治療和診斷年齡相關性黃斑變性的方法和試劑的製作方法

2023-05-31 11:11:51

治療和診斷年齡相關性黃斑變性的方法和試劑的製作方法
【專利摘要】本發明涉及與AMD危險提高或降低相關的因子H基因多態性和單元型。本發明提供了診斷和治療AMD的方法和試劑。
【專利說明】治療和診斷年齡相關性黃斑變性的方法和試劑
[0001]本申請是發明人於2006年2月14日提交的題為「治療和診斷年齡相關性黃斑變性的方法和試劑」的中國專利申請200680012494.9的分案申請。
[0002]相關文獻的交叉參考
[0003]本申請要求U.S.臨時申請N0.60/650, 078 (2005年2月14日提交)、60/717,861(2005 年 9 月 16 日提交)、60/715，503 (2005 年 9 月 9 日提交)和60/735，697 (2005年11月9日提交)的權益，所述文獻均以其全部內容引入本文為參考。
[0004]聯邦資助的研發中產生的發明的權利陳述
[0005]本申請所述工作部分由NIH眼科研究院基金EY11515資助。美國政府擁有本發明的某些權利。 【背景技術】
[0006]年齡相關性黃斑變性(AMD)是發達國家中引起不可逆失明的最主要原因(綜述參閱，Zarbin, 1998, 2004 ;Klein 等，2004 ；Ambati 等，2003 ；de Jong, 2004 ；van Leeuwen 等，
2003)，影響約15%的60歲以上個體。估計有6億個體在這一年齡統計範圍內。AMD的患病數隨年齡提高，在75歲及以上的群體中，輕度或早期形式在近30%的個體中發生，高級形式在約7%的個體中發生(Klein等，1992 ;Vingerling等，1995a，1995b)。在臨床上，AMD的特徵為由黃斑中發生的退化性變化引起的漸進性中央視覺喪失，黃斑是視網膜神經中的特化區域及其下層組織。在最嚴重或滲出性的疾病形式下，來自脈絡膜脈管系統的新生血管葉突破了 Bruch膜和視網膜色素上皮(RPE)，一般引起視網膜脫落和其後的變性。
[0007]AMD作為遲發性複合疾病，似乎由遺傳和環境因素的組合引起和/或調節(Seddon和Chen，2004 ;Tuo等，2004 ；Klein和Francis，2003)。家族性聚集研究估計遺傳組分主要參與了多達25%的疾病(Klaver等，1998a)。根據流行的假說，多數AMD病例不是多種單基因病症的集合，而是代表定量的表型、表示多種易患基因座的相互作用。所涉及的基因座數、所賦予的歸因危險度和多個基因座之間的相互作用仍不清楚。
[0008]連鎖和候選基因篩選分析已經對AMD的遺傳學提供了有限的了解。已經報導了一個增加危險的基因，ABCA4 (Allikmets等，1997)和一個降低危險的基因，ApoE4 (Klaver等，1998b，Souied等，1998)對AMD的可靠關聯。，此外，一些小組報導了全基因組連鎖分析的結果(綜述於Tuo等，2004 ;Weeks等，2004)。已經證明了一個有AMD表型的家族與特定染色體區域Iq25_q31 (ARMDl)的連鎖(Klein等，1998)。已經提出HEMICENTIN-l基因為致病基因(Schultz等，2003)，儘管其作用還沒有可靠地得到確認。若干研究(Weeks等，2001 ;Iyengar等，2003 ;Weeks等，2004)中染色體Iq上重疊基因座的鑑定提示該基因座可能包含一個或多個AMD相關基因。
[0009]最近對玻璃疣(與AMD發病相關的特徵性眼損傷)的研究已經指出了炎症和其他免疫介導過程(特別是補體活化)在AMD早期和晚期形式的病因學中的作用(Hageman等，1999,2001 ；Mullins 等，2000,2001 ;Russell 等，2000 ;Anderson 等，2002，2004 Johnson等,2000, 2001 ；Crabb 等,2002 ；Ambati 等,2003 ；Penfold 等,2001 ；Espinosa-Heidman 等，2003)。這些研究已經揭示了沿著bruch膜(由彈性蛋白質和膠原組成的分隔RPE和脈絡膜的細胞外層)的玻璃疣中和RPE細胞上的玻璃疣中的末端途徑補體組分(C5、C6、C7、C8和C9)和末端途徑的活化特異性補體蛋白質片段(C3b、iC3b、C3dg和C5b-9)以及多種補體途徑調節子和抑制子(包括因子H、因子1、因子0、CD55和CD59) (Johnson等，2000，2001 ；Mullins等2000，2001 ;Crabb等，2002)。許多這些玻璃疣相關分子先前認為是主要由肝合成的循環血漿蛋白質。有趣的是，許多這些玻璃疣相關分子似乎還由RPE和/或脈絡膜細胞局部合成。
[0010]補體系統的活化在正常宿主的防禦和損傷應答中發揮關鍵作用(Kinoshita，1991)。這一系統的不適當活化和/或控制(常由特異性補體相關基因的突變引起)可引起自身免疫後遺症和局部組織破壞(Holers, 2003 ；Liszewski and Atkinson, 1991 ；Morganand Walport, 1991 ；Shen and Meri, 2003),就像動脈粥樣硬化(Torzewski 等，1997 ；Niculescu等，1999)、阿爾茨海默病(Akiyama等,2000)和腎小球腎炎(Schwertz等,2001)中所顯示的那樣。
[0011]2型膜性增生性腎小球腎炎(MPGN II) 一種罕見疾病，與補體級聯繫統旁路途徑的非受控系統性活化相關。該疾病的特徵為腎小球基底膜中異常電子密度物質的沉積，最終導致腎衰竭，其中所述異常電子密度物質由補體旁路途徑中涉及的蛋白質C3和C3c組成。有趣的是，許多MPGNII患者發生了斑狀玻璃疣、RPE脫離和脈絡膜新生血管膜，它們在臨床上和組成上均與AMD中形成的有所不同，儘管它們常在十至二十歲中檢測到(Mullins等，2001 ；0 ' Brien 等，1993 ；Huang 等，2003 ；Colville 等，2003 ；DuvalI — Young 等，1989a, 1989b ；Raines 等，1989 ；Leys 等，1990 ；McAvoy and Silvestri, 2004 ；Bennett 等，1989 ；0rth and Ri tz, 1998 ；Habib 等，1975)。
[0012]在多數MPGNII患者中，補體級聯繫統的調節失能是由針對C3bBb的自身抗體介導的。然而，其他MPGNII患者在因子H中存在突變(Ault等，1997 ;Dragon_Durey等，
2004)，因子H是旁路補體途徑的主要抑制子。因子H中的點突變(I1166R)在約克豬中引起MPGNII (Jansen等，1998)，因子H缺陷型小鼠發生嚴重腎小球腎炎(Pickering等，2002)。此外，一些患MPGNIII的擴大家族(相關疾病)的患病個體顯示對染色體lq31_32的連鎖(Neary等，2002)，lq31_32是與在AMD的全基因組連鎖研究(見上文)中已經鑑定的基因座重疊的區域。這一特定基因座包含大量補體途徑相關基因。這些基因的一個組稱為補體活化調節子(RCA)基因簇，含有編碼因子H、五種因子H相關基因(CFHR1、CFHR2、CFHR3、CFHR4和CFHR5)和凝固因子XIII β亞基的基因。補體途徑相關基因的第二個簇與lq25_31基因座毗鄰，包括 C4BPA、C4BPB、C4BPAL2、DAF(CD55) CR1、CR2、CRlL 和 MCP (CD46)。
[0013]發明概述
[0014]本發明涉及補體因子H基因的多態性和單元型，所述基因與年齡相關性黃斑變性(AMD)和2型膜性增生性腎小球腎炎(MPGNII)的發生相關。本發明還涉及補體因子H相關5(CFHR5)基因的多態性和單元型，所述基因與AMD和MPGNII的發生相關。本發明提供診斷、監測和治療這些以及其他疾病的方法。
[0015]在一方面中，本發明提供用於確定受試者發生年齡相關性黃斑變性(AMD)的傾向的診斷方法，所述方法包括檢測因子H基因多個多態性位點中變異的存在與否。在一個實施方案中，本發明提供診斷對發生AMD的易感性增加的方法，包括檢測個體中因子H基因多態性的存在與否。該方法可包括獲得來自個體的DNA和分析來自該個體的DNA以確定該DNA是否在因子H基因中含有多態性。某些多態性指示，該個體與對照群體相比發生AMD的易感性增加。某些多態性指示該個體發生AMD的可能性降低。某些多態性指示該個體發生AMD的可能性既沒有增加也沒有降低。
[0016]在一個實施方案中，受試者發生年齡相關性黃斑變性(AMD)的傾向的診斷方法包括獲得來自該受試者的DNA樣品和檢測該患者的DNA中是否存在與發生AMD相關的多態性，存在該多態性指示該受試者發生AMD的傾向提高，不存在該多態性指示該受試者發生AMD的傾向降低。
[0017]在相關的方面中，本發明提供診斷對發生AMD的易感性的方法，包括確定個體的因子H單元型。該方法包括獲得來自個體的DNA和分析該個體的DNA以確定其因子H單元型。某些單元型(危險單元型)指示該個體對發生AMD的易感性提高。某些單元型(保護性單元型)指示該個體對發生AMD的易感性降低。某些單元型(中性單元型)指示該個體對發生AMD的可能性既不提高也不降低。
