一種禽流感h5n1病毒的ctl表位多肽及其應用的製作方法

2023-05-30 12:56:51

專利名稱：：一種禽流感h5n1病毒的ctl表位多肽及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽及其應用。
背景技術：
：人禽流感H5N1病毒是一種來源於禽類的高致病性、高致死率的流感病毒亞型。1997年在香港首先爆發了人禽流感的感染，18人感染，其中6人死亡。到2003年，世界範圍內又重新出現了人禽流感病例。從2003年底至今，己有408例感染，其中205例死亡。人禽流感的傳播方式一般是從禽類傳染給人，人和人之間的直接傳染只是偶發現象。但是，一旦病毒通過突變或者與人流感病毒基因發生重排，就可能產生適應在人體複製和人與人直接傳播的新毒株，導致流感大流行。雖然目前沒有觀察到H5N1病毒持續的人到人的傳播，但是20世紀的3次流感大流行都起源於鳥類的流感病毒，其中1918-1919年流感大流行奪去了四千萬人口的生命。據估計，下一次流感大流行造成的死亡數字將遠高於此。因此，為應對流感大流行做準備是十分緊迫的任務。機體的免疫系統是抵禦病毒入侵的重要紡線，研製高效的疫苗，激發人體的保護性免疫反應是防治高致病性禽流感最重要的手段。機體的免疫系統有體液免疫和細胞免疫兩個分支。體液免疫是由抗體介導的。流感病毒通過其血凝素(HA)糖蛋白結合細胞表面的唾液酸殘基而粘附在宿主細胞表面，再通過內吞作用以及隨後的病毒囊膜和宿主細胞膜的融合而進入細胞。病毒HA對於流感病毒致病力和病毒感染的宿主範圍起著關鍵的作用，同時HA也是體液免疫的主要靶抗原。HA特異性抗體起著阻斷病毒粘附的作用，從而抑制病毒感染細胞。與體液免疫不同，細胞免疫是由細胞毒性T淋巴細胞(CTL)所介導的。病毒感染細胞後，病毒蛋白質被細胞內的蛋白酶分解成多肽，被轉運到內質網中，再被裝載到主要組織相容性複合體(MHC)I類分子上。然後多肽-MHC複合物通過高爾基體被轉運到細胞表面，再被CTL(CD8+T細胞)識別。CTL識別MHC分子提呈的病毒多肽後，分泌具有抗病毒活性的細胞因子，如IFN-Y和TNF-a，以及具有裂解細胞作用的穿孔素，從而殺傷被病毒感染的細胞，限制病毒的複製和傳播，進而清除病毒。這些被CTL識別的病毒多肽就是相應的MHC限制性的CTL表位。細胞免疫雖然可能不能預防病毒感染細胞，但是可以通過清除被病毒感染的細胞防止流感病毒導致的嚴重疾病和死亡。目前禽流感H5N1的檢測方法包括病原學方法、血清學方法和核酸檢測方法。通過病毒的分離鑑定是禽流感的經典病原學方法。該方法檢測結果準確可靠、靈敏(極少量病毒也可檢出)，但操作程序繁雜、費用高、實驗室要求高(國家規定必須在P3級實驗室進行)、耗時費力、周期長(檢測時間需1-3周)，大面積應用推廣受到較大限制。目前共有6種血清學檢測技術，分別是血凝抑制試驗(HI)、微量中和試驗(麗T)、免疫螢光技術(IFA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、膠體金免疫層析分析(GICA)和蛋白免疫印跡(westernblot)。這些方法都是利用抗原抗體之間的特異性反應，來確定病毒亞型或者某種亞型特異性抗體的滴度。血凝抑制試驗和瓊脂擴散實驗操作簡便快速，但靈敏度較低。微量中和試驗雖然靈敏度高，但操作繁瑣耗時。免疫螢光技術靈敏度高，但需要複雜昂貴的儀器設備，應用受到限制。酶聯免疫吸附試驗一般被認為是既簡便快捷，又靈敏的方法，但是用於檢測抗體時，對抗原製備的要求較高。在這6種檢測技術中，血凝抑制試驗和微量中和試驗是實驗室常規方法，其餘4種對於常規流感甲1和甲3亞型已有完善的方法，但是用於H5抗原的檢測還需改進和優化。對於膠體金免疫層析分析，日本、美國和我國有區別甲型流感、乙型流感和H5亞型的試劑盒，敏感度不夠高。禽流感病毒的核酸檢測技術包括反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和實時定量PCR(RTQ-PCR)。該方法不但可鑑定樣品中病毒的型及亞型，還可結合基因序列分析推測病毒的致病力高低。其靈敏度高，較病毒分離法快速、特異性也高，是公認的能夠在較短時間做出準確診斷的方法。但其成本較高，試驗過程複雜，對實驗環境、儀器設備、操作人員等要求高，同時幹擾因素多，會出現假陰性或假陽性現象，診斷時不能作為唯一的判定依據。除了病原學和血清學等指標對禽流感進行檢測和監測外，特異性的T細胞也可以作為一項監測指標。