Prg4及其治療調製的應用和用途的製作方法

2023-05-31 01:30:31 4

專利名稱：Prg4及其治療調製的應用和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質PRG4(包括其蛋白多糖)和/或其治療調製的用途。特別是，本發明涉及組合物及其方法，包括手術潤滑、體育潤滑、治療口腔邊界潤滑缺陷伴隨的疾病，皮膚填充劑，藥物遞送方法，和用於授乳潤滑。背景蛋白多糖4(prg4)基因編碼稱為巨核細胞刺激因子(MSF)、Iubricin和淺表層蛋 白(SZP)的高度糖基化蛋白質。Lubricin首先是從滑膜液中分離，在軟骨-玻璃界面證明類似於滑膜液的體外潤滑能力。Lubricin後來被鑑定為滑膜成纖維細胞的產物。在大型粘液素內0-聯P (1-3)Gal-GalNAc低聚糖如940個胺基酸的區域，由外顯子6編碼，也已被描述。首先將SZP局限在淺表層外植軟骨的表面，從條件培養基分離。這些分子(及其0-聯蛋白多糖)在本文統稱為PRG4。已顯示PRG4存在於體內在滑膜、肌腱和半月板表面，但尚無用PRG4作為潤滑劑用於本文所述目的的說明。發明概述在各種實施方案中，本發明提供用於處理潤滑的組合物及其使用方法。在各種實施方案中，此類潤滑包括，非限制性實例是，用作手術潤滑劑，用於預防或減小術後粘連的治療，用於治療口腔潰瘍，用作體育潤滑貼劑，用作皮膚填充劑，用於治療口乾，用於藥物遞送方法或組合物，和用於授乳潤滑。本文還提供用於治療上述任何病症(或本文所述任何其它病症)的PRG4蛋白(如純化或分離的PRG4蛋白)。在一個實施方案中，提供此類組合物和方法用於治療性補充和強化口腔的邊界潤滑分子。在本發明某些實施方案中描述觀察到PRG4mRNA表達於小鼠下頜下組織，提示PRG4蛋白是分泌入口腔內。圖I說明在各種小鼠下頜下腺的PRG4mRNA表達。通過使用瓊脂糖凝膠電泳篩選擴增樣品中PRG4產物的存在。垂直泳道11-16含有來自6隻不同小鼠下頜下腺組織的擴增、確認的PRG4 mRNA。在本發明某些情況下描述觀察到PRG4蛋白保護口腔(包括咽喉)免受進食、談話、吞咽、講話和/或其它口部功能產生的顯著剪切力。在本發明某些情況下還描述觀察到見於軟骨的邊界潤滑的分子機制，包括分泌組分在動態負荷的存在下介導剪切應力的能力，當用於潤滑口腔時可能有用。在某些實施方案中，本發明提供適合局部應用於患者口腔的口部護理組合物，製劑含有治療量的治療有效濃度的PRG4蛋白(包括例如糖基化的PRG4蛋白，如0-聯蛋白多糖)。在一些實施方案中，口部護理藥用組合物包含PRG4蛋白，所述蛋白懸浮於水滲透平衡鹽溶液、多相乳液、凝膠、液體、霜劑、軟膏、噴霧劑、粘性溶液或包裹在緩釋裝置內，或在錠劑中。
在某些實施方案中，本發明的口部護理組合物還包含各種油提取物、甜味劑、唾液腺刺激劑、防腐劑和調味劑。在某些實施方案中，口部護理組合物還包含治療有效量的透明質酸鈉。在某些實施方案中，口部護理組合物將還包含局麻劑比如利多卡因、利諾卡因或丙胺卡因。本發明提供治療口腔乾燥症或其伴隨症狀(包括Sjdgren氏症候群、過敏、口面病症、慢性炎症、高摩爾滲透壓濃度、衰老、處方或OTC藥物、放療、化療、神經損傷或其任何組合伴隨的口腔乾燥症症狀)的方法，包含局部給予有需要的個體的口腔(或口腔內的潰瘍)，有效量的本文所述任何口部護理組合物。在又一個實施方案中，本發明提供治療口腔潰瘍的方法，包含局部給予有需要的個體的口腔潰瘍，有效量的本發明口部護理組合物。本發明某些實施方案提供適合在醫療和手術操作中使用的潤滑組合物，所述操作的非限制性實例包括插入導管、內鏡、手術器械、進入身體開口(orifice)的手套，作為手術輔件和/或臨時植入物，作為水合植入物，和用於白內障摘除術、雷射角膜切削術、人工晶狀體(IOL)插入和取出、角膜手術、青光眼手術、外傷手術、後段手術、眼整形手術和肌肉手術，所述組合物包含PRG4在手術可接受的鹽溶液中。 在某些實施方案中，本文所述任何潤滑組合物還包含透明質酸鈉。在某些實施方案中，本發明的潤滑組合物還包含附加賦形劑和緩和劑，包括但不限於羧甲基纖維素鈉、羥乙基纖維素、羥丙甲纖維素、甲基纖維素、右旋糖酐70、明膠、甘油、聚乙二醇300、聚乙二醇400、聚山梨醇酯80、丙二醇、聚乙烯醇和聚維酮。在某些實施方案中，本文所述任何潤滑組合物還包含一種或多種選自利多卡因、利諾卡因和丙胺卡因的局麻劑。在某些實施方案中，本文所述任何潤滑組合物還包含一種或多種選自葡糖酸氯己定、苯扎氯銨、溴化十六烷基三甲基銨、西吡氯銨、苄索氯銨、酒精、氯化鈉和碳酸氫鈉的消毒劑。本發明某些實施方案提供用於手術或醫療操作的提供潤滑的方法，包含將本文所述任何潤滑組合物局部應用於任何醫療器械或涉及操作的其它表面。在各種實施方案中，手術或醫療操作包括，非限制性實例是，插入導管、內鏡、手術器械、進入身體開口的手套、作為手術輔件和/或臨時植入物、作為水合植入物，和用於白內障摘除術、雷射角膜切削術、人工晶狀體(IOL)插入和取出、角膜手術、青光眼手術、外傷手術、後段手術、眼整形手術和肌肉手術。本發明一些實施方案提供預防或減小非臥床性運動過程中摩擦的方法，包含將本文所述任何合適的潤滑組合物(如含有PRG4的水凝膠、溶膠、溶液或膠粘貼劑)應用於感興趣的區域。在本發明某些實施方案中，組合物(如膠粘貼劑)還包含透明質酸。在本發明某些實施方案中，組合物(如膠粘貼劑)還包含停留時間增加聚合物、賦形劑或緩和劑。本發明某些實施方案提供適合用作可注射皮膚填充劑的皮膚病學組合物，包含與皮膚病學可接受的介質或溶媒(如粘性溶液)組合(如懸浮於其中)的皮膚病學有效濃度的PRG4。在某些實施方案中，本發明的皮膚病學組合物還包含皮膚病學有效量的透明質酸。在一個實施方案中，皮膚病學用途是減小疤痕組織的出現。在某些實施方案中，本發明的任何皮膚病學組合物還包含皮膚病學有效量的膠原、羧甲基纖維素、聚乙二醇和/或聚環氧乙烷。在某些實施方案中，本發明的任何皮膚病學組合物還包含選自抗凝血酶原藥、抗炎藥、激素、趨化因子、鎮痛藥、生長因子、細胞因子、骨原性因子和麻醉劑的藥物。在某些實施方案中，本發明的任何皮膚病學組合物還包含維甲酸和/或氘還原水。本發明一些實施方案提供恢復人的皮膚(如在臉或所選身體區域)組織體積、皮膚充盈、紋理和緊實的方法，包含將本發明的皮膚病學組合物注入真皮或真皮下的步驟。在各種實施方案中，治療和注射可發生在臉部一處或多處區域，或者人身體的所選區域，包括但不限於眶周區、嘴唇、顴骨區、鼻唇褶、唇-下頜骨褶、頸或手。本發明某些實施方案提供提供(如促進)藥物遞送的方法，所述方法包含將生物活性劑遞送至個體，將生物活性劑在組合物中遞送，所述組合物包含生物活性劑和包含PRG4的載體混合物。在本發明某些實施方案中，生物活性劑包含藥物、肽、蛋白質、抗體或其片段、核酸或顯像劑。在另一個實施方案中，遞送載體還包含透明質酸鈉。在本發明某些實施方案中，遞送載體還包含選自L-a-二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、磷酯醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺和鞘磷脂的表面活性磷脂。混合物的物理遞送可通過局部給藥、注射或口服，或者通過任何其它合適的給藥技術完成。 本發明一些實施方案提供預防或減小授乳(哺乳)過程中摩擦的方法，其包含將含有PRG4的本文所述任何潤滑組合物(如水凝膠、溶膠、溶液或膠粘貼劑)應用於有需要的表面(如乳頭、乳暈和/或乳房)。在本發明某些實施方案中，本文所述任何組合物(如膠粘貼劑)還包含透明質酸、羊毛脂、甘油等。在本發明某些實施方案中，任何組合物(如膠粘貼劑)還包含停留時間增加聚合物、賦形劑或緩和劑。通過參考結合在本說明書中提到的所有出版物和專利申請通過引用結合到本文中用於引證的目的。附圖