[0018]在相關的實施方案中，通過分析該基因編碼的基因產物(如RNA或因子H蛋白質(如蛋白質同種型))來確定因子H基因的多態性位點中變異的存在與否。變體蛋白質的表達指示因子H基因的變異，並可指示提高或降低的發生AMD的傾向。可以使用免疫測定和其他方法檢測蛋白質。[0019]在另一相關的實施方案中，本發明提供通過檢測個體生物樣品中的變體因子H多肽來診斷髮生AMD或其他疾病的易感性的方法。在一個實施方案中，使用基於抗體的測定診斷個體中的AMD或其他疾病，其中使該個體的生物樣品(如血清樣品)接觸抗體並檢測變體因子H多肽的存在與否。在實施方案中，該抗體與變體因子H多肽特異性表位(即在野生型因子H多肽中未發現)特異性相互作用。在實施方案中，使用基於分離的測定(如PAGE)診斷個體中的AMD或其他疾病，其中檢測個體的生物樣品(如血清樣品)中變體因子H多肽的存在與否。
[0020]在一個方面中，本發明提供通過調節因子H的類型和/或全身和/或眼水平的量來治療患AMD (如其中檢測到指示發生症狀AMD的危險提高的多態性或單元型的個體)或其他變體因子H基因相關疾病的個體的方法。該因子H多肽可以是野生型因子H多肽或變體因子H多肽。該因子H多肽可以是這樣的因子H多肽，即其具有中性或保護性等位基因而不是危險單元型相關等位基因編碼的序列。在一個實施方案中，該方法包括對個體施用有效量的因子H多肽，以降低疾病症狀。在一個實施方案中，該方法包括對個體施用有效量的因子H多肽，以降低發生疾病症狀的傾向並延緩疾病的發生和發展。在一個實施方案中，該方法包括施用包含因子H的血液。在一個實施方案中，該方法包括施用核酸(如轉基因)，所述核酸包含編碼因子H多肽的核苷酸序列。在一個實施方案中，該方法包括施用表達因子H多肽的細胞。
[0021]在一個方面中，本發明提供治療患AMD(如其中檢測到指示發生症狀AMD的危險提高的多態性或單元型的個體)或其他變體因子H基因相關疾病的個體的方法。在一個實施方案中，該方法包括對患者施用有效量的降低變體因子H的量或編碼因子H的基因表達的物質，以減少患者的疾病症狀。在相關實施方案中，對個體施用治療量的變體因子H多肽抑制劑(如滅活劑)。[0022]在一個實施方案中,對個體施用抑制性核酸(如與變體因子H多肽的核苷酸序列至少部分互補的RNA)。在一個實施方案中，施用純化的反義RNA，其與編碼變體因子H多肽的RNA互補。
[0023]在另一實施方案中，對個體施用治療量的抗CFH抗體，所述抗體足以部分滅活變體因子H多肽。
[0024]在另一實施方案中，治療個體以從血中除去因子H的有害形式(如通過血漿去除術、抗體指導的血漿去除術或與因子H結合部分如肝素的複合)。
[0025]在一個方面中，本發明提供編碼變體因子H多肽的純化DNA、編碼變體因子H多肽的純化RNA，與編碼變體因子H多肽的RNA互補的純化反義RNA以及純化的變體因子H多肽。在相關方面中，本發明提供用於表達野生型或變體因子H多肽或因子H生物活性片段的核酸。
[0026]在一個方面中，本發明提供包含編碼因子H多肽的核酸的基因治療載體。該載體可包括驅動因子H基因在多種細胞類型中表達的啟動子。備選地，該載體可包括驅動因子H基因僅在特定細胞 類型(如視網膜細胞或腎細胞)中表達的啟動子。在一個方面中提供了含有編碼因子H蛋白質的基因治療載體和可藥用賦形劑的藥物組合物，其中該組合物不含有病原體，並適於對人類患者施用。在一個實施方案中，所編碼的因子H多肽為保護性變體。
[0027]在一個方面中，本發明提供含有重組或純化的因子H多肽的組合物，其中所述多肽為保護性多肽。
[0028]在相關方面中，本發明提供含有重組或純化的因子H多肽和可藥用賦形劑的藥物組合物，其中所述組合物不含有病原體，並適於對人類患者施用。在一個實施方案中，編碼的因子H多肽具有野生型序列。在一個實施方案中，編碼的因子H多肽為保護性變體。
[0029]在一個方面中，本發明提供抗體，所述抗體與變體因子H多肽而不是野生型因子H多肽特異性相互作用。這些抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，並可通過消減技術獲得。這些抗體足以滅活變體因子H多肽。在相關方面中，本發明提供含有抗因子H抗體和可藥用賦形劑的藥物組合物，其中所述組合物不含有病原體，並適於對人類患者施用。
[0030]在一個方面中，本發明提供鑑定與發生AMD的危險提高或降低相關的變體因子H蛋白質的方法。在一個實施方案中，本發明提供鑑定保護性因子H蛋白質的方法，所述方法通過(a)鑑定具有保護性單元型的個體，和(b)確定在個體基因組中編碼的因子H的胺基酸序列，其中保護性因子H蛋白質由具有保護性單元型的等位基因編碼。在一個實施方案中，本發明提供鑑定中性因子H蛋白質的方法，所述方法通過(a)鑑定具有中性單元型的個體，和(b)確定在個體基因組中編碼的因子H的胺基酸序列，其中中性因子H蛋白質由具有中性單元型的等位基因編碼。在相關實施方案中，本發明提供鑑定與發生AMD的危險降低相關的因子H變體形式的方法，包括(a)鑑定具有與發生AMD的危險降低相關的單元型或二倍型(diplotype)的個體；(b)獲得來自個體的基因組DNA或RNA ;和(c)確定在個體基因組中編碼的因子H的胺基酸序列，其中保護性因子H蛋白質由具有與發生AMD的危險降低相關的等位基因編碼。在實施方案中，所述保護性或中性因子H蛋白質不具有野生型因子H多肽的胺基酸序列。
[0031]在相關方法中，鑑定與發生AMD的危險提高相關的因子H形式，是通過(a)鑑定具危險單元型的個體；和(b)確定在個體基因組中編碼的因子H的胺基酸序列，其中危險因子H蛋白質由具危險單元型的等位基因編碼。在相關實施方案中，本發明提供了鑑定與發生AMD的危險提高相關的因子H的變體形式的方法，包括(a)鑑定具有與發生AMD的危險提高相關的單元型或二倍型的個體；(b)獲得來自該個體的基因組DNA或RNA ;和(c)確定在個體基因組中編碼的因子H的胺基酸序列，其中危險因子H蛋白質由具有與發生AMD的危險提高相關的單元型的等位基因編碼。在實施方案中，所述危險因子H蛋白質不具有野生型因子H多肽的胺基酸序列。
[0032]在一個方面中，本發明提供診斷髮生AMD或其他疾病的傾向或易感性的方法，所述方法通過檢測患者的生物樣品中全長因子H與截短因子H的比值。在一個實施方案中，診斷受試者中發生AMD的傾向或易感性的方法包括獲得來自受試者的RNA樣品和檢測患者RNA中外顯子10(即全長因子H)與外顯子10A(即截短的因子H)表達的比值，比值提高指示該受試者發生AMD的傾向或易感性提高，比值降低指示該受試者發生AMD的傾向或易感性降低。在一個實施方案中，診斷受試者中發生AMD的傾向或易感性的方法包括獲得來自受試者的蛋白質樣品和檢測患者蛋白質中全長因子H與截短的因子H的表達比值，比值提高指示該受試者發生AMD的傾向或易感性提高，比值降低指示該受試者發生AMD的傾向或易感性降低。
[0033]在一個方面中，本發明提供細胞，所述細胞含有編碼因子H蛋白質或其片段的重組或純化核酸，例如來自因子H基因的核酸。細胞可以為細菌或酵母或用於研究和藥物開發的任何其他細胞。因此，本發明提供表達重組變體人因子H的分離宿主細胞或細胞系。在實施方案中，變體是危險變體且第402位胺基酸具有組氨酸。在實施方案中，變體是保護性變體且第62位胺基酸為異亮氨酸。在實施方案中，變體為中性變體。在實施方案中，所述危險、保護性或中性變體因子H蛋白質不具有野生型因子H多肽的胺基酸序列。 [0034]在一個方面中，本發明提供轉基因非人動物，其體細胞和生殖細胞含有編碼人變體因子H多肽的轉基因。本發明的轉基因動物可用作AMD模型和用於篩選治療AMD的有用物質。動物可以是小鼠、蟲或用於研究和藥物開發(如重組產生因子H)的任何其他動物。在實施方案中，該因子H為變體人因子H，其中所述變體的第62位胺基酸為異亮氨酸或第402位胺基酸為組氨酸。
[0035]在一個方面中，本發明提供篩選多態性位點的方法，所述多態性位點與表1A、1B和IC所述因子H基因中的多態性位點連鎖。這些方法包括鑑定基因中與因子H基因多態性位點連鎖的多態性位點，其中因子H基因中多態性位點的多態性形式與AMD相關；確定個體群中的單元型，以指示該連鎖的多態性位點是否具有與因子H基因的多態性形式平衡一不平衡的多態性形式，其中因子H基因的多態性形式與AMD表型相關。
[0036]在一個方面中，本發明提供MPGNII的診斷、治療和篩選方法，如上述對AMD進行。
[0037]在一個方面中，本發明提供用於確定受試者發生AMD或MPGNII的傾向的方法，包括檢測CFHR5基因的一個或多個多態性位點中是否存在一個或多個變異。在一個實施方案中，本發明提供診斷對發生AMD或MPGNII的易感性提高的方法，包括檢測個體CFHR5基因中是否存在多態性。該方法可包括獲得自個體的DNA和分析來自該個體的DNA以確定該DNA是否在CFHR5基因中含有多態性。某些多態性指示個體對發生AMD或MPGNII的易感性提高。某些多態性指示個體發生AMD或MPGNII的可能性降低。某些多態性指示個體發生AMD或MPGNII的可能性既不提高也不降低。
[0038]在一個實施方案中，診斷受試者中發生AMD或MPGNII的傾向的方法包括從受試者獲得DNA樣品和檢測該患者的DNA中是否存在與發生AMD或MPGNII相關的多態性，存在該多態性指示該受試者發生AMD或MPGNII的傾向提高,不存在該多態性指示該受試者發生AMD或MPGNII的傾向降低。
