用於好氣性產芽孢細菌鑑定的寡核苷酸以及使用此寡核苷酸的好氣性產芽孢細菌的鑑定...的製作方法

2023-05-31 09:58:36 4

專利名稱：用於好氣性產芽孢細菌鑑定的寡核苷酸以及使用此寡核苷酸的好氣性產芽孢細菌的鑑定 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及可在用於鑑定作為鑑定對象的被鑑定菌是否是好氣性產芽孢細菌的PCR中使用的寡核苷酸及其應用，具體地說，涉及上述寡核苷酸、通過以此寡核苷酸為引物進行PCR，檢測好氣性產芽孢細菌的特異性DNA片段，從而鑑定被鑑定菌是否是好氣性產芽孢細菌的方法、及用於進行該鑑定方法的鑑定試劑盒。
背景技術：
以往，分類鑑定細菌的方法，已知的有根據生理生化性狀的方法，根據醌組成、菌體脂肪酸組成、細胞壁成分等的方法，根據DNA的G+C含量的方法，根據DNA同源性的方法，使用DNA探針的方法，及進行16S核糖體RNA基因的鹼基序列分析的方法等。
特別是近年來，通過以16S核糖體RNA基因的鹼基序列為基礎進行系統分類，把所得到的菌群(簇)作為指標進行細菌的分類·識別，已成為普遍的方法。
可是，以芽孢桿菌屬(Bacillus)為首的好氣性產芽孢細菌廣泛分布於土壤、水、空氣等的自然界中。芽孢桿菌屬中，對人體顯示病原性的細菌，已知有炭疽桿菌(Bacillus anthracis)、引起食物中毒的蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)等。而且，關於含有芽孢桿菌屬的好氣性產芽孢細菌的系統分類及分類體系，例如，非專利文獻1[信太治，《好氣性產芽孢細菌的分類與鑑定》，日本清涼飲料(Soft Drinks)技術資料2001年3號，221-227]中所述的，芽孢桿菌屬以外的各屬也已為人所知。這些好氣性產芽孢細菌具有形成芽孢的特徵，但因其芽孢的耐熱性和抗藥性強，所以殺菌難，且從食品工廠的製造過程中完全去除是很困難的。故而，多數情況下，可在食品工廠的工序檢查等中分離出好氣性產芽孢細菌。
因此，例如，在食品製造工場中，從產品及製造過程中分離細菌時，為探明汙染原因，很重要的是鑑定被分離細菌是否形成芽孢。所以，特別是在食品行業中，期望能迅速鑑定從產品或製造過程中分離的細菌是否形成芽孢。
一般地，被分離的細菌是否是好氣性產芽孢細菌，常用的鑑定方法是在芽孢形成培養基上培養作為鑑定對象的被鑑定菌(供試菌)，再用顯微鏡確認該菌體是否形成芽孢。此方法中，因必須在芽孢形成培養基上培養被鑑定菌，所以到鑑定出為止需數日到1星期的非常長的時間。在此一般的鑑定方法中，通過縮短檢測鑑定時間(培養時間)，雖可某種程度上縮短時間，但此時有可能檢測不出增殖速度慢的菌株，所以風險性較大。
為此，在上述一般的鑑定方法中，為能可靠地鑑定好氣性產芽孢細菌，就需要長時間的培養。所以，上述鑑定方法，可以說對特別需要迅速性的食品行業出廠前的檢查是不適合的。
上述一般的鑑定方法以外，鑑定屬於好氣性產芽孢細菌的細菌的技術，例如，專利文獻1[日本國公開專利公報《日本特開平9-94100號公報》(
公開日1997年4月8日)]及非專利文獻2[Shida，O et al.，Proposal forTwo New Genera，Brevibacillus gen.nov.and Aneurinibacillus gen.nov.，International Journal of Systematic Bacteriology，939-946(1996)]中所公開的方法。此技術中，把具有屬於短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)等好氣性產芽孢細菌的、細菌的16S核糖體RNA基因中存在的特異性鹼基序列DNA作為引物，以從被鑑定細菌中獲得的染色體DNA為模板，使用PCR法，將特定的DNA的擴增作為指標，從而進行被鑑定細菌的屬水平的鑑定。
另外，已知利用16S核糖體RNA基因的芽孢桿菌屬細菌的分類技術，如非專利文獻3(Goto，K et al.，Application ofthe partial 16S rDNA sequence asan index for rapid identification of species in the genus Bacillus，The Journal ofGeneral and Applied Microbiology，46，1-8(2000))中公開的方法。被稱作16S核糖體RNA基因的高變區[hypervariable region(HV region)]的5』側的約275bp是種特異性區域，所以，此技術中，通過進行此區域的鹼基序列分析，可進行芽孢桿菌細菌屬細菌的分類。
其他，在專利文獻2[日本國專利公報《日本特公平7-89956號公報》(公告日1995年10月4日、對應日本國公開專利公報《日本特開平3-49696號公報》(
公開日1991年3月4日))]中記載了通過使用來源於蠟狀芽孢桿菌的、β-內醯胺酶基因檢測用的引物檢測出該基因，從而檢測出蠟狀芽孢桿菌的方法。