簡述在所附權利要求中特別列出本發明的新特徵。通過參考以下列出示例性實施方案的詳述將更好地理解本發明的特徵和優點，其中利用本發明的原理，和附圖圖I說明小鼠PRG4 mRNA表達，如通過瓊脂糖電泳然後在下頜下腺組織中擴增證明。mRNA是通過測序確認。圖2說明PRG4的胺基酸序列以及用於PRG4 mRNA的PCR擴增的核酸弓丨物序列。發明詳述雖然本文已顯示和描述本發明的優選實施方案，本領域技術人員將明白提供此類實施方案只是用於舉例。現在本領域技術人員在不脫離本發明的情況下將想到許多變更、改變和取代。應理解對本文所述本發明實施方案的各種替代都可用於實施本發明。下列權利要求打算限定本發明的範圍，從而覆蓋這些權利要求及其等同方案範圍內的方法和結構。通過突變引起人的屈曲指-關節病-髖內翻-心包炎(CACP)疾病症候群顯示PRG4的功能重要性。CACP表現為屈曲指、非炎症性關節病和肥厚性滑膜炎，具有髖內翻畸形、心包炎和胸腔積液。而且，在PRG4-無效小鼠中，觀察到軟骨退化和後來的關節障礙。因此，PRG4表達是健康滑膜關節的必需組分。PRG4是粘液素家族成員，一般在上皮層豐富，提供許多功能，包括潤滑和保護免受侵襲性微生物的傷害。粘液素的功能特性一般是通過專門的糖基化方式及其通過分子間二硫鍵形成多聚體的能力確定，在慢性疾病(如囊性纖維化、哮喘)中兩者都是變化的。從滑膜液中分離的PRG4的生物化學特徵顯示在O-糖基化的分子多相性，其似乎介導潤滑特性。來自牛滑膜液PRG4的前期數據已揭示二硫鍵二聚體的存在，除了單體形式以外，從N-和C-端都有保守的半胱氨酸富集區和在C-端有不成對半胱氨酸預測。潤滑的物理化學模式已被分為流體膜或邊界模式。起作用的潤滑模式取決於對關節組織的正常和切向力、這些表面之間切向運動的相對速率以及負荷和運動的時間歷史。摩擦係數U，提供定量測量，限定為切向摩擦力與法向力的比率。一種流體介導的潤滑模式類型是流體靜力的。在負荷開始和通常持續延長的時間，間質液變為受壓，因為組織的雙相性；還可將流體通過滲出機制壓入關節面之間的表面微凸體(asperities)內。受壓的間質液和截留的潤滑劑池因此可明顯促成支承正常負荷，對剪切力的抗性小，利於非常低的U。而且，在負荷開始和/或運動時，擠壓膜、流體動力和彈性流體動力類型的流體膜潤滑出現，加壓、運動和變形驅動粘性潤滑劑從和/或通過相對運動的兩個表面之間的縫隙。在一些情況下，流體壓力/膜與邊界潤滑相比發生的相對程度取決於許多因素。當潤滑膜可在貼合滑動的表面之間流動時，它可彈性變形，出現彈性流體動力潤滑。壓力、 表面糙度和相對滑動速度決定全面流體潤滑何時開始中止，潤滑進入新的方案。隨著速度進一步下降，粘附於關節面的潤滑膜開始起作用，出現混合潤滑方案。如果速度甚至進一步下降和只剩下一層由少數分子組成的超薄潤滑層，則出現邊界潤滑。在某些情況下，邊界潤滑模式因此由穩定滑動過程中的摩擦係數(在相對運動的兩個接觸面之間測量的摩擦力與所加法向力的比率)指示，不變因素是流體膜的影響形成，比如相對滑動速度和軸向負荷。對於身體某些組織，比如關節軟骨，已推斷出現邊界潤滑，由流體加壓及其它機制補充。但是，先前尚無將邊界潤滑劑用於本發明描述的目的和用途的研究，因為例如已將優勢潤滑模式假定為流體動力和彈性流體動力性。而且，製造用於本文治療提出的應用的產物傳統上聚焦於用長鏈聚合物比如聚卡波非、聚乙二醇和甘油進行粘性流體相潤滑或水合。流體膜法的實例包括，用於口腔乾燥症的Biotene、Orex> Salivart,用於口腔潰瘍的Blistex,用於手術應用的Surgilube和Healon,和用於皮膚填充劑的Restylane和JuveDerm。對於本文要求的發明，最佳潤滑可涵蓋增強邊界模式或涉及增強邊界模式和流體膜潤滑的組合。在邊界潤滑中，負荷是通過面與面接觸支持，伴隨的摩擦特性是由潤滑劑表面分子決定。在某些情況下，這種模式可能重要，因為相對的組織面接觸超過總面積的 10%，這可能是出現大部分摩擦的地方。而且，在一些情況下，隨著負荷時間的增加和流體靜力壓的消散，塗潤滑劑的表面支承與加壓流體相比越來越高比例的負荷，所以這種模式可變得越來越佔優勢。在某些情況下，邊界潤滑減輕粘滑，因此表現為對穩定運動和突然出現的運動的抗性下降。在一些情況下，後一種狀態與延長壓迫負荷(如活體坐或站)後支承負荷的表面有關。關節面比如在軟骨中的典型支承方式也說明在一些情況下，邊界潤滑對於組織結構的保護和維持是重要的。在一些情況下，口腔的負荷是經受剪切力(如以其佔優勢)，咀嚼對表面細胞和牙釉質都產生顯著應力。而且，在口腔內潤滑劑的產生下調或上皮細胞萎縮的疾病狀態下，常規剪切應力還可具有強烈的降解和炎症危險。嚴重萎縮或因癌症治療比如他莫昔芬、抗組胺劑、抗抑鬱劑或高血壓藥物醫源性引起的乾燥還可產生正常水平的剪切應力疼痛。
在一些情況下，PRG4在關節面之間的流體中蓄積，以及它與組織基質自髮結合的傾向，促成PRG4的邊界潤滑能力。在本文所述某些實施方案中，我們公開蛋白多糖4(PRG4)沿著口腔壁發揮邊界潤滑劑的作用。在一些實施方案中，這種糖蛋白(PRG4)保護口面免受摩擦力、細胞粘附和/或蛋白質沉積。在本文所述各種實施方案中，利用各種天然和重組Iubricin蛋白和亞型的任何一種或多種。例如，美國專利號5，326，558,6, 433，142,7, 030223和7，361，738公開人巨核細胞刺激因子家族(MSF)，其各自結合到本文中用於此類公開。美國專利號6，960，562和6，743，774還公開潤滑多肽、tribonectin，包含基本純的MSF片段，其各自結合到本文中用於此類公開。口部護理在本文某些實施方案中提供在有需要的個體處理口腔潤滑缺乏、口腔乾燥症或其伴隨症狀(包括Sjdgren氏症候群、過敏、口面病症、慢性炎症、高摩爾滲透壓濃度、衰老、處方或OTC藥物、放療、化療、神經損傷或其任何組合伴隨的口腔乾燥症症狀)的方法，包含給 予個體的口腔PRG4蛋白(如以有效量)。在一些實施方案中，將PRG4蛋白在口部護理組合物(如藥學上可接受的口部護理組合物)中給藥。在某些實施方案中，給予的PRG4蛋白是外源性PRG4蛋白(即不是接受給藥的個體天然的PRG4)。在一些實施方案中，口部可接受的製劑(如本文所述口部護理產物)包含緩和劑、收斂劑、軟化劑、增甜劑、刺激劑或其組合。在另一個實施方案中，本文所述任何組合物還包含治療有效量的透明質酸鈉。口腔乾燥症是其中唾液腺不產生足量唾液的狀態。在某些情況下，口腔乾燥症引起不適，這有時可能相當嚴重。沒有唾液，口可能有燒灼感，咽喉和舌可發生劇烈改變。牙齒可迅速腐爛，舌可變滑、開裂和容易感染。經常有味覺喪失，因為唾液含有重要的消化酶，經常有消化的問題。口是暴露於外部環境最多的身體區域之一。正常來講，粘液在鼻、口和咽喉形成連續的保護層。患口腔乾燥症的患者不僅口中流體減小，而且可能具有不足量的粘蛋白和粘多糖以保持流體與細胞接觸和產生對刺激和感染的屏障。本文某些實施方案提供治療口腔乾燥症或其伴隨任何症狀(具體包括上述症狀)的方法，該方法包含口部給予有需要的個體PRG4蛋白(如包含有效量和/或濃度PRG4蛋白的口部護理組合物)。估計全國有幾百萬人患有該病。但是，患口腔乾燥症個體的實際數不詳，因為直到最近對該問題的普遍性或嚴重性的認識很少。口腔乾燥症的情況可能從輕度(只有體驗輕微乾燥)至重度(患者咀嚼、吞咽、消化、演講等都有嚴重問題)不同。如在授予Balslevet al.的美國專利號4，438，100指出，有多種口腔乾燥症的原因，包括生理性(如年齡、絕經、術後狀態、脫水)以及心理性(神經過敏)。口乾的原因還可以是藥理學性(如作為許多藥物包括利尿劑、抗關節炎劑和抗抑鬱劑的常見副作用)或作為放療的結果。口腔乾燥症最嚴重的情況是由頭頸部手術後放療和自身免疫性疾病比如狼瘡、Sjogrens症候群和類風溼性關節炎引起。