用於由大腸桿菌向培養基中分泌來製備Leu－水蛭素的信號序列的製作方法

2023-05-30 18:09:51

專利名稱：用於由大腸桿菌向培養基中分泌來製備Leu－水蛭素的信號序列的製作方法
來源於水蛭的產品Refludan在臨床試驗中顯示出良好的治療特性(The Lancet，第353卷，429-438頁)。由此得出將來對該產品的需要量可能比較大的結論。該產品中的生物活性成分是[Leu1，Thr2]-63-脫硫水蛭素，該成分被記載在歐洲專利0 324 712中並在下文中被簡稱為「Leu-水蛭素。」歐洲專利0 448 093記載了一種製備水蛭素的方法。該專利優選的實施方案包括N-末端胺基酸由丙氨酸構成的水蛭素。將該水蛭素融合到α-環糊精糖基轉移酶(CGT酶)的信號序列上，並按照該專利中記載的方法將編碼該融合蛋白的表達載體轉化到大腸桿菌(E.coli)分泌突變體中，這樣能夠以高於2g/L的粗產率製備Ala-水蛭素。歐洲專利0549 915記載了穩定性得到改善的Ala-水蛭素的變體。利用大腸桿菌分泌系統製備這些變體的產率是每升數克。因此該產率明顯高於由Dodt等描述的水蛭素變體HV1的產率(FEBS LETTERS，第202卷，373-377頁，1986)。美國專利5,573,929中記載了通過pUC載體代替Dodt等描述的源自pBR322的載體以已知方式來對表達盒進行表達，該表達產率與由Dodt等描述的水蛭素變體HV1的產率相比，只有微乎其微的增加量。Bender等(應用微生物學生物技術(Appl.MicrobiolBiotechnol)34，203-207頁，1990)描述了由變青鏈黴菌進行Thr-水蛭素的分泌，Thr-水蛭素的分泌已被記載在歐洲專利0 171 024中。但是，該產率與歐洲專利0 448 093和0 549 915中提到的產率相比，也有明顯的降低。這還適用於在由P.de Taxis du Poet等發現的大腸桿菌B中通過大腸桿菌的信號序列Ompa表達分泌水蛭素變體HV1。這些作者發現水蛭素的產率在胞質中是300mg/l，而在細胞上清液中大約為40mg/l。在所述文章中還記載了在昆蟲細胞系統中的表達非常低(400μg/l)。
採用酵母表達系統多形漢遜氏酵母或巴斯德畢赤氏酵母獲得的產率與歐洲專利0 448 093和0 549 915中記載的利用啤酒糖酵母獲得的產率最接近。
Rosenfeld等(蛋白質表達和純化8，476-482，1996)描述了酵母菌巴斯德畢赤氏酵母對水蛭素的表達和分泌。在這種情況下，獲得的產率大約為1.5g/l培養液。採用多形漢遜氏酵母能夠獲得相似數量級的產率(應用微生物學生物技術(Appl.Microbiol Biotechnol)44，377-385頁，1995)。然而，這種表達系統的主要缺點在於發酵時間明顯長於大腸桿菌系統的發酵時間。因此如果象Ala-水蛭素一樣，由大腸桿菌分泌製備Leu-水蛭素將是有利的。
然而，採用歐洲專利0 448 093中記載的系統是不可能的。由於這個原因，在該專利中建議通過三肽Ala-Thr-Arg延伸Leu-水蛭素序列來製備一種前Leu-水蛭素，與胰蛋白酶發生反應後該Leu-水蛭素最終被轉化為天然活性成分Leu-水蛭素。按照這個建議進行振蕩搖瓶實驗，結果粗產率明顯低於所述Ala-水蛭素的產率。因此，初步看起來，與後來的酵母表達系統相比，不具備明顯的優勢。
因此本發明的目的是製備一種融合蛋白，在該融合蛋白中信號序列與Leu-水蛭素的結合使得對Leu-水蛭素直接進行加工並隨後由大腸桿菌以高產率分泌天然Leu-水蛭素成為可能。對於建立一種通過提高水蛭素的初始濃度而降低Refludan的發酵和後續純化生產成本的方法，這是先決條件。目前已驚奇地發現，存在能夠由大腸桿菌直接分泌Leu-水蛭素的信號序列，並且在這種情況下的分泌實際上比歐洲專利0 448093中記載的那種分泌看起來更有效。因此有可能建立一種不需要高成本就能得到大量Leu-水蛭素的方法。本發明正是如此。