但是，因目前還沒有迅速且包羅地鑑定是否是形成芽孢的好氣性產芽孢細菌的有效方法，所以，期望開發可用於特別需要迅速性的食品行業出廠前檢查等的技術。
具體地說，首先，上述專利文獻1及非專利文獻1中所述的方法，從一開始就不是用於食品行業出廠前檢查等的技術，而是重點放在細菌鑑定的技術。因此，此方法，雖然由於PCR法檢測可擔保迅速性，但由於是屬特異性方法，所以需採用適應各個屬的引物，不僅操作繁雜，而且還會產生對於檢測不出來的屬的細菌不能適用的問題。
另外，上述非專利文獻3中所述的方法，在鑑定芽孢桿菌屬的種時有效，對其他屬的細菌不適用，而上述專利文獻2中所述的方法，只對蠟狀芽孢桿菌的檢測有效。
因此，迄今為止，雖已有比較迅速地檢測(或鑑定)某一特定屬的好氣性產芽孢細菌的技術，但迅速且包羅地鑑定好氣性產芽孢細菌的技術卻還不為人所知。

發明內容
本發明鑑於上述問題點，其目的在於，提供可優選適用於能迅速且包羅地鑑定好氣性產芽孢細菌的方法的寡核苷酸，及通過以該寡核苷酸為引物進行擴增反應，檢測出對於好氣性細菌的特異性DNA片段，從而鑑定被鑑定菌是否是好氣性產芽孢細菌的方法，以及進行該鑑定方法的試劑盒。
本發明者等為解決上述課題，著眼於芽孢桿菌屬及其近緣的好氣性產芽孢細菌的16S核糖體RNA基因中比較共通的鹼基序列區域，進行了銳意研究。其結果，通過將與本發明有關的寡核苷酸用於引物進行PCR擴增，發現了對於以芽孢桿菌屬為首的好氣性產芽孢細菌，約100bp長度的特異性DNA片段得到了擴增，使本發明得以完成。即本發明包含以下發明。(1)寡核苷酸，其含有對於好氣性產芽孢細菌的16S核糖體RNA基因的特異性鹼基序列或該鹼基序列的互補序列，且上述特異性鹼基序列是序列號1～6中所示的鹼基序列的任一個。
(2)(1)中所述的寡核苷酸，其中，上述好氣性產芽孢細菌屬於從芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、硫胺素芽孢桿菌屬、土芽孢桿菌屬、環脂酸芽孢桿菌屬、短芽孢桿菌屬、雙芽孢桿菌屬、枝芽孢桿菌屬、喜鹽芽孢桿菌屬、Gracillibacillus屬、Salibacillus屬、Marinibacillus屬及芽孢乳桿菌屬細菌中選擇的至少1種的細菌。
(3)好氣性產芽孢細菌的鑑定方法，其把由鑑定對象的被鑑定菌製備的核酸作為被檢樣本使用，把以該被檢樣本為模板、進行PCR反應時所得到的特定DNA片段的擴增作為指標，鑑定上述被鑑定菌是否是好氣性產芽孢細菌，且用於PCR反應的引物，使用含有對好氣性產芽孢細菌的16S核糖體RNA基因特異的鹼基序列或該鹼基序列的互補序列的寡核苷酸的至少1種，同時，上述特異性鹼基序列是序列號1～6中所示的鹼基序列的任一個。
(4)(3)中所述的好氣性產芽孢細菌的鑑定方法，其中，上述引物中，含有序列號1或2中所述的鹼基序列或其鹼基序列的互補序列的寡核苷酸作為正義引物使用，同時，含有序列號3～6中任一個所示的鹼基序列或其鹼基序列的互補序列的寡核苷酸作為反義引物使用。
(5)(3)或(4)中所述的好氣性產芽孢細菌的鑑定方法，其中上述正義引物及反義引物的至少一方，使用2種或大於2種的含有上述特異性鹼基序列或該鹼基序列的互補序列的寡核苷酸。
(6)(3)～(5)中任一項所述好氣性產芽孢細菌的鑑定方法，其中，被擴增的上述特定的DNA片段具有通過凝膠電泳分離，可在0.1kb附近被檢測出的長度。
(7)(3)～(6)中任一項所述好氣性產芽孢細菌的鑑定方法，其中上述好氣性產芽孢細菌屬於從芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、硫胺素芽孢桿菌屬、土芽孢桿菌屬、環脂酸芽孢桿菌屬、短芽孢桿菌屬、雙芽孢桿菌屬、枝芽孢桿菌屬、喜鹽芽孢桿菌屬、Gracillibacillus屬、Salibacillus屬、Marinibacillus屬及芽孢乳桿菌屬細菌中選擇的至少1種的細菌。
(8)鑑定試劑盒，其用於進行(3)～(7)中任一項所述的好氣性產芽孢細菌的鑑定方法。
(9)好氣性產芽孢細菌的鑑定試劑盒，其把由鑑定對象的被鑑定菌製備的核酸作為被檢樣本使用，把以該被檢樣本為模板、進行PCR反應時所得到的特定DNA片段的擴增作為指標，用於鑑定上述被鑑定菌是否是好氣性產芽孢細菌，且用於PCR反應的引物，含有對好氣性產芽孢細菌的16S核糖體RNA基因特異的鹼基序列或該鹼基序列的互補序列，且含有該特異性鹼基序列是序列號1～6中所示的鹼基序列的某一個的寡核苷酸的至少1種。
(10)(9)中所述的好氣性產芽孢細菌的鑑定試劑盒，其中，還含有用作凝膠電泳用標記物的、包含多種不同長度的指標用DNA片段的DNA片段混合物，並在該DNA片段混合物中，含有具有0.1kb長度的指標用DNA片段。
(11)(9)或(10)中所述好氣性產芽孢細菌的鑑定試劑盒，其中，還含有由被鑑定菌製備核酸時的試劑組。
(12)(9)～(11)中任一項所述的好氣性產芽孢細菌的鑑定試劑盒，其中，還含有用於PCR反應的試劑。
