫促進劑或免疫抑制劑。這些藥劑包括但不限於各種細胞因子和淋巴因子，例如各種白介素，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-12和這些分子的突變蛋白；幹擾素，包括但不限於IIFN-α、IFN-β、IFN-γ及其突變蛋白；集落刺激因子如GM-CSF和GM-CSF的突變蛋白；腫瘤壞死因子，例如TNF-α和TNF-β及這些分子的突變蛋白。術語「免疫治療劑」還包括免疫毒素。「免疫毒素」指抗體-毒素偶合物，用於破壞具有與該抗體同源的抗原的特定靶細胞(例如，腫瘤細胞)。與這種抗體偶合毒素的例子包括但不限於蓖麻毒蛋白A鏈(RTA)、封端的蓖麻毒蛋白(blR)、皂草素(SAP)、美洲商陸抗病毒蛋白(PAP)和假單胞菌外毒素(PE)，以及其它毒性化合物，例如放射性同位素和其它化學治療藥物。
術語「IL-2」在這裡指來源於淋巴因子的蛋白質，淋巴因子由正常外周血淋巴細胞產生，體內低濃度存在。IL-2首先由Morgan等，(1976)，Science，1931007-1008描述，由於它能誘導激活的T淋巴細胞增殖而最初稱為T細胞生長因子。這是一種報導分子量為13,000-17,000的蛋白質(Gillis和Watson，(1980)，J.Exp.Med.，1591709)，其等電點為6-8.5。該定義包括全長度IL-2蛋白及其生物學活性片段，該術語還包括IL-2的表達後修飾，例如，糖基化、乙醯化、磷酸化等。
術語「突變蛋白」在這裡指包括修飾的蛋白質，例如，對原有序列的刪除、去頭、添加和取代。一般，該蛋白質保持生物學活性，即抗腫瘤活性。這些修飾可以是精心設計的，例如通過定向誘變，或是意外的，例如通過產生該蛋白質的宿主的突變或由於PCR擴增的誤差。術語「突變蛋白」可與術語「變體」和「類似物」互換使用。這些突變蛋白的胺基酸序列與參比序列具有高度序列同源性，例如，當兩個序列比對時，胺基酸序列同源性大於50％，通常大於60-70％，甚至大於80-85％或以上，例如至少90-95％或以上。常常，類似物包括相同數量的胺基酸但包括取代物，如本文所述。製備多肽突變蛋白的方法是本領域已知的，如下所述。
突變蛋白包括性質上保守性或非保守性的取代。保守性取代指發生在與其側鏈相關的胺基酸家族中的取代。具體地說，胺基酸通常分為四個家族(1)酸性--天冬氨酸和穀氨酸；(2)鹼性--賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性--丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；和(4)不帶電荷的極性--甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時也可歸類為芳香族胺基酸。例如，可合理地預測，用異亮氨酸或纈氨酸獨立地取代亮氨酸，用穀氨酸獨立地取代天冬氨酸，用絲氨酸獨立地取代蘇氨酸，或用結構上相關的胺基酸類似地保守性取代一個胺基酸，將不會對生物學活性有重大影響。例如，感興趣的蛋白質可包括多達約5-10個保守性或非保守性胺基酸取代，或甚至多達約15-25個、50個或75個保守性或非保守性胺基酸取代，或5-75之間的任何整數，只要不影響該分子的所需功能。本領域技術人員容易確定感興趣的蛋白質耐受改變的區域。
術語「突變蛋白」也指天然分子的衍生物。「衍生物」指感興趣天然多肽、天然多肽片段或它們各自的類似物的任何合適的修飾，例如糖基化、磷酸化、聚合物偶聯(如與聚乙二醇偶聯)或加入其它外來成分的類似物，只要保留天然多肽所需的生物學活性。製備多肽片段、類似物和衍生物的方法是本領域公知的。
「片段」指僅由完整全長序列和結構的一部分所形成的分子。片段包括天然多肽的C-端刪除、N-端刪除和/或中間刪除。特定蛋白質的活性片段通常包括至少約5-10個全長分子的連續胺基酸殘基，優選至少約15-25個全長分子的連續胺基酸殘基，最優選至少約20-50或更多個全長分子的連續胺基酸殘基，或5個胺基酸與全長序列之間的任何整數，只要感興趣片段保留生物學活性，例如抗腫瘤活性，如本文所述。
當指多肽時，「分離的」表示所指的分子與完整生物體(該分子在自然界中在該生物體中被發現)離析並分開，或該分子以基本上不存在相同類型的其它生物大分子的狀態存在。指多核苷酸時，術語「分離的」指全部或部分地缺少天然狀態下與其正常相關的序列的核酸分子；或自然存在，但具有與其相關的異源序列的序列；或從染色體解離的分子。
術語「細胞培養」和「組織培養」可互換使用，指在液體介質的懸浮培養液中，或在具有液體介質的表面如玻璃、塑料、瓊脂或其它合適的基質上，體外維持細胞。一般來說，「細胞培養」需要緩衝以維持恆定適當pH的介質。通常配製細胞培養中使用的介質，以包含足夠的必需營養物質，且滲透壓調節到適合需維持的特定細胞，溫度和氣體也控制在合適的範圍內。細胞培養技術是本領域已知的。例如，參見Morgan等，Animal Cell Culture，BIOS Scientific Publishers，Oxford，UK(1993)，和Adams，R.L.P.Cell Culture for Biochemists，第2版，Elsevier(I990)。
術語「內皮細胞」在這裡指來源於心臟空腔和血管和淋巴管細胞最內層的分化的扁平細胞。內皮細胞來源於中胚層胚胎細胞層。
內皮細胞的例子如下所述。
「外周血單核細胞」或「PBMC」指採用例如密度離心，從哺乳動物如人的外周血分離的細胞群。通常，PBMC群包括大多數淋巴細胞和單核細胞，不包括血紅細胞和大多數多形核白細胞和粒細胞。
「代」指傳代培養細胞群的行為。「傳代培養」指用上一次培養的樣品接種新鮮無菌培養液建立的細胞培養。每次重複的傳代培養計為一次傳代。
本發明分析中使用的合適的「大分子」是足夠大的大分子，除非單層破裂，融合單層可基本上保留該大分子，從而提高大分子通過融合單層的滲透性。「提高」的滲透性指與不存在破裂試劑(即用導致血管滲漏症候群的免疫治療劑刺激LSK細胞)條件下轉運通過單層相比，轉運通過單層的大分子的量更大，速率更快。尤其有用的大分子包括血清白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白、鑰孔血藍蛋白、免疫球蛋白分子、甲狀球蛋白及本領域技術人員已知的其它蛋白質。
如本文所用，術語「標記」和「可檢測的標記」指能夠檢測的分子，包括但不限於，放射性同位素、螢光劑、半導體納米結晶、化學發光物質、發色團、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑、染料、金屬離子、金屬溶膠、配基(例如，生物素、抗生蛋白鏈菌素或半抗原)等。術語「螢光劑」指在檢測範圍內能夠顯示螢光的物質或其一部分。本發明中可使用的標記的具體例子包括但不限於辣根過氧化物酶(HRP)，螢光素化合物如稱為「FITC」的螢光素5(6)-異氰酸酯或螢光素異氰酸酯異構體I，羅丹明、丹醯、羥基香豆素、二甲基吖啶鎓酯(DMAE)、德克薩斯紅、魯米諾、NADPH和α-β-半乳糖苷酶。
II.實施本發明的方式在詳細描述本發明之前，應理解本發明並不限於這些具體製劑或方法參數，這些製劑或方法參數可變化。還應理解，本文所用術語僅僅是為了描述本發明的具體實施方式