[0039]在相關的實施方案中，通過分析基因產物(如RNA或該基因編碼的CFHR5蛋白質(如蛋白質同種型))確定CFHR5基因多態性位點處的變異存在與否。變體蛋白質的表達指示CFHR5基因中的變異，並可指示發生AMD或MPGNII的傾向提高或降低。可以使用免疫測定和其他方法檢測蛋白質。
[0040]在相關方面中，本發明提供診斷對發生AMD或MPGNII的易感性的方法，包括確定個體的CFHR5單元型。該方法包括獲得來自個體的DNA和分析該個體的DNA以確定其CFHR5單元型。某些單元型(危險單元型)指示個體具有比對照群提高的對發生AMD或MPGNII的易感性。某些單元型(保護性單元型)指示該個體具有降低的對發生AMD或MPGNII的易感性。某些單元型(中性單元型)指示該個體發生AMD或MPGNII的可能性既不提高也不降低。[0041]在另一相關方面中，本發明提供通過檢測個體的生物樣品中變體CFHR5多肽來診斷對發生AMD或MPGNII或其他疾病的易感性的方法。在一個實施方案中，使用基於抗體的測定診斷個體中的AMD或MPGNII或其他疾病，其中通過使個體的生物樣品(如血清樣品)接觸該抗體並檢測是否存在該變體CFHR5多肽。在實施方案中，該抗體與變體CFHR5多肽特異性表位(即在野生型CFHR5多肽中未發現的)特異性相互作用。在實施方案中，使用基於分離的測定(如PAGE)診斷個體中的MPGNII或其他疾病，這是通過檢測該個體的生物樣品(如血清樣品)中是否存在該變體CFHR5多肽。可以使用多種類型的免疫測定形式來測定樣品中的CFH或CFHR5的多肽或蛋白質。包括夾層ELISA、放射性免疫測定、螢光免疫測定、免疫組織化學測定、點印跡、量杆(dip-stick)和Western印跡。
[0042]在一個方面中，本發明提供通過調節CFHR5的類型和/或全身性和/或腎水平的量來治療個體的方法，所述個體患有AMD或MPGNII (如其中檢測到指示發生AMD或MPGNII症狀的危險提高的多態性或單元型的個體)或與變體CFHR5基因相關的其他疾病，或者有患病危險。CFHR5多肽可以是中性或保護性等位基因而不是與危險單元型相關的等位基因所編碼的CFHR5多肽。在一個實施方案中，該方法包括以有效降低疾病症狀的量對個體施用CFHR5多肽。在一個實施方案中，該方法包括以有效降低發生疾病症狀的傾向和延緩疾病的發生或發展的量對個體施用CFHR5多肽。在一個實施方案中，該方法包括施用含有CFHR5的血。在一個實施方案中，該方法包括施用包含編碼CFHR5多肽的核苷酸序列的核酸(如轉基因)。
[0043]在一個方面中，本發明提供治療個體的方法，所述個體患有AMD或MPGNII (如檢測到指示發生AMD或MPGNII症狀的危險提高的多態性或單元型的個體)或與變體CFHR5基因相關的其他疾病。在一個實施方案中，該方法包括以有效降低患者中疾病症狀的量對患者施用物質，所述物質降低變體CFHR5的量或編碼CFHR5的基因的表達。CFHR5多肽可以是野生型CFHR5多肽或變體CFHR5多肽。
[0044]在一個實施方案中，對個體施用抑制性核酸(如與變體CFHR5多肽的核苷酸序列至少部分互補的RNA)。在一個實施方案中，施用與編碼變體CFHR5多肽的RNA互補的純化的反義RNA。
[0045]在另一實施方案中，對個體施用治療量的抗CFHR5抗體，所述抗體足以使該變體CFHR5多肽部分失活。
[0046]在相關的實施方案中，對個體施用治療量的變體CFHR5多肽抑制劑(如滅活劑)。
[0047]在另一實施方案中，治療個體以從血中除去CFHR5的有害形式(如通過血漿去除術、抗體指導的血漿去除術或與CFHR5結合部分如肝素的複合)。
[0048]在一個方面中，本發明提供編碼變體CFHR5多肽的純化DNA、編碼變體CFHR5多肽的純化RNA、與編碼變體CFHR5多肽的RNA互補的純化的反義RNA以及純化的變體CFHR5多肽。在相關方面中，本發明提供用於表達野生型或變體CFHR5多肽或CFHR5的生物活性片段的核酸。
[0049]在一個方面中，本發明提供包含編碼CFHR5多肽的核酸的基因治療載體。該載體可包括驅動CFHR5基因在多種細胞類型中表達的啟動子。備選地，該載體可包括驅動CFHR5基因僅在特定細胞類型(例如視網膜細胞或腎細胞(如內皮細胞、腎繫膜細胞、足細胞))中表達的啟動子。在一個方面中，本發明提供含有編碼CFHR5蛋白質的基因治療載體和可藥用賦形劑的藥物組合物，其中該組合物不含病原體，並適於對人類患者施用。在一個實施方案中，編碼的CFHR5多肽為保護性變體。
[0050]在一個方面中，本發明提供含有重組或純化的CFHR5多肽的組合物，其中該多肽為保護性變體。 [0051]在相關方面中，本發明提供含有重組或純化的CFHR5多肽和可藥用賦形劑的藥物組合物，其中該組合物不含病原體，並適於對人類患者施用。在一個實施方案中，編碼的CFHR5多肽為野生型序列。在一個實施方案中，編碼的CFHR5多肽為保護性變體。
[0052]在一個方面中，本發明提供與變體CFHR5多肽特異性相互作用而不與野生型CFHR5多肽相互作用的抗體。這些抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，並都可通過消減技術獲得。這些抗體可以足以滅活變體CFHR5多肽。在相關方面中，本發明提供含有抗CFHR5抗體和可藥用賦形劑的藥物組合物，其中該組合物不含病原體，並適於對人類患者施用。
[0053]在一個方面中，本發明提供鑑定與發生AMD或MPGNII的危險提高或降低相關的變體CFHR5蛋白質的方法。在一個實施方案中，本發明提供鑑定保護性CFHR5蛋白質的方法，所述方法通過(a)鑑定具有保護性單元型的個體，和(b)確定在個體基因組中編碼的CFHR5胺基酸序列，其中保護性CFHR5蛋白質由具有保護性單元型的等位基因編碼。在一個實施方案中，本發明提供鑑定中性CFHR5蛋白質的方法，所述方法通過(a)鑑定具有保護性單元型的個體，和(b)確定在個體基因組中編碼的CFHR5胺基酸序列，其中中性CFHR5蛋白質由具有中性單元型的等位基因編碼。在相關實施方案中，本發明提供鑑定與發生AMD或MPGNII的危險降低相關的CFHR5變體形式的方法，包括(a)鑑定具有與發生AMD或MPGNII的危險降低相關的單元型或二倍型的個體；(b)獲得來自個體的基因組DNA或RNA;和(c)確定在個體基因組中編碼的CFHR5胺基酸序列，其中保護性CFHR5蛋白質由具有與發生AMD或MPGNII的危險降低的單元型的等位基因編碼。在實施方案中，保護性或中性CFHR5蛋白質不具有野生型CFHR5多肽的胺基酸序列。
[0054]在相關方法中，鑑定了與發生AMD或MPGNII的危險提高相關的CFHR5形式，所述鑑定通過(a)鑑定具危險單元型的個體和(b)確定在個體基因組中編碼的CFHR5胺基酸序列，其中危險CFHR5蛋白質由具危險單元型的等位基因編碼。在相關實施方案中，本發明提供鑑定與發生AMD或MPGNII的危險提高相關的CFHR5變體形式，包括(a)鑑定具有與發生AMD或MPGNII的危險提高相關的單元型或二倍型的個體；(b)獲得來自該個體的基因組DNA或RNA，和(c)確定在個體基因組中編碼的CFHR5胺基酸序列，其中危險CFHR5蛋白質由具有與發生AMD或MPGNII的危險提高相關的單元型的等位基因編碼。在實施方案中，危險CFHR5蛋白質不具有野生型CFHR5多肽的胺基酸序列。
[0055]在一個方面中，本發明提供含有重組或純化的核酸的細胞，所述核酸來自CFHR5基因。該細胞可以為細菌或酵母，或用於研究和藥物開發的任何其他細胞。因此，本發明提供表達重組變體人CFHR5的分離的宿主細胞或細胞系。在實施方案中，CFHR5變體為危險變體，並且第46位胺基酸為絲氨酸。在實施方案中，CFHR5變體為中性變體。在實施方案中，危險、保護性或中性變體CFHR5蛋白質不具有野生型CFHR5多肽的胺基酸序列。
[0056]在一個方面中，本發明提供轉基因非人動物，其體細胞和生殖細胞含有編碼人變體CFHR5多肽的轉基因。本發明的轉基因動物用作AMD或MPGNII的模型，並用於篩選用於治療AMD或MPGNII的物質。所述動物可以為小鼠、蟲或用於研究和藥物開發(如重組產生CFHR5)的任何其他動物。 在實施方案中，CFHR5為變體人CFHR5，其中所述CFHR5變體的第46位胺基酸為絲氨酸。
[0057]在一個方面中，本發明提供篩選與表14或表15中所述CFHR5基因多態性位點連鎖的多態性位點的方法。這些方法包括鑑定與CFHR5基因多態性位點連鎖的基因中的多態性位點，其中CFHR5基因中多態性位點的多態性形式與AMD或MPGNII相關；以及測定個體群中的單元型，以指示連鎖的多態性位點是否具有與AMD或MPGNII表型相關CFHR5基因的多態性形式平衡一不平衡的多態性形式。