見例如 P.C.Fox et al. , J. Am. Dental Assoc. 110 :519-525 (1985)。目前對於口腔乾燥症的治療具有顯著缺點。例如，通過消耗流體、硬糖和潤喉片可稍微減輕輕度口腔乾燥症的症狀。但是，因為口腔乾燥症患者對牙齒腐蝕和牙齦疾病的易感性，所以真正擔心的是常規糖果和糖錠伴隨的糖攝入增加。此外，流體或糖果通常既對更嚴重的口腔乾燥症無效，對輕症病例也不提供長效緩解。在市場上也有很多含有酒精、礦物油、甘油和聚乙二醇組合的人工唾液。在市場上也有很多羧甲基纖維素_基製劑，包括銷售商標為Orex. RTM. (Young Dental)、Xero_Lube.RTM. (Scherer) > Moi-Stir. RTM. (Kingswood Laboratories)和 Salivart. RTM. (WestportPharmaceuticals)的那些製劑。但是，許多患者發現此類製劑有刺激性或味道差，且它們的潤滑作用持續相對短時間。口腔乾燥症及其伴隨症狀可用任何合適的方法確定。在一些情況下，定性(如感覺低潤滑、不適、口乾、口癢或燒灼感、疼痛感和講話困難)或定量(如通過機械、生物化學、電、光或其它定量測定方法測量)限定口部潤滑的缺乏及其伴隨症狀。在優選實施方案中，將組合物作為PRG4的水溶液(或混懸液)給藥。在某些實施方案中，所述組合物將還包含散塔草流浸膏、柑橘油、檸檬油、白檸檬油、橙花油、橙油、薄荷油、椒樣薄荷油、留蘭香薄荷油、茴香油、豆蘧油、肉桂油、丁香油、芫荽油、桉樹油、小茴香油、芸香草油、肉豆蘧油、聖草流浸膏或甘草浸膏，範圍是0. 25wt. % -IOwt. %，更優選0. 5wt. % -5. Owt. %，最優選約1.25wt. %。在某些實施方案中，所述組合物將還包含一種或多種增甜劑，總計包含約I. Owt. % -30wt. %，更優選10wt. % -20wt. %,最優選約15wt. %增甜劑。 合適的增甜劑可以很容易選擇，加入本發明組合物內的增甜劑量將通過味道決定。一般來講，增甜劑可以是引起甜味或加強甜味的任何一種或多種化合物。增甜劑可以為自然存在或合成來源，可具有營養或非營養價值。用於本文的合適增甜劑實例包括糖，如果糖、葡萄糖、甘油糖、蘇糖、赤鮮糖、甲基戊糖、半乳糖、木糖、核糖、右旋糖、麥芽糖和d-甘露糖；糖醇比如山梨醇、木糖醇和甘露醇；水溶性人工增甜劑比如可溶性糖精鹽，如糖精鈉或糖精鈣、環己烷氨基磺酸鹽、乙醯舒泛-K等；和二肽基增甜劑比如L-天冬氨醯基-L-苯丙氨酸甲酯。合適增甜劑的其它實例列出於Encyclopedia of ChemicalTechnology,vol. 19, 2d Ed. , New York John Wiley & Sons，1969，在 593-607 頁。優選增甜劑不致齲，特別優選用於本文的增甜劑是木糖醇、山梨醇、甘露醇、糖精鈉及其組合。任選所述組合物還含有將刺激唾液腺分泌的「刺激劑」化合物。特別優選用於該目的的化合物是檸檬酸，含量為約0. 25wt. % -約5. Owt. %，優選約0. 5wt. %。將檸檬酸加入本發明組合物內還提供令人愉快的柑橘味。任選所述組合物含有一種或多種防腐劑，通常是有效阻止流浸膏氧化和/或鈍化的量的抗氧化劑。與增甜劑相同，本領域技術人員將很容易選擇一種或多種防腐劑。合適防腐劑的實例包括抗壞血酸棕櫚酸酯、丁羥茴醚、丁羥甲苯、山梨酸鉀或山梨酸鈉、亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、山梨酸、二氧化硫和苯甲酸鈉或苯甲酸鉀。特別優選用於本文的防腐劑是苯甲酸鈉。如果需要，可加入本發明組合物內的其它組分包括著色劑(可以是自然或合成的)、調味劑、香味保存劑、稀釋劑、乳化劑、賦形劑、PH緩衝劑等。合適的著色劑包括一般適合食品、藥物和化妝品應用的染料，即稱為F.D.&C.染料的那些著色劑。可接受的染料應當為水溶性。示例性實例包括5，5-靛藍二磺酸的二鈉鹽("F.D.& C. Blue No. 2.")和4-[4_N_乙基-對磺基-苄基氨基)二苯基亞甲基]_[1-(N-乙基-N-對鋶-苄基)-2，5_環己二烯亞胺的單鈉鹽("F.D.& C. GreenNo. I")。關於其它F. D. &C.著色劑和對應的化學結構，可參考Kirk-Othmer Encyclopediaof Chemical Technology, 3rd Ed.,在第 6 卷。
調味劑是任選的，當在不存在任何附加調味劑的情況下將檸檬酸和/或抗壞血酸加入組合物內將提供令人愉快的柑橘味。附加調味劑可包括其它自然或人工調味劑，如薄荷油比如椒樣薄荷、冬青(水楊酸甲酯)、留蘭香薄荷、桉樹等，柑橘油比如檸檬油、橙油、白檸檬油、葡萄柚油，果香精比如蘋果香精、桃香精、紅莓香精等。當選擇油基調味劑時，將一種或多種防腐劑包括在如上所述組合物中。還可將各種合成調味劑加入組合物內。調味劑的含量將取決於選擇的個別調味劑，但如果存在的話，將通常佔組合物約0. 5wt. % -約5. Owt. % o在某些實施方案中，所述口部護理組合物還包含見於唾液中的酶包括乳過氧化物酶、硫氰酸酯和葡萄糖氧化酶。剛才描述的組合物優選作為水溶液、凝膠或糊劑給藥和經過口腔噴霧劑、漱口劑、牙膏、衝洗劑或凝膠給藥。還可將所述組合物製備為樹膠或糖錠，具有與上述水溶液相同的優選組分和優選 相對重量組成。在各種實施方案中，用任何合適的常規方法製備樹膠組合物。例如，在一些實施方案中，將PRG4與可咀嚼膠基、一種或多種增甜劑和如上所述任選附加組分混合，以上述比例存在。在各種實施方案中，本文所述樹膠組合物包含如本文所述的調味添加劑、乳化劑和著色劑。「膠基」可以是多種組合物類型其中一種，典型地通過將各種成分如自然膠、合成樹脂、蠟、增塑劑等加熱和共混製備。見於口香糖膠基的成分的非限制性實例包括植物來源的咀嚼物比如糖膠樹膠、冠膠(crown gum)、nispero、山欖膠、節路頓膠、pendare、perillo、尼日杜仲膠、tunu等，合成來源的咀嚼物比如丁二烯-苯乙烯聚合物、異丁烯異戊二烯共聚物、石蠟、石油蠟、聚乙烯、聚異丁烯、聚乙酸乙烯酯等，增塑劑或柔軟劑比如羊毛脂、硬脂酸、硬脂酸鈉、硬脂酸鉀、三乙酸甘油酯、甘油等。還可將蠟，包括自然和合成蠟、石油蠟、石蠟和微晶蠟加入膠基中以獲得理想的質地和粘度。本文所述糖錠任選成形為含有PRG4在糖果或甘油膠基中的固體。在一些實施方案中，例如,用描述於Remington' s Pharmaceutical Sciences的合適方法製備糖錠形式。在某些情況下，將PRG4與增甜劑及其它如上所述任選化合物混合，濃縮所得糖漿劑，在加熱的同時將混合物成形和/或壓縮為理想的形式。給予的PRG4量可變化，取決於受治療的受試者、口腔乾燥症嚴重度和開處方的衛生保健專家的判斷。但是，有效的劑量方案將典型地是1-2茶匙(或l-20mL、2-15mL、3-10mL等)水性組合物(或採用膠或糖錠形式的等同物)，每天I次或2-6次口部給藥。關於水性組合物，優選組合物保持與口黏膜接觸足夠時間以允許口的內部塗上PRG4。優選組合物保持在口中1-30、2-20、5-15或8-10秒。而且，組合物可以是，和可作為漱口劑給藥，其中只是用水溶液清洗口，或者如果希望的話，可吞下組合物。在各種實施方案中，本文所述任何口部護理組合物都適合利於或可用於治療患口內潰瘍的患者，無論是普通「 口瘡」或更嚴重的經常作為癌症療法副作用看到描述為口黏膜炎的潰瘍。所述方法和組合物涉及局部給予病損的藥物。在優選實施方案中，本發明的組合物提供口瘡伴隨的疼痛和不適的延長緩解。