，而不是限制性的。
雖然可採用許多與本發明所述類似或等價的方法和材料來實施本發明，本文描述了優選的材料和方法。
如上所述，採用免疫療法如IL-2療法來治療各種癌症，例如轉移性黑色素瘤、腎細胞癌和淋巴瘤。但是，與免疫療法相關的嚴重毒性限制了這些治療方法，例如血管滲漏症候群(VLS)、嚴重的流感樣症狀(發熱、寒顫、嘔吐)、低血壓、神經變化、一氧化氮(NO)產生，導致後續內皮細胞的損傷。因此，製備了許多免疫治療劑的突變蛋白，如淋巴因子突變蛋白，希望能夠克服上述副作用。本發明提供了試驗這些突變蛋白，和其它治療劑的體外方法，來預測毒性。
具體地說，本發明基於以下發現體外方法可用於精確和有效地預測患者對採用特定IL-2突變蛋白的耐受能力，而不發生當患者經歷IL-2免疫療法時所產生的常見副作用。該分析方法利用體外內皮滲透性模型來監測大分子通過融合內皮細胞單層的滲漏。該分析中使用的大分子一般被融合單層保留，或僅少量洩漏。然而，當細胞單層的完整性受到損傷時，例如，暴露於可引起血管滲漏症候群的治療藥物，或暴露於由引起血管滲漏症候群等的治療藥物刺激產生的LAK細胞(或其上清液)，大分子的內皮滲透性增加。
本分析方法尤其適用於預測人對各種基於淋巴因子的免疫療法如IL-2免疫療法的耐受性，因為人的DLT(發熱/寒顫，VLS和低血壓)都與致炎細胞因子和NO具有衍生相關性。
本領域已知許多滲透性試驗，可用於檢測治療藥物如IL-2突變蛋白。例如，參見Damle和Doyle，J.Bacteriol.(1989)1422660-2669；Kotasek等，Cancer Res.(1988)485528-5532；Stone-Wolff等，J Exp.Med.(1984)159828；Lindstrom等，Blood(1997)902323-2334。
一般來說，這些試驗採用具有融合單層的粘附基質，它通常允許可溶性營養物、代謝物和激素因子通過，但基本上阻止細胞遷移通過，除非融合單層的完整性受損。本發明試驗中採用的融合單層通常來自內皮細胞，例如血管和淋巴內皮細胞。這些細胞的例子包括但不限於人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，可根據例如Jaffe等，J.Clin.Invest.(1973)522745；Stroncek等，Arteriosclerosis(1986)1371735-1742所述的方法獲得，購自各供應商如美國標準培養菌種庫(ATCC)，Manassas，VA(例如商品目錄CRL-1730)和Cascade Biologics，Poland，OR；WB572細胞(自發轉化的人隱靜脈平滑肌細胞)；SV-E6細胞(穩定轉染E6病毒癌基因的人隱靜脈細胞)；A7R5細胞(自發轉化的大鼠胸主動脈平滑肌細胞；ATCC)；GH3B6細胞(大鼠腦垂體細胞；ATCC，Bethesda，Md.)；PVEC細胞(大鼠肺靜脈內皮細胞；J.Tissue CultureRes.(1986)109)；CPA47(牛內皮細胞；ATCC CRL 1733)；CPAE細胞(牛內皮細胞；ATCC CCL 209)；EJG細胞(牛內皮細胞；ATCC CRL 8659)；FBHE(牛內皮細胞；ATCC CRL 1395)；HW-EC-C細胞(人內皮細胞；ATCC CRL 1730)；和T/GHA-VSMC細胞(人血管平滑肌細胞；ATCC CRL 1999)。
在使用本發明試驗之前，在合適的培養液中常規傳代細胞並培養，如本領域技術人員所公知。例如，可在市售培養液，例如實施例所述的RPMI-10AB培養液；如Damel和Doyle，J.Bacteriol.(1989)1422660-2669所述的RPMI1640補給性培養液；如Lindstrom等，Blood(1997)902323-2334所述的M199補給性培養液；得自Cambrex，Baltimore，MD，含2％胎牛血清的內皮生長培養液以及本領域技術人員已知的其它組織培養介質中，培養內皮細胞。可使用其它因子，如內皮細胞生長因子(ECGF)、肝素等。例如，參見Thornton等，Science(1983)222623。使用前合適的代數可變化，取決於所用細胞系的期望壽命。通常，本發明中使用的HUVEC的代數為2-20代，優選3-10代，甚至更優選，少於5代，例如2、3、4代。
經過所需次數的傳代之後，將大約1×103-1×107，有效1×104-1×107，例如1×105-1×106的細胞加入到合適的粘附基質中。根據細胞類型，培養適當時間，得到融合單層。例如，HUVAC一般培養約1-7天，通常2-5天，例如1、2、3、4、5、6或7天，直到形成融合單層。可採用本領域已知的技術評價融合度，例如用結晶紫檢測。
本發明試驗中試驗的合適的基質包括膜支持物，例如用於組織培養的滲透性微孔薄膜，通常允許物質如可溶性營養物、代謝物和激素因子自由通過該膜，同時阻止細胞遷移通過該膜。例如，粘附支持物包括葡聚糖聚合物、聚氯乙烯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乳酸乙醇酸共聚物(polylactic coglycolic acids)和/或矽。通常，基質還可包括膠原、纖維蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白和/或透明質酸。這些支持物是本領域所公知的，例如，可購自Costar(Cambridge，MA)。一個例子是TrranswellTM支持物(例如，TRANSWELL-COL PTFE膜，膜厚度25-50μm，孔徑0.4-3.0μm，用來自牛胎盤的I型和II型膠原處理)。這些支持物允許物質從上室通過單層進入下室，在下室中收集和測定物質。然而，本發明方法可使用任何合適的滲透膜支持物，只要可監測通過單層的遷移。
融合單層一旦建立，在不存在試驗物質的情況下，將可檢測的標記大分子加入到單層(例如轉移孔支持物的上室)，以提供背景測定。可檢測的標記大分子的尺寸大到足以被融合單層保留，除非由於可使單層破裂的分子的存在而導致單層滲漏。如上所述，本發明方法中一般使用的大分子包括血清白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白、鑰孔血藍蛋白、免疫球蛋白分子、甲狀球蛋白及本領域技術人員已知的其它蛋白質。加入標記大分子之後，試驗進行15分鐘到幾個小時，例如，30分鐘到48小時，優選1小時到24小時，更優選2小時到12小時，例如1...2...3...4...5...6...7...8...12...20...24...40...48或更多個小時。例如，採用分光光度計，可檢測通過單層進入(例如)底室的標記分子，以提供基線測定。如果採用螢光標記，可使用螢光光度計測定螢光，表示為相對螢光單位。測定可以是定性或定量的。例如，可採用以下公式計算白蛋白清除白蛋白清除(μl)＝VL×A/L，其中，VL是取樣時的底室體積，A是取樣時每微升底室中的螢光單位，L是試驗開始時，每微升頂室中的螢光單位。通過線性回歸分析計算白蛋白的清除率(μl/分鐘)。例如，可測定清除(μl±SEM/分鐘)。