為了找到有利的信號序列，引進一種PCR-輔助信號序列篩選方法。該方法利用編碼目的蛋白的DNA作為模板以及利用一種確定的反向PCR引物和可變正向引物，該正向引物可以進行一種DNA片段的合成，該DNA片段編碼一種與目的基因偶合的信號序列。反應按照附

圖1中描述的方案進行。可以根據待合成的信號序列的長度來改變反應步驟的數目對於本技術領域的技術人員來說是清楚的。簡訊號序列可以通過一個反應步驟來製備，而較長的信號序列可以通過兩個、三個或多個反應步驟來製備。另外，反應步驟的數目還取決於用來合成作為引物的寡核苷酸的設備。以這種方式合成的融合信號肽基因然後可以被識別限制位點1和2的酶特異切割並被插入到相應打開的表達載體中。當選擇水蛭素作為目的基因時，該系統變得具有普遍意義。而且可變選擇水蛭素的N-端胺基酸是可能的。儘管這對水蛭素與凝血酶的結合有一定影響(結合常數發生變化)，但與凝血酶活性有關的水蛭素的抑制作用仍然是可測的。
專利EP-B1 0 448 093記載了水蛭素向培養上清液中的分泌。上清液中的水蛭素濃度可以直接通過著名的凝血酶抑制試驗來測定。水蛭素濃度是分泌效率的直接度量，因而是信號序列消除的直接度量。然而，該專利記載了，例如，起始於亮氨酸的水蛭素不能通過CGT酶的信號序列有效地釋放到上清液中。利用上述方法，目前有可能找到有效進行分泌的信號序列。以類似的方式，目前有可能對起始於其它19種胺基酸中的一種胺基酸的水蛭素的分泌進行研究。結果產生了針對一系列信號序列的各種情況，所述信號序列能夠以一種模式對信號肽的羧基端胺基酸和與其連接的肽殘基進行有效加工。因此可以對將目的蛋白有效分泌到胞質中的信號肽進行預選，因而增加了建立一種有效製備蛋白質方法的可能性。本發明同樣也涉及這些。通過以下步驟可以加快所述方法的進程或可以使所述方法自動進行在選擇培養基中過夜振蕩培養作為液體培養物的配體混合物和感受態細胞的轉化混合物，第二天，採用實施例11中所述細胞的等分樣品接種含有用來進行誘導的誘導物的培養基，但是離心大部分培養物並凍結細胞沉澱。如果表達時發現了水蛭素活性，則相應的表達質粒可以被從所述細胞中再分離出來，然後被線性化並通過凝膠電泳被從任何自連接產物中分離出來。然後所述線性質粒DNA被再連接和再轉化到宿主菌株中。然後可以分離出單個菌落並檢測它們的表達效率。這種方法可以按照工藝滿足藥品審批標準的方式進行。
所述方法的另一個優點在於能容易地同時對不同信號肽變體有效分泌水蛭素的能力進行研究，如在各個種間進行胺基酸交換的進化過程中出現的信號肽變體。
通過利用Nielsen等描述的電腦程式(蛋白質工程(ProteinEngineering)10，1-6，1997)進行比較，所述方法也是有利的，藉助該方法可以預測信號序列和目的蛋白間的切割位點。然而，發現以此進行的預測在每種情況下都不正確，因此有利的結合可能容易被忽略。另外，正確加工的預測和能準確獲得的產率之間沒有關係。
本發明一方面涉及一種含有信號序列的水蛭素前體，該信號序列選自粘質沙雷氏菌的外膜蛋白、螢光假單胞菌的oprF蛋白、大腸桿菌的lamb B蛋白(由λ受體(lamB)基因編碼)和腐敗希瓦氏菌的延胡索酸還原酶的信號序列，優選地選自粘質沙雷氏菌的外膜蛋白和腐敗希瓦氏菌的延胡索酸還原酶的信號序列，所述信號序列上具有C-端連接的Leu-水蛭素的序列。
本發明的另一方面涉及一種製備Leu-水蛭素的方法，其中如上所述的水蛭素前體以中間體的形式存在，其中(a)製備一種含有編碼水蛭素前體的DNA序列的表達質粒；(b)在適當的大腸桿菌細胞中表達得自於(a)的表達質粒；(c)水蛭素前體從大腸桿菌中分泌出來並同時被加工；和(d)從培養基中直接分離Leu-水蛭素。
本發明還涉及上述水蛭素前體用於製備Leu-水蛭素的用途，優選地是在上述方法中的用途。
另外本發明還涉及尋找用於在大腸桿菌中分泌表達任何目的蛋白的合適信號肽的方法，其中(a)在大腸桿菌中表達水蛭素或一種水蛭素衍生物，該水蛭素衍生物具有抗血栓形成作用和在其與一種待測信號肽進行N-端連接的N末端具有一個確定的胺基酸aax；(b)通過測定培養上清液中的水蛭素活性來確定表達率；