[0058]在一個方面中，本發明提供用於分析因子H單元型的試劑盒。該試劑盒可用於診斷患者的AMD。該試劑盒可包括一個或多個因子H、因子H等位基因特異性寡核苷酸(如等位基因特異性引物或探針)或特異性識別因子H多肽的抗體。該因子H等位基因特異性寡核苷酸可包括來自因子H基因編碼(外顯子)或非編碼(啟動子、5』未翻譯、內含子或3』未翻譯)區的序列。該因子H特異性抗體可識別正常或野生型H多肽或變體因子H多肽，其中在該因子H編碼區中存在一個或多個非同義單核苷酸多態性(SNP)。該試劑盒可用於診斷AMD以及與因子H基因SNP相關的其他疾病，如MPGNII。作為替代或補充，該試劑盒可包括一個或多個因子H相關5(CFHR5)等位基因特異性寡核苷酸(如引物或探針)或特異性識別CFHR5多肽的抗體。CFHR5等位基因特異性引物和因子H相關5等位基因特異性寡核苷酸可包括來自因子H相關5基因的編碼(外顯子)或非編碼(啟動子、5』未翻譯、內含子或3』未翻譯)區的序列。因子H相關5特異性抗體可識別正常或野生型H多肽或變體因子H相關5多肽，其中在該因子H相關5編碼區中存在一個或多個非同義單核苷酸多態性(SNP)。
[0059]在一個實施方案中，該試劑盒包含探針或引物，它們可以在表1A、表1B和/或表IC中列出的多態性位點處區分等位基因。在實施方案中，該探針為用於核酸擴增的引物，所述擴增為擴增跨越表1A、表1B和/或表1C中列出因子H基因多態性位點的區域。在實施方案中，該試劑盒具有探針或引物，它們在表1A、表1B和/或表1C中列出的一個以上多態性位點處區分等位基因。在實施方案中，該試劑盒具有在一個以上多態性位點處區分等位基因的探針或引物，其中所述多態性位點包括(a)rs529825 ；(b)rs800292 ； (c)rs3766404 ；
(d)rsl061147 ； (e)rsl061170 ； (f)rs203674 ； (g)rs529825 和 rs800292 中至少一個；(h)rsl061147、rsl061170 和 rs203674 中至少一個；(i)rs529825 和 rs800292 中至少一個，以及 rs3766404 ;以及 rsl061147, rsl061170 和 rs203674 中至少一個；或者 j)rs529825,rs800292, rs3766404, rsl061170 和 rs203674 中至少一個。
[0060]在相關實施方案中，試劑盒具有在一個以上多態性位點區分等位基因的探針或引物，其中所述多態性位點包括(a)rs529825 ；(b)rs800292 ； (c)內含子2 (IVS2或insTT) (d)rs3766404 ； (e)rsl061147 ； (f)rsl061170 ； (g)外顯子 IOA ； (h)rs203674 ； (i)rs375046 ；j)rs529825 和 rs800292 ； (k)rsl061147、rsl061170 和 rs203674 中至少兩個或三個；(I)rs529825 和 rs800292 中至少一個;和內含子 2 ;和 rs3766404 ;和 rsl061147、rsl061170 和rs203674 中至少一個；和外顯子 IOA ;和 rs375046 ； (m)至少 rs529825 ；rs800292 ;內含子2 ；rs3766404 ；rsl061170 ;外顯子 IOA ；rs203674 ;和 rs375046 ； (n) rs529825、rs800292、內含子2 ;rs3766404、rsl061170、外顯子10A、rs203674和rs375046中至少兩個，或至少三個或至少四個；(ο)外顯子22 (1210);或(P)外顯子22(1210)與任意前述變異或一組變異(a-o)組合。在實施方案中，試劑盒具有在rs460897和rs460184中一處或兩處區分等位基因的探針或引物。在實施方案中，該試劑盒具有在一個以上多態性位點處區分等位基因的探針或引物，其中所述多態性位點選自(a)rs3753394 ； (b)rs529825 ； (c)rs800292 ； (d)內含子 2(IVS2 或 insTT) ； (e)rs3766404 ； (f)rsl061147 ； (g)rsl061170 ； (h)rs2274700 ； (i)rs203674 ； (j)rs3753396 ;和(k)rs1065489?[0061]在一個實施方案中，作為上述探針的替代或補充，試劑盒含有區分CFHR5基因中多態性位點的探針、引物、抗體等。在一個方面中，本發明提供基於CFHR5基因變異的診斷患者AMD或MPGNII的試劑盒。試劑盒可包括一種或多種CFHR5特異性探針或CFHR5等位基因特異性寡核苷酸，或特異性識別CFHR5多肽的抗體。CFHR5特異性引物和CFHR5等位基因特異性寡核苷酸可包括來自CFHR5基因編碼(外顯子)或非編碼(啟動子、5』未翻譯、內含子或3』未翻譯)區的序列。CFHR5特異性抗體可識別正常或野生型CFHR5多肽或變體CFHR5多肽，其中在CFHR5編碼區中存在一個或多個非同義單核苷酸多態性(SNP)。該試劑盒可用於診斷AMD或MPGNII以及與CFHR5基因中SNP相關的其他疾病。
[0062]在一個實施方案中，試劑盒含有在表14或表15中列出的多態性位點處區分等位基因的探針或引物。在實施方案中，探針為用於核酸擴增的引物，其中擴增是擴增跨越表14或表15中列出的CFHR5基因多態性位點的區域。在實施方案中，該試劑盒具有在表14或表15中列出的一個以上多態性位點處區分等位基因的探針或引物。在實施方案中，該試劑盒包含在一個、兩個或全部以下多態性位點處區分等位基因的探針或引物:rs9427661( —249T>C) ；rs9427662( — 20T>C)和 rsl2097550(P46S)。
[0063]在一個實施方案中，試劑盒含有在CFH基因中的多態性位點和CFHR基因(如CFHR5)的多態性位點處區分等位基因的探針或引物。
[0064]在一個方面中，本發明提供用於確定受試者單元型的裝置。該裝置可用於例如診斷患者的AMD或其他疾病。在一個實施方案中，該裝置含有在表1A、IB和/或IC中列出的多態性位點處區分等位基因的探針或引物。在實施方案中，探針為用於核酸擴增的引物，其中擴增是擴增跨越表1A、1B和/或IC中列出的因子H基因多態性位點的區域。在實施方案中，該裝置具有在表1A、1B和/或IC中列出的一個以上多態性位點處區分等位基因的探針或引物。在實施方案中，該裝置具有在一個以上多態性位點處區分等位基因的探針或引物，其中所述多態性位點包括(a)rs529825 ； (b)rs800292 ； (c)rs3766404 ； (d)rsl061147 ；
(e)rsl061170 ;(f)rs203674 ;(g)rs529825 和 rs800292 中至少一個；(h)rsl061147、rsl061170 和 rs203674 中至少一個;(i) rs529825 和 rs800292 中至少一個；和 rs3766404 ；以及 rsl061147、rsl061170 和 rs203674 中至少一個；或者 j)至少 rs529825、rs800292、rs3766404、rsl061170 和 rs203674。
[0065]上述試劑盒及其內含物還可用於為任何目的而鑑定發生MPGNII的傾向或確定因子H單元型。
[0066]在相關實施方案中，該裝置具有在一個以上多態性位點處區分等位基因的探針或引物，其中所述多態性位點包括(a)rs529825 ；(b)rs800292 ；(c)內含子2(IVS2或insTT) ； (d)rs3766404 ； (e)rsl061147 ； (f)rsl061170 ； (g)外顯子 IOA ； (h)rs203674 ； (i)rs375046 ； (j)rs529825 和 rs800292 ； (k)rsl061147、rsl061170 和 rs203674 中至少兩個或三個；(l)rs529825 和 rs800292 中至少一個；和內含子 2 ;和 rs3766404 ;和 rsl061147,rsl061170 和 rs203674 中至少一個；和外顯子 IOA ;和 rs375046 ； (m)至少 rs529825 ；rs800292 ;內含子 2 ；rs3766404 ；rsl061170 ;外顯子 IOA ；rs203674 ；和 rs375046 ； (η)rs529825、rs800292、內含子 2、rs3766404、rsl061170、外顯子 10A、rs203674 和 rs375046中至少兩個，或至少三個或至少四個；(o)外顯子22 (1210);或(P)外顯子22 (1210)與任意前述變異或一組變異(a- o)組合。在實施方案中，裝置具有在rs460897和rs460184中一個或兩個處區分等位基因的探針或引物。在實施方案中，裝置具有在一個以上多態性位點處區分等位基因的探針或引物，其中所述多態性位點選自(a)rs3753394 ;(b)rs529825 ;(c)rs800292 ； (d)內含子 2 (IVS2 或 insTT) ； (e)rs3766404 ； (f)rsl061147 ； (g)rsl061170 ； (h)rs2274700 ； (i)rs203674 ; (j) rs3753396 和(k) rsl065489。在實施方案中，裝置具有在一個以上多態性位點處區分等位基因的探針或引物，其中所述多態性位點選自(a)rs3753394 ；(b)rs529825 ； (c)rs800292 ； (d)內含子 2(IVS2 或 insTT) ； (e)rs3766404 ； (f)rsl061147 ；(g)rsl061170 ； (h)rs2274700 ； (i)rs203674 ； (j)rs3753396 和(k)rs1065489?