監測禽流感病毒特異性的T細胞，可以了解人群免疫狀態，評價疫苗的免疫效果，也為制定合理的免疫規劃提供依據。近年來T細胞檢測技術有了很大發展。首先，酶聯免疫斑點技術(enzyme-linkedi醒nospotassay,ELISPOT)是可以從單細胞水平檢測分泌細胞因子的T細胞的一種細胞免疫學檢測技術。利用ELISPOT檢測分泌IFN-y的CTL是常用的評價細胞免疫水平的方法，其原理是將IFN-y的單抗包被在貼有PVDF膜的96孔板上，再將經過免疫原性表位多肽刺激過的T細胞加入微孔內培養，其分泌的IFN-y與包被抗體結合。將細胞和未結合成分洗去後，加入酶標記IFN-y檢測單抗，與被捕獲的IFN-y結合。加入底物後，可在有IFN-y的位置產生有色斑點，每個斑點代表一個分泌IFN-y的細胞。用計算機成像分析系統記數斑點數，就可以確定樣品中分泌IFN-y的CTL的數量。ELISPOT技術敏感性高，由於細胞附近的細胞因子濃度高，分泌100個細胞因子的細胞也能被發現，足以檢測到1/15個IFN-y分泌細胞。並且因為使用了識別細胞因子或抗體的兩個不同表位的兩種單克隆抗體，ELISPOT技術有著高度的特異性。其次，MHCI類分子四聚體(Tetramer)技術是另一種近年來發展起來的CTL檢測技術。該技術是一種可直接對抗原特異性CTL進行標記和檢測的新方法。該技術利用1個分子的螢光素標記的鏈黴親合素與4個分子的生物素化的MHC-表位多肽連接成四聚體複合物，顯著增加了其與T細胞受體(Tcellrec印tor，TCR)的親和力，因而使CTL的測定敏感性大為提高。Tetramer技術不僅可定性檢測T細胞群中MHC-肽特異性T細胞，還可定量測定其百分率。該技術的特點是快速、敏感和結果特異，較ELISPOT技術更為精確。利用ELISPOT和Tetramer技術檢測特異性CTL的基礎，是已知相應的CTL表位多肽。對於禽流感H5N1病毒來說，如果確定了其不同於其他流感病毒亞型的特異性的CTL表位，就可以對其相應的特異性的CTL進行定性定量分析，但是由於沒有H5N1病毒特異性的T細胞表位，針對H5N1禽流感病毒的T細胞檢測技術至今沒有建立。
發明內容本發明的目的是提供一種禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽及其應用。本發明提供的禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽，為如下(a)或(b):(a)由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的多肽；(b)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與禽流感H5N1病毒的CTL表位相關的由序列1衍生的多肽。為了使(a)中的多肽便於純化，可在由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的多肽的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標籤。表l標籤的序列tableseeoriginaldocumentpage5上述(b)中的多肽可人工合成，也可先合成其編碼DNA，再進行生物表達得到。上述(b)中的多肽的DNA可通過將序列表中序列2自5'端第1至30位鹼基所示的DNA序列中缺失一個或幾個胺基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個鹼基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標籤的編碼序列得到。序列表的序列l所示的多肽(YV-10)為GENBANKACCESSIONGNO.AAZ16277中自氮末端第207-216位胺基酸殘基。編碼所述多肽的DNA分子也屬於本發明的保護範圍。所述DNA分子可為如下1)或2)或3):1)其編碼序列是序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且編碼相同功能多肽的DNA分子。上述嚴格條件可為在6XSSC，0.5。/。SDS的溶液中，在65。C下雜交,然後用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。