在一個實施方案中，用於治療口腔潰瘍的組合物包含將在口部可接受的溶液中的PRG4局部給予有需要的口腔潰瘍。在另一個實施方案中，PRG4組合物還包含透明質酸鈉。在又一個實施方案中，PRG4組合物還包含一種或多種選自利多卡因、利諾卡因和丙胺卡因的局麻劑。本發明進一步提供用於治療口腔潰瘍的方法，包含局部給予有需要的口腔潰瘍有效量的在口部可接受的溶液(或在本文設想的任何其它組合物)中的PRG4，其中所述組合物採用凝膠、液體、霜劑、軟膏、噴霧劑或粘性溶液的形式。手術本發明某些實施方案提供適合潤滑器械和/或其它涉及手術或醫療操作的表面的組合物。在具體實施方案中，本文提供粘彈性溶液(或混懸液)，包含PRG4和/或透明質酸鈉和任選附加賦形劑和緩和劑。在一些實施方案中，此類組合物是非常特別適合作為手術輔件和/或臨時植入物的生物相容性水溶液(或混懸液)。本發明某些實施方案進一步涉及所述組合物(如溶液)作為手術/醫療潤滑劑的用途，用於插入導管、內鏡、手術器械、 進入身體開口的手套，作為手術輔件和/或臨時植入物，作為水合植入物，和用於白內障摘除術、雷射角膜切削術、人工晶狀體(IOL)插入和取出、角膜手術、青光眼手術、外傷手術、後段手術、眼整形手術和肌肉手術。一般來講，每種手術創傷都引起組織損傷。為了減輕或預防涉及的損傷或將其降至最小，尤其是在組織特別脆弱和/或不可代替的區域，可用粘彈性溶液作為手術輔件。此類溶液保護組織免受手術器械的損傷和幫助所述組織的操作。它們還用於維持距離或體積以預防組織融合和破壞這樣的距離或體積。這種類型的溶液非常特別用於眼部手術。參考白內障手術，至今已提出下列商品Viscoat. RTM.,來自Alcon Surgical,Inc.，它含有透明質酸鈉和硫酸軟骨素，這種產品目前在市場上是主導；Healon.RTM.和Healon GV. RTM.，目前由 A. M. 0.銷售，Amvisc. RTM.和 Amvisc Plus. RTM.，目前由 Bausch& Lomb 銷售，Vitrax. RTM.，目前由 A. M. 0.銷售，和 Viscorneal. RTM.和 Biocorneal. RTM.，由 Applicant 銷售，它含有透明質酸鈉(NaHA) ; Orco I on. RTM.,來自 Optical RadiationCorporation,它含有聚丙烯醯胺,現在已購買不到；和Occucoat. RTM.,來自Storz,它含有羥丙基甲基纖維素(HPMC)。在一個優選實施方案中，手術潤滑劑/粘彈性流體包含PRG4在手術可接受的鹽溶液中。在另一個實施方案中，手術潤滑劑/粘彈性流體還包含透明質酸鈉。在又一個實施方案中，手術潤滑劑/粘彈性流體還包含附加賦形劑和緩和劑，包括但不限於羧甲基纖維素鈉、羥乙基纖維素、羥丙甲纖維素、甲基纖維素、右旋糖酐70、明膠、甘油、聚乙二醇300、聚乙二醇400、聚山梨醇酯80、丙二醇、聚乙烯醇和聚維酮。在又一個實施方案中，手術潤滑劑/粘彈性流體還包含一種或多種選自利諾卡因和丙胺卡因的局麻劑。在又一個實施方案中，手術潤滑劑/粘彈性流體還包含一種或多種選自葡萄糖酸氯己定、苯扎氯銨、溴化十六烷基三甲基銨、西吡氯銨、苄索氯銨、酒精、氯化鈉和碳酸氫鈉的消毒劑。本發明進一步提供用於在手術或醫療操作中提供潤滑的方法，包含將有效量PRG4(如在手術可接受的溶液或在任何其它本文設想的組合物中)應用於有需要的組織或醫療裝置。在具體實施方案中，此類方法是減小或預防手術或醫療操作伴隨的組織損傷的方法。此類手術或醫療操作包括插入導管、內鏡、手術器械、進入身體開口的手套、作為手術輔件和/或臨時植入物、作為水合植入物、白內障摘除術、雷射角膜切削術、人工晶狀體(IOL)插入和取出、角膜手術、青光眼手術、外傷手術、後段手術、眼整形手術和肌肉手術。體育潤滑本發明還提供，在某些實施方案中，減小非臥床性運動過程中摩擦的新組合物和方法，此類方法包含將任何組合物(如包含PRG4蛋白的任何組合物)給予有需要的表面(比如磨損面或對摩擦和/或磨損敏感的表面)。體育努力經常包括皮膚與衣服、皮膚與皮膚和毛髮與皮膚之間的顯著剪切應力和摩擦。這經常導致磨損、「古巴人擦(chub rub)」、皮膚撕裂、乳頭流血等。這種剪切誘發損傷類型在長距離競賽比如馬拉松或鐵人賽跑過程中常見。目前方法包括應用聚合物和皮膚溼潤劑比如B0DYGLIDE。但是目前方法不能提供長效緩解，不提供減小邊界潤滑的任何機制。在本發明某些實施方案中，提供用於減小由非臥床性運動所致摩擦的包含PRG4的體育組合物。在具體實施方案中，將PRG4與或在緩釋聚合物中配製。在某些實施方案 中，緩釋聚合物包含下列羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚丙烯或其它常用賦形劑或緩和劑其中一種或多種。在某些實施方案中，體育組合物還包含透明質酸鈉。在某些實施方案中，體育組合物還包含尿囊素(0.5%)。在某些實施方案中，體育組合物還包含蘆薈(巴貝多蘆薈)葉提取物、C18 36酸甘油三酯、羊蠟酸/羊脂酸硬脂酸甘油三酯、Tribehenin和或乙酸維生素E。在一個任選實施方案中，將膠粘貼劑塗上PRG4，置於摩擦區與摩擦起因之間。合適的膠粘貼劑實例包括創可貼或體育膠帶。在另一個實施方案中，將透明質酸和PRG4含在膠粘貼劑內。本發明進一步提供減小運動過程中摩擦的方法，包含將有效量PRG4在溶液、凝膠、溶膠(或在本文設想的任何其它組合物或裝置)中應用於有需要的區域。皮膚填充劑一方面，本發明提供可注射的組合物，用於注入真皮或皮下組織(皮下組織)以恢復臉和所選身體區域比如頸和手的年齡相關性組織丟失。在一些情況下，將PRG4用於皮膚填充劑製劑中增加皮膚填充劑在吸收之前保持的時間量。臉部老化是幾種因素的結果，如皮膚內固有改變、重力的作用、臉部肌肉作用於皮膚(動態性皺紋(dynamic lines))、軟組織丟失或移位和骨骼丟失和組織彈性喪失。當真皮開始變薄時皮膚老化，與真皮的結合變平。當人老化時膠原減少，使皮膚有充盈感的膠原束變得更鬆弛和強度喪失。當皮膚喪失彈性時，較不能夠耐受拉伸。與重力、肌肉牽拉和組織改變匹配，皮膚開始起皺紋。水分丟失和細胞間結合的斷裂還減小皮膚的屏障功能，可引起皮膚孔徑增大。隨著人老化，臉部失去體積、軟組織和脂肪。下頜垂肉和皺褶的出現通常是由臉部組織下垂和下方肌肉附著於皮膚的區域皺褶引起。作為軟組織減小的一部分，臉部變得更凹陷。更具體來講，在各種臉部區域，比如前額、眼、鼻、臉中部和臉下部，與老化有關的改變已得到很好證明。在前額區，前額和眉毛隨時間推移下垂，眉毛降低，引起上眼瞼皮膚聚在一起。當人試圖保持眉毛和眼瞼向上以抵消這些改變時出現前額紋。眾所周知眼睛經常是顯示老化徵象的第一種臉部特徵。眼周皮膚改變出現早於臉部其餘部位，因為眼周皮膚更薄。這裡的皮膚含有較少腺體，經受不斷地眨眼、斜視、摩擦和牽拉。當臉頰開始下垂時臉中部老化，引起鼻唇褶。鼻唇褶是從鼻兩側至口角的細紋。這些皺褶已用臉部填充劑治療。在鼻區，隨著人老化，鼻伸長。伸長的常見原因是軟組織變薄和彈性丟失，引起「鼻尖下垂」和骨骼的暴露，產生新的隆起。在臉下部區域，隨著臉老化，臉部組織下降。這導致所謂「笑紋」。在該區域的皺褶和細紋已用臉部填充劑治療。在臉部進一步向下，口角可下垂，下頜垂肉下降可產生經常稱為「木偶(marionette)」紋的皺褶。而且，當臉頰在臉部肌肉連接下頜骨的下頜固定點周圍下陷時形成下頜垂肉。臉部肌肉繼續向下進入頸部成為所謂頸闊肌。該肌肉經常在頸部中央豁成兩條帶。各種注射劑已被用於恢復臉部組織丟失。自從1980年代以來，可注射的膠原已被作為軟組織填充劑用於填充臉上的皺紋、細紋和疤痕。膠原是支持包括皮膚、肌腱和韌帶在內的各種身體部分的自然存在的蛋白質。多年來脂肪注射已被用於增加體積、填充皺紋、細紋和提升嘴唇。脂肪注射涉及將脂肪從患者身體的一部分(腹部、大腿或臀部)取出並將其再注入臉部皮膚下方。肉毒桿菌毒素已被用於頸痙攣、顱神經病症和眼痙攣。隨著最近FDA批准Botox在美容方面用於眉間區域，該藥被用於使皺紋變光滑。當注入臉部肌肉時，