[0067]在一個方面中，本發明提供用於診斷患者的AMD或MPGNII的裝置。在一個實施方案中，該裝置含有在表14和表15列出的多態性位點處區分等位基因的探針或引物。在實施方案中，探針為用於核酸擴增的引物，其中擴增是擴增跨越表14或表15中列出的CFHR5基因多態性位點的區域。在實施方案中，該裝置具有在表14或表15中列出的一個以上多態性位點處區分等位基因的探針或引物。本發明的裝置可含有區分因子H和CHFR5變體的探針或引物，包括上文及本文公開內容中其他處所述的位點的任何組合。
[0068]上文所述裝置及其內含物還可用於為任何目的而鑑定發生MPGNII的傾向或確定因子H單元型。
[0069]在一個實施方案中，作為上述探針或引物的替代或補充，該裝置含有區分CFHR5基因中多態性位點的探針、引物、抗體等。在一個方面中，本發明提供基於CFHR5基因變異診斷患者的AMD或MPGNII的裝置。該裝置可包括一種或多種CFHR5特異性探針或CFHR5等位基因特異性寡核苷酸或特異性識別CFHR5多肽的抗體。CFHR5特異性引物和CFHR5等位基因特異性寡核苷酸可包括來自CFHR5基因編碼(外顯子)或非編碼(啟動子、5』未翻譯、內含子或3』未翻譯)區的序列。該CFHR5特異性抗體可識別正常或野生型CFHR5多肽或變體CFHR5多肽，其中在該CFHR5編碼區中存在一個或多個非同義單核苷酸多態性(SNP)。該裝置可用於診斷AMD或MPGNII以及與CFHR5基因SNP相關的其他疾病。
[0070] 在一個實施方案中，該裝置含有在表14或表15中列出的多態性位點處區分等位基因的探針或引物。在實施方案中，該探針為用於核酸擴增的引物，其中擴增是擴增跨越表14或表15中列出的CFHR5基因多態性位點的區域。在實施方案中，該裝置具有在表14或表15中列出的一個以上多態性位點處區分等位基因的探針或引物。在實施方案中，該試劑盒具有在一個、兩個或全部以下多態性位點處區分等位基因的探針或引物:rs9427661( —249T>C) ；rs9427662( — 20T>C)和 rsl2097550(P46S)。
[0071]在一個實施方案中，該裝置含有在CFH基因中的多態性位點和CFHR基因(如CFHR5)的多態性位點區分等位基因的探針或引物。
[0072]在閱讀全部公開內容後，本發明的其他方面將是顯而易見的。
[0073]附圖簡述
[0074]圖1A-1L顯示人視網膜色素上皮中因子H(圖1A-1H)和末端互補複合物(C5b_9)(圖11-1L)的免疫定位。縮寫:(RPE) —脈絡膜(Chor)複合物；Bruch膜(BM);視網膜(Ret);玻璃疣(Dr)。
[0075]圖2顯示使用來自人眼的RNA提取物對因子H基因表達((FH和截短形式HFL1)的RT-PCR分析。
[0076]圖3是人因子H基因的簡圖，顯示本分析中使用的12個SNP、因子H基因的22個外顯子、20個短共有重複序列(SCR)、病原體和其他底物的結合位點以及連鎖不平衡(LD)節段的大概位置。顯示CHl所有22個外顯子(但無內含子)的簡圖未按比例拉伸。
[0077]圖4是人因子H基因SNP的單元型網狀圖，顯示危險(實心圓)、保護性(劃線圓)、中性(空心圓)和始祖(標出)單元型的關係以及單元型的相對頻率，以圓的大小和位置表示。
[0078]圖5顯示人因子H基因單元型和二倍型的相關分析。在AMD病例和對照中分析了8個信息化SNP的配對連鎖不平衡。顯示了在編碼鏈上標出的多態性位點處的核苷酸，除了IYS1，顯示了其非編碼鏈上的核苷酸。
[0079]圖6顯示人因子H cDNA參照形式的3926鹼基核苷酸序列(GenBank登錄號Y00716[SEQ ID N0:1])。ATG起始密碼子開始於第74位核苷酸，TAG終止密碼子終止於第3769位核苷酸。
[0080]圖7 顯示 SEQ ID NO:1 編碼的多肽序列(GenBank登錄號 Y00716 [SEQ ID NO:2]) ?1231個胺基酸的因子H多肽包括18個胺基酸的N端信號肽。
[0081]圖8顯示HFLl——人因子H截短形式的參照形式的1658鹼基核苷酸序列(GenBank登錄號X07523 [SEQ ID NO:3])。ATG起始密碼子開始於第74位核苷酸，TGA終止密碼子終止於第1423位核苷酸。
[0082]圖9顯示SEQ ID NO:3編碼的HFLl參照形式的多肽序列(GenBank登錄號X07523[SEQ ID NO:4])。449個胺基酸的HFLl多肽包括18個胺基酸的N端信號肽。
[0083]圖10顯示示例性人因子H保護性變體的多肽序列[SEQ ID NO:5]。這種保護性變體因子H多肽的第62位胺基酸為異亮氨酸，第402位胺基酸為酪氨酸(以粗體標出)。
[0084]圖11顯示示例性HFLl保護性變體——人因子H的截短形式的多肽序列(SEQ IDNO:6)。這種保護性變體截短的因子H多肽的第62位胺基酸為異亮氨酸，第402位胺基酸為酪氨酸(以粗體標出)。
[0085]圖12顯示如(A)光學顯微鏡和(B)電子顯微鏡所見，具有密集膜內沉積的顯著的腎小球細胞增多，其在MPGNII患者中引起毛細血管壁增厚。沉積可在腎小球基底膜(GBM)的緻密板中形成分節的、間斷或彌散模式。通過光學顯微鏡可見，它們是嗜酸性並為折射體，用過碘酸希夫明亮染色並為高滲的，這解釋了其電子密度外觀(A)。甚至通過電子顯微鏡可見，沉積缺乏亞結構，表現為非常暗的均勻斑點(B)。緻密沉積的準確組成仍然未知(條帶，5 μ m)。
[0086]圖13是顯示補體級聯繫統旁路途徑的激活和調節的圖，所述補體級聯繫統在AMD和MPGNII患者中系統性高水平激活。補體級聯繫統的旁路途徑在MPGNII/DDD患者中系統性高水平激活。正常情況下，自發的水解(稱為tick-over)過程低水平地持續激活C3。C3水解與圖上部顯示的大的蛋白質構象變化相關。該構象變化使C3 (H20)與C3b(C3的切割產物)類似。起始轉化酶C3 (H20)Bb激活C3以形成C3b。儘管C3b具有短暫的半衰期，如果其與IgG、細胞或基底膜結合，則可被保護免於立即失活。(C3b)2-1gG複合物在流體相中形成，並與備解素(P)結合，這促進了因子B的結合和C3bBb的產生，C3bBb為旁路途徑的轉化酶，其在此處顯示為Bb(C3b)2-1gG-備解素複合物。擴增環以箭頭顯示。C3NeF延長了 C3轉化酶的半衰期，在插圖中顯示。降解C3轉化酶的一種機制是通過其與補體因子H(CFH)的相互作用，在底部右側顯示為fH。因子H的缺乏和突變與MPGN II/DDD相關。
[0087]圖14為顯示補體激活調節子(RCA)基因簇在染色體lq32上的組構以及已知為補體因子 H (CFH)、因子 H 樣 I (CFHLl)和因子 H 相關 1、2、3、4 和 5 (CFHR1、CFHR2、CFHR3、CFHR4和CFHR5)中短共有重複序列(SCR)的約60個胺基酸的結構域的排列的圖。CFH具有20個SCR。已經確定了這些SCR中一些的相互作用配偶體，在右上方顯示(CRP - C反應蛋白質；Hep，肝素)。補體因子H樣I(CFHLl)是CFH的剪接異構體，而補體因子H相關蛋白質1-5 (CFHR1-5)各由單獨的基因編碼(CFHR1-5)。CFHR1-5的SCR與CFH中的一些SCR相似，以橢圓中的數字顯示。例如，CFHR5具有9個SCR，前兩個與因子H的SCR6和7相似，因此具有CRP和肝素結合特性。CFHR5的SCR5-7在相應橢圓中具有數字12 — 14，因為這些SCR與因子H的SCR12 - 14相似，並具有C3b和肝素結合特性。
[0088]圖15顯示連鎖不平衡曲線，表明A307A和Y402H在因子H中連鎖不平衡，一 249T>C和-20T>C在CFHR5中連鎖不平衡。
[0089]圖16顯示人CFHR5參照形式的2821個鹼基的核苷酸序列(GenBank登錄號AF295327[SEQ ID N0:7])。ATG起始密碼子開始於第94位核苷酸，TGA終止密碼子終止於第1803位核苷酸。
[0090]圖17 顯示 SEQ ID NO:7 編碼的多肽序列(GenBank 登錄號 AAK15619 [SEQ ID NO:8])。569個胺基酸的CFHR5多肽包括18個胺基酸的N端信號肽。
[0091]圖18顯不CFH和 因子H相關蛋白質的基因中的基因組複製。外顯子以垂直線標出。以相同字母標出的區域(如A，A』和A")具有基本相同的序列。
[0092]發明詳述[0093]1.引言
[0094]本發明提供由因子H基因中和因子H相關基因如因子H相關5基因中多種變異組成的多態性和單元型的集合。這些多態性和單元型與年齡相關性黃斑變性(AMD)和其他因子H相關病症相關。這些多態性和單元型中的某些導致變體因子H多肽。對這些和其他多態性和多態性組(如單元型)的檢測可用於設計和進行AMD的診斷測定。可以通過核酸分析、通過因子H編碼序列所編碼的多肽(包括剪接變體編碼的多肽)的分析或通過本領域已知的其他方法檢測多態性和多態性組。分析這類多態性和單元型也可用於設計AMD的預防和治療方案。