含有所述DNA分子的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬於本發明的保護範圍。'本發明還保護如下物質中的至少一種在製備禽流感病毒疫苗中的應用所述的多肽，所述的DNA分子，所述的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。所述禽流感病毒具體可為H5型禽流感病毒，如H5N1禽流感病毒。本發明還保護一種禽流感病毒疫苗，它的活性成份為如下物質中的至少一種所述的多肽，所述的DNA分子，所述的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。所述禽流感病毒具體可為H5型禽流感病毒，如H5N1禽流感病毒。本發明同時保護如下物質中的至少一種在製備禽流感病毒特異性T細胞檢測試劑盒中的應用所述的多肽，所述的DNA分子，所述的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。所述禽流感病毒具體可為H5型禽流感病毒，如H5N1禽流感病毒。本發明同時保護一種禽流感病毒特異性T細胞檢測試劑盒，它含有如下物質中的至少一種所述的多肽，所述的DNA分子，所述的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。所述禽流感病毒具體可為H5型禽流感病毒，如H5N1禽流感病毒。本專利的保護範圍也包括對YV-10的胺基酸以及相應的基因序列進行增刪或突變所得到的用於相同目的的序列。人類白細胞抗原(HLA)是人類的主要組織相容性複合體(MHC)分子。HLA-A*0201是世界人口表達最廣泛的一個HLA的等位基因，HLA-A的201陽性的個體佔世界人口的50%。所述的表位多肽(YV-10)經過refolding結合實驗和T2細胞結合實驗，證實了其與HLA-A的201分子具有較高親和力，並且在HLA-AW201/Kb轉基因小鼠中證實其具有很強的免疫原性，能誘導很強的CTL反應。YV-10還被證實能在康復期的禽流感患者外周血單個核細胞中誘導CTL反應。H5N1特異性T細胞表位的鑑定，使得H5N1病毒特異性T檢測能夠以高度的特異性和靈敏度進行，這樣就可以作為一項診斷指標，也可以為檢測人群對特定病原體免疫狀態、制定合理的免疫規劃提供依據。本發明所提供的表位多肽，主要用作在HLA-AW201陽性個體中激發對禽流感H5N1病毒具有保護作用的細胞免疫的疫苗，也用作在HLA-AW201陽性個體中檢測禽流感H5N1病毒特異性CTL反應的診斷試劑。本發明提供表位多肽為開發相應的疫苗、相應的檢測試劑和診斷方法奠定了基礎。圖1為多肽與HLA-AW201分子以及P2m分子構成複合物的refolding實驗結果。圖2為多肽與T2細胞表面的HLA-A2分子結合能力的實驗結果。圖3為經帶有H5HA基因的痘苗病毒載體免疫的HLA-A的201/Kb轉基因小鼠脾細胞中的多肽的特異性CTL反應的實驗結果。圖4為多肽免疫HLA-A沐0201/Kb轉基因小鼠後CTL反應的實驗結果。具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。YV-IO多肽如序列表的序列1所示。以下實施例中的多肽均委託北京中科亞光生物科技有限公司合成，經過HPLC和質譜分析進行鑑定，純度〉95%。實施例l、用refolding實驗檢測多肽與HLA-八*0201分子的結合能力在refolding實驗中，如果多肽能與HLA-A*0201分子結合，那麼多肽、HLA-A*0201重鏈和P2m就能形成穩定的多肽-MHC-P2m三元複合物，在分子篩層析圖譜中出現多肽-重鏈-輕鏈複合物峰。一、HLA-AW201重鏈胞外區包涵體的製備1、重組質粒I的構建將編碼HLA-A的201重鏈胞外區的DNA(GENBANKACCESSIONNO.AY365426自5'末端第73-897位核苷酸)導入pET-28(a)，得到重組質粒I。2、HLA-AW201重鏈胞外區包涵體的製備將轉染了重組質粒I的大腸桿菌BL21(NEB公司，Cat.No.C2566H)的單克隆菌種接種於少量培養基中，在37t:搖床上過夜。再將過夜培養物接種於2L培養基中，在37'C搖至0D600為0.6-0.8時，加入lraMIPTG(終濃度為lmM)誘導4h後收穫細菌。用PBS重懸菌體，加入lmMDTT，超聲破碎後離心，沉澱為包涵體。