(c)採用各種信號肽重複步驟(a)和(b)；(d)通過比較由步驟(b)中測到的水蛭素活性表示的表達率來選擇合適的信號肽。
本發明還涉及水蛭素或一種水蛭素衍生物用於尋找一種信號肽的用途，所述水蛭素衍生物具有抗血栓形成作用和在其N末端具有一個確定的胺基酸aax，所述信號肽能夠有效分泌一種由所述信號肽和任何其它目的蛋白組成的前體蛋白並且同時能夠去除源於大腸桿菌的信號肽，所述目的蛋白具有N末端胺基酸aax，特別是其中aax是亮氨酸。
而且本發明還涉及一種通過在大腸桿菌中的分泌表達來製備任何目的蛋白的方法，其中(a)通過尋找一種合適信號肽的方法尋找一種合適的信號肽；(b)在大腸桿菌中表達一種編碼一種前體蛋白的核酸構建體，所述前體蛋白由得自(a)的合適信號肽和目的蛋白組成；和(c)從培養上清液中分離所述的目的蛋白。
尤其是，其中所述目的蛋白的N-端胺基酸是亮氨酸，並且所述表達通過一種核酸構建體來進行，該核酸構建體中包括信號肽的序列編碼一種選自粘質沙雷氏菌的外膜蛋白、螢光假單胞菌的oprF蛋白、大腸桿菌的lamb B蛋白(由λ受體(lamB)基因編碼)和腐敗希瓦氏菌的延胡索酸還原酶的信號肽。
通過實施例方式來描述能夠有效合成和分泌Leu-水蛭素的信號序列的合成。同時還描述了沒有達到目標或產率結果較差的其它信號序列的合成。所述實施例目的在於通過以Leu-水蛭素為基礎的信號序列的選擇解釋本發明的構思而非對本發明進行限制。
所述方法可被用於Refludan的純化；這一點，例如，在實施例11中進行了描述。
實施例1編碼由Leu-水蛭素和粘質雷沙氏菌的外膜蛋白的信號序列組成的融合蛋白的融合基因的合成所使用的表達質粒是載體pJF118，該載體被記載在歐洲專利0 468539中的圖1中，原因是該載體的基本結構與歐洲專利0 448 093中記載的載體pCM7053相同。
所使用的模板是質粒pK152，該質粒被記載在歐洲專利0 448 093中的實施例1中並且含有相應於歐洲專利0 171 024的水蛭素序列。
膜蛋白已由Braun，G.和Cole，S.T.進行了描述(分子基因遺傳學(Mol.Gen.Genet.)195，321-328，1984)。
為了合成所需的DNA片段，製備三種寡核苷酸序列。
寡核苷酸hirrev具有以下序列5′TTTTTTT AAG CTTGGGCTGC AGGTC 3′[SEQ ID NO1]HindIII所述引物與表1中所述水蛭素基因的區域227-210 bp雜交。
引物smompaf1具有下列序列5′-TGGCACTGGC AGGTTTCGCT ACCGTAGCGC AAGCCcttac gtatactgac tgca-3′[SEQ ID NO2]所述引物與表1中所述水蛭素序列的第1-19個核苷酸雜交。引物序列的雜交部分用小寫字母來表示。所述序列的其餘部分與由Braun，G.和Cole，S.T.(分子基因遺傳學(Mol.Gen.Genet.)195，321-328，1984)公開的序列的區域229 bp-263 bp雜交。
引物smompaf2具有下列序列5′-ttttttgaat tcATGAAAAA GACAGCTATC GCATTAGCAG TGGCACTGGC AGGTTTC-3′[SEQ ID NO3]所述引物序列從13 bp位點向前與由Braun，G.和Cole，S.T.公開的201 bp-245 bp序列雜交並因而與引物序列smompaf2重疊。所述引物的1-12位點含有一個識別限制酶EcoRI的位點並且與6個T核苷酸鄰接以便被潛在的酶所識別。
在標準的PCR(如，例如，94℃10″，50℃30″，72℃45″，25個循環)中，以含有表1所述序列的質粒pK152的DNA作為模板，並採用引物hirrev和smompaf1，通過細菌的部分信號序列來延伸水蛭素序列。然後在相同條件下，將反應產物作為第二次PCR的模板與引物hirrev和smompaf2反應。反應產物是一種編碼融合蛋白的DNA片段，所述融合蛋白由通過目的信號序列延伸的水蛭素序列組成。在其5』端有一個識別限制酶EcoR1的位點而在3』端有一個識別限制酶HindIII的位點。