[0095]因 子H是多功能蛋白質，發揮補體系統關鍵調節子的功能。參閱Zipfel，2001, " Factor H and disease:a complement regulator affects vital bodyfunctions" Semin Thromb Hemost.27:191-9。因子 H 蛋白質活性包括:(I)與 C 反應蛋白質(CRP)結合，⑵與C3b結合，(3)與肝素結合，⑷與唾液酸結合，(5)與內皮細胞表面結合，(6)與細胞整聯蛋白質受體結合，(7)與病原體(包括微生物)結合(見圖3)和(8)C3b輔因子活性。因子H基因稱為HFl、Cra和HF，位於人染色體1，位置lq32。lq32特定基因座含有大量補體途徑相關基因。這些基因中的一組稱為補體激活調節子(RCA)基因簇，含有編碼因子H、五種因子H—相關基因(分別為FHR — 1、FHR — 2、FHR — 3、FHR-4和FHR - 5或者CFHR1、CFHR2、CFHR3、CFHR4和CFHR5)的基因，以及編碼凝結因子XIII β亞基的基因。因子H和因子H相關基因幾乎完全由短共有重複序列(SCR)組成。因子H和FHLl 分別由 SCRl — 20 和 I — 7 組成。FHR — 1、FHR — 2、FHR — 3、FHR-4 和 FHR — 5 分別由5、4、5、5和8個SCR組成(見圖14)。基因的順序從著絲粒到端粒為FH/FHL1、FHR_3、FHR — 1、FHR-4、FHR — 2 和 FHR — 5。
[0096]因子H基因
[0097]已經確定了人因子H cDNA的參照形式(SEQ ID NO:1)(參閱Ripoche等，1988，Biochem J249:593 — 602)和基因組序列。因子H cDNA編碼表觀分子量155kDa的長度為1231個胺基酸的多肽(SEQ ID NO:2)。存在稱為FHL — I (也稱為HFLl或CFHT)的因子H替代性剪接形式。FHL — I (SEQ ID NO:3)基本對應於因子H的外顯子I至9 (參閱Ripoche 等，1988，Biochem J249:593 — 602)。FHLIcDNA 編碼表觀分子量 45 — 50kDA 的長度為449個胺基酸的多肽(SEQ ID NO:4)。Hll和FHLl的前445個胺基酸相同，FHLl具有獨特的C端4個胺基酸(外顯子10A)。替代外顯子IOA位於外顯子9與外顯子10之間的內含子中。人因子H和FHLl的cDNA和胺基酸序列數據分別以登錄號Y00716和X07523見於EMBL/GenBank資料庫。人因子H cDNA參照形式的3926鹼基的核苷酸序列(GenBank登錄號Y00716[SEQ ID NO:1])示於圖6，SEQ ID NO:1編碼的多肽序列(GenBank登錄號Y00716[SEQ ID NO:2])示於圖7。人因子H的截短形式——HFLl參照形式的1658個鹼基的核苷酸序列(GenBank登錄號X07523 [SEQ ID NO:3])示於圖8，SEQ ID NO:3編碼的多肽序列(GenBank登錄號X07523 [SEQ ID NO:4])示於圖9。因子H基因序列(長度為150626個鹼基)以GenBank登錄號AL049744可見。因子H啟動子位於因子H基因編碼區的5』。
[0098]FHR — I 基因
[0099]FHR-1 基因也稱為 CHFR1、CFHL1、CFHL、FHR1 和 HFL1。已經確定了人 HFR — IcDNA的參照形式(參閱 Estaller 等，1991，J Immunol.146:3190 — 3196)和基因組序列。FHR —IcDNA編碼長度為330個胺基酸的多肽，預計分子量為39kDa。人FHR — I的cDNA和胺基酸序列數據以登錄號M65292見於EMBL/GenBank資料庫。FHR — I基因序列以GenBank登錄號AL049741可見。
[0100]FHR—2 基因
[0101]FHR - 2 基因也稱為 CHFR2、CFHL2、FHR2 和 HFL3。已經確定了人 HFR — 2cDNA 的參照形式(參閱 Strausberg 等，Proc.Natl.Acad.Sci 美國 99: 16899 一 16903)和基因組序列。FHR - 2cDNA編碼長度為270個胺基酸的多肽，預計分子量為31kDa。人FHR-2的cDNA和胺基酸序列數據以登錄號BC022283見於EMBL/GenBank資料庫。FHR — 2基因序列以GenBank登錄號AL139418可見。
[0102]FHR—3 基因
[0103]FHR - 3 基因也稱為 CHFR3、CFHL3、FHR3 和 HFL4。已經確定了人 HFR — 3cDNA 的參照形式(參閱 Strausberg 等，Proc.Natl.Acad.Sci 美國 99: 16899 一 16903)和基因組序列。FHR - 3cDNA編碼長度為330個胺基酸的多肽，預計分子量為38kDa。人FHR-3的cDNA和胺基酸序列數據以登錄號BC058009見於EMBL/GenBank資料庫。FHR — 3基因序列以GenBank登錄號AL049741可見。
[0104]H1R-4 基因
[0105]FHR-4基因也稱為CHFR4、CFHL4和FHR4。已經測定了人HFR_4cDNA的參照形式(參閱 Skerka 等，1991，J.Biol.Chem.272:5627 — 5634)和基因組序列。FHR_4cDNA 編碼長度為331個胺基酸的 多肽，預計分子量為38kDa。人FHR-4的cDNA和胺基酸序列數據以登錄號X98337見於EMBL/GenBank資料庫。FHR-4基因序列以GenBank登錄號AF190816 (5，末端)、AL139418(3』 末端)和 BX248415 可見。
[0106]H1R-5 基因
[0107]FHR-5基因也稱為CHFR5、CFHL5和FHR5。已經確定了人CHFR_5cDNA的參照形式(SEQ ID NO:83)(參閱 McRae 等，2001，J.Biol.Chem.276:6747 — 6754)和基因組序列。CFHR5cDNA編碼長度為569個胺基酸的多肽(SEQ ID NO:8)，表觀分子量為65kDa。人CFHR5的cDNA和胺基酸序列數據以登錄號AF295327見於EMBL/GenBank資料庫。人CFHR5參照形式的2821鹼基的核苷酸序列(GenBank登錄號AF295327 [SEQ ID NO:7])示於圖16，SEQID NO:7 編碼的多肽序列(GenBank 登錄號 AAK15619[SEQ ID NO:8])示於圖 17。CFHR-5基因序列以GenBank登錄號AL139418 (5，末端)、AL353809 (3，末端)可見。FHR-5啟動子位於CFHR5基因編碼區的5』。
[0108]I1.定義
[0109]提供以下定義以幫助理解本發明。除非另外指明，本文使用的所有技術術語、注釋和其他科學或醫學術語或命名法具有醫學和分子生物學領域技術人員普遍理解的意義。在一些情況下，為了清楚和/或易於參考起見，本文定義了具有普遍理解意義的術語，不應假定本文中這些定義的內容代表與本領域一般理解相比存在的顯著差異。
[0110]「核酸」、「多核苷酸」或「寡核苷酸」是任何長度的核苷酸聚合形式，可以是DNA或RNA，並且可以是單鏈或雙鏈。核酸可包括啟動子或其他調節序列。寡核苷酸基本通過合成的手段製備。核酸包括跨越任一多態性位點或位於其側翼的DNA節段或其互補序列，所示多態性位點示於表1A、表1B和/或1C，或者已知在因子H基因中。節段通常在5至100個連續鹼基之間，範圍經常從下限5、10、12、15、20或25個核苷酸至上限10、15、20、25、30、50或 100 個核苷酸(其中上限大於下限)。5-10、5-20、10-20、12 — 30、15-30、10-50、20-50或20-100之間的核酸是常見的。多態性位點可以在節段內的任何位置出現。提到雙鏈核酸中的一條鏈的序列也定義了其互補鏈，除非本文中另外明確說明，提到核酸的一條鏈也指其互補物。對於某些應用，可以修飾核酸(如RNA)以提高胞內穩定性和半衰期。可能的修飾包括但不僅限於在分子骨架中使用硫代磷酸酯或2』 -O -甲基而不是磷酸二酯酶鍵。修飾的核酸包括肽核酸(PNA)和具有內源性內切核酸酶不易識別的非常規鹼基如肌苷、queosine和wybutosine以及腺嘌呤、胞嘧唳、鳥嘌呤、胸腺嘧唳和尿嘧唳的乙醯基一、甲基一、硫代一及類似修飾形式的核酸。
[0111]「雜交探針」是能以鹼基特異性方式與核酸互補鏈結合的核酸。此類探針包括核酸和肽核酸(Nielsen等，1991)。可以在本領域已知的嚴格條件下進行雜交。例如，參閱如 Berger 和 Kimmel (1987)Methods In Enzymology, 152 卷:Guide To Molecular CloningTechniques,San Diego:Academic Press,Inc.;Sambrook 等，(1989)Molecular Cloning:Aaboratory Manual,第 2版，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory ;Sambook(2001)第 3版；Rychlik，W.和 Rhoads，R.E.，1989，Nucl.Acids Res.17,8543 ；Mueller,P.R.等(1993)In Current Protocols in Molecular Biologyl5.5, Greene Publishing Associates,Inc.和 John Wiley 和 Sons, New York ;以及 Anderson 和 Young, Quantitative FilterHybridization in Nucleic Acid Hybridization (1985))。本文使用的術語「探針」包括引物。探針和引物有時指「寡核苷酸」。