將包涵體用含有Triton的洗滌緩衝液(50mMTrisHC1，0.5%TritonX-100，lOOmMNaCl，lmMNaEDTA，lmMDTT)洗兩次，用不含有Triton的洗滌緩衝液洗一次，再加入尿素緩衝液(25mMMES[SIGMAM-3023]，8Murea[Baker4204-05]，10mMNaEDTA,0.1mMDTT)溶解，分裝後在-S(TC保存。二、人P2微球蛋白包涵體的製備1、重組質粒II的構建將編碼人P2微球蛋白的DNA(GENBANKACCESSIONNO.NM—004048自5'末端第121-417位核苷酸)導入pET-28(a)，得到重組質粒II。2、人P2微球蛋白包涵體的製備用重組質粒II代替重組質粒I，其它同步驟一的2。三、refolding實驗Refolding體系:向Refolding緩衝液(100mMTris-HCl，400mML-arginine-HCL，2mMNaEDTA，0.5mMoxidizedglutathione,5mMreducedglutathione)中按l:1:3的摩爾比加入HLA-AHO201重鏈胞外區包涵體、人e2微球蛋白包涵體和YV-10。HLA-A帕201重鏈胞外區包涵體和人e2微球蛋白包涵體配成注入緩衝液，逐滴加入，YV-10溶解在100-200ul二甲亞碸中之後再加入。將Refolding體系放置在4T:攪拌48-36h後濃縮，進行分子篩層析。YV-10的分子篩圖譜見圖1。在洗脫體積為15ml處出現的峰就代表YV-10-MHC重鏈-P2m三元複合物，結果表明，YV-10與HLA-A的201分子有較好的親和力。實施例2、用T2細胞結合實驗檢測多肽與T2細胞表面的HLA-A2分子的結合能力T2細胞是HLA-A的201陽性，TAP分子缺陷的細胞株。該細胞不能加工內源性的抗原，但是可以遞呈外源性的抗原肽。在無抗原肽存在的情況下，其細胞表面HLA-A2分子的表達處於低水平，一旦有合適的外源性抗原肽與T2細胞表面的HLA-A2分子結合，其細胞表面HLA-A2的表達強度將大大提高。T2細胞(ATCC，Cat.No.CRL-1992)培養於含有10%胎牛血清(FBS，Gibico)的RPMI-1640(補加5.9%HEPES，0.307%穀氨酸，0.11%丙酮酸鈉，2%碳酸氫鈉，50u/ml青黴素，50u/ml鏈黴素)中，培養箱溫度為37'C，含5%C02。取對數生長期的細胞，用無血清的培養基洗2次後，將細胞調至2XlS/ml，接種於24孔板中，加入YV-10使其終濃度為50uM。在37匸和5%c02的條件下培養18h後，收穫細胞，用PBS洗2次，加入FITC標記的anti-HLA-A2單克隆抗體BB7.2(Serotech，Cat.No.P10892)，在冰上孵育20min後，用含O.5%BSA的PBS洗2次，流式細胞儀測定樣品的螢光強度。用相同體積無菌水的代替YV-10，作為陰性對照。YV-10的結果見圖2。結果表明YV-10能使T2細胞表面的HLA-A2分子表達水平提高，進一步在細胞水平證實了YV-10可以與HLA-A2分子結合。實施例3、用ELISP0T分析檢測多肽誘導經帶有H5HA基因的pcDNA3.1(+)載體免疫的HLA-AHO201/Kb轉基因小鼠的脾細胞產生特異性CTL反應的能力HLA-AW201/Kb轉基因小鼠購自上海第二軍醫大學。重組質粒III(插入青海湖H5N1病毒H5HA的pcDNA3.1(+))的製備方法如下設計上遊引物(5'-GCTAGCCATGGAGAAAATAGTGCTT-3')和下遊引物(5'-AATGCAAATTCTGCATTGTAAAAGCTT-3')擴增H5HA的基因(GENBANKACCESSIONGNO.AAZ16277)，用NheI和HindIII雙酶切，同時將pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen，Catalognos.V790-20)用NheI和HindIII雙酶切，將酶切產物置於18。C連接過夜，轉化大腸桿菌DH5a(TAKARA，Cat.No.D9057)。經克隆篩選、測序鑑定後備用。取雌性的HLA-AW201/Kb轉基因小鼠，用重組質粒III進行免疫。免疫的途徑為肌肉注射，免疫的劑量為每次3.0X106pfu。免疫分三次進行，兩次免疫之間的間隔為4周。用PBS代替重組質粒III，免疫雌性的HLA-A的201/Kb轉基因小鼠，作為對照。