進行適當測定之後，除去任何殘留的標記大分子，將試驗化合物以及含標記大分子的培養液加入到頂孔中。例如，加入感興趣的治療藥物，或已用治療藥物刺激活化的LAK細胞(或其上清液)，以及對照，如下所述。採用選定的治療藥物以激活PBMC，通過活化外周血單核細胞(PBMC)，產生LAK細胞。可採用本領域公知的技術，例如採用Ficoll-Hypaque密度梯度離心，從全血分離用於激活的PBMC。離心後，通過在37℃下，粘附塑料的相繼循環持續45分鐘，粘附的單核細胞可與(但不必需)非粘附單核細胞(NAMNC)分離。為了製備活化細胞，聯合(使用)治療藥物和PBMC。加入的藥物量取決於特定的受試物質。因此，例如，當分析淋巴因子如IL-2突變蛋白時，突變蛋白的加入濃度為10-500nM，通常濃度為25-250nM，甚至更優選濃度為35-100nM。本領域技術人員可容易地確定合適的使用濃度。例如，參見Damle和Doyle，J.Bacteriol.(1989)1422660-2669；Damle等，J.Immunol.(1987)1381779；Damle和Doyle，Int.J.Cancer(1987)40519；Damle等，J.Immunol.(1986)1372814。
參考如上所述基線測定，進行試驗。可在多個時間點從底室取樣，測定存在的標記大分子。可進行各種對照，如下所述。具體地說，可使用具有改善的耐受性的治療藥物作為陰性對照，以建立不存在引起VLS的治療藥物時發生的基線滲漏。例如，IL-2突變蛋白F42E和Y107R是耐受性提高的取代突變蛋白。參見，2005年3月5日提交的共同擁有、共同待批的美國臨時專利申請序列號60/550,868。體內外模型中，就NK和T細胞增殖，以及NK/LAK/ADCC活性方面而言，這些突變蛋白也維持效應子作用。此外，可採用陽性對照，例如去汙劑和已知可破壞細胞單層的物質等，例如皂苷。還可使用培養液對照。
如上所述，使用本發明方法測定治療劑如IL-2突變蛋白的患者耐受性。已知許多IL-2突變蛋白，如下所述。然而，本發明方法也可應用於本文未具體描述的其它IL-2突變蛋白。這些IL-2突變蛋白可來源於任何種類的IL-2。這些變體應保留天然多肽所需的生物學活性，使得給予患者時，含變體多肽的藥物組合物具有與含天然多肽的藥物組合物相同的治療效果。即，變體多肽可以類似於天然多肽的方式，用作藥物組合物中的治療活性成分。本領域已知測定變體多肽是否保留所需的生物學活性的方法，因而可用作藥物組合物中的治療活性成分。可採用特別用於測定天然多肽或蛋白質活性的試驗來測定生物學活性。天然或天然來源的IL-2的合適的生物學活性突變蛋白可以是該多肽的片段、類似物以及衍生物，如上所述。
例如，可通過在編碼感興趣天然多肽的克隆DNA序列中產生突變來製備多肽的胺基酸序列變體。誘變和改變核苷酸序列的方法是本領域所所熟知的。例如，參見以下文獻Walker和Gaastra編，(1983)，《分子生物學技術》(Techniques in Molecular Biology)，(MacMillan Publishing Company，New York)；Kunkel，(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 82488-492；Kunkel等，(1987)，Methods Enzymol.，154367-382；Sambrook等，(1989)，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，(冷泉港實驗室出版社，Plainview，New York)；美國專利號4,873,192；和本文引用的參考文獻。不影響感興趣的多肽的生物學活性的合適胺基酸取代的指南可參見Dayhoff等，(1978)，在《蛋白質序列和結構圖》(Atlas of Protein Sequence andStructure)(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)中所述的模型。優選保守性取代，例如用具有相似性質的另一種胺基酸替換一種胺基酸。保守性取代的例子包括但不限於GlyAla、ValIleLeu、AspGlu、LysArg、AsnGln和PheTrpTyr。
可在專業文獻中找到殘基取代、刪除或插入來改變IL-2蛋白質諸區域的指導。例如，參見以下文獻所述的結構/功能關係和/或結合研究Bazan，(1992)，Science，257410-412；McKay，(1992)，Science，257412；Theze等，(1996)，Immunol.Today，17481-486；Buchli和Ciardelli，(1993)，Arch.Biochem.Biophys.，307411-415；Collins等，(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 857709-7713；Kuziel等，(1993)，J.Immunol.，1505731；Eckenberg等，(1997)，Cytokine，9488-498。
在構建感興趣IL-2多肽的變體的過程中，進行的修飾應使變體繼續具有所需活性。顯然，在編碼變體多肽的DNA中產生的任何突變不能將該序列置於讀碼框外，並且優選不會產生可能產生二級mRNA結構的互補區域。參見，歐洲專利申請號75,444。
IL-2的生物學活性變體一般與用作比較基準的參比IL-2多肽分子，例如天然的人IL-2具有至少約70％、優選至少約80％、更優選至少約90％-95％或更高、最優選至少約98％、99％或更高的胺基酸序列相同性。序列相同性百分比可用Smith-Waterman同源性檢索算法，以親族缺口(affine gap)檢索測定，所用參數為缺口開放罰分12、缺口延伸罰分2和BLOSUM矩陣62。Smith-Waterman同源性檢索算法的說明見Smith和Waterman，(1981)，Adv.Appl.Math.2482-489。例如，變體可有少至1-15個胺基酸殘基、少至1-10個胺基酸殘基，如6-10，少至5個、少至4個、3個、2個、甚至1個胺基酸殘基不同。
就兩條胺基酸序列的最佳比對而言，與參比胺基酸序列相比，變體胺基酸序列的連續區段可具有相同的胺基酸數、加入的胺基酸殘基或刪除的胺基酸殘基。用於和參比胺基酸序列比較的連續區段包含至少20個連續的胺基酸殘基，可以是30、40、50或更多個胺基酸殘基。可對與保守性殘基取代或缺口相關的序列相同性進行校正(參見Smith-Waterman同源性檢索算法)。感興趣的天然IL-2多肽的生物學活性變體與天然多肽相比有少至1-15個胺基酸殘基、少至1-10個胺基酸殘基，如6-10，少至5個、少至4個、3個、2個、甚至1個胺基酸殘基的不同。