[0112]術語「引物」指能在適當條件下、在適當的緩衝液和適當的溫度下作為模板指導的DNA合成的起始點的單鏈寡核苷酸。引物的適當長度取決於引物的預期用途，但範圍一般從15至30個核苷酸。引物序列不需要與模板精確互補，但必須充分互補以與模板雜交。術語「引物位點」指靶DNA中 與引物雜交的區域。術語「引物對」指一組引物，包括與待擴增DNA序列的5』末端雜交的5』上遊引物以及與待擴增序列3』末端互補序列雜交的3』下遊引物。
[0113]用於短探針和引物的示例性雜交條件為所計算的Tm下約5至12°C。計算Tm的公式是已知的，包括對於小於14個鹼基的寡聚物並假定反應在50mM —價陽離子存在下進行時的Tm = 4 0C X (引物中的G和C數)+2°C X (引物中的A和T數)。對於較長的寡聚物，可以使用以下公式:Tm = 64.9°C +41°C X (引物中的G和C數一16.4)/N，其中N為引物長度。另一普遍使用的公式考慮了反應的鹽濃度(Rychlik,同上，Sambrook,同上，Mueller,同上):Tm = 81.5°C +16.6°C X (logl0[Na+] + [K+])+0.41°C X (% GC) — 675/N，其中 N 為寡聚物中的核苷酸數。上述公式提供了某些應用的起點，然而，特定探針和引物的設可以考慮其他或不同的因素。設計用於本發明方法的探針和引物的方法為本領域所熟知。
[0114]術語「危險」、「保護性」和「中性」用於描述變異、SNP、單元型、二倍型和特徵為這些變異模式的基因所編碼的群體中的蛋白質。危險單元型是基因(本文中為因子H或因子H相關基因)的等位基因形式，其包含至少一個與發生AMD的危險提高相關的變體多態性，優選一組變體多態性。涉及因子H或因子H相關基因使用時，術語「變體」指核苷酸序列，其中該序列與種群(本文中為美國歐裔血統的人)中最常見的序列不同。變體多態性可以在基因的編碼或非編碼部分中。危險因子H單元型的實例為編碼胺基酸402處的組氨酸和/或胺基酸1210處的半胱氨酸的因子H基因等位基因。危險單元型可以是天然存在的，或者通過重組技術合成。保護性單元型是基因(本文中為因子H或因子H相關基因)的等位基因形式，其包含至少一個與發生AMD的危險降低相關的變體多態性，優選一組多態性。例如，一種保護性因子H單元型具有編碼胺基酸62處為異亮氨酸的因子H基因。保護性單元型可以是天然存在的，或者通過重組技術合成。中性單元型是基因(本文中為因子H或因子H相關基因)的等位基因形式，其不包含種群或人種群中與發生AMD的危險提高或降低相關的變體多態性。從以下的討論中顯然可見，當施用於需要治療或預防AMD或其他病症的患者時，「中性」單元型編碼的蛋白質可以是保護性的。即施用於例如患AMD或有發生AMD的受試者時，CFH或CFHR5的「中性」和「保護性」形式可提供治療益處，從而「保護」受試者免於疾病。
[0115]術語「野生型」指核酸或多肽，其中序列為種群(本文中為歐洲一美洲血統的人)中的普及形式(約40%普及，見圖5)。就本文公開內容的目的而言，「野生型」因子H蛋白質具有SEQ ID NO: 2的序列(圖7)，只是第402位胺基酸為酪氨酸(Y ; [SEQ ID NO:337])。就本文公開內容的目的而言，編碼野生型因子H蛋白質的因子H基因具有SEQ ID N0:1的序列(圖6)，只是開始於鹼基1277的密碼子(對應於第402位胺基酸)編碼酪氨酸(TAT [SEQID NO:336])。
[0116]涉及因子H或因子H相關多肽時使用的術語「變體」指多肽，其中序列在改變所編碼多肽的胺基酸序列的位置上不同於正常或野生型序列。例如，因子H基因核苷酸序列中的一些變異或取代改變密碼子，從而編碼不同的胺基酸(例如但不僅限於在一個或多個I62V、Y402H、D936E中的替代等位基因)，導致變體多肽。變體多肽可與危險相關(如第402位為組氨酸)、與保護相 關(如第62位為異亮氨酸)，或者可以由中性單元型編碼(如936位為天冬氨酸)。變體CFHR5多肽可與危險相關(如第46位為絲氨酸)、與保護相關，或者可以是中性的。
[0117]涉及因子H多肽時，術語「參照」指胺基酸序列與Ripoche等人，1988, BiochemJ.249 =593-602 所述的全長 O7Hl，SEQ ID NO:2)或截短(FHL1，SEQ ID NO:4)人因子 H 序列相同的多肽。涉及CFHR5多肽時，術語「參照」指胺基酸序列與McRae等人，2001，J.Biol.Chem.276:6747-6754所述全長人CFHR5 (SEQ ID NO:8)的序列相同的多肽。任意地將第一種鑑定的等位基因形式稱為參照形式或等位基因；其他等位基因形式稱為替代或變體等位基因。野生型和變體形式可以與參照形式具有實質的序列同一性(例如，野生型或變體形式可以在至少90%的野生型或變體中胺基酸位置上與參照形式相同，有時在至少95%的位置、有時至少98%或99%的位置上與參照形式相同)。變體可以由於移碼突變或剪接變異而在某些蛋白質區域中與參照形式不同。
[0118]術語「多態性」指種群中存在兩種或更多遺傳確定的替代序列或等位基因。「多態性位點」是發生序列趨異的基因座。多態性位點具有至少兩種等位基因。雙等位基因多態性具有兩種等位基因。三等位基因多態性具有三種等位基因。二倍體生物的等位基因形式可以是純合或雜合的。多態性位點可以小至一個鹼基對。多態性位點的實例包括:限制性片段長度多態性(RFLP);可變數目串聯重複(VNTR);高變區；小衛星；雙核苷酸重複；三核苷酸重複；四核苷酸重複和簡單序列重複。本文使用的術語「多態性」可包括一組多態性(即單元型)。[0119]「單核苷酸多態性(SNP) 」在單核苷酸佔據的多態性位點發生，所述位點是等位基因序列之間的變異位點。該序列之前和之後一般為高度保守的等位基因序列。SNP通常由於多態性位點處一個核苷酸取代另一個而產生。用一個嘌呤取代另一個嘌呤或者用一個嘧啶取代另一個嘧啶稱為轉換(transition)。用嘧啶取代嘌呤或相反稱為顛換(transversion)。同義SNP指編碼區中用一個核苷酸取代另一個而不改變所編碼多肽胺基酸序列。非同義SNP指編碼區中用一個核苷酸取代另一個而改變所編碼多肽胺基酸序列。SNP還可以由相對於參照等位基因的核苷酸缺失或插入而產生。
[0120]一「組」多態性指多於一種多態性，如表1A、表1B和/或表1C中所示或已知在因子H基因或其他基因中的至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種或多於6種多態性。
[0121]術語「單元型」指個體基因中一組多態性或多態性位點的等位基因的命名。例如，「112」因子H單元型指該因子H基因在前兩個多態性位點處均包含等位基因I，在第三個多態性位點處包含等位基因2。「二倍型」為單元型對。
[0122]「分離的」核酸指是組合物中存在的優勢種的核酸種類。分離的指核酸從至少一種與其天然相關的化合物分離。純化的核酸包含(基於摩爾)至少約50%、80%或90%的所存在的所有大分子種類。[0123]當兩胺基酸序列至少約80%—致、優選至少約90%—致、更優選至少約95%、至少約98%—致或至少約99%—致時，認為其具有「實質的同一性」。一般通過確定兩序列間的最佳比對和比較兩序列來計算序列同一性百分比。可以通過觀察，或使用Smith和Waterman, 1981, Adv.App1.Math.2:482 的局部同源性算法、使用 Needleman 和 Wunsch,1970, J.Mol.Biol.48:443 的同源性比對算法、使用 Pearson 和 Lipman, 1988, Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.85:2444的相似性搜索方法，通過這些算法的計算機化的實施(例如Wisconsin Genetics 軟體包中，Genetics Computer Group, 575Science Dr., Madison,Wis.)使用用於胺基酸比較的默認參數(例如用於缺口評分等)來進行序列的最適比對。有的時候需要描述兩個序列之間關於具體長度或區域的序列同一性(例如兩個序列可以被描述為在至少500鹼基對的長度上具有至少95%的同一性)。通常所述長度可以是至少約50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個胺基酸，或是參照蛋白質的全長。如果兩個胺基酸序列有1、2或3個殘基，或2-20個殘基、2-10個殘基、3_20個殘基或3 —10個殘基不同，則也認為它們具有實質的同一性。
[0124]「連鎖」描述了基因、等位基因、基因座或遺傳標記由於其位於相同染色體上，所以被一起遺傳的趨勢。連鎖可通過兩個基因、等位基因、基因座或遺傳標記之間的重組百分比測量。通常，以彼此間50釐摩(CM)以內的距離存在的基因座是連鎖的。連鎖的標記可存在於相同的基因或基因簇內。「連鎖不平衡」或「等位基因關聯」是指具體的等位基因或遺傳標記與位於鄰近染色體位點上特定的等位基因或遺傳標記，以比群體中對任何具體等位基因可能估計的頻率更頻繁地優先關聯。連鎖不平衡的標記特別適用於檢測對疾病的易感性，即使標記本身不引起所述疾病。