通過如下所示的說明可充分理解本發明其他的目的、特徵及優點。另外，通過參照附圖的如下說明也可非常明確本發明的益處。


圖1是表示為獲得與本發明有關的寡核苷酸，比較各種細菌的16S核糖體RNA基因的鹼基序列的結果、和當作指標的特定DNA片段區域的示意圖。
圖2是表示在實施例1中，使用與本發明有關的寡核苷酸作為引物，以好氣性產芽孢細菌及其其他的細菌的基因組DNA為模板進行PCR時、擴增產物的電泳結果的示意圖。
圖3是表示在實施例2中，使用與本發明有關的寡核苷酸作為引物，以從食品製造環境中分離的未鑑定細菌2株No.1及No.2的基因組DNA為模板進行PCR時、擴增產物的電泳結果的示意圖。
具體實施例方式
根據圖1對本發明的實施方式之一進行下述詳細說明，但本發明不限於下述內容。
本發明的方式中，按與本發明有關的寡核苷酸、使用此寡核苷酸的與本發明有關的好氣性產芽孢細菌的鑑定方法(以下，有時只簡稱為鑑定方法)、以及與本發明有關的好氣性產芽孢細菌的鑑定試劑盒(以下，有時只簡稱為鑑定試劑盒)的順序，詳細說明本發明。
(1)與本發明有關的寡核苷酸與本發明有關的寡核苷酸，含有對好氣性產芽孢細菌的16S核糖體RNA基因特異的鹼基序列或該鹼基序列的互補序列，具體地說，上述特異性鹼基序列，是含有把序列號1～6中所示的鹼基序列的某一個作為上述特異性鹼基序列的寡核苷酸。
上述寡核苷酸只要是含有序列號1～6中任一項所示的鹼基序列或該鹼基序列的互補序列，均無特別限定。更具體地說，例如，可為以下6種寡核苷酸(a)～(f)。
(a)具有如下所示的鹼基序列(序列號1)，含有24個鹼基。
寡核苷酸(a)(5′)d-ACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGGG(3′)(b)具有如下所示的鹼基序列(序列號2)，含有24個鹼基。
寡核苷酸(b)(5′)d-ACGATGAGTGCTAGGTGTTGGGGG(3′)(c)具有如下所示的鹼基序列(序列號3)，含有22個鹼基。
寡核苷酸(c)(5′)d-TTGAGTTTCAGTCTTGCGAGCG(3′)(d)具有如下所示的鹼基序列(序列號4)，含有22個鹼基。
寡核苷酸(d)(5′)d-TTGAGTTTCAGTCTTGCGACCG(3′)(e)具有如下所示的鹼基序列(序列號5)，含有22個鹼基。
寡核苷酸(e)(5′)d-TTGAGTTTCACTCTTGCGAGCG(3′)(f)具有如下所示的鹼基序列(序列號6)，含有22個鹼基。
寡核苷酸(f)(5′)d-TTGAGTTTCACTCTTGCGACCG(3′)與本發明有關的寡核苷酸，不限於上述(a)～(f)，也可為具有序列號1～6中任一項所示的鹼基序列以外的、具有其鹼基序列的互補序列的物質。並且，在與本發明有關的寡核苷酸中，也可含有序列號1～6中任一項所示的鹼基序列及其鹼基序列的互補序列以外附加的鹼基序列。特別是在與本發明有關的寡核苷酸中，也可以在序列號1～6中任一項所示的鹼基序列及其鹼基序列的互補序列中進行改變，使1～3個範圍內的鹼基被取代、缺失、插入及/或添加。
與本發明有關的寡核苷酸的獲得方法無特別限定。具體地說，可用公知的方法化學合成序列號1～6中任一個鹼基序列或互補序列。
與本發明有關的寡核苷酸優選作為PCR的引物使用，但其鹼基序列及長度(大小)，如後述實施例所示，使用BLAST資料庫測定。具體地說，首先，從資料庫(BLAST)中，抽取Bacillus屬及其近緣的芽孢形成細菌及非芽孢形成細菌的16S核糖體RNA基因序列。之後使用VectorNTI的AlignX基因分析軟體進行比對，並選出與好氣性產芽孢細菌比較共通的區域。
在這些多種的區域中，使之儘量滿足適合作為如下所示的引物的各條件，並確定其鹼基序列和長度。
1.適當的長度(大小)為20～25鹼基。
2.G+C(鳥嘌呤+胞嘧啶)含量優選50％左右。
3.考慮到引物間的互補性，為防止二聚體形成，避開3』末端互補的引物。
4.為避免在引物內形成二級結構，不能含有自體互補序列。
5.儘量選擇2種引物的Tm值接近的引物。
其結果，通過如圖1所示的比對，設計了上述寡核苷酸(a)～(f)。在同一圖中作為「DNA擴增區域」所示的區域相當於用於判斷鑑定對象的被鑑定菌是否是好氣性產芽孢細菌時的被當作指標的「特定的DNA片段」。且，在同一幅圖的左側，Paenib validus以上(圖中線的上側)，表示Bacillus屬及其近緣的芽孢形成細菌的學名，Staphy aureus以下(圖中線的下側)表示非芽孢形成細菌的學名，網線部分表示具有同源性的鹼基。另外，同圖下方的箭頭中，用F表示的箭頭是對應於寡核苷酸(a)·(b)的區域，用R表示的箭頭是對應於寡核苷酸(c)～(f)的區域。
(2)與本發明有關的好氣性產芽孢細菌的鑑定方法與本發明有關的好氣性產芽孢細菌的鑑定方法，是通過把(1)中說明的上述寡核苷酸(a)～(f)作為引物進行PCR反應，使特定的DNA片段擴增，從而以其為指標進行鑑定的方法。