透明質酸是一種最常用的美容皮膚填充劑，其增加體積以使皺紋和細紋最小化。透明質酸是自然存在於所有活的生物體中的線性多糖，是身體組織細胞外間隙的通用組分。透明質酸在所有物種和組織中的相同結構使這種多糖成為用作保健和藥品的生物材料的理想物質。透明質酸存在於人體的許多位置。它賦予皮膚體積、眼睛形狀和關節彈性。最高濃度見於結締組織，大多數透明質酸(約56% )見於皮膚。在市場上由許多製造商提供各種形式的透明質酸。最常用的透明質酸是透明凝膠形式的非動物穩定化透明質酸(NASHA)，用鏈球菌通過細菌發酵生產。與動物衍生的透明質酸不同，非動物衍生的透明質酸不含動物蛋白。這限制動物基疾病傳播或發生對動物蛋白過敏反應的危險。最有名的非動物穩定化透明質酸由Qued, Seminariegatan, Uppsala製造，以商品名Restylane. RTM.市售獲得。自從它在1996年市售以來，估計在全世界已治療超過2，500, 000次。其它非動物穩定化透明質酸產品包括來自Q-med的Perlane. RTM.，它具有大於 Restylane. RTM.的顆粒，和來自 Genzyme Corporation 的 Captique. TM.。另一種常用填充劑是由Genzyme Corporation製造的透明質燒，以商品名Hylaform Plus市售獲得。Hylaform Plus是無菌、無熱原、粘彈性、澄清、無色、透明的凝膠植入物，由透明質烷的交聯分子組成。雖然透明質酸和衍生物是最常用的皮膚填充劑，但它們具有有限的活力。每4-12個月或甚至更短時間就需要再注射。這是HA皮膚填充劑的主要缺點。在一個實施方案中，可注射的組合物包含PRG4在粘性溶液中。在又一個實施方案中，可注射的組合物包含與皮膚病學有效量的透明質酸組合的PRG4。在又一個實施方案中，可注射的組合物包含與皮膚病學有效量的膠原、羧甲基纖維素、聚乙二醇和/或聚環氧乙烷組合的PRG4。在又一個實施方案中，可注射的組合物包含與選自抗凝血酶原藥、抗炎藥、激素、趨化因子、鎮痛藥、生長因子、細胞因子、骨原性因子和麻醉劑的藥物組合的PRG4。在又一個實施方案中，可注射的組合物包含與維甲酸和/或氘還原水組合的PRG4。
恢復臉部或所選人體區域的組織體積、皮膚充盈、紋理和緊實的治療方法包含以下的步驟將PRG4組合物(或本文設想的其它皮膚組合物)注入臉部或者所選人體區域一處或多處的真皮或真皮下。在另一個實施方案中，治療區域包括眶周區、嘴唇、顴骨區、鼻唇褶、唇-下頜骨褶、頸或手。藥物遞送在某些實施方案中，本發明提供藥物遞送的方法，該方法包含與PRG4蛋白組合(如混合)的生物活性劑。在一些實施方案中，將生物活性劑遞送至受試者，在組合物中遞送，所述組合物包含與包含PRG4的載體混合的生物活性劑。用於藥物釋藥的載體材料是基於多種材料，比如有機或無機聚合物、金屬和陶瓷。儘管不受任何理論的約束，但據信用PRG4作為釋藥方法將導致靶化合物的停留時間增加和優秀的定位。在一個實施方案中，生物活性劑包含藥物、肽、蛋白質、抗體或其片段、核酸或顯像 齊U。在另一個實施方案中，遞送載體還包含透明質酸鈉。在又一個實施方案中，遞送載體還包含選自L- a - 二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺和鞘磷脂的表面活性磷脂。混合物的物理遞送可通過局部給藥、注射或口服完成。哺乳潤滑在一些實施方案中，本發明為授乳母親提供潤滑的方法，所述方法包含將PRG4蛋白給予有需要的表面。在授乳過程中，不完全的銜乳可引起嬰兒口的選用區(palette)與母親乳頭之間明顯的剪切應力。隨著時間推移，乳頭變得發炎和疼痛。現有方法，比如羊毛脂軟膏或凝膠貼劑，只可以使用有限的時間，對某些人而言可能弄髒或刺激乳頭，因為機制是流體膜潤滑。PRG4邊界潤滑，在單個單層中發揮作用，提供優越的停留時間且沒有其它霜劑產生的殘留物。在某些實施方案中，流體膜和邊界潤滑的組合可能有用。在一個優選實施方案中，授乳潤滑劑由PRG4在水溶液、凝膠、溶膠或膠粘貼劑中組成。在另一個實施方案中，潤滑劑還包含透明質酸鈉。在又一個實施方案中，潤滑劑包含附加賦形劑和緩和劑。在本申請自始至終，參考各種出版物。所有這些出版物和在那些出版物中全部引用的那些參考文獻的公開內容從而通過引用結合到本申請中，以便更全面地描述本發明所屬領域的狀態。還應理解上文涉及本發明的優選實施方案，可在不脫離本發明範圍的情況下對其進行多種改變。通過下列實施例進一步說明本發明，無論如何不應將其視為限制本發明的範圍。相反，應清楚地理解在閱讀本文描述後，本領域技術人員在不脫離本發明的主題和/或附屬權利要求範圍的情況下，可將其訴諸各種其它實施方案、修飾及其等同物。如用於本文，術語「PRG4 」、「PRG4蛋白」或「蛋白多糖4 」蛋白，與術語「 Iubricin 」蛋白可互換使用。PRG4用於本文還包括術語巨核細胞刺激因子(MSF)，其已被UCL/HGNC/HUGO Human Gene Nomenclature 資料庫接受,和淺表層蛋白(SZP)。PRG4 或 Iubricin 蛋白(在本文與Iubricin蛋白多糖可互換使用)用於本文指任何分離或純化的天然或重組Iubricin蛋白、同系物、功能片段或基序、亞型和/或其突變體。在某些實施方案中，分離或純化的PRG4蛋白包含人天然或重組Iubricin蛋白的胺基酸序列。在其它實施方案中，分離或純化的PRG4蛋白包含由prg4基因外顯子編碼的胺基酸序列，該基因外顯子編碼全長PRG4蛋白或亞型的一級結構。蛋白多糖4(prg4)基因含有12個外顯子。本文所用PRG4蛋白包含由prg4基因外顯子1-12、更優選外顯子6-12、最優選外顯子9-12編碼的胺基酸序列。如用於本文，PRG4蛋白包括現在已知或後來描述的任何PRG4蛋白。在某些實施方案中，優選的PRG4蛋白胺基酸序列提供於SEQ ID N0:1。PRG4蛋白以至少60 %同源性、優選75%同源性、更優選85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大同源性共享任何已知PRG4蛋白或亞型的一級胺基酸結構。在某些實施方案中，優選的PRG4蛋白具有50kDa-400kDa的平均摩爾質量，包含PRG4蛋白的一種或多種生物活性部分，或功能片段，比如潤滑片段，或其同系物。如用於本文，PRG4蛋白包含蛋白質的生物活性部分。如用於本文，PRG4蛋白的「生物活性部分」包括包含與蛋白質的胺基酸序列十分類似或由其衍生的胺基酸序列的蛋白質的功能片段，所述蛋白質包括少於全長蛋白質的胺基酸，表現全長蛋白質的至少一種活性。通常生物活性部分包含具有蛋白質至少一種活性的功能域或基序。蛋白質的生物活性部分 可以是長度為例如10、25、50、100、200或更多胺基酸的多肽。在一個實施方案中，PRG4蛋白的生物活性部分可以單獨作為治療劑或與其它治療劑組合用於治療不理想或下降的陰道邊界潤滑。在又一個實施方案中，將PRG4的功能片段、多聚體(如二聚體、三聚體、四聚體等)、同系物或直系同源物用於口部護理組合物中。PRG4的功能片段和同系物包括在中央粘液素樣KEPAPTT-重複域內較少重複、蛋白質的糖基化和非糖基化形式、剪接變體、重組形式等的那些功能片段和同系物。PRG4的潤滑片段表現人PRG4的至少20%、30%、40%、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或95 %潤滑作用，如定性、機械、光、電或通過生物化學測定測量。幾種天然和重組PRG4或Iubricin蛋白的核酸和胺基酸序列，和PRG4蛋白和各種亞型的表徵公開於，例如授予Turner et al.