在最後一次免疫後的第IO天，分離小鼠脾細胞，用ELISPOT試劑盒(UCTech產品，產品目錄編號CT317-PB5)分析檢測多肽特異性的CTL反應。ELISPOT分析的具體步驟ELISPOT分析中，脾細胞的培養孔中加入YV-10使其終濃度為20ixM(或相同體積的無菌水)和終濃度為20u/ml的rmlL-2。ELISPOT分析的具體步驟如下用70%的乙醇潤溼96孔板底部的PVDF膜。然後用100u1/孔的去離子水洗滌2次，再加入50iU/孔用PBS稀釋好的anti-IFN-y包被抗體，4。C包被過夜。次日傾倒包被液，用無菌PBS洗滌3次。最後一次，在滅菌的吸水紙上扣幹。加入200ul/孔稀釋好的封閉液，37""C封閉lh。傾倒封閉液，加入2X10V孔的細胞和終濃度為20uM的YV-10(或相同體積的無菌水)，在37。C和5。/。C02的條件下培養24小時。傾倒孔內的細胞及培養基，加入200u1/孔冰冷的去離子水，4"C冰浴10min。每孔加入200u1PBST，浸泡3-5min後扣出洗滌液，重複5次。最後一次，在吸水紙上扣幹。每孔加入100uL稀釋好的生物素標記anti-IFN，檢測抗體，37。C孵育lh。每孔加入200u1PBST，浸泡3-5rains後扣出洗滌液，重複5次。最後一次，在吸水紙上扣幹。每孔加入100u1稀釋好的酶標親和素，37。C孵育1小時。每孔加入200u1PBST，浸泡3-5mins後扣出洗滌液，重複5次。最後一次，在吸水紙上扣幹。每孔加入100uL的顯色液，室溫靜置15-45min(在20-25"C)，避光。待斑點生長到適合的大小之後，以去離子水洗滌2遍，終止顯色過程。將ELISP0T板置於BiosysBioreader自動讀板儀內，調節好合適的參數，計數斑點。結果見圖3。結果表明用編碼H5HA的痘苗病毒載體免疫的轉基因小鼠的脾細胞產生了顯著的CTL反應，而用PBS免疫的轉基因小鼠的脾細胞未產生CTL反應。在YV-10的刺激下，CTL的數目與無多肽刺激時相比顯著增加，這表明YV-10有明顯的免疫原性，能誘導產生CTL反應。實施例4、用tetramer染色的方法檢測多肽免疫HLA-AW201/Kb轉基因小鼠後脾細胞中產生的CTL反應取雌性的HLA-AHO201/I(b轉基因小鼠，用50ugYV-10進行免疫，用小鼠gp96的N末端片段N333(22-355)(GENBANKACCESSIONNO.麗—011631是自氮末端第22-355位胺基酸)50ug作為佐劑，與氟式不完全佐劑(IFA)乳化後皮下多點注射。免疫分三次進行，兩次之間的時間間隔為2周。在最後一次免疫後的第10天，分離小鼠脾細胞，在體外培養2周，細胞密度為2X107ml，培養孔加入多肽YV-10使其終濃度10uM，和終濃度為20u/ml的重組小鼠白介素-2(rmIL-2)，然後用IFN-yELISP0T法和tetramer染色檢測多肽特異性CTLs反應。用流感病毒的優勢表位GL-9(序列為GILGFVFTL)代替YV-10，作為陽性對照，tetr咖er染色①tetramer的製備HLA-AHO201/Kb分子是HLA-A*0201分子和小鼠Kb分子的雜合分子，編碼DNA由HLA-A*0201分子的編碼DNA(GENBANKACCESSIONNO.AY365426中自5，端第73-615位核苷酸)和Kb分子的編碼DNA(GENBANKACCESSIONNo.J00400中自5，端第349-630位核苷酸)拼合。HLA-A句201/Kb分子的包涵體的製備方法與實施例1中所述的"HLA-A*0201重鏈胞外區包涵體的製備"方法相同。P2M分子的編碼DNA是GENBANKACCESSIONNO.NM_004048自5'末端第121-417位核苷酸。P2M分子的包涵體的製備方法與實施例1中所述"人P2微球蛋白輕鏈包涵體的製備"方法相同。將C-末端帶有生物素化位點標籤(GSGGGLNDIFEAQKIEWHE)的HLA-AHO201/I(b分子的包涵體、P2M分子的包涵體與RI-10與YV-IO按I:1:3的摩爾比復性，得到YV-10-HLA-A2-P2M複合體。YV-10-HLA-A2-P2M複合體經分子篩和離子交換柱純化，加入BirA酶(Avidity,Denver,Co)和生物素，在室溫反應過夜，進行生物素化。其後，再用分子篩純化，收集複合體蛋白並測定蛋白濃度。加入取適量複合物蛋白，按1:4的摩爾比在4。