從第二次PCR得到的反應產物以一種雙重消化混合物的形式與兩種限制酶反應並且在T4 DNA連接酶反應中以EcoR1/HindIII片段的形式被插入到載體DNA中，該載體DNA已被所述兩種酶打開鏈。大腸桿菌菌株Mc1061或其分泌突變株WCM100的感受態細胞被所述連接混合物轉化並在含氨苄青黴素的平板上於選擇壓力下進行培養。第二天早晨，將實施例6中所述的表達與利用大腸桿菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表達進行比較。結果發現所獲得的表達比對比試驗中的表達強大約1.5倍。
實施例2Leu-水蛭素與源於螢光假單胞菌的oprF基因產物的信號序列的融合蛋白的合成按照實施例1中所述的方案進行構建，其中不同的是使用兩種新引物代替引物smompaf1/f2，所述兩種新引物在對水蛭素基因的特異性方面和被限制酶EcoR1識別的序列方面與smompa引物具有相同的特徵但編碼oprF基因的所需信號序列(De，E.等；FEMS Microbial.Lett.127，267-272，1995)。
引物pfuf1具有下列序列5′GGTTCTCTTA TTGCCGCTAC TTCTTTCGGC GTTCTGGCAc ttacgtatac tgactgca 3′0[SEQ ID NO4]
引物pfuf2具有下列序列5′ttttttgaat tcatgAAAAA CACCTTGGGC TTGGCCATTG GTTCTCTTAT TGCCGC 3′[SEQ ID NO5]在這種情況下，引物pfuf1按照實施例1被用於PCR1中而引物pfuf2被相應地用於PCR2中。所述表達與利用大腸桿菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表達進行比較。結果發現所獲得的表達比對比試驗中的表達強大約1.1倍。通過在SDS-PAGE系統中進行凝膠電泳進行分級分離，分離水蛭素電泳帶並測定水蛭素的N-端序列。結果發現所述序列非常完整並且起始於亮氨酸。這一結果令人驚奇的原因是用於鑑定推定的信號肽酶識別位點的程序可預測由纈氨酸延長了水蛭素。
實施例3Leu-水蛭素與源於大腸桿菌的lamB基因產物的信號序列的融合蛋白的合成按照實施例1中所述的方案進行構建，其中不同的是使用兩種新引物代替引物smompaf1/f2，所述兩種新引物在對水蛭素基因的特異性方面和被限制酶EcoR1識別的序列方面與smompa引物具有相同的特徵但編碼lamb基因的所需信號序列(Clement.J.M.和Hofnung，M.細胞(Cell)27，507-514，1981)。
引物lambbf1具有下列序列5′GTTGCCGTCG CAGCGGGCGT AATGTCTGCT CAGGCAATGG CTcttacgta tactgactgc a 3′[SEQ ID NO6]引物lambbf2具有下列序列5′ttttttgaat tcATGATGAT TACTCTGCGC AAACTTCCTC TGGCGGTTGC CGTCGCAGC 3′[SEQ ID NO7]
在這種情況下，引物lambbf1按照實施例1被用於PCR1中而引物lambbf2被相應地用於PCR2中。所述表達與利用大腸桿菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表達進行比較。結果發現所獲得的表達與對比試驗中的表達處於同一水平。通過在SDS-PAGE系統中進行凝膠電泳進行分級分離，分離水蛭素電泳帶並測定水蛭素的N-端序列。結果發現所述序列非常完整並且起始於亮氨酸。這一結果令人驚奇的原因是用於鑑定推定的信號肽酶識別位點的程序沒有預測出水蛭素的正確加工。