具體地說，在與本發明有關的鑑定方法中，最好包含至少把上述寡核苷酸(a)～(f)作為引物、以進行PCR反應的「PCR過程」，和鑑定由PCR過程獲得的PCR產物中，是否含有被擴增的特定DNA片段的「DNA片段擴增確認步驟」，而且還可包含「被檢樣本製備步驟」等的其他的步驟。
好氣性產芽孢細菌
在本發明中當作鑑定對象的好氣性產芽孢細菌，具體地說，只要是芽孢桿菌(Bacillus)屬及其近緣的細菌，無特別限定，但具體地說，例如，可例舉為芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus)、土芽孢桿菌屬(Geobacillus)、環脂酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、雙芽孢桿菌屬(Amphibacillus)、枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus)、喜鹽芽孢桿菌屬(Halobacillus)、Gracillibacillus屬、Salibacillus屬、Marinibacillus屬、芽孢乳桿菌屬(Sporolactobacillus)等的細菌。上述好氣性產芽孢細菌，其好氣性產芽孢細菌具有形成芽孢的特徵。
上述各好氣性產芽孢細菌，根據其分子系統等，可分類成為多個亞菌群。具體地說，例如，可例舉為芽孢桿菌屬的各種亞菌群；環脂酸芽孢桿菌屬的亞菌群；類芽孢桿菌屬的亞菌群；短芽孢桿菌屬的亞菌群；硫胺素芽孢桿菌屬的亞菌群；土芽孢桿菌屬的亞菌群；枝芽孢桿菌屬、喜鹽芽孢桿菌屬、Gracillibacillus屬、及Salibacillus屬的亞菌群；雙芽孢桿菌屬及芽孢乳桿菌屬的亞菌群等。本發明對於鑑定上述任一個亞菌群的好氣性產芽孢細菌的用途均可適用。
上述各好氣性產芽孢細菌中，芽孢桿菌屬的各種、類芽孢桿菌屬、硫胺素芽孢桿菌屬、土芽孢桿菌屬、環脂酸芽孢桿菌屬及短芽孢桿菌屬的各亞菌群，是特別在食品關係上經常被分離的細菌，針對這些好氣性產芽孢細菌的鑑定，可特別優選使用本發明。
與本發明有關的鑑定方法中，如上述寡核苷酸(a)～(f)等，把含有對好氣性產芽孢細菌的16S核糖體RNA基因特異的鹼基序列或該鹼基序列的互補序列的寡核苷酸作為引物使用。因此，可包羅地鑑定被鑑定菌是否是好氣性產芽孢細菌。
所以，與本發明有關的鑑定方法，因與特定個別屬的以往的技術不同，可迅速地鑑定被鑑定菌是否是形成芽孢的菌，特別在食品行業，可作為迅速鑑定從產品或製造過程中檢測出的細菌是否形成芽孢的檢查方法，優選使用。
PCR步驟
PCR步驟是以由鑑定對象的被鑑定菌製備的核酸為被檢樣本，並以該被檢樣本為模板進行PCR反應的步驟，此時，使用與本發明有關的寡核苷酸，例如上述寡核苷酸作為引物。
在此，上述引物中，含有序列號1或2中所示的鹼基序列或其鹼基序列的互補序列的寡核苷酸可作為正義引物使用。具體地說，上述寡核苷酸(a)～(f)中，寡核苷酸(a)及/或(b)作為正義引物使用。另外，含有序列號3～6中任一個所示的鹼基序列或其鹼基序列的互補序列的寡核苷酸可作為反義引物使用。具體地說，上述寡核苷酸(a)～(f)中，寡核苷酸(c)、(d)、(e)及(f)中的至少一個可作為反義引物使用。
並且，在上述正義引物或反義引物或其任一個引物中，可以只使用1種寡核苷酸，也可以使用2種或大於2種的寡核苷酸。具體地說，作為正義引物，可以只使用寡核苷酸(a)或(b)，也可兩者均使用。同樣，作為反義引物，可使用寡核苷酸(c)～(f)中的任一個，也可使用4種中的2種或大於2種。
在PCR步驟中，用於PCR的試劑、裝置或PCR反應的條件無特別限定，試劑可優選使用市場銷售的PCR試劑盒或裝置，反應溫度、反應時間、循環次數等條件可對應於PCR試劑盒或裝置的種類適宜設定。
DNA片段擴增確認步驟
只要是在上述PCR步驟中所得到的PCR產物中，鑑定是否有被擴增的特定DNA片段的步驟的DNA片段擴增確認步驟，均無特別限定。在與本發明有關的鑑定方法中，以上述特定DNA片段的擴增為指標，可鑑定當作鑑定對象的被鑑定菌是否是好氣性產芽孢細菌。
確認上述特定DNA片段的擴增的方法，無特別限定，但一般優選使用凝膠電泳法的方法。通過凝膠電泳的方法，是在使用核酸的實驗中一般被廣泛使用的技術，可準確且有效地分離DNA、RNA等核酸的同時，還可通過凝膠的染色確認其大小(長度)。對於進行凝膠電泳法的裝置或電泳條件無特別限制，可優選使用市場銷售的電泳裝置等，並用適應於該裝置的條件進行電泳即可。
在DNA片段擴增確認步驟中確認的上述特定DNA片段的長度，從圖1所示的「DNA擴增區域」中也可明確知道，為約100bp。換句話說，被擴增的上述特定的DNA片段，通過凝膠電泳分離，具有在0.1kb附近被檢測出的長度。例如，如圖1所示的實例中，101個鹼基被擴增了。由於好氣性產芽孢細菌的種類不同，且考慮到該區域中發生鹼基的缺失或添加，所以至少具有90～110bp範圍內、優選為100bp～110bp範圍大小的DNA片段可被擴增。換句話說，只要在上述範圍內，即可看做具有0.1kb的大小。因此，在DNA片段擴增確認步驟中，只需確認是否能檢測出具有通過凝膠電泳分離而可在0.1kb附近被檢測出的長度的DNA片段即可。
