一種預防和治療豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗的製作方法

2023-05-31 07:36:56 1

專利名稱：一種預防和治療豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種預防和治療豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗，特別是指一種含多種抗原的豬萎縮性鼻炎的水性佐劑滅活疫苗。
背景技術：
豬萎縮性鼻炎(atrophic rhinitis，AR)是豬群的一種重要的呼吸系統傳染病，它會引起豬的慢性鼻炎、打噴嚏、流眼淚、顏部變性和鼻甲骨萎縮等症狀，嚴重的還可以導致鼻吻變形並影響全身骨骼發育，從而導致豬生長遲緩，使豬容易感染繼發性複合性肺炎，給養豬業造成巨大的損失。該病可感染任何年齡階段的豬，其中4周齡以內的豬感染率最高， 症狀一般出現在8-12周齡。豬萎縮性鼻炎可分為進行性豬萎縮性鼻炎(progressive atrophic rhinitis, PAR)和非進行性豬萎縮性鼻炎(nonprogressive atrophic rhinitis，NPAR)。進行性豬萎縮性鼻炎主要由產毒素多殺性巴氏桿菌(toxigenic Pasteurella multocida, Pm) 引起，是豬萎縮性鼻炎的主要形式；非進行性豬萎縮性鼻炎，單純由支氣管敗血波氏桿菌 (Bordetella bronchiseptica, Bb)引起，由於其通常只引起輕微的鼻甲骨萎縮，往往觀察不到鼻吻部的典型病變，而常常為人們所忽視。產毒素多殺性巴氏桿菌(Pm)有莢膜D型和A型等。D型和A型Rn均可以分泌一種皮膚壞死毒素(Pasteurella multocida toxin, PMT) 由於D型Pm與A型Pm產生的PMT 均相同，因此，現有的疫苗中常常僅含有D型Rii抗原，不含A型Rii。PMT是約146KDa的類毒素(toxoid)，可直接引起豬鼻炎、鼻梁變形、鼻甲骨萎縮甚至消失，全身代謝障礙，生產性能下降，是豬萎縮性鼻炎最重要的致病因子。PMT在去離子水(DW)中，或在高於pHIO或低於pH4的溶液中，都不穩定。因此，傳統中用於預防豬萎縮性鼻炎的疫苗抗原是利用福馬林(formaldehyde)滅活，以使PMT成為失去毒性但保有抗原性的類毒素(toxoid)。但是，生產PMT類毒素的步驟複雜，現有技術中是先於37°C下以血液培養基來培養多殺巴斯德氏菌產毒株Rn長達沈小時，或是以腦心浸出物肉湯培養基 (brain heart infusionbroth, BHI brotti)培養72小時後，進行PMT的提取與濃縮，所收穫的毒素於37°C下以福馬林滅活4天後，才能得到低毒性但仍具抗原性的類毒素。因此，除了製備方式繁瑣以外，將PMT滅活製備成疫苗中抗原成本很高，也限制了 PMT在豬萎縮性鼻炎中的應用。當前，我國所用的豬萎縮性鼻炎疫苗還主要是支氣管敗血波氏桿菌(Bb)滅活苗或支氣管敗血波氏桿菌(Bb)加有產毒素多殺性巴氏桿菌D型(Pm-D)的滅活苗，所使用的佐劑常常為鋁膠佐劑、弗氏佐劑、油包水型佐劑，存在著保護性抗原成分少，不能提供完全的保護，注射後吸收不完全，副反應大等缺點。

發明內容
有鑑於此，本發明的主要目的在於提供一種預防和治療豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗，包含滅活的支氣管敗血波氏桿菌(Bb)，滅活的多殺性巴氏桿菌A型(Pm-A)，滅活的多殺性巴氏桿菌D型(Pm-D)和滅活的多殺性巴氏桿菌D型的類毒素(PMT)及獸藥學上可接受的佐劑。優選地，本發明的滅活的多殺性巴氏桿菌D型的類毒素為使用甲醛滅活獲得的類毒素。