實施例4Leu-水蛭素與源於腐敗希瓦氏菌的延胡索酸還原酶黃素蛋白亞基的前體的信號序列的融合蛋白的合成按照實施例1中所述的方案進行構建，其中不同的是使用兩種新引物代替引物smompaf1/f2，所述兩種新引物在對水蛭素基因的特異性方面和被限制酶EcoR1識別的序列方面與smompa引物具有相同的特徵但編碼源於腐敗希瓦氏菌的所需信號序列(Pealing S.L.等生物化學(Biochemistry)31，12132-12140，1992)。由於所述出版物只記載了蛋白質序列，所以按照密碼子表將胺基酸序列翻譯成DNA序列因而引物spfccf1的序列如下所示5′CTACCCTGAT GGGTACCGCT GGTCTGATGG GTACCGCTGT TGCTcttacg tatactgact gca 3′[SEQ ID NO8]引物spfccf2具有下列序列5′ttttttgaat tcATGAAAAA AATGAACCTG GCTGTTTGCA TCGCTACCCT GATGGGTACC 3′[SEQ ID NO9]在這種情況下，引物spfccf1按照實施例1被用於PCR1中而引物spfccf2被相應地用於PCR2中。所述表達與利用大腸桿菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表達進行比較。結果發現所獲得的表達比對比試驗中的表達強大約1.5倍。通過在SDS-PAGE系統中進行凝膠電泳進行分級分離，分離水蛭素電泳帶並測定水蛭素的N-端序列。結果發現所述序列非常完整並且起始於亮氨酸。這一結果令人驚奇的原因是用於鑑定推定的信號肽酶識別位點的程序可預測對水蛭素序列的位點6上的半胱氨酸的羧基側進行加工。
實施例5Leu-水蛭素與源於pBR322的β-內醯胺酶前體的信號序列的融合蛋白的合成按照實施例1中所述的方案進行構建，其中不同的是使用兩種新引物代替引物smompaf1/f2，所述兩種新引物在對水蛭素基因的特異性方面和被限制酶EcoR1識別的序列方面與smompa引物具有相同的特徵但編碼β-內醯胺酶前體蛋白的所需信號序列(Sutcliffe J.G.；ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.4377-90(1978))。
引物blatf1具有下列序列5′CTGATCCCGT TCTTTGCAGC GTTCTGCCTG CCGGTTTTCG CGcttacgta tactgactgc a 3′[SEQ ID NO10]引物blatf2具有下列序列5′ttttttgaat tcATGTCCAT CCAGCACTTC CGCGTCGCCC TGATCCCGTT CTTTGC 3′[SEQ ID NO11]在這種情況下，引物blatf1按照實施例1被用於PCR1中而引物blatf2被相應地用於PCR2中。所述表達與利用大腸桿菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表達進行比較。結果發現所獲得的表達率僅為在對比試驗中所獲得的表達率的50％-90％。通過在SDS-PAGE系統中進行凝膠電泳進行分級分離，分離水蛭素電泳帶並測定水蛭素的N-端序列。結果發現所述序列非常完整並且起始於亮氨酸。這一結果是由用於鑑定推定的信號肽識別位點的程序預測出的。
實施例6Leu-水蛭素與源於大腸桿菌的鹼性磷酸酶前體的信號序列的融合蛋白的合成按照實施例1中所述的方案進行構建，其中不同的是使用兩種新引物代替引物smompaf1/f2，所述兩種新引物在對水蛭素基因的特異性方面和被限制酶EcoR1識別的序列方面與smompa引物具有相同的特徵但編碼源於大腸桿菌的鹼性磷酸酶蛋白的所需信號序列(Shuttleworth，H.，Taylor，J.和Minton，N.核酸研究(Nucleic Acids Res.)14(21)，8689(1986))。
引物linkphoaf1具有下列序列5′GCTGCCGCTG CTGTTCACCC CGGTTACCAA AGCGcttacg tatactgact gca 3′[SEQ ID NO.12]引物linkphoaf2具有下列序列5′ttttttgAAT TCATGAAACA GTCGACCATC GCGCTGGCGC TGCTGCCGCT GCTGTTC 3′[SEQ ID NO.13]所述兩種引物在對大腸桿菌的密碼子選擇方面被優化，即它們與起始基因的天然序列不完全一致。
