一種人工合成的新抗菌肽及其製備方法和應用的製作方法

2023-05-31 08:16:11

專利名稱：：一種人工合成的新抗菌肽及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種人工合成的新抗菌肽、其製備方法和在製備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌感染的藥物中的應用。
背景技術：
：抗菌肽(Antibacterialp印tide)又口憤微生物肽(Antimicrobialp印tide)、抗生素肽(Antibioticsp印tide)，是由多種生物細胞特定基因編碼，經外界條件誘導產生的一類具有廣譜抗菌、抗病毒活性的多肽。抗菌肽在疾病治療與預防中具有廣闊的應用前景，可望成為新型的抗菌和抗病毒藥物。抗菌肽不僅自身具有良好的抗菌活性，不同抗菌肽與傳統抗生素聯用，還可提高抗菌肽和傳統抗生素的藥物療效，甚至拓寬傳統抗生素的抗菌譜。傳統抗生素通過消除微生物生長或生存必不可少的條件，如使酶失活變性，來達到殺菌的目的，細菌只要改變一種基因就足以抵抗此類抗生素的攻擊；而抗菌肽則通過中和電荷的方法與細菌細胞膜相互作用，從而穿透細胞膜達到殺菌目的，極大地減少了細菌產生耐藥性的可能。目前已有十餘種抗菌肽進行臨床前或臨床研究。衍生於magainins的MSI78已進入III期臨床試驗，主要用於治療糖尿病患者由多種微生物引起的腳部潰瘍，研究結果證實，其效果與口服奧氟沙星的作用相同，但不良反應相對較少。來自人嗜中性粒細胞中的抗菌肽BPI的N端21kDa的片段(Neuprex)作為注射劑也已進入III期臨床，它能夠大幅降低小兒腦膜炎奈瑟氏球菌感染造成的死亡。天然抗菌肽的肽鏈較長、合成成本高、抗菌活性低並且有很強的溶血副作用，因此臨床使用價值較低。因此如何減少多肽的胺基酸殘基數並提高其抗菌活性，降低溶血副作用成為抗菌肽藥物開發的熱點。目前的研究主要集中在對已知結構的天然抗菌肽進行功能改造，如殘基替換、構建雜合肽、截取部分序列等。但通過這種途徑很難開發出結構新穎且比天然抗菌肽具有更廣泛抗菌譜的新型抗菌肽。因此本發明對抗菌肽序列進行全新設計並人工合成，提供了一種不同於天然抗菌肽結構的新型抗菌肽KW-13。其由脯氨酸連接的兩部分結構域組成，N端的胺基酸用於增加正電荷含量，在此基礎上C端另加一段標準的a螺旋結構(鹼性胺基酸-疏水性胺基酸-疏水性胺基酸-鹼性胺基酸的重複序列)。發明人將本發明的KW-13全序列胺基酸結構經NCBI蛋白質資料庫進行搜尋比對，未發現有任何相同多肽；將本發明的KW-13全序列胺基酸結構經APD抗菌肽資料庫進行模擬預測，顯示其具有良好的抗菌活性。
發明內容本發明的目的是基於抗菌肽分子設計理論和固相多肽合成技術，提供一種具有強烈抗菌活性的新型抗菌肽KW-13。本發明的另一個目的是將這種抗菌肽應用於製備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌感染的藥物中。為了實現本發明的目的，本發明提供了如下技術方案抗菌肽KW-13是一種直鏈多肽，含有13個胺基酸殘基，分子量為1686Da。KW-13的全序列為賴氨酸_色氨酸_賴氨酸_酪氨酸_脯氨酸_賴氨酸_亮氨酸_亮氨酸_賴氨酸_賴氨酸_亮氨酸_亮氨酸_賴氨酸。抗菌肽KW-13的製備方法根據所設計的KW-13胺基酸序列，利用固相多肽合成技術進行手工合成。將經保護的胺基酸在Wang樹脂上按預先設計的順序從C端到N端逐個進行偶合併脫保護。合成的多肽經高濃度的TFA剪切後，得到粗品。經HPLC反相柱進行純化後通過質譜分析確證。合成的多肽溶於滅菌水，利用96孔板法對其抗菌活性進行檢測。