C分次加入PE標記的鏈黴親和素，製得YV-10-HLA-A2tetramer。濃縮後用PBS洗3次，再濃縮至適當的體積備用。用同樣的方法製備GL-9-HLA-A2tetramer。②tetramer染色脾細胞在體外培養，在培養體系中加入YV-10(10nM)和IL-2(20u/ml)。2周後收穫細胞用YV-10-HLA-A2tetramer和FITC標記的anti-小鼠CD8單克隆抗體(BD，Cat.No.560469)對細胞進行雙染色，或者用GL-9-HLA-A2tetramer或再用流式細胞儀檢測多肽特異性的CTL反應。結果見圖4。結果表明，YV-IO誘導了強大的CTL反應，其特異性的CTL佔脾細胞中CD8+細胞的2.7%，提示YV-10是具有強大免疫原性的CTLs表位多肽。序列表中國科學院微生物研究所〈120>—種禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽及其應用CGGNARY92293〈160〉21〈211〉10〈212〉PRT人工序列<220〉<223〉2〈211>30〈212〉DNA人工序列〈223〉2tatcaaaacccaaccacctatatttccgtt1權利要求1、一種禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽，為如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的多肽；(b)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與禽流感H5N1病毒的CTL表位相關的由序列1衍生的多肽。2、編碼權利要求1所述多肽的DNA分子。3、如權利要求2所述的DNA分子，其特徵在於所述DNA分子為如下1)或2)或3):1)其編碼序列是序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有9(m以上同源性，且編碼相同功能多肽的DNA分子。4、含有權利要求2或3所述DNA分子的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。5、如下物質中的至少一種在製備禽流感病毒疫苗中的應用權利要求l所述的多肽，權利要求2或3所述的DNA分子，權利要求4所述的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。6、一種禽流感病毒疫苗，它的活性成份為如下物質中的至少一種權利要求l所述的多肽，權利要求2或3所述的DNA分子，權利要求4所述的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。7、如下物質中的至少一種在製備禽流感病毒特異性T細胞檢測試劑盒中的應用權利要求l所述的多肽，權利要求2或3所述的DNA分子，權利要求4所述的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。8、一種禽流感病毒特異性T細胞檢測試劑盒，它含有如下物質中的至少一種權利要求l所述的多肽，權利要求2或3所述的DNA分子，權利要求4所述的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。全文摘要本發明公開了一種禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽及其應用。本發明提供的禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽，為如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的多肽；(b)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與禽流感H5N1病毒的CTL表位相關的由序列1衍生的多肽。本發明還保護編碼所述多肽的DNA。本發明所述的表位多肽可用於製備針對禽流感H5N1病毒的疫苗，也可用於製備檢測H5N1病毒特異性T細胞的試劑盒。本發明具有重大價值。文檔編號A61K48/00GK101560245SQ200910085530公開日2009年10月21日申請日期2009年5月25日優先權日2009年5月25日發明者孫業平,福高申請人:中國科學院微生物研究所