優選地，本發明的支氣管敗血波氏桿菌HN8株保藏號為CCTCC NO :M2011223，多殺性巴氏桿菌A型HN5株保藏號為CCTCC NO :M2011222，多殺性巴氏桿菌D型HB4株保藏號為 CCTCC NO :M2011221o優選地，本發明的支氣管敗血波氏桿菌含量為IXlO9 5X109CFU/ml。優選地，本發明的多殺性巴氏桿菌A型含量為IXlO9 5X109CFU/ml。優選地，本發明的多殺性巴氏桿菌D型含量為IXlO9 5X109CFU/ml。優選地，本發明的多殺性巴氏桿菌D型的類毒素含量為1 5yg/ml。優選地，本發明的獸藥學上可接受的佐劑為水佐劑。優選地，本發明的獸藥學上可接受的佐劑為gel佐劑。本發明的另一目的在於提供一種豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗的製備方法，包括以下步驟(1)將保存的支氣管敗血波氏桿菌HN8株菌種於固體平面活化，挑取單克隆於適宜培養基培養16-24h，之後於適宜培養基擴大培養16-24h，收穫菌液，滅活；(2)將保存的多殺性巴氏桿菌A型HN5株，多殺性巴氏桿菌D型菌HB4株種於固體平面活化，挑取單克隆於適宜培養基培養16-24h，之後於適宜培養基擴大培養16-24h，收穫菌液，滅活；(3)多殺性巴氏桿菌D型菌HB4株種於固體平面活化，挑取單克隆於適宜培養基培養16-24h，之後於適宜培養基擴大培養16-24h，收穫菌液，離心收集菌體，超聲破碎，提取多殺性巴氏桿菌D型(PMT)毒素，甲醛滅活製成PMT類毒素；(4)將已滅活的支氣管敗血波氏桿菌、多殺性巴氏桿菌A型、多殺性巴氏桿菌D型和PMT類毒素按比例混合，加入水佐劑，乳化製成多價滅活疫苗。優選地，本發明的豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗的製備方法，已滅活的支氣管敗血波氏桿菌的含量為IXlO9 5X109CFU/ml、多殺性巴氏桿菌A型的含量為IXlO9 5X 109CFU/ml、多殺性巴氏桿菌D型的含量為1 X IO9 5X 109CFU/ml和PMT類毒素的含量為 1 5 μ g/ml0技術效果由上可知，本發明的豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗有如下優點首先，本發明的豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗的抗原保護全面，相對於傳統的豬萎縮性鼻炎疫苗而言，不僅有常見的滅活的多殺性巴氏桿菌D型(Pm-D)抗原和滅活的支氣管敗血波氏桿菌(Bb)抗原，還含有滅活的多殺性巴氏桿菌A型(Pm-A)抗原和PMT類毒素， 因此本發明的豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗可以更全面並且更加有效地治療和預防豬萎縮性鼻炎，特別是針對由多殺性巴氏桿菌A型或PMT直接引起的豬萎縮性鼻炎提供更加有效的疫苗，而在以往對豬萎縮性鼻炎中的防治中常常被人們所忽視。其次，本發明提供了一種新的PMT培養和提取的方法，克服了以往滅活PMT類毒素需要使用福馬林，而可能使該毒素的抗原性產生一些無法預估的化學結構性變化，進而影響到疫苗的效力的缺點。並且，本發明的培養PMT的工藝簡便，具有生產時間短、效率高、 生產成本低廉、無毒性、高安全性及高免疫保護效力特點，因此，本發明的豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗可以含有傳統疫苗中沒有的滅活的PMT類毒素的抗原。 最後，本發明的豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗經過發明人反覆試驗獲得了一種各種抗原的配比合理的疫苗，可以解決各種抗原相互幹擾的問題，進而提高免疫的效果。而且，發明人還提供了一種水型佐劑，可以解決傳統的鋁膠佐劑、弗氏佐劑、油包水型佐劑注射後吸收不完全，副反應大等缺點。


圖1為PCR鑑定結果圖。菌株保藏信息本發明菌株為支氣管敗血波氏桿菌HN8株(Bordetella bronchiseptica HN8)保藏號為 CCTCC NO :M2011223，多殺性巴氏桿菌 A 型 HN5 株(Pasteurella multocida A Type HN5)保藏號為 CCTCC NO :M2011222、多殺性巴氏桿菌 D 型 HB4 株(Pasteurella multocida D Type HB4)保藏號為CCTCC NO :M2011221。以上三個菌株於2011年6月28日在武漢大學的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)進行了保藏。