具有IL-2活性的多肽的精確化學結構取決於許多因素。由於分子中存在可電離的氨基和羧基，獲得的特定多肽可以是酸性鹽或鹼性鹽，或中性形式。在合適的環境中可保留它們的生物學活性的所有這些製劑包括在本文所用具有IL-2活性的多肽的定義中。此外，可通過利用糖分子衍生化(糖基化)或其它補充分子，例如脂質、磷酸、乙醯基團等增加該多肽的一級胺基酸序列。也可通過和糖偶聯來增加該多肽的一級胺基酸序列。這種增加的某些方面可通過生產宿主的翻譯後加工系統來實現；其它這種修飾可在體外引入。在任何情況中，只要多肽的IL-2活性未遭破壞，這種修飾就包括在本文所用的IL-2多肽的定義中。在各種試驗中，期望這種修飾可通過提高或降低該多肽的活性來定量或定性地影響其活性。此外，可通過氧化、還原或其它衍生化方式來修飾鏈中的單個胺基酸殘基，可切割該多肽而得到保留活性的片段。這種不破壞活性的改變不將這種多肽序列排除在本文所用感興趣的IL-2多肽的定義之外。
本領域為多肽變體的製備和使用提供了基本指導。在製備IL-2變異蛋白過程中，本領域的技術人員不難確定對天然蛋白質的核苷酸或胺基酸序列的哪種修飾將導致產生適合用作本發明方法藥物組合物中治療活性組分的變體。
用於本發明方法中的IL-2或其變異蛋白可以是任何來源，但優選重組產生。「重組IL-2」或「重組IL-2變異蛋白」指具有與天然序列IL-2相當生物學活性並通過例如Taniguchi等，(1983)，Nature，302305-310和Devos，(1983)，NucleicAcids Research，114307-4323所述重組DNA技術製備的白介素-2或其變體；或者如Wang等，(1984)，Science，2241431-1433所述經突變而改變的IL-2。大體上，克隆編碼IL-2的基因，然後在轉化的生物，優選微生物中表達。宿主生物能在表達條件下表達外來基因而產生IL-2。生長、收集、破裂(disrupt)或自細胞者中提取IL-2的方法的基本描述見，例如全文納入本文作為參考的美國專利號4,604,377；4,738,927；4,656,132；4,569,790；4,748,234；4,530,787；4,572,798；4,748,234。
例如IL-2突變蛋白，參見歐洲專利(EP)公布號EP 136,489(公開了天然存在的IL-2的胺基酸序列中的一種或多種以下改變Asn26-Gln26；Trp121-Phe121；Cys58-Ser58或Ala58；Cys105-Ser105或Ala105；Cys125-Ser125或Ala125；刪除Arg 120之後的所有殘基；和它們的Met-1形式)；1983年10月13日提交的歐洲專利申請號83306221.9所述的重組IL-2突變蛋白(1984年5月30日以公布號EP 109,748公布)，該專利是比利時專利號893,016和共有的美國專利4,518,584的等同專利(這兩份專利公開了重組的人IL-2突變蛋白，其中天然人IL-2編號的125位半胱氨酸被刪除或被中性胺基酸所取代；丙氨醯-ser125-IL-2；和脫-丙氨醯-ser125-IL-2)。也參見美國專利號4,752,585(該專利公開了以下IL-2突變蛋白ala104 ser125 IL-2、ala104 IL-2、ala104 ala125 IL-2、val104 ser125IL-2、val104 IL-2、val104 ala125 IL-2、脫-ala1 ala104 ser125 IL-2、脫-ala1 ala104IL-2、脫-ala1 ala104 ala125 IL-2、脫-ala1 val104 ser125 IL-2、脫-ala1 val104 IL-2、脫-ala1 val104 ala125 IL-2、脫-ala1脫-pro2 ala104 ser0125 IL-2、脫-ala1脫-pro2ala104 IL-2、脫-ala1脫-pro2 ala104 ala125IL-2、脫-ala1脫-pro2 val104 ser125IL-2、脫-ala1脫-pro2 val104 IL-2、脫-ala1脫-pro2 val104 ala125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3 ala104 ser125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3 ala104 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3 ala104 ala125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3 val104 ser125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3 val104 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3 val104 ala125IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4 ala104 ser125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4 ala104 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4 ala104 ala125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4 val104 ser125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4 val104 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4 val104 ala125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5 ala104 ser125IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5 ala104 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5 ala104ala125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5 val104 ser125IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5 val104 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5 val104 ala125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6ala104 ala125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6 ala104IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6 ala104 ser125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6 val104 ser125IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6 val104 IL-2和脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6 val104 ala125IL-2)和美國專利號4,931、543(該專利公開了用於本文實施例的IL-2突變蛋白脫-丙氨醯-1，絲氨酸-125人IL-2以及其它IL-2突變蛋白)。