本發明的有益效果在於基於抗菌肽分子設計理論和固相多肽合成技術得到的新抗菌肽KW-13具有結構簡單、人工合成方便和廣譜抗菌等有益特點。另外KW-13不含有稀有胺基酸和外源化學成分，是一種極具應用潛力且安全的抗菌替代物。具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發明的實質性內容。應當理解這些實施例僅用於說明本發明而非對本發明有任何限制。實施例1抗菌肽的製備及分離純化按下述序列製備KW-13。KW-13的全序列賴氨酸-色氨酸-賴氨酸-酪氨酸-脯氨酸-賴氨酸-亮氨酸-亮氨酸-賴氨酸_賴氨酸_亮氨酸_亮氨酸_賴氨酸。本實施例採用固相多肽合成技術進行手工合成。合成的多肽經高濃度的TFA剪切後，得到粗品。經HPLC反相柱進行純化後，通過質譜分析確證。具體實驗步驟如下1、KW-13的製備:(以製備0.12,1量的KW-13為例說明固相合成多肽的方法)以下製備抗菌肽的樹脂、Fmoc保護胺基酸及縮合試劑、切割試劑均購買於上海吉爾生化有限公司。製備從C端到N端逐個進行。稱取O.5012g(0.12mmol)Fmoc-Lys(Boc)-WangResin放入燒杯，加入DMF溶脹lh。將反應後的樹脂用DMF洗兩次，抽濾幹。加入部分20%的哌啶/DMF先反應5min，之後加入剩餘部分再反應15min，脫去Fmoc保護基。用茚三酮顯色法檢測，結果表明脫保護反應已進行完全。濾去反應液，將樹脂用DMF洗滌4次，至濾液加水無渾濁，濾幹。稱取第2個胺基酸Fmoc-Leu-0H0.1276g(0.36mmol)，縮合劑HBTU0.1365g(0.36mmol)，HOBT0.0486g(0.36mmol)用DMF約4ml溶10min。將Fmoc-Leu-OH的DMF溶液加入到含樹脂的砂心漏鬥中，調節氮氣的流速使之處於穩速狀態，之後再加入DIEA145ii1(0.84mmol)，室溫反應lh。用茚三酮顯色法檢測，結果表明偶合反應已進行完全。將反應後的樹脂用DMF洗三次，抽濾幹，加入20%的哌啶/DMF重複脫保護操作。濾去反應液，將樹脂用DMF洗滌4次，至濾液加水無渾濁，濾幹。後面接著偶合由C端起的第三個至最後一個胺基酸。所有胺基酸的a-氨基都用Fmoc保護，有側鏈保護基的胺基酸為Fmoc-Lys(boc)-0H、Fmoc_Tyr(tbu)-OH和Fmoc-Trp(Boc)_0H。最後一次脫保護後將反應後的樹脂用DMF洗4次，無水甲醇1次，DCM2次，無水甲醇2次，濾幹。將樹脂轉移後，加入切割液TFA:H20:EDT:Tis(9.4:2.5:2.5:0.1)攪拌1.5h。抽濾，在濾液中加入10倍體積的冰乙醚，充分震蕩後靜置30min。抽濾，真空乾燥，即得KW-13粗肽。2、KW-13的純化將200mg上述粗肽溶解於40mL純水中，用製備型反相HPLC純化。色譜柱為Delta-PakC1825X200mm;流動相為A液5%甲醇+水相中0.05X三氟乙酸，B液95%甲醇+水相中0.05%三氟乙酸。洗脫程序為57%-64%B液150ml，流速為5ml/min，檢測波長為280nm和210nm。分管收集主峰峰尖部分後，用分析型反相HPLC對收集成分進行檢測，色譜柱為globalSP120-5-C18-BI04.6X250mm，流動相同上，洗脫程序為49%-54%B液20min，流速為lml/min，檢測波長210nm，收集的成分達到純度要求。收集液經旋轉蒸發濃縮，然後冷凍乾燥得到KW-13純肽。純肽的質譜表明，其分子量與計算值相符。實施例2抗菌肽的抑菌活性檢測採用96孔板法對抗菌肽的抑菌活性進行檢測。1、KW-13的抑菌圈測定試驗菌株分別接種於斜面固體培養基上，37t:培養18小時後，將保存在斜面上的試驗菌株用3ml生理鹽水洗下來，取lml菌液加入融化並冷卻至40-5(TC左右的培養基，迅速混勻。