其他步驟
與本發明有關的鑑定方法中，只要包含上述PCR步驟及DNA片段擴增確認步驟即可，但也可包含其他步驟，例如被檢樣本製備步驟。
被檢樣本製備步驟，在上述PCR步驟的前段，由一定量的被鑑定菌利用公知的方法製備染色體DNA等的核酸即可。通過菌體的核酸的製備方法無特別限定，因可優選使用公知的方法，所以最好利用市場銷售的DNA製備試劑盒等。
其他，也可包含、把從檢查對象的產品或製造過程中的機械·裝置等中分離的被鑑定菌進行一定量培養的被鑑定菌培養過程等。此時的培養基或培養條件也無特別限定，可適宜選擇公知的培養基或培養條件。
(3)與本發明有關的好氣性產芽孢細菌的鑑定試劑盒與本發明有關的好氣性產芽孢細菌的鑑定試劑盒，只要是進行(2)中說明的上述好氣性產芽孢細菌的鑑定方法的鑑定試劑盒均可。具體地說，作為用於PCR反應的引物，可例舉為，至少是含有包含對好氣性產芽孢細菌的16S核糖體RNA基因特異性的、序列號1～6中任一個的鹼基序列或該鹼基序列的互補序列的寡核苷酸的組成，優選為包含進行上述各步驟的試劑類等的組成。
例如，與本發明有關的鑑定試劑盒中，含有上述序列號1～6中任一個鹼基序列或該鹼基序列的互補序列的寡核苷酸，作為正義引物最好包含上述寡核苷酸(a)·(b)的至少一方，作為反義引物最好包含寡核苷酸(c)～(f)的至少任一個。上述寡核苷酸，只要能作為PCR反應的引物使用，可為任何狀態，例如，也可為溶解於緩衝液的溶液狀態。
與本發明有關的鑑定試劑盒，可包含用於實施上述各過程的試劑類等，此種試劑類可例舉為，用於PCR反應的試劑組、用於確認DNA片段擴增的試劑組、由被鑑定菌製備核酸時的試劑組、用於培養被鑑定菌的試劑組等。這些試劑組至少含有1種為好。且此處所述的試劑組，最好含有用於上述過程實施的試劑、實驗用材料、或1次性實驗用具等的2種或大於2種。
用於PCR的試劑組，具體地說，可例舉為dNTP、Taq聚合酶(polymerase)、及用於Taq聚合酶(polymerase)的緩衝液(Taq Buffer)等。其他，根據需要，還可添加微型離心管等的試驗用材料。
用於確認DNA片段擴增的試劑組，通過凝膠電泳確認擴增時，可例舉為用於製成電泳用凝膠的瓊脂糖、緩衝液、凝膠電泳用標記物等。其中，凝膠電泳用標記物，雖最好含有多種不同長度的用作指標的DNA片段的DNA片段混合物，但該DNA片段混合物中，需含有具有0.1kb長度的用作指標的DNA片段。如上所述，作為鑑定指標的特定的DNA片段，因具有約100bp的大小，所以非常優選在凝膠電泳用標記物中，含有在電泳上、可明確區分出此大小的條帶的指標用DNA片段。並且，用於此凝膠電泳用標記物的DNA片段的來源，無特別限定。
其他，由被鑑定菌製備核酸時的試劑組，可例舉為公知的DNA製備試劑盒，用於培養被鑑定菌的試劑組，可例舉為培養基或其原料。
(4)本發明的用途與本發明有關的寡核苷酸及使用其的鑑定方法、以及鑑定試劑盒的用途無特別限定，可用於鑑定好氣性產芽孢細菌所需的全部用途。具體地說，例如，由於微生物汙染而對質量造成很大影響的各種工業產品的製造工序中，鑑定從同工業產品或其製造環境等中分離的菌是否是好氣性產芽孢細菌的場合時，可優選使用。
成為鑑定對象的被鑑定菌來源的上述工業產品，代表的可例舉為食品、飲料、醫藥品·試劑·醫藥保健品、一次性醫療器具等，但無特別限定。上述食品，更具體地說，可例舉為麵包、日式西式點心(包含冷點心)、副食食品、乳製品、穀類早餐食品、豆腐·油炸豆腐類、麵食類、盒飯類、調料、小麥粉或肉食等的農產品加工品、營養輔助食品(營養補充食品等)、可長期保存的食品(罐頭、冷凍食品、高溫蒸煮食品等)，但無特別限定。飲料，更具體地說可例舉為各種清涼飲料、礦泉水、牛乳·乳飲料、清酒、啤酒、發泡酒等，但無特別限定。醫藥品·試劑·醫藥保健品，更具體地說，例如可為面向各種醫療機構的醫藥品、各種大眾藥、臨床檢查藥、試驗用試劑類、其他檢查藥的全部等，但無特別限定。一次性醫療器具更具體地說，例如，可為注射器等，但無特別限定。
工業產品的製造設備中，空中浮遊菌也好、表面附著菌也好、其他菌也好，均可當作被鑑定菌。空中浮遊菌的分離，可採用平板沉降法、空氣浮遊菌採樣器法等的方法，但無特別限定。表面附著菌的分離中，可使用抹片試驗法、stampagar method等的方法，但無特別限定。
且本發明並不限於以上所述的各構成，在專利要求範圍所示的範圍內可進行種種變更，適當組合不同的實施形態中各種被公開了的技術手段後所得到的實施形態，也包含於本發明的技術範圍內。
以下，將本發明以實施例、圖2及圖3為基礎更具體地說明，但本發明不限於此。
〔實施例1引物的好氣性產芽孢細菌檢測力的測定〕使用鑑別芽孢桿菌屬(Bacillus屬)及對其近緣的好氣性產芽孢細菌的16S核糖體RNA基因特異的基因序列後設計的引物、進行PCR，並評價了是否可檢測出好氣性產芽孢細菌及其以外的細菌。
被檢樣本製備過程