也參見歐洲專利公布號EP 200,280(1986年12月10日公布)，該專利公開了重組IL-2突變蛋白，其中104位的甲硫氨酸被保守性胺基酸取代。例子包括以下突變蛋白ser4脫-ser5 ala104 IL-2；脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5 ala104 ala125 IL-2；脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5 glu104 ser125IL-2；脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5 glu104 IL-2；脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5 glu104 ala125IL-2；脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6 ala104 ala125 IL-2；脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6 ala104 IL-2；脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6 ala104ser125 IL-2；脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6 glu104 ser125IL-2；脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6 glu104 IL-2和脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6 glu104 ala125 IL-2。也參見歐洲專利申請號EP 118,617和美國專利號5,700,913，該兩份專利公開了以丙氨酸取代天然IL-2的甲硫氨酸作為N-末端胺基酸的未糖基化人IL-2變體；刪除了起始甲硫氨酸從而使脯氨酸是N-末端胺基酸的未糖基化人IL-2；和在N-末端甲硫氨酸和脯氨酸之間插入丙氨酸的未糖基化人IL-2。
其它IL-2突變蛋白包括公開於WO 99/60128的(用組氨酸或異亮氨酸取代20位的天冬氨酸，用精氨酸、甘氨酸或異亮氨酸取代88位的天冬醯胺，或者用亮氨酸或穀氨酸取代126位的穀氨醯胺)，據報導這些突變蛋白對T細胞受體表達細胞所表達的高親和力IL-2受體具有優於NK細胞所表達受體的選擇性活性並且IL-2毒性降低；美國專利號5,229,109所公開的突變蛋白(用丙氨酸取代38位的精氨酸，或者用賴氨酸取代42位的苯丙氨酸)，與天然IL-2相比這些突變蛋白顯示與高親和力IL-2受體結合(能力)降低但仍能激活LAK細胞；國際公布號WO 00/58456所公開的突變蛋白(改變或刪除天然IL-2中天然存在的(x)D(y)序列，其中D是天冬氨酸，(x)是亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸或纈氨酸，(y)是纈氨酸、亮氨酸或絲氨酸)；公開於國際公布號WO 00/04048中的IL-2 p1-30肽(對應於IL-2的前30個胺基酸，該肽含有IL-2的整個α-螺旋A並能與IL-2受體的b鏈相互作用)；和公開於WO 00/04048的IL-2 p1-30肽的突變形式(用賴氨酸取代20位的天冬氨酸)。
具有預計的毒性降低的IL-2突變蛋白的其它例子公開於2004年3月5日提交的美國臨時專利申請序列號60/550,868中。這些突變蛋白包括在成熟人IL-2序列的125位用絲氨酸取代半胱氨酸的成熟人IL-2胺基酸序列，並且在該成熟人IL-2序列中具有至少一處額外的胺基酸取代從而使該突變蛋白具有以下功能特徵在可比試驗條件下與類似量的脫-丙氨醯-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，1)能維持或提高天然殺傷(NK)細胞的增殖，和2)誘導NK細胞產生的致炎細胞因子水平降低。在一些實施方式中，此額外取代選自T7A、T7D、T7R、K8L、K9A、K9D、K9R、K9S、K9V、K9W、T10K、T10N、Q11A、Q11R、Q11T、E15A、H16D、H16E、L19D、L19E、D20E、124L，K32A、K32W、N33E、P34E、P34R、P34S、P34T、P34V、K35D、K35I、K35L、K35M、K35N、K35P、K35Q、K35T、L36A、L36D、L36E、L36F、L36G、L36H、L36I、L36K、L36M、L36N、L36P、L36R、L36S、L36W、L36Y、R38D、R38G、R38N、R38P、R38S、L40D、L40G、L40N、L40S，T41E、T41G、F42A、F42E、F42R、F42T、F42V、K43H、F44K、M46I、E61K、E61M、E61R、E62T、E62Y、K64D、K64E、K64G、K64L、K64Q、K64R、P65D、P65E、P65F、P65G、P65H、P65I、P65K、P65L、P65N、P65Q、P65R、P65S、P65T、P65V、P65W、P65Y、L66A、L66F、E67A、L72G、L72N、L72T、F78S、F78W、H79F、H79M、H79N、H79P、H79Q、H79S、H79V、L80E、L80F、L80G、L80K、L80N、L80R、L80T、L80V、L80W、L80Y、R81E、R81K、R81L、R81M、R81N、R81P、R81T、D84R、S87T、N88D、N88H、N88T、V91A、V91D、V91E、V91F、V91G、V91N、V91Q、V91W、L94A、L94I、L94T、L94V、L94Y、E95D、E95G、E95M、T102S、T102V、M104G、E106K、Y107H、Y107K、Y107L、Y107Q、Y107R、Y107T、E116G、N119Q、T123S、T123C、Q126I和Q126V；其中胺基酸殘基位置相對於成熟人IL-2胺基酸序列編號。在其它實施方案中，這些突變蛋白包括在成熟人IL-2序列的125位用丙氨酸取代半胱氨酸的成熟人IL-2胺基酸序列，並且在該成熟人IL-2序列中具有至少一處額外的胺基酸取代從而使該突變蛋白具有相同的功能特徵。