具體實施例方式下面以具體實施例對本發明進行說明實施例1豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗的製備1.本發明實施例的菌種的來源及鑑定1. 1菌種的來源支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchis印tica，Bb)HN8株保藏號為CCTCC NO :M2011223，多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)A 型 HN5 株保藏號為 CCTCC N0: M2011222、多殺性巴氏桿菌D型HB4株保藏號為CCTCC N0:M2011221。以上三個菌株的菌株由普萊柯生物工程股份有限公司分離鑑定，上述菌株製備的疫苗免疫性好，特異性強，具有其他菌株不可替代的作用。1.2菌種的鑑定1.2. 1生化鑑定支氣管敗血波氏桿菌HN8株有溶血現象；過氧化氫酶、氧化酶、尿素酶、檸檬酸酶、 氯化鈉(6%、7. 5%,9% )試驗和石蕊牛乳試驗均為陽性；阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、 麥芽糖、甘露醇、蔗糖、木糖試驗和亞硝酸鉀試驗均為陰性。多殺性巴氏桿菌A型HN5株和多殺性巴氏桿菌D型HB4株氧化氫酶、氧化酶、尿素酶、吲垛、硫化氫試驗和硝酸鹽還原試驗陽性，葡萄糖、半乳糖、蔗糖、山梨醇試驗陽性；麥康凱培養基生長性、運動性、溶血性為陰性；MR、VP反應，明膠液化試驗，乳糖、棉籽糖試驗為陰性。1.2.2PCR 鑑定將保存支氣管敗血波氏桿菌HN8株、多殺性巴氏桿菌A型HN5株、多殺性巴氏桿菌 D型HB4株菌種劃線於BHIAgar平板復甦，挑單菌落搖制菌液進行PCR鑑定，PCR引物共4對，為Bb，Pm, Pm-A, Pm-D, T+Pm，分別檢測支氣管敗血波氏桿菌，多殺性巴氏桿菌，多殺性巴氏桿菌A型，多殺性巴氏桿菌D型，產毒素多殺性巴氏桿菌，Bb引物擴增基因為支氣管敗血波氏桿菌的flaA基因，PCR擴增片段為237bp。Pm引物擴增基因為多殺性巴氏桿菌的KMTl 基因，PCR擴增片段為457bp。Pm-A引物擴增基因為多殺性巴氏桿菌A型的hyaD-hyaC基因，PCR擴增片段為1044bp。Pm-D引物擴增基因為多殺性巴氏桿菌D型的dcbF基因，PCR 擴增片段為657bp。T+Pm引物擴增基因為toxA基因，PCR擴增片段為864bp。PCR鑑定結果見附圖1，其中，泳道1 為 Mark。泳道2和3為支氣管敗血波氏桿菌HN8株，目的條帶(237bp)為支氣管敗血波氏桿菌鑑定基因fla。泳道4 為 ddH20。泳道5為多殺性巴氏桿菌A型HN5株，泳道6為多殺性巴氏桿菌D型HB4株，目的條帶(457bp)為多殺性巴氏桿菌種特異性基因KMT。泳道7 為 ddH20。泳道8和9為多殺性巴氏桿菌A型HN5株，目的條帶(1044bp)為多殺性巴氏桿菌 A型鑑定基因hyaD-hyaC。泳道10 為 ddH20。泳道11和12為多殺性巴氏桿菌D型HB4株，目的條帶(657bp)為多殺性巴氏桿菌D型鑑定基因dcbF。泳道13 為 ddH20。泳道14和15為多殺性巴氏桿菌D型HB4株，目的條帶(864bp)為產毒素多殺性巴氏桿菌鑑定基因ToxA。2.豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗的配製2.1菌毒液的製備2. 1. 1支氣管敗血波氏桿菌菌液的製備將支氣管敗血波氏桿菌HN8株劃線於改良鮑姜氏血平板，與37°C培養48h，挑取溶血環明顯的單克隆於含5ml BHI的試管中，於150-220rpm，37°C振蕩培養16_24h，之後將菌液以