的美國專利號5，326，558、6，433，142、7，030，223、7，361，738，和授予 Jay et al.的美國專利號 6，743，774 和 6，960，562。授予Flannery et al.的美國公開號20070191268還公開可用於本發明的重組PRG4或Iubricin分子。PRG4蛋白的分離、純化和重組表達方法在本領域眾所周知。在某些實施方案中，所述方法開始是用標準分子生物學技術比如PCR或RT-PCR克隆和分離編碼PRG4蛋白或亞型的mRNA和cDNA。然後將編碼PRG4蛋白或亞型的分離cDNA克隆入表達載體內，進一步轉化和表達於宿主細胞中用於製備重組PRG4蛋白。如用於本文，「重組」指體外合成或另外處理的多核苷酸(如「重組多核苷酸」)，指用重組多核苷酸在細胞或其它生物系統中製備基因產物的方法，或指由重組多核苷酸編碼的多肽(「重組蛋白」)。「重組」還包括將具有各種編碼區或域或啟動子序列的核酸從不同來源接合入表達盒或載體內用於表達，例如融合蛋白的可誘導或組成型表達，包含PRG4基因的活性域和用本發明弓I物擴增的核酸序列。在某些實施方案中，編碼PRG4蛋白的核酸可含有一種或多種突變、缺失或插入。在此類實施方案中，編碼PRG4蛋白的核酸與野生型編碼PRG4蛋白的核酸為至少60%同源性，優選75%同源性，更優選85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%，或更大同源性。如用於本文，術語「cDNA」包括與存在於細胞或生物體mRNA中的mRNA分子互補的DNA，所述mRNA可用酶比如逆轉錄酶轉化為cDNA。在某些實施方案中，將編碼PRG4蛋白的cDNA用本領域熟知的RT-PCR法從表達於人角膜或結膜上皮細胞的PRG4 mRNA分離。如用於本文，術語「多核苷酸」、「核酸/核苷酸」和「寡核苷酸」可互換使用，包括任何長度核苷酸的聚合物形式，無論是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其類似物。多核苷酸可具有任何三維結構，可發揮任何功能，已知或未知的。下列是多核苷酸的非限制性實例基因或基因片段、外顯子、內含子、信使RNA (mRNA)、轉移RNA、核糖體RNA、核酶、DNA、cDNA、基因組DNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質粒、載體、任何序列的分離DNA、任何序列的分離RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可以是自然存在、合成、重組或其任何組合。多核苷酸可包含修飾核苷酸，比如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。如果存在，可在聚合物組裝之前或之後修飾核苷酸結構。核苷酸序列可被非核苷酸組分間斷。可將多核苷酸在聚合後進一步修飾，比如通過與標記組分綴合。該術語還包括雙鏈和單鏈分子。除非 另外指定或要求，本發明多核苷酸的任何實施方案包括雙鏈形式和已知或預測組成雙鏈形式的兩種互補單鏈形式中的每一種。如用於本文，術語「多核苷酸序列」是多核苷酸分子的字母順序表示。多核苷酸由4種核苷酸鹼基的具體序列組成腺嘌呤(A);胞嘧啶(C);鳥嘌呤(G);胸腺嘧啶(T);當多核苷酸是RNA而不是DNA時尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶。可將這種字母順序表示輸入計算機資料庫內，用於生物學信息應用比如功能基因組學和同源性搜索。如用於本文，術語「分離的多核苷酸/cDNA」包括從存在於多核苷酸自然來源的其它多核苷酸分子分離的多核苷酸分子。例如，關於基因組DNA，術語「分離的」包括從其中基因組DNA自然關聯的染色體分離的多核苷酸分子。優選「分離的」多核苷酸不含有在衍生多核苷酸的生物體基因組DNA中自然位於多核苷酸側面的序列(即位於感興趣的多核苷酸5』和3』端的序列)。例如，在各種實施方案中，編碼用於本發明的PRG4蛋白的分離多核苷酸分子可含有小於約5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb或0. Ikb核苷酸序列，其在衍生多核苷酸的細胞基因組DNA中自然位於多核苷酸分子的側面。而且，「分離的」多核苷酸分子，比如cDNA分子，當通過重組技術製備時可基本不含其它細胞物質或培養基，或者當化學合成時可基本不含化學前體或其它化學劑。如用於本文，「基因」包括含有至少一個在轉錄和翻譯後能夠編碼特定多肽或蛋白質的開放讀碼框的多核苷酸。本文所述任何多核苷酸序列還可用於鑑定與其關聯的基因的更大片段或全長編碼序列。本領域技術人員已知分離更大片段序列的方法。如用於本文，「天然或自然存在的」多核苷酸分子包括，例如，具有自然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(如編碼自然蛋白質)。如用於本文，術語「多肽」或「蛋白質」可互換使用，包括兩種或多種亞單位胺基酸、胺基酸類似物或擬肽的化合物。亞單位可通過肽鍵連接。在另一個實施方案中，亞單位可通過其它鍵如酯、醚等連接。如用於本文，術語「胺基酸」包括天然和/或非天然或合成的胺基酸，包括甘氨酸，D或L旋光異構體，和胺基酸類似物和擬肽。三種或多種胺基酸的肽常稱為寡肽。大於三種或多種胺基酸的肽鏈稱為多肽或蛋白質。在某些實施方案中，本文所用PRG4蛋白稱為PRG4蛋白或其各種同系物或亞型，自然或重組表達於人或其它宿主細胞中。如用於本文，「表達(express)」或「表達(expression) 」包括將多核苷酸轉錄為RNA和/或翻譯為多肽的過程。如果多核苷酸是用基因組DNA衍生，則表達可包括剪接RNA，如果選擇適當的真核細胞宿主。表達需要的調控元件包括啟動子序列以結合RNA聚合酶和轉錄起始序列用於核糖體結合。例如，細菌表達載體包括啟動子比如Iac啟動子和用於轉錄起始Shine-Dalgarno序列和起始密碼子AUG。類似地，真核細胞表達載體包括RNA聚合酶II的異源性或同源性啟動子、下遊多聚腺苷酸信號、起始密碼子AUG和用於核糖體脫離的終止密碼子。此類載體可市售獲得或者通過描述於本領域熟知方法的序列組裝，例如下文描述用於構建通用載體的方法。如用於本文，術語「載體」包括將插入的多核苷酸轉移至宿主細胞和/或在宿主細胞之間轉移的自複製核酸分子。該術語打算包括主要功能是將核酸分子插入細胞內的載體、主要功能是複製核酸的複製載體和功能是轉錄和/或翻譯DNA或RNA的表達載體。還打算包括提供不止一種上述功能的載體。如用於本文，「宿主細胞」打算包括任何個體細胞或細胞培養基，它們可以是，或已經是，載體或摻入外源性多核苷酸和/或多肽的受體。還打算包括單細胞的子代。由於自然、偶然或故意的突變，所以子代可以不必與原始母細胞完全相同(在形態學或在基因組 或總DNA互補方面)。細胞可以是原核細胞或真核細胞的，包括但不限於細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、動物細胞和哺乳動物細胞，包括但不限於小鼠、大鼠、猴或人細胞。如用於本文，「宿主細胞」還包括遺傳上修飾的細胞。術語「遺傳上修飾的細胞」包括細胞，其含有和/或表達外來或外源性基因或多核苷酸序列，其轉而修飾細胞或其子代的基因型或表型。「遺傳上修飾的」還包括含有或表達已被引入細胞內的基因或多核苷酸序列的細胞。例如，在該實施方案中，遺傳上修飾的細胞已具有引入基因，該基因對細胞也是內源性的。術語「遺傳上修飾的」還包括對細胞內源性核苷酸的任何添加、缺失或破壞。如用於本文，「宿主細胞」可以是表達人PRG4蛋白的任何細胞。如用於本文，「同系物」在本文被限定為分別具有類似、或基本一致的核酸或胺基酸序列的兩種核酸或肽。