在一些實施方案中，此額外取代選自T7A、T7D、T7R、K8L、K9A、K9D、K9R、K9S、K9V、K9W、T10K、T10N、Q11A、Q11R、Q11T、E15A、H16D、H16E、L19D、L19E、D20E、124L、K32A、K32W、N33E、P34E、P34R、P34S、P34T、P34V、K35D、K35I、K35L、K35M、K35N、K35P、K35Q、K35T、L36A、L36D、L36E、L36F、L36G、L36H、L36I、L36K、L36M、L36N、L36P、L36R、L36S、L36W、L36Y、R38D、R38G、R38N、R38P、R38S、MOD、L40G、L40N、L40S、T41E、T41G、F42A、F42E、F42R、F42T、F42V、K43H、F44K、M46I、E61K、E61M、E61R、E62T、E62Y、K64D、K64E、K64G、K64L、K64Q、K64R、P65D、P65E、P65F、P65G、P65H、P65I、P65K、P65L、P65N、P65Q、P65R、P65S、P65T、P65V、P65W、P65Y、L66A、L66F、E67A、L72G、L72N、L72T、F78S、F78W、H79F、H79M、H79N、H79P、H79Q、H79S、H79V、L80E、L80F、L80G、L80K、L80N、L80R、L80T、L80V、L80W、L80Y、R81E、R81K、R81L、R81M、R81N、R81P、R81T、D84R、S87T、N88D、N88H、N88T、V91A、V91D、V91E、V91F、V91G、V91N、V91Q、V91W、L94A、L94I、L94T、L94V、L94Y、E95D、E95G、E95M、T102S、T102V、M104G、E106K、Y107H、Y107K、Y107L、Y107Q、Y107R、Y107T、E116G、N119Q、T123S、T123C、Q126I和Q126V；其中胺基酸殘基位置相對於成熟人IL-2胺基酸序列編號。在其它實施方案中，這些突變蛋白包括在成熟人IL-2序列內至少一處額外的胺基酸取代的成熟人IL-2胺基酸序列，從而使該突變蛋白具有相同的功能特徵。在一些實施方案中，此額外取代選自T7A、T7D、T7R、K8L、K9A、K9D、K9R、K9S、K9V、K9W、T10K、T10N、Q11A、Q11R、Q11T、E15A、H16D、H16E、L19D、L19E、D20E、124L、K32A、K32W、N33E、P34E、P34R、P34S、P34T、P34V、K35D、K35I、K35L、K35M、K35N、K35P、K35Q、K35T、L36A、L36D、L36E、L36F、L36G、L36H、L36I、L36K、L36M、L36N、L36P、L36R、L36S、L36W、L36Y、R38D、R38G、R38N、R38P、R38S、L40D、L40G、L40N、L40S、T41E、T41G、F42A、F42E、F42R、F42T、F42V、K43H、F44K、M46I、E61K、E61M、E61R、E62T、E62Y、K64D、K64E、K64G、K64L、K64Q、K64R、P65D、P65E、P65F、P65G、P65H、P65I、P65K、P65L、P65N、P65Q、P65R、P65S、P65T、P65V、P65W、P65Y、L66A、L66F、E67A、L72G、L72N、L72T、F78S、F78W、H79F、H79M、H79N、H79P、H79Q、H79S、H79V、L80E、L80F、L80G、L80K、L80N、L80R、L80T、L80V、L80W、L80Y、R81E、R81K、R81L、R81M、R81N、R81P、R81T、D84R、S87T、N88D、N88H、N88T、V91A、V91D、V91E、V91F、V91G、V91N、V91Q、V91W、L94A、L94I、L94T、L94V、L94Y、E95D、E95G、E95M、T102S、T102V、M104G、E106K、Y107H、Y107K、Y107L、Y107Q、Y107R、Y107T、E116G、N119Q、T123S、T123C、Q126I和Q126V；其中胺基酸殘基位置相對於成熟人IL-2胺基酸序列編號。除了在成熟人IL-2序列1位刪除了起始丙氨酸殘基之外，美國臨時專利申請序列號60/550,868中描述的其它突變蛋白包括上述突變蛋白。
IL-2突變蛋白也可以是IL-2融合物或偶聯物，所述融合物或偶聯物包括與第二蛋白融合或與聚脯氨酸或水溶性聚合物共價偶聯的IL-2，以降低給藥頻率或提高IL-2耐受性。例如，可採用本領域已知的方法(參見，WO 01/79258)，使IL-2突變蛋白與人白蛋白或白蛋白片段融合。或者，可採用本領域已知的方法(參見，例如美國專利號4,766,106；5,206,344和4,894,226)，使IL-2突變蛋白與聚脯氨酸或聚乙二醇均聚物和聚氧乙基化多元醇共價偶聯，其中所述均聚物未取代或一端被烷基取代，所述多元醇未取代。
本發明分析方法也可由於檢測其它治療藥物，例如其它免疫治療劑、細胞因子和淋巴因子突變蛋白，以及免疫毒素和小分子化學治療劑。這些藥物包括但不限於白介素，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4，IL-5、IL-12和這些分子的突變蛋白；幹擾素，例如但不限於IFN-α、IFN-β、IFN-γ及其突變蛋白；GM-CSF和GM-CSF的突變蛋白；腫瘤壞死因子，例如TNF-α和TNF-β及這些分子的突變蛋白；抗神經節苷抗體、環孢素A、環磷醯胺、絲裂黴素C、FK973、野百合鹼吡咯(monocrotalinepyrrole)和阿糖胞苷及這些分子的突變蛋白；以及各種免疫毒素。
III.實驗下面是進行本發明的具體實施方式
的例子。提供這些實施例僅僅是為了說明目的，而不是為了以任何方式限制本發明的範圍。
為確保使用的各種數值的準確性(例如，量、溫度等)，進行了研究，但應當允許一定的實驗誤差和偏差。
材料和方法A.培養液和試劑-PBS(不含Ca/Mg)，冰冷；-培養液200(Cascade Biologics，Portland，OR)；-培養液200PRF(Cascade Biologics，Portland，OR)；-LSGS低血清生長添加劑(50×)。(Cascade Biologics，Portland，OR)。補給性培養液中這些組分的最終濃度為2％v/v胎牛血清；1μg/ml氫化可的松；10ng/ml人表皮生長因子；10ng/ml人表皮生長因子；3ng/ml基本的成纖維細胞生長因子和10g/ml肝素；-PSA溶液(Cascade Biologics，Portland，OR)完全培養液中的最終濃度含有100U/ml青黴素，100μg/ml硫酸鏈黴素和0.25μg/ml兩性黴素B；-胰蛋白酶(0.25％)/EDTA(0.1％)(Cellgro，Hemdon，VA)；-FITC-白蛋白(50mg)(Sigma，St.Louis，MO)；-FITC-BSA儲備液(20×)。FITC-BSA懸浮在2.5ml完全培養液200中。