的接種量於37°C擴大培養12-16h，轉速150-220rpm。取樣作系列十倍稀釋，塗平板計數。2. 1.2巴氏桿菌A型，巴氏桿菌D型菌液的製備將巴氏桿菌A型HN5株，巴氏桿菌D型HB4株的菌種劃線於TSA平板，與37°C培養 16-20h，挑取單克隆於含5mlBHI的試管中，於150_220rpm，37°C振蕩培養16_24h，之後將菌液以
的接種量於37°C擴大培養12-16h，轉速150-220rpm。取樣作系列十倍稀釋，塗平板計數。2. 1.4菌液的滅活取支氣管敗血波氏桿菌HN8株、巴氏桿菌A型HN5株和巴氏桿菌D型HB4株菌液， 加入 甲醛，使甲醛的最終濃度為0. 2% -0. 4%體積，37°C滅活24-48h，其間不斷搖動。滅活後取樣塗布於BHI平板，37°C培養16-24h，無菌落生長。2. 1. 5菌液的濃縮將滅活後的菌液離心濃縮，棄上清，用PBS懸浮稀釋菌體，使細菌含量相當於滅活前活菌數為lXlO^CFU/mL。
2. 2多殺性巴氏桿菌D型(PMT)類毒素的提取於滅活2. 2. 1將離心收集的巴氏桿菌D型HB4株菌體用滅菌雙蒸水重懸，使細菌濃度達到 1012CFU/mL。將重懸菌液置冰浴中經超聲波破碎後，10000r/min離心30min，上清用0. 22pm 濾膜過濾，濾液為粗製PMT類毒素。用TE(10mmol/L Tris-HCl pH 7. 4，lmmol/LEDTA)平衡DEAE-52柱，以含0 0. 5mol/L NaCI的TE線性梯度洗脫，流速30mL/h。收集各峰，取 50 μ L進行SDS-PAGE分析。將DEAE-52分離到的樣品用蔗糖濃縮後上S印hadex G-200柱， 用TE以6mL/h流速洗脫，分段收集各峰，進行SDS-PAGE分析。收集的PMT蛋白用超濾管濃縮，並用考馬斯亮藍法測定PMT蛋白濃度。將濃縮的蛋白加入甲醛，使甲醛的最終濃度為 0. 2% -0. 4%體積，37°C滅活24-48h，其間不斷搖動。PMT類毒素滅活後取0. Iml於豚鼠背部皮膚注射，無皮膚壞死。(3)疫苗配 製取滅活後的支氣管敗血波氏桿菌HN8株、巴氏桿菌A型HN5株、巴氏桿菌D型HB4 株菌液和PMT類毒素緩緩加入到一定量的Gel佐劑(法國賽比克公司)中，加的過程中不斷用玻璃棒攪拌，最後加入柳硫汞鈉，使最終濃度為0.01%體積，混勻、檢驗、分裝，即為豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗，其中疫苗中菌體含滅活前支氣管敗血波氏桿菌HN8株、巴氏桿菌A型HN5株和巴氏桿菌D型HB4株含量為1 X 109CFU/mL_5 X 109CFU/mL, PMT類毒素含量為 1-5 μ g/ml。實施例2豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗的製備2菌種及菌種的滅活，PMT類毒素的提取和滅活同實施例1。實施例2的各個抗原的比例參見下表1。實施例3豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗的製備3菌種及菌種的滅活，PMT類毒素的提取和滅活同實施例1。實施例3的各個抗原的比例參見下表1。實施例1-3的疫苗的具體配比如表1 表1豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗的成分配比
權利要求
1.一種預防和治療豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗，其特徵在於，包含滅活的支氣管敗血波氏桿菌，滅活的多殺性巴氏桿菌A型，滅活的多殺性巴氏桿菌D型和滅活的多殺性巴氏桿菌D型的類毒素及獸藥學上可接受的佐劑。
2.根據權利要求1所述的豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗，其特徵在於，滅活的多殺性巴氏桿菌D型的類毒素為使用甲醛滅活獲得的類毒素。
3.根據權利要求1所述的豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗，其特徵在於，所述的支氣管敗血波氏桿菌HN8株的保藏號為CCTCCNO :M2011223，所述的多殺性巴氏桿菌A型HN5株的保藏號為CCTCC NO :M2011222，所述的多殺性巴氏桿菌D型HB4株保藏號為CCTCC NO M2011221。