使用與芽孢桿菌屬(Bacillus屬)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus屬)、硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus屬)、環脂酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus屬)、及芽孢桿菌屬(Bacillus屬)細菌的基因序列比較類似的非芽孢形成細菌。被檢樣本所使用的細菌如表1所示。用對上述各菌株最適的培養條件培養的菌株，使用基因組DNA純化試劑盒(Edge Biosystems公司制)，根據添加方案，製備了基因組DNA。
〔表1〕Bacillus屬細菌
1枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(IFO13719)
2球形芽孢桿菌(B.sphaericus)(NBRC15095)3蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)(IAM12605)4凝結芽孢桿菌(B.coagulans)(IAM12463)5巨大芽孢桿菌(B.megaterium)(JCM2506)Bacillus屬的近緣好氣性產芽孢細菌
6Paenibacillus validus(BUB75)7Paenibacillus illinoisensis(IFO15379)8Aneurinibacillus aneurinolyticus(IAM1077)9酸土環脂芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)(ATCC49025)10酸熱脂環酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)(JCM5260)非芽孢形成細菌
11金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC9144)12頭狀葡萄球菌(Staphylococcus capitis)(ATCC27840)13唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius)(SAM0180)14德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)(IAM1928)引物的設計與合成
從資料庫(BLAST)中抽取芽孢桿菌屬(Bacillus屬)與其近緣的好氣性產芽孢細菌[例如，類芽孢桿菌屬(Paenibacillus屬)、硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus屬)、土芽孢桿菌屬(Geobacillus屬)、環脂酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus屬)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus屬)等]、及非芽孢形成細菌的16S核糖體RNA基因序列，使用VectorNTI的AlignX的基因分析軟體進行比對，選出與好氣性產芽孢細菌比較共同的區域。其中，選擇序列號1～6的序列，化學合成與其具有同樣序列的寡核苷酸，並作為引物使用。以下，將各引物分別稱作寡核苷酸(a)～(f)。
PCR步驟·DNA片段擴增確認步驟
以上述基因組DNA為模板，使用上述寡核苷酸(a)～(f)，製備了表2所示的樣品後進行PCR反應。且PCR反應使用Biometra公司制的TGRAGIENT進行，PCR條件如表3所示。PCR反應結束後，根據Agilent2100生物分析儀(Agilent Technologies公司制)中附加的方案進行分析，確認了DNA的擴增帶及其擴增帶的大小。
結果
通過生物分析儀進行電泳的結果如圖2所示。圖2中分別表示了泳道1是分子量marker，泳道2是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(IFO13719)的結果，泳道3是球形芽孢桿菌(B.sphaericus)(NBRC15095)的結果，泳道4是蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)(IAM12605)的結果，泳道5是凝結芽孢桿菌(B.coagulans)(IAM12463)的結果，泳道6是巨大芽孢桿菌(B.megaterium)(JCM2506)的結果，泳道7是Paenibacillus validus(BUB75)的結果，泳道8是P.illinoisensis(IFO15379)的結果，泳道9是Aneurinibacillus