-人AB血清(SeraCare Life Sciences，Oceanside，CA)-人AB培養液(500mL)RPMI(不含酚紅)............................................426.5ml人AB-加熱滅活*............................................50ml
青黴素/鏈黴素(終濃度100μg/ml).................................5mlHEPES(1M儲備液，終濃度25mM)....................................12.5mlL-穀氨醯胺(100×儲備液，終濃度2mM).............................5ml兩性黴素B(250μg/ml儲備液，終濃度0.5μg/ml)....................1ml4℃下，儲存培養液至多4周。
*4℃下過夜解凍血清，56℃加熱滅活45分鐘-RPMI冰冷，不含血清-PBS/EDTA5.7ml 0.5M EDTA加入到500ml PBS(不含Ca/Mg)中，最終pH7.2；-臺盼藍染料(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，或等價的0.4％溶液)；-10％皂苷儲備液2.5g皂苷在25ml PBS中，4℃下儲存；-完全培養液200培養液200/培養液200PRF..........................................500mlLSGS............................................................10mlPSA溶液.........................................................1mlB.細胞培養HUVEC(人臍靜脈內皮細胞)得自Cascade Biologics，Portland，OR。每小管含有≥5×105個細胞。通過浸入37℃的水，解凍小管。用完全培養液200將細胞稀釋至10ml，採用臺盼藍計數確定每毫升中的活細胞數。然後，再用完全培養液200將小管內容物稀釋至1.25×104活細胞/毫升。將5ml或15ml細胞懸浮液分別加入到25cm2或75cm2培養瓶中，在培養瓶中渦旋培養液以分散細胞。在溼潤的5％CO2孵育箱中，37℃下孵育培養物。24-36小時後，將培養液換成新鮮補給性培養液200，以後每天換液，直到培養物達到約80％融合。這大概需要5-6天。
然後如下所述傳代培養HUVEC。除去培養液，將胰蛋白酶/EDTA溶液加入到培養瓶中，通過輕拍和吸取並加入完全培養液200取出細胞，將細胞轉移至15ml無菌錐形試管中。細胞在1000rpm下離心10分鐘，計數，並以2.5×103活細胞/平方釐米接種。
2或3代期間的細胞在凍存培養液(90％FBS，10％DMSO)中冷凍保存，儲存在液氮中備用。
實施例1篩選IL-2突變蛋白的體外試驗為了試驗預測IL-2突變蛋白患者耐受性的能力，進行了以下試驗。試驗中使用兩種耐受性提高的IL-2突變蛋白，作為原理證據。這兩種突變蛋白是F42E和Y107R取代突變蛋白。參見2005年3月5日提交的共同擁有、共同待批的美國臨時專利申請序列號60/550,868。體內外模型中，在NK和T細胞增殖，以及NK/LAK/ADCC活性方面，這些突變蛋白也保持了效應子功能。此外，使用由Emeryville，CA的Chiron Corporation生產的Proleukin作為引起VLS的代表性IL-2分子。該製劑中的IL-2是重組產生的，未糖基化的人IL-2突變蛋白，稱為aldesleukin，其刪除了起始丙氨酸殘基並用絲氨酸殘基取代125位半胱氨酸殘基(稱為脫-丙氨醯-1，絲氨酸-125人白介素-2)而與天然人IL-2胺基酸序列不同。該IL-2突變蛋白在大腸桿菌中表達，然後如美國專利號4,931543所述經滲濾和離子交換層析純化。IL-2製劑以Proleukin商品名提供，為無菌、白色至灰白色無防腐劑的凍乾粉，每小管含有1.3mg蛋白質(22MIU)。
如下製備本試驗中使用的淋巴因子-活化的殺傷(LAK)細胞。從正常供體收集全血，置於Vacutainer CPT管(ACDA，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中。根據CPT生產商的說明書分離PBMC。簡言之，倒置試管以混合，1500-1800×g下離心20分鐘，除去血沉棕黃層，置於錐形管中，用PBS 2％FBS洗(最多300×g，15分鐘)。除去上清液，洗滌細胞2次。將PBMC懸浮在RPMI-10AB培養液中，採用血細胞計數器進行臺盼藍排斥試驗計數。將PBMC以1.5×106細胞/毫升懸浮在RPMI-10AB中(不含酚紅)。24孔組織培養板的每孔中加入1ml PBMC懸浮液，並加入含50nm所需IL-2突變蛋白的1ml/孔37℃RPMI-10AB培養液。蓋上培養板，在溼潤的37℃、5％CO2培養箱中孵育3天，然後將培養板置於冰上約30分鐘，除去上清液，4℃，300×g下離心5分鐘，收集在冰上的50ml錐形試管中。每孔中加入1ml冰冷的PBS/EDTA，孵育20分鐘。取出粘附細胞，加入到冰上的試管中。每孔中加入1ml冷的PBS。4℃，將50ml錐形試管在300×g下離心5分鐘。同時，洗滌各孔，將洗滌液收集在冰上50ml錐形試管中。倒出上清液，細胞團懸浮在12ml冷RPMI中，加入到PBS洗滌液中。4℃，300×g下再次離心5分鐘。再次倒出上清液，懸浮細胞團，離心，如上所述。將洗滌的細胞懸浮在冷的完全RPMI中，臺盼藍排斥試驗計數。
將600μl完全培養液200PRF加入到膠原塗覆轉移孔(Transwell-COLTM，膠原塗覆PTFE膜，Costar(Corning，Inc.，Coming，NY)的下室中，從培養瓶中取出代系小於5的HUVEC，以1.0×106細胞/毫升懸浮在完全培養液200PRF中。將100μlHUVEC懸浮液加入到轉移孔的上室中。設立含培養液但無細胞的對照轉移孔，以測定FITC-BSA穿過膠原膜的最大轉移。將轉移孔在溼潤的5％CO2培養箱中，37℃孵育3天，以建立融合單層。第4天，用結晶紫(Sigma，St.Louis，MO；2.3％w/v，草酸銨0.1％w/v，乙醇，SD3A 20％v/v)染色單層，檢查融合。當單層達到90％融合時進行試驗。
從轉移孔的上室中全部取出完全培養液200，將100μl含FITC-BSA(1mg/ml)的完全培養液200加入到試驗和對照轉移孔中。用鋁箔覆蓋培養板，30分鐘時，從轉移孔的下室中取出10μl樣品，置於具有透明底部的黑色96-孔板中。然後，補充10μl完全培養液至下室中。將40μl完全培養液200加入到黑色96-孔板中，混合。利用IL-2突變蛋白-螢光素(485/575nm，1.0s)進行，樣品讀數。基於螢光強度讀數，再次分配轉移孔，對於90％融合或更高的融合單層，讀數應低於6,000。孵育3小時後，培養板再次取樣，讀數，如上所述。3小時強度讀數作為基線或時間0時的讀數。