術語「同系物」還包括由於遺傳密碼簡併所以編碼相同胺基酸序列、區別在於一種核苷酸序列的核酸分子。在一個優選實施方案中，同系物包括編碼PRG4蛋白(如SEQ ID NO :1，見如圖2)的核酸的等位變體、直系同源物、旁系同源物、激動劑和拮抗劑。如用於本文，術語「直系同源物」指來自不同物種、但從共同的祖先基因通過物種形成進化而來的兩種核酸。正常來講，直系同源物編碼具有相同或類似功能的肽。特別是，本發明的直系同源物將一般表現至少80-85 %，更優選85-90 %或90-95 %，最優選95 %、96%,97%,98%或甚至99%一致性，^ 100%序列一致性，與任何已知PRG4蛋白(如SEQID NO :1)、亞型或其類似物的所有或部分胺基酸序列相比，將表現類似於這些肽的功能。如還用於本文，術語「旁系同源物」指通過在基因組內複製相關的兩種核酸。旁系同源物通常具有不同功能，但這些功能可能相關。為了確定兩種胺基酸序列的序列一致性百分數，將序列對齊用於最佳比較的目的(如可將空格引入一種多肽的序列中用於與其它多肽或核酸最佳對齊)。然後比較對應胺基酸位置的胺基酸殘基。當一種序列中的位置被在其它序列對應位置的相同胺基酸殘基佔據時，則分子在該位置是一致的。可在兩種核酸序列之間進行相同類型的比較。兩種序列之間的序列一致性百分數是序列共享一致位置數的函數(即序列一致性百分數=一致位置數/總位置數X 100)。優選本發明包括的分離胺基酸同系物與任何已知PRG4蛋白(如SEQ ID NO :1)的完整胺基酸序列相比，至少約50-60%，優選至少約60-70%，更優選至少約 70-75 %、75-80 %、80-85 %、85-90 % 或 90-95 %，最優選至少約 96 %、97 %、98 %、99 % 或
更大一致性。在某些實施方案中，編碼PRG4蛋白的分離核酸同系物包含與編碼此類PRG4蛋白(如SEQ ID NO 1)的胺基酸序列的核苷酸序列相比，至少約40-60%，優選至少約60-70%，更優選至少約70-75 75-8080-8585-90 %或90-95 %，甚至更優選至少約95 %、96 %、97 %、98 %、99%或更大一致性的核苷酸序列。在本領域眾所周知兩種核酸或肽序列之間序列一致性百分數的確定。例如，可用Vector NTI 6. 0 (PC)軟體包(InforMax, Bethesda,MD)確定兩種核酸或肽序列之間的序列一致性百分數。在該方法中，空格開放罰分15和空格擴展罰分6. 66用於確定兩種核酸的一致性百分數。空格開放罰分10和空格擴展罰分0. I用於確定兩種多肽的一致性百分數。 所有其它參數都設為預設設置。用於多重對齊的目的(Clustal W算法)，空格開放罰分是10，空格擴展罰分是0. 05,blosum62矩陣。應理解用於確定序列一致性的目的，當比較DNA序列與RNA序列時，胸腺嘧啶核苷酸等同於尿嘧啶核苷酸。而且，本文所用PRG4蛋白包括在嚴格條件下由與編碼PRG4蛋白的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的PRG4蛋白。如用於本文，「雜交」包括其中一種或多種多核苷酸反應以形成通過核苷酸殘基鹼基之間的氫鍵穩定化的複合物的反應。氫鍵可通過Watson-Crick鹼基配對、Hoogstein結合或任何其它序列特異性方式出現。複合物可包含兩股形成雙鏈結構、三股或多股形成多股複合物、單一的自雜交股，或這些的任何組合。雜交反應可構成更廣泛過程的一步，比如啟動PCR反應，或者核酶對多核苷酸的酶裂解。雜交反應可在不同的嚴格條件下進行。本發明包括能夠在低嚴格條件、更優選嚴格條件且最優選高嚴格條件下與編碼本文所述PRG4蛋白的多核苷酸雜交的多核苷酸。如用於本文，術語「嚴格條件」指在10XDenharf s溶液、6XSSC、0. 5 % SDS和IOOmg/ml變性鮭精DNA中在60°C雜交過夜。將印跡在62°C按順序在3XSSC/0. 1% SDS、接著在1XSSC/0. 1% SDS、最後在0. 1XSSC/0. 1% SDS中衝洗，每次30分鐘。如還用於本文，在某些實施方案中，短語「嚴格條件」指在65 °C在6 X SSC溶液中雜交。在其它實施方案中，「高嚴格條件」指在10XDenhartJ s溶液、6XSSC、0. 5% SDS和100mg/ml變性鮭精DNA中在65°C雜交過夜。將印跡在65°C按順序在3XSSC/0. 1% SDS、接著在I X SSC/0. 1% SDS、最後在0. 1XSSC/0. 1% SDS中衝洗，每次30分鐘。在本領域眾所周知核酸雜交的方法。因此，編碼本文所用PRG4蛋白的核酸包括與編碼人PRG4蛋白(如SEQ ID NO 1)或其特異性亞型或同系物的多核苷酸序列相比，具有至少60%同源性，優選75%同源性，更優選85%，更優選90%，最優選95%、96%、97%、98%、99%同源性的核酸。而且，本文所用PRG4蛋白還可以是嵌合蛋白或融合蛋白。如用於本文，「嵌合蛋白」或「融合蛋白」包含與第二多肽有效連接的第一多肽。嵌合蛋白可任選包含與第一或第二多肽有效連接的第三、第四或第五或其它多肽。嵌合蛋白可包含兩種或多種不同的多肽。嵌合蛋白可包含多次複製的同一種多肽。嵌合蛋白還可包含一種或多種多肽中的一種或多種突變。在本領域眾所周知製備嵌合蛋白的方法。在本發明某些實施方案中，嵌合蛋白是PRG4蛋白與其它PRG4蛋白亞型的嵌合體。如用於本文，「分離的」或「純化的」蛋白質、多核苷酸或分子指離開它們自然存在的環境，或者基本不含細胞物質，比如來自衍生蛋白質、多核苷酸或分子的細胞或組織來源的其它汙染蛋白質，或者基本不含化學合成時的化學前體或其它化學劑。措辭「基本不含細胞物質」包括與從中分離或重組製備或合成的細胞的細胞組分分離的製劑。在某些實施方案中，措辭「基本不含細胞物質」包括具有小於約30% (乾重)其它蛋白質(本文也稱為「汙染蛋白」)、更優選小於約20%、還更優選小於約10%、最優選小於約5%其它蛋白質的PRG4蛋白製劑。當重組製備蛋白質或多核苷酸時，還優選基本不含培養基，即培養基代表小於約20%、更優選小於約10%、最優選小於約5%感興趣的蛋白質製劑的體積。
從以下優選實施方案的描述和從權利要求中將清楚本發明的其它特徵和優點。本領域技術人員在瀏覽說明書和實施例後將清楚本發明的這些和許多其它變更和實施方案。
實施例實施例I體內治療口腔邊界潤滑缺陷口腔乾燥症適合用作口部潤滑劑的含漱液組合物具有下列組成
PRG4含漱溶液:
PRG4100 pg/mL
山梨醇(Sorbital)2%
1 %
苯曱酸0.02 %
FD&C Green No. 3 染料
椒樣薄荷油調味劑適量
無菌水適量製備以上配方含漱液是通過將上文列出的成分混合一起以製備適合用於潤滑口腔的成品來製備。給藥將20ml以上配方含漱液每4小時或按需給予患口腔乾燥症的患者。患者用含漱液漱口 2-5分鐘並完全吐出漱口液。適合將PRG4遞送至口腔的口香糖具有下列組成
權利要求
1.一種用於改善口腔邊界潤滑的ロ部護理組合物，其包含配製在水性滲透平衡鹽溶液、多相乳液、凝膠、液體、霜劑、軟膏劑、噴霧劑、糊劑、粘性溶液、緩釋裝置或者在糖錠或樹膠中的有效量和濃度的分離或純化PRG4 ;其中有效量和濃度的分離或純化PRG4足以改善口腔邊界潤滑。
2.權利要求I的ロ部護理組合物，其中所述組合物包含濃度為10-10，OOOμ g/mL的PRG4。
3.權利要求I的ロ部護理組合物，其中PRG4具有50kDa-400kDa的平均摩爾質量。
4.權利要求I的ロ部護理組合物，其中PRG4包含潤滑片段、多聚體或其同系物。
5.權利要求I的ロ部護理組合物，其中PRG4是重組PRG4蛋白或其功能片段。
6.權利要求I的ロ部護理組合物，其中PRG4是純化的自然存在的PRG4蛋白。