aneurinolyticus(IAM1077)的結果，泳道10是酸土環脂芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)(ATCC49025)的結果，泳道11是酸熱脂環酸芽孢桿菌(A.acidocaldarius)(JCM5260)的結果，泳道12是金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC9144)的結果，泳道13是頭狀葡萄球菌(Staphylococcus capitis)(ATCC27840)的結果，泳道14是唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius)(SAM0180)的結果，以及泳道15是德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)(IAM1928)的結果。
圖2中只有泳道2～11中所示的好氣性產芽孢細菌在100bp附近檢測出了擴增帶，而顯示了好氣性產芽孢細菌以外的細菌結果的泳道12～15中，未檢測出100bp附近的擴增帶。因此，具有約100bp大小的DNA片段，對好氣性產芽孢細菌具特異性，可以說，將此DNA片段的有無作為指標，可很容易地判斷出是否是好氣性產芽孢細菌。
〔實施例2從食品製造環境中分離的未鑑定細菌株的檢測鑑定〕對於未鑑定細菌株，通過將有無100bp的DNA片段作為指標判斷是否是好氣性產芽孢細菌的結果，與該細菌的鑑定結果比較，探討了與本發明有關的好氣性產芽孢細菌的檢測鑑定方法的妥當性。
被檢樣本製備步驟
把從食品製造環境中分離的未鑑定細菌2株(No.1及No.2)置於胰酪蛋白腖大豆瓊脂培養基(BBL公司制)中，於35℃，好氣條件下培養。挑取培養基上的菌體1個菌落，使用Genomic DNA Purification Kit(Edge10B.縱向病例

No.1中，在100bp附近檢測出擴增帶，可判定該細菌是好氣性產芽孢細菌。而且用顯微鏡觀察時，也確認了芽孢的形成。另外，使用Api50CHB(日本Biomerieux公司制)，根據附加的方案，進行該細菌的鑑定時，鑑定出是好氣性產芽孢細菌的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。因此與以100bp的擴增帶為指標進行判斷的結果一致。
另外，在No.2中，100bp附近未檢測出擴增帶，可判定其不是好氣性產芽孢細菌。對於該細菌的16S核糖體RNA基因的部分鹼基序列進行測序鑑定時，判明了其不是好氣性產芽孢細菌，而是甲基桿菌屬(Methylobacterium)細菌。因此，No.2與以100bp的擴增帶為指標進行判斷的結果一致，可說明將有無100bp附近的擴增帶作為指標，以檢測鑑定是否是好氣性產芽孢細菌的方法是妥當的。
由以上結果，以與本發明有關的寡核苷酸(a)～(f)為引物、進行PCR擴增等的擴增反應時，由特異性DNA片段(約100bp)是否被擴增，可簡便地鑑定被鑑定菌是否是好氣性產芽孢細菌。也就是說，與本發明有關的鑑定方法，是好氣性產芽孢細菌的有效的檢測及鑑定手段。同時，也可以說，如將含有的上述寡核苷酸試劑盒化，即可提供好氣性產芽孢細菌的鑑定試劑盒。
並且，在具體實施方式
中舉出的具體實施形態或實施例，無論如何也只不過是明確本發明技術內容的內容，而不應狹義地理解為只限於其具體實例，在本發明的精神和以下所述的權利要求的範圍內，可進行各種變更。
通過以與本發明有關的寡核苷酸為引物，以從被鑑定菌中獲得的染色體DNA等為模板，進行PCR擴增等的擴增反應，可擴增芽孢桿菌屬及其近緣的好氣性產芽孢細菌的16S核糖體RNA基因中存在的特異性DNA片段。由此，通過上述的擴增反應，由該特異性DNA片段(約0.1kb)是否被擴增，可迅速地鑑定出被鑑定菌是否是芽孢桿菌屬及其近緣的好氣性產芽孢細菌。另外，通過將含有的上述寡核苷酸試劑盒化，可提供好氣性產芽孢細菌的鑑定試劑盒。
因此，根據本發明，可迅速且包羅地進行至今為止認為困難的好氣性產芽孢細菌的檢測，且行之有效。
迄今為止，為鑑定是否是形成芽孢的細菌(好氣性產芽孢細菌)時，必須在芽孢形成培養基上培養被鑑定菌，再用顯微鏡確認該菌是否形成了芽孢。所以，到鑑定出為止，需要數日～1星期的非常長的時間。而根據本發明，半日左右即可鑑定出是否是好氣性產芽孢細菌，使簡便且迅速地鑑定出是否是好氣性產芽孢細菌成為可能。
所以，本發明可利用於食品製造業、飲食行業、藥品行業等的衛生管理、過程管理、質量管理。並且，萬一檢測出有微生物汙染時，也可通過迅速鑑定該細菌是否是好氣性產芽孢細菌，而可針對情況迅速採取措施。
序列表110三得利株式會社120用於好氣性產芽孢細菌鑑定的寡核苷酸以及使用此寡核苷酸的好氣性產芽孢細菌的鑑定方法和鑑定試劑盒130p03-0094150JP 2003-3461671512003-10-31606170PatentIn Ver.2.1210121124212DNA213人工序列220
223人工序列的描述人工合成的序列4001acgatgagtg ctaagtgttg gggg 24210221124212DNA