FITC-BSA從上室除去，將100μl含FITC-BSA(1mg/ml)的試驗化合物加入到上室中(1)IL-2突變蛋白F42E、Y107R或Proleukin(25nM)；(2)3天25nM IL-2-突變蛋白-刺激的PBMC上清液；(3)3天25nM IL-2-突變蛋白-刺激的LAK細胞；和(4)3天25nM IL-2-突變蛋白-刺激的LAK細胞的上清液。另外，採用0.05％皂苷作為陽性對照(皂苷能破壞單層)，完全培養液200用作培養液對照。用鋁箔覆蓋培養板，37℃孵育。與試驗化合物孵育3小時後收集樣品，螢光讀數，如上所述。
結果如圖1-4所示。所示數據例子為3次獨立的實驗，每種試驗條件n＝5或6，圖中數據來自3位不同的正常人供體。如圖1A-1C所示，Proleukin-刺激的PBMC(LAK)和上清液導致內皮細胞單層明顯損傷。在3位受試供體的2位中，與Proleukin相比，F42E和Y107R突變蛋白的VLS顯著降低。如圖2A-2C所示，3位受試供體的2位中，僅Proleukin-誘導的LAK細胞顯示超過培養液對照樣品的VLS顯著增加，但培養液對照與F42E或Y107R之間沒有顯著性差異。如圖3A-3C所示，僅來自IL-2-誘導的PBMC培養物上清液不足以在體外明顯誘導VLS症候群。如圖4A-4C所示，僅Proleukine或F42E和Y107R都不能直接引起EC單層損傷。如圖1-4所示，單獨用F42E和Y107R之間，F42E-和Y107R-刺激的上清液之間，單獨用F42E-和Y107R-刺激的LAK細胞與培養液對照之間沒有顯著性差異。
因此，測定FITC-BSA穿過內皮細胞融合單層的滲透性的VLS的體外模型有效且一致。
因此，描述了用於預測IL-2突變蛋白患者耐受性的新型體外試驗系統。雖然詳細描述了本發明優選的實施方式，但應理解，不背離權利要求書所述的本發明精神和範圍，可進行各種明顯改變。
權利要求
1.一種預測患者對選定的治療藥物耐受或不耐受的體外方法，所述方法包括(a)提供貼附於粘附基質的內皮細胞融合單層；(b)使所述單層與以下成分接觸(i)所述選定的治療藥物或淋巴因子活化的殺傷(LAK)細胞製劑，其中，通過用所述治療藥物或所述LAK細胞的上清液激活外周血單核細胞產生所述LAK細胞，和(ii)可檢測標記的大分子，其中，當所述單層保持完整時，所述融合單層可基本上保留所述可檢測標記的大分子；(c)在所述單層的完整性受損時，在所述可檢測標記的大分子能穿過所述融合單層和所述粘附基質的條件下，孵育步驟(b)的所述單層一段時間；和(d)檢測穿過所述融合單層和所述粘附基質的大分子，作為患者對所述治療藥物耐受或不耐受的指標。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述治療藥物是免疫治療劑、免疫毒素或小分子化學治療劑。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述免疫治療劑是白介素-2(IL-2)突變蛋白。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述粘附基質包括膠原基質。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述內皮細胞是人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述可檢測標記的大分子是可檢測標記的白蛋白。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述可檢測標記的白蛋白是標記的牛血清白蛋白(BSA)。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述BSA是螢光標記的。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述螢光標記是FITC。
10.一種預測患者對白介素-2(IL-2)突變蛋白耐受或不耐受的體外方法，所述方法包括(a)提供貼附於粘附基質的內皮細胞融合單層；(b)使所述單層與以下成分接觸(i)淋巴因子活化的殺傷(LAK)細胞製劑，其中，通過用所述IL-2突變蛋白激活外周血單核細胞產生所述LAK細胞，和(ii)可檢測標記的大分子，其中，當所述單層保持完整時，所述融合單層可基本上保留所述可檢測標記的大分子；(c)在所述單層的完整性受損時，在所述可檢測標記的大分子能穿過所述融合單層和所述粘附基質的條件下，孵育步驟(b)的所述單層一段時間；和(d)檢測穿過所述融合單層和所述粘附基質的大分子，作為患者對IL-2突變蛋白耐受或不耐受的指標。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述粘附基質包括膠原基質。
12.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述內皮細胞是人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)。
13.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述可檢測標記的大分子是可檢測標記的白蛋白。
14.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述可檢測標記的白蛋白是標記的牛血清白蛋白(BSA)。
15.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述BSA是螢光標記的。
16.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述螢光標記是FITC。
17.一種涉及預測患者對白介素-2(IL-2)突變蛋白耐受或不耐受的體外方法，所述方法包括(a)提供貼附於粘附基質如膠原基質的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的融合單層；(b)使所述單層與以下成分接觸(i)淋巴因子活化的殺傷(LAK)細胞製劑，其中，通過用所述IL-2突變蛋白激活外周血單核細胞產生所述LAK細胞，和(ii)螢光標記的白蛋白；(c)在所述單層的完整性受損時，在所述螢光標記的白蛋白能穿過所述融合單層和所述粘附機制的條件下，孵育步驟(b)的所述單層一段時間；和(d)檢測穿過所述融合單層的螢光標記的白蛋白，作為患者對所述IL-2突變蛋白耐受或不耐受的指標。
18.如權利要求17所述的方法，其特徵在於，所述螢光標記的白蛋白是標記的牛血清白蛋白(BSA)。
19.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述螢光標記是FITC。
全文摘要
描述了預測患者對治療藥物如細胞因子、淋巴因子和免疫毒素的耐受性的方法。該方法利用血管滲透症候群(VLS)體外模型來評價藥物對大分子蛋白質通過內皮細胞(EC)融合單層的作用。
文檔編號C12Q1/02GK1930300SQ200580007070
公開日2007年3月14日 申請日期2005年3月3日 優先權日2004年3月5日
發明者曹穎, K·德尼斯-米澤, S·E·威爾森 申請人:希龍公司