7.權利要求I的ロ部護理組合物，其還包含透明質酸鈉。
8.權利要求7的ロ部護理組合物，其中所述組合物包含濃度為10-100，000μ g/mL的透明質酸鈉或透明質酸。
9.權利要求7的ロ部組合物，其中所述組合物包含濃度為500-5，000μ g/mL的透明質酸鈉或透明質酸。
10.權利要求I的ロ部護理組合物，其還包含約O.25wt. % -IOwt. %聖草流浸膏。
11.權利要求I的ロ部護理組合物，其還包含約I.Owt. % -30wt. %增甜劑或調味劑。
12.權利要求I的ロ部護理組合物，其還包含有效刺激唾液腺分泌的量的刺激劑化合物，所述刺激劑化合物選自檸檬酸、抗壞血酸及其混合物。
13.權利要求I的ロ部護理組合物，其還包含ー種或多種選自利多卡因、利諾卡因和丙胺卡因的局麻劑。
14.權利要求I的ロ部護理組合物，其還包含一種或多種見於唾液的酶，包括乳過氧化物酶、硫氰酸酯和葡萄糖氧化酶。
15.一種用於改善口腔邊界潤滑的ロ香糖組合物，其包含 (a)約O.25wt. % -IOwt. %聖草流浸膏、柑橘油、檸檬油、白檸檬油、橙花油、橙油、薄荷油、椒樣薄荷油、留蘭香薄荷油、茴香油、豆蘧油、肉桂油、丁香油、芫荽油、桉樹油、小茴香油、芸香草油、肉豆蘧油、聖草流浸膏、甘草浸膏； (b)約I.Owt. % -30wt. %增甜劑或調味劑； (c)有效刺激唾液腺分泌的量的刺激劑化合物，其選自檸檬酸、抗壞血酸及其混合物； (d)膠基； (e)治療有效量的PRG4;和 (f)治療有效量的透明質酸鈉。
16.一種用於改善口腔邊界潤滑的糖錠組合物，其包含下列的成形固體 (a)約O. 25wt. % -IOwt. %聖草流浸膏；(b)約I. Owt. % -30wt. %增甜劑； (C)有效刺激唾液腺分泌的量的刺激劑化合物，其選自檸檬酸、抗壞血酸及其混合物；和 (d)膠基， (e)治療有效量的PRG4，(f)治療有效量的透明質酸鈉。
17.一種治療口腔邊界潤滑下降或改善口腔邊界潤滑的方法，所述方法包含將治療有效量的分離或純化PRG4局部給予有需要的受試者的口腔表面。
18.權利要求17的方法，其中所述分離或純化PRG4存在於權利要求1-16中任ー項的ロ部護理組合物中。
19.一種治療具有口腔邊界潤滑下降伴隨症狀的疾病的方法，所述疾病包括例如ロ腔乾燥症、Sjdgren氏症候群、過敏、ロ面病症、慢性炎症、高摩爾滲透壓濃度、衰老、處方或OTC藥物、放療、化療、神經損傷或其任何組合，所述方法包含將治療有效量的PRG4局部給予有需要的受試者的口腔表面。
20.一種治療口腔潰瘍的方法，所述方法包含將治療有效量的PRG4局部給予有需要的個體的口腔表面。
21.一種適合用作手術潤滑劑的組合物，所述組合物包含在手術可接受的載體中的有效量的PRG4。
22.權利要求21的組合物，其還包含一種或多種手術可接受的潤滑劑，其選自透明質酸鈉、羧甲基纖維素鈉、羥こ基纖維素、羥丙甲纖維素、甲基纖維素、右旋糖酐70、明膠、甘油、聚こニ醇300、聚こニ醇400、聚山梨醇酯80、丙ニ醇、聚こ烯醇、聚維酮。
23.權利要求21的組合物，其還包含ー種或多種選自利多卡因、利諾卡因和丙胺卡因的局麻劑。
24.權利要求21的組合物，其還包含ー種或多種消毒劑，其選自葡萄糖酸氯己定、苯扎氯銨、溴化十六烷基三甲基銨、西吡氯銨、苄索氯銨、酒精、氯化鈉和碳酸氫鈉。
25.ー種在手術或醫療操作過程中提供潤滑的方法，所述方法包含將PRG4應用於有需要的組織或醫療裝置。
26.權利要求25的方法，其中所述手術或醫療操作包括插入導管、內鏡、手術器械、進入身體開ロ的手套、作為手術輔件和/或臨時植入物、作為水合植入物，和用於白內障摘除術、雷射角膜切削術、人工晶狀體(IOL)插入和取出、角膜手術、青光眼手術、外傷手術、後段手術、眼整形手術和肌肉手木。
27.一種用於減小運動所致摩擦的組合物，所述組合物包含配製在溶液、凝膠、溶膠和緩釋聚合物中的PRG4。
28.權利要求27的組合物，其中所述緩釋聚合物包含ー種或多種下列組分羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚丙烯或其它常用賦形劑或緩和劑。
29.權利要求27的組合物，其還包含透明質酸鈉。
30.權利要求27的組合物，其還包含尿囊素(O.5% )。
31.權利要求27的組合物，其還包含蘆薈(巴貝多蘆薈)葉提取物、C1836酸甘油三酷、羊蠟酸/羊脂酸硬脂酸甘油三酷、Tribehenin和或こ酸維生素E。
32.一種用於減小運動所致摩擦的膠粘貼劑，所述膠粘貼劑包含膠粘表面和非膠粘表面，其還包含在非膠粘表面上的PRG4。
33.權利要求32的膠粘貼劑，其還包含透明質酸鈉。
34.ー種防止運動過程中摩擦的方法，所述方法包含局部應用有效量的PRG4。
35.權利要求34的方法，其還包含應用權利要求27-31中任一項的組合物。
36.權利要求34的方法，其中將含有PRG4的膠粘貼劑應用於感興趣的區域。
37.一種用作皮膚填充劑的藥學上可接受的組合物，其包含在皮膚病學可接受的粘性溶液中的PRG4。
38.權利要求37的組合物，其還包含皮膚病學有效量的透明質酸。
39.權利要求37的組合物，其還包含皮膚病學有效量的膠原。
40.權利要求37的組合物，其還包含皮膚病學有效量的羧甲基纖維素、聚こニ醇和/或聚環氧こ烷。
41.權利要求37的組合物，其還包含皮膚病學有效量的藥物，所述藥物選自抗凝血酶原藥、抗炎藥、激素、趨化因子、鎮痛藥、生長因子、細胞因子、骨原性因子和麻酔剤。
42.權利要求37的組合物，其還包含皮膚病學有效量的維甲酸。
43.權利要求37的組合物，其還包含皮膚病學有效量的氘還原水。
44.一種恢復人的臉部或所選身體區域的組織體積、皮膚充盈、紋理和緊實的治療方法，所述方法包含以下的步驟將權利要求37-43中任一項的組合物在人的臉部或所選身體區域的ー個或多個區域注入真皮或真皮下。
45.權利要求44的治療方法，其中所述ー個或多個區域是眶周區、嘴唇、顴骨區、鼻唇褶、唇-下頜骨褶、頸或手。
46.ー種促進將生物活性劑遞送至有需要的個體的方法，所述方法包含將生物活性劑與PRG4蛋白混合給予個體。
47.權利要求46的方法，其中所述生物活性劑包含藥物、肽、蛋白質、抗體或其片段、核酸或顯像劑。
48.權利要求46的方法，其中所述遞送載體還包含透明質酸鈉。
49.權利要求46的方法，其中所述遞送載體還包含表面活性磷脂，其選自L-a-ニ棕櫚醯磷脂醯膽鹼、磷酯醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺和鞘磷脂。
50.權利要求46的方法，其中所述混合物是通過局部給予、注射或ロ部給藥。
51.一種減小授乳所致摩擦的方法，所述方法包含將配製在溶液、凝膠、溶膠或膠粘貼劑中有效量的PRG4給予有需要的乳頭、乳房或乳暈。
52.權利要求51的方法，其中所述溶液、凝膠、溶膠或膠粘貼劑含有ー種或多種下列組分羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚丙烯、其它常用賦形劑或緩和劑，或透明質酸鈉。
全文摘要
本發明涉及蛋白質PRG4及其治療調製的用途。特別是，本發明涉及利用PRG4及其治療調製的組合物和方法，包括用作手術潤滑劑，用於預防或減小術後粘連的治療，用於口腔潰瘍的治療，用作體育潤滑貼劑，用作皮膚填充劑，用於口乾的治療，用於藥物遞送方法或組合物，和用於授乳潤滑。
文檔編號A61K38/16GK102711796SQ201080033795
公開日2012年10月3日 申請日期2010年5月24日 優先權日2009年5月22日
發明者B·薩利文, D·薩利文, E·R·特勒伊特, N·B·J·特勒伊特, T·施米德特 申請人:盧布裡斯有限責任公司, 謝彭斯眼科研究所有限公司