4.根據權利要求1所述的豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗，其特徵在於，所述的支氣管敗血波氏桿菌含量為1 X IO9 5 X 109CFU/ml。
5.根據權利要求1所述的豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗，其特徵在於，所述的多殺性巴氏桿菌A型含量為1 X IO9 5 X 109CFU/ml。
6.根據權利要求1所述的豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗，其特徵在於，所述的多殺性巴氏桿菌D型含量為1 X IO9 5 X 109CFU/ml。
7.根據權利要求1所述的豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗，其特徵在於，所述的多殺性巴氏桿菌D型的類毒素含量為1 5 μ g/ml。
8.根據權利要求1所述的豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗，其特徵在於，所述的獸藥學上可接受的佐劑為水佐劑。
9.根據權利要求8所述的豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗，其特徵在於，所述的獸藥學上可接受的佐劑為gel佐劑。
10.一種豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)將保存的支氣管敗血波氏桿菌HN8株菌種於固體平面活化，挑取單克隆於適宜培養基培養16-24h，之後於適宜培養基擴大培養16-Mh，收穫菌液，滅活；(2)將保存的多殺性巴氏桿菌A型HN5株，多殺性巴氏桿菌D型HB4株菌種於固體平面活化，挑取單克隆於適宜培養基培養16-24h，之後於適宜培養基擴大培養16-Mh，收穫菌液，滅活；(3)多殺性巴氏桿菌D型HB4株菌種於固體平面活化，挑取單克隆於適宜培養基培養 16-24h，之後於適宜培養基擴大培養16-Mh，收穫菌液，離心收集菌體，超聲破碎，提取多殺性巴氏桿菌D型(PMT)毒素，甲醛滅活製成PMT類毒素；(4)將已滅活的支氣管敗血波氏桿菌、多殺性巴氏桿菌A型、多殺性巴氏桿菌D型和 PMT類毒素按比例混合，加入水佐劑，乳化製成多價滅活疫苗。
11.根據權利要求10所述的豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗的製備方法，其特徵在於，所述已滅活的支氣管敗血波氏桿菌的含量為1 X IO9 5X 109CFU/ml、多殺性巴氏桿菌A型的含量為1\109 5\10^^/1111、多殺性巴氏桿菌0型的含量為1 X IO9 5X IO9CFU/ ml和PMT類毒素的含量為1 5 μ g/ml。
全文摘要
本發明提供一種預防和治療豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗及其製備方法，所述多價滅活疫苗包含滅活的支氣管敗血波氏桿菌、多殺性巴氏桿菌A型和多殺性巴氏桿菌D型及PMT類毒素。本發明還提供了一種新的PMT培養和提取的方法，因此，本發明的豬萎縮性鼻炎的多價滅活疫苗抗原保護全面，相對於傳統的豬萎縮性鼻炎疫苗而言，可以更全面並且更加有效地治療和預防豬萎縮性鼻炎。最後，本發明的多價疫苗中，各種抗原的配比合理的疫苗，可以解決各種抗原相互幹擾的問題，進而提高免疫的效果。而且，發明人還提供了一種水型佐劑，可以解決傳統的鋁膠佐劑、弗氏佐劑、油包水型佐劑注射後吸收不完全，副反應大等缺點。
文檔編號A61K39/116GK102302771SQ20111019606
公開日2012年1月4日 申請日期2011年7月13日 優先權日2011年7月13日
發明者孫進忠, 張許科, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司