用移液管移取10ml培養基於平皿中，冷卻凝固。將牛津杯放置在規定位置，在每個牛津杯中加入100iU樣品溶液，放入37t:培養箱中培養24小時，觀察抑菌圈形成與否。2、KW_13最小抑菌濃度(MinimumInhibitoryConcentration)測定試驗菌株分別接種於斜面固體培養基上，37t:培養18小時後，轉接至2ml液體培養基，37t:培養8小時，使菌濃度約為105CFU/ml。稱取適量KW-13樣品用滅菌水配製成藥物原液512g/ml，振蕩均勻後進行倍比稀釋。如表1所示表1藥物的倍比稀釋方法tableseeoriginaldocumentpage5注先給每隻小試管編號，每管加入2ml滅菌水，再進行倍比稀釋，最後一管吸取2ml棄去。將平板編號為1.1-1.10(l為512iig/ml、10為0.5iig/ml)，還有0(空白點樣前)和2(空白點樣後)。取lml稀釋的藥物迅速加入剛滅菌後試管固體培養基9ml，振蕩均勻後將小試管按編號倒入平板，迅速混勻冷卻製成一系列藥物濃度為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5iig/ml的藥物平板。用槍吸取275的菌液加入96孔板，調整好多點接種儀，從同一藥物的低濃度到高濃度點樣。37t:培養10小時，觀察抗菌效果，記錄MIC。最小抑菌濃度為看不見細菌或真菌生長的最低樣品濃度。結果如表2所示。表2KW-13的抗菌活性tableseeoriginaldocumentpage6MIC:最小抑菌濃度，ND:未檢測到活性。以上實驗所用菌株均為臨床分離得到的致病菌株。上表中的最小抑菌濃度值越小，則代表抗菌能力越強。測試菌株均為臨床常見致病菌，包括金黃色葡萄球菌、表面葡萄球菌、產氣桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、白色念球菌和黑麴黴。從抑菌實驗結果不難看出，本發明的抗菌肽KW-13對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌都有較好的抑菌活性。比較而言，KW-13對表面葡萄球菌和產氣桿菌的抑菌作用最強，最小抑菌濃度均可達到4i!g/ml。權利要求KW-13的特徵在於其是一種直鏈多肽，含有13個胺基酸殘基，分子量為1686Da。KW-13的全序列為賴氨酸-色氨酸-賴氨酸-酪氨酸-脯氨酸-賴氨酸-亮氨酸-亮氨酸-賴氨酸-賴氨酸-亮氨酸-亮氨酸-賴氨酸。2.—種如權利要求1所述抗菌肽的製備方法，其特徵在於，所述的製備方法為固相化學法合成。3.—種如權利要求1所述抗菌肽的應用，其特徵在於，所述的抗菌肽在製備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌藥物中的應用。全文摘要本發明涉及一種人工合成的新抗菌肽KW-13的製備方法及其應用，屬於生物醫藥領域。KW-13是一種直鏈多肽，含有13個胺基酸殘基，分子量為1686Da。KW-13的全序列為賴氨酸-色氨酸-賴氨酸-酪氨酸-脯氨酸-賴氨酸-亮氨酸-亮氨酸-賴氨酸-賴氨酸-亮氨酸-亮氨酸-賴氨酸。KW-13用固相化學法合成，對多種臨床致病菌具有很強的殺滅作用，具有結構簡單、人工合成方便和廣譜抗菌等有益特點。另外KW-13不含有稀有胺基酸和外源化學成分，是一種極具應用潛力且健康安全的抗菌替代物。文檔編號A61P31/04GK101775067SQ20101010482公開日2010年7月14日申請日期2010年2月3日優先權日2010年2月3日發明者姚文瑾,孔毅,楊天雨,賴伊麗申請人:中國藥科大學