213人工序列220
223人工序列的描述人工合成的序列4002acgatgagtg ctaggtgttg gggg 24210321122212DNA213人工序列220
223人工序列的描述人工合成的序列4003ttgagtttca gtcttgcgag cg 22210421122212DNA213人工序列220
223人工序列的描述人工合成的序列4004ttgagtttca gtcttgcgac cg 22210521122212DNA
213人工序列220
223人工序列的描述人工合成的序列4005ttgagtttca ctcttgcgag cg 22210621122212DNA213人工序列220
223人工序列的描述人工合成的序列4006ttgagtttca ctcttgcgac cg 2權利要求
1.寡核苷酸，其特徵在於，含有對好氣性產芽孢細菌的16S核糖體RNA基因特異的鹼基序列或該鹼基序列的互補序列，且上述特異性鹼基序列是序列號1～6中所示的鹼基序列的任一個。
2.權利要求1中所述的寡核苷酸，其特徵在於，上述好氣性產芽孢細菌屬於從芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、硫胺素芽孢桿菌屬、土芽孢桿菌屬、環脂酸芽孢桿菌屬、短芽孢桿菌屬、雙芽孢桿菌屬、枝芽孢桿菌屬、喜鹽芽孢桿菌屬、Gracillibacillus屬、Salibacillus屬、Marinibacillus屬及芽孢乳桿菌屬細菌中選擇的至少1種的細菌。
3.好氣性產芽孢細菌的鑑定方法，其特徵在於，把由鑑定對象的被鑑定菌製備的核酸作為被檢樣本使用，把以該被檢樣本為模板進行PCR反應時所得到的特定DNA片段的擴增作為指標，鑑定上述被鑑定菌是否是好氣性產芽孢細菌，用於PCR反應的引物，使用含有對好氣性產芽孢細菌的16S核糖體RNA基因特異的鹼基序列或該鹼基序列的互補序列的寡核苷酸的至少1種，同時，上述特異性鹼基序列是序列號1～6中所示的鹼基序列的任一個。
4.權利要求3中所述的好氣性產芽孢細菌的鑑定方法，其特徵在於，上述引物中，含有序列號1或2中所示的鹼基序列或其鹼基序列的互補序列的寡核苷酸作為正義引物使用，同時，含有序列號3～6中任一個所示的鹼基序列或其鹼基序列的互補序列的寡核苷酸作為反義引物使用。
5.權利要求3或4中所述的好氣性產芽孢細菌的鑑定方法，其特徵在於，上述正義引物及反義引物的至少一方，使用2種或大於2種的含有上述特異性鹼基序列或該鹼基序列的互補序列的寡核苷酸。
6.權利要求3～5中任一項所述好氣性產芽孢細菌的鑑定方法，其特徵在於，被擴增的上述特定的DNA片段具有通過凝膠電泳分離，可在0.1kb附近被檢測出的長度。
7.權利要求3～6中任一項所述好氣性產芽孢細菌的鑑定方法，其特徵在於，上述好氣性產芽孢細菌屬於從芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、硫胺素芽孢桿菌屬、土芽孢桿菌屬、環脂酸芽孢桿菌屬、短芽孢桿菌屬、雙芽孢桿菌屬、枝芽孢桿菌屬、喜鹽芽孢桿菌屬、Gracillibacillus屬、Salibacillus屬、Marinibacillus屬及芽孢乳桿菌屬細菌中選擇的至少1種的細菌。
8.鑑定試劑盒，其用於進行權利要求3～7中任一項所述的好氣性產芽孢細菌的鑑定方法。
9.好氣性產芽孢細菌的鑑定試劑盒，其特徵在於，把由鑑定對象的被鑑定菌製備的核酸作為被檢樣本使用，把以該被檢樣本為模板進行PCR反應時所得到的特定的DNA片段的擴增作為指標，鑑定上述被鑑定菌是否是好氣性產芽孢細菌，用於PCR反應的引物，含有對好氣性產芽孢細菌的16S核糖體RNA基因特異的鹼基序列或該鹼基序列的互補序列，且該特異性鹼基序列是序列號1～6中所示的鹼基序列的某一個的寡核苷酸的至少1種。
10.權利要求9中所述的好氣性產芽孢細菌的鑑定試劑盒，其特徵在於，還含有作為凝膠電泳用標記物使用，且包含多種長度不同的用作指標的DNA片段的DNA片段混合物，且該DNA片段混合物中，含有具有0.1kb長度的用作指標的DNA片段。
11.權利要求9或10中所述好氣性產芽孢細菌的鑑定試劑盒，其特徵在於，還含有由被鑑定菌製備核酸時的試劑組。
12.權利要求9～11中任一項所述的好氣性產芽孢細菌的鑑定試劑盒，其特徵在於，還含有用於PCR反應的試劑組。
全文摘要
本發明涉及的寡核苷酸，含有對好氣性產芽孢細菌的16S核糖體RNA基因特異的鹼基序列或該鹼基序列的互補序列，且上述特異性鹼基序列是序列號1～6中所示的鹼基序列的任一個。此寡核苷酸用作，以由鑑定對象的被鑑定菌製備的核酸為被檢樣本，以該被檢樣本為模板進行PCR反應時的引物。由此，以特定的DNA片段的擴增為指標，可鑑定被鑑定菌是否是好氣性產芽孢細菌。
文檔編號C12N15/11GK1863925SQ20048002880
公開日2006年11月15日 申請日期2004年9月29日 優先權日2003年10月3日
發明者山中實喜子, 村田將一 申請人:三得利株式會社