[0125]術語「診斷」是指確定個體是否具有發生疾病的傾向(包括有無體徵或症狀)的能力。診斷髮生疾病的傾向還可被稱為「篩選」，在本文中使用時，術語診斷和篩選可交換使用。應當明白具有提高的或降低的發生病症的傾向是指相對於未患有所述病症的群體中的個體，發生所述病症的可能性。
[0126]II1.表格
[0127]本文涉及到的某些表格在下文實施例之後提供。提供以下描述以幫助閱讀者:
[0128]表1A-1C顯示人因子H基因多態性及其與年齡相關性黃斑變性的關聯。(IA)顯示人因子H基因中dbSNP號、定位、跨越多態性的編碼(頂部，5』到3』方向)和非編碼(底部)鏈的序列、胺基酸改變、對照和AMD病例的等位基因頻率，和ISNP的X 2與P —值。(IB)顯示人因子H基因中dbSNP號、被查詢的序列、黑猩猩因子H基因中相應的核苷酸、定位、胺基酸改變以及引物與探針組。(IC)顯示在dbSNP資料庫中沒有找到的人因子H基因中定位、跨越多態性的序列、胺基酸位置和14SNP的胺基酸改變(如果有的話)。
[0129]表2顯示一組AMD病例和對照中人因子H基因中八個SNP的單元型分析。
[0130]表3顯示人因子H基因中六個SNP的單元型分析以及它們與AMD的關聯。
[0131]表4顯示11個人因子H基因SNP與年齡相關性黃斑變性的關聯。
[0132]表5顯示用於人因子H的SSCP、DHPLC和DNA測序分析的引物。
[0133]表6顯示AMD患者和對照的基因分型數據。
[0134]表7顯示多個人種群中危險單元型的頻率。
[0135]表8顯示若干 種因子H的二倍型。指出了普遍危險和保護性二倍型。
[0136]表9顯示用於擴增因子H編碼序列的引物序列。
[0137]表10顯示用於擴增CFHR5編碼序列的引物序列。
[0138]表11顯示22個MPGNII患者中因子H SNP分析。
[0139]表12顯示22個MPGNII患者和AMD —陰性的、人種相匹配的對照中因子H SNP頻率的比較。
[0140]表13列出與MPGNII相關聯的因子H SNP及其相關的SCR。
[0141]表14顯示22個MPGNII患者中CFHR5SNP的分析。
[0142]表15顯示22個MPGNII患者和AMD —陰性的、人種相匹配的對照中CFHR5SNP頻率的比較。
[0143]表16顯示用於檢測因子H基因中多態性的示例性的等位基因特異的探針(16A)和引物(16B)。
[0144]IV.補體因子H多態性
[0145]在一個方面，本發明提供與下述發現相關的新的診斷、治療和藥物篩選方法，所述發現為:補體因子H(HFl)基因中的多態位點與對AMD的易感性和AMD的發展有關。
[0146]與AMD相關的因子H多態性如實施例1所述被鑑定，其根據標準方案使用SSCP分析、DHPLC分析和直接測序法檢查因子H(包括外顯子10A，其被轉錄為因子H的同種型FHLI)的編碼區和鄰近內含子區域的變體。剩餘的多態性通過5』核酸酶(Taqman，ABI)方法分型。如所述的進行Taqman基因分型和關聯分析(Gold等,2004)。使用Mac Vector軟體設計用於SSCP和DNA測序分析的引物，以擴增各外顯子及其鄰近的內含子區域。根據標準方案通過SSCP和DHPLC，針對序列變異篩選PCR得到的擴增子。通過SSCP和DHPLC檢測到的所有改變根據標準方案通過雙向測序證實。使用X方(X2)和Fisher' s精確檢測(P值)進行統計學分析。
[0147]使用兩組獨立的AMD病例和年齡匹配的對照。所有參與的個體都是美國歐裔血統、大於60歲年齡並依照知情同意在IRB-批准的方案下招募。這些組由以下組成:來自The University of 1wa的352名患有臨床上被證明的AMD的無關聯的患者(平均年齡79.5±7.8歲)和113名無關聯的對照患者(平均年齡78.4±7.4歲；通過年齡和人種匹配)，和來自Columbia University的550名患有臨床上被證明的AMD的無關聯的患者(平均年齡71.32±8.9)和275名無關聯的、通過年齡和人種匹配的對照(平均年齡68.84±8.6歲)。由視網膜研究員訓練的眼科醫師通過間接檢眼鏡檢查法和裂隙燈顯微鏡檢查法來檢查患者。
[0148]Fundas照片根據標準化的、國際分類體系(Bird等，1995)分級。如果對照患者未顯示任何可辨別的黃斑疾病體徵或不具有已知的AMD家族史，則將他們選擇並包括。AMD患者根據他們參與研究時最嚴重的眼分類被細分為表型類別:早期AMD (ARM)、地圖樣萎縮(GA)和滲出性(CNV) AMD。The University of 1wa的ARM和GA病例被進一步細分為不同的表型(單獨的RPE改變、>10的斑狀硬玻璃疣、斑狀軟玻璃疣、BB (表皮)玻璃疣、PED、「Cherokee」萎縮、半島狀地圖樣萎縮(peninsular geographic atrophy)和框式地圖樣萎縮(pattern geographic atrophy))。所有病例的最早的可被證明的表型也被記錄並用於分析。
[0149]如表1A中所示，在兩個獨立組的檢測中發現因子H基因多態位點與AMD的高度顯著的關聯，所述兩個獨立組一共包括約900個AMD病例和400個匹配的對照。表1A-1B中列出十六(16)個因子H基因中的多態性。其中有十二(12)個在SNP資料庫(dbSNP)中發現，所述資料庫可在國家生物技術信息中心(NCBI)找到。dbSNP是人因子H基因中SNP的集合，所述SNP分散於因子H基因的22個編碼外顯子中，分散於因子H基因的啟動子、5』未翻譯區、內含子和3』未翻譯區中。以下列出在dbSNP資料庫中找到的人因子H基因中379個SNP的登錄號。這些SNP可用於實施本發明的方法。
[0150]表A
【權利要求】
1.分離的補體因子H多肽在製備預防或治療年齡相關性黃斑變性的藥物中的用途，其中所述補體因子H多肽包含SEQ ID NO:2第402位殘基對應位點的酪氨酸。
2.權利要求1的用途，其中所述補體因子H多肽包含SEQID NO:2第62位殘基對應位點的異亮氨酸。
3.權利要求1或2的用途，其中所述補體因子H多肽用於通過眼內注射施用。
4.表達補體因子H多肽的分離的細胞在製備預防或治療年齡相關性黃斑變性的藥物中的用途，其中所述補體因子H多肽包含SEQ ID NO:2第402位殘基對應位點的酪氨酸。
5.權利要求4的用途，其中所述補體因子H多肽包含SEQID NO: 2第62位殘基對應位點的異亮氨酸。
6.分離的多核苷酸在製備預防或治療年齡相關性黃斑變性的藥物中的用途，所述多核苷酸包含編碼補體因子H多肽的序列，所述序列與啟動子有效連接，其中所述補體因子H多肽包含SEQ ID NO:2第402位殘基對應位點的酪氨酸。
7.權利要求6的用途，其中所述補體因子H多肽包含SEQID NO: 2第62位殘基對應位點的異亮氨酸。
8.權利要求6或7的用途，其中所述啟動子對視網膜色素上皮具有特異性。
9.權利要求1-8中任一項的用途，其中所述補體因子H多肽的胺基酸序列是SEQIDNO:2，或是由SEQ ID NO:2經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸衍生的序列，且該序列具有與補體因子H多肽相同的功能，前提是第402位對應的殘基是酪氨酸。
10.權利要求1-8中任一項的用途，其中所述補體因子H多肽包含SEQID NO: 5或SEQID NO:6的殘基19之前的胺基酸序列。
11.與補體因子H多肽的至少一部分核苷酸序列互補的分離的反義RNA、核酶或短幹擾RNA在製備治療或預防年齡相關性黃斑變性的藥物中的用途。
12.單克隆抗體在製備治療或預防年齡相關性黃斑變性的藥物中的用途，所述單克隆抗體與第402位為組氨酸的補體因子H多肽結合，但不與第402位為酪氨酸的補體因子H多肽結合。
13.權利要求1-12中任一項的用途，其中所述藥物給予診斷患有年齡相關性黃斑變性的患者，或給予鑑定具有與年齡相關性黃斑變性危險相關的補體因子H基因單元型的患者。
14.藥物組合物，其包含重組補體因子H多肽和可藥用賦形劑，其中重組補體因子H多肽包含第62位的異亮氨酸和第402位的酪氨酸，並且其中所述組合物不含病原體，並且適於對人類患者施用。
15.藥物組合物，其包含重組補體因子H多肽和可藥用賦形劑，其中所述補體因子H多肽的胺基酸序列是SEQ ID NO:2，或是由SEQ ID NO:2經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸衍生的序列，且該序列具有與補體因子H多肽相同的功能，前提是第402位對應的殘基是酪氨酸且第62位對應的殘基是異亮氨酸，並且其中所述組合物不含病原體，並且適於對人類患者施用。
16.包含抗體的藥物組合物，所述抗體與第402位為組氨酸的補體因子H蛋白質結合，但不與第402位為酪氨酸的補體因子H蛋白質結合。
17.藥物組合物，其包含編碼補體因子H多肽的基因治療載體和可藥用賦形劑，其中所述補體因子 H多肽包含第62位的異亮氨酸和第402位的酪氨酸。
18.表達重組人補體因子H的分離的哺乳動物宿主細胞，其中所述重組人補體因子H包含第62位的異亮氨酸和第402位的酪氨酸。
【文檔編號】C12N5/10GK103920142SQ201410180974
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2006年2月14日 優先權日:2005年2月14日
【發明者】G·S·哈格曼, R·J·史密斯 申請人:愛荷華大學研究基金會