在這種情況下，引物linkphoaf1按照實施例1被用於PCR1中而引物linkphoaf2被相應地用於PCR2中。所述表達與利用大腸桿菌菌株WCM 100/pCM7053的Ala-水蛭素表達進行比較。結果發現所獲得的表達率僅為在對比試驗中所獲得的表達率的一小部分。通過在SDS-PAGE系統中進行凝膠電泳進行分級分離，分離水蛭素電泳帶並測定水蛭素的N-端序列。結果發現所述序列非常完整並且起始於亮氨酸。這一結果是由用於鑑定推定的信號肽識別位點的程序預測出的。然而，令人驚奇地是，產率非常低。
實施例7Leu-水蛭素與源於弗格森埃希氏菌的鹼性磷酸酶前體的信號序列的融合蛋白的合成按照實施例1中所述的方案進行構建，其中不同的是使用兩種新引物代替引物smompaf1/f2，所述兩種新引物在對水蛭素基因的特異性方面和被限制酶EcoR1識別的序列方面與smompa引物具有相同的特徵但編碼源於弗格森埃希氏菌的鹼性磷酸酶蛋白的所需信號序列(Du Bose，R.F.和Hartl，D.L.分子生物學進展(Mol.Biol.Evol.)7，547-577(1990))。
這個信號序列在5個位點與源於大腸桿菌的鹼性磷酸酶不同。
引物fergusf1具有下列序列5′GCTGAGCTGC CTGATCACCC CGGTGTCCCA GGCGcttacg tatactgact gca 3′[SEQ ID NO.14]引物fergusf2具有下列序列5′ttttttgaat tcATGAAACA GAGCGCGATC GCGCTGGCTC TGCTgAGCTG CCTGATC 3′[SEQ ID NO.15]所述兩種引物在對大腸桿菌的密碼子選擇方面被優化，即它們與起始基因的天然序列不完全一致。在這種情況下，引物fergusf1按照實施例1被用於PCR1中而引物fergusf2被相應地用於PCR2中。所述表達與利用大腸桿菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表達進行比較。結果發現所獲得的表達率僅為在對比試驗中所獲得的表達率的一小部分。而且表達率比源於大腸桿菌鹼性磷酸酶的信號肽與Leu-水蛭素的構建物的表達率低大約50％。
實施例8Leu-水蛭素與源於浸麻類芽孢桿菌的環糊精葡聚糖轉移酶前體的信號序列的融合蛋白的合成按照實施例1中所述的方案進行構建，其中不同的是使用兩種新引物代替引物smompaf 1/f2，所述兩種新引物在對水蛭素基因的特異性方面和被限制酶EcoR1識別的序列方面與smompa引物具有相同的特徵但編碼源於浸麻類芽孢桿菌的環糊精葡聚糖轉移酶基因的所需信號序列(Takano，T.，Fukuda，M.Monma，M.，Kobayashi，S.，Kainuma，K.和Yamane，K.J.細菌學(Bacteriol.)166，1118-1122(1986))。
引物baccdgf1具有下列序列5′CTTTCGCTGA GTATGGCGTT GGGGATTTCA CTGCCCGCAT GGGCActtac gtatactgac tgca 3′[SEQ ID NO.16]引物baccdgf2具有下列序列5′ttttttgaat tcATGAAATC GCGGTACAAA CGTTTGACCT CCCTGGCGCTTTCGCTGAGT ATGGC 3′[SEQ ID NO.17]在這種情況下，引物baccdgf 1按照實施例1被用於PCR1中而引物baccdgf 2被相應地用於PCR2中。所述表達與利用大腸桿菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表達進行比較。結果發現所獲得的表達率僅為在對比試驗中所獲得的表達率的四分之一。所合成的水蛭素在凝血酶抑制測定試驗中的作用與Leu-水蛭素相似。這意味著所述信號肽已被正確地進行了加工。這與通過理論分析得到的期望值不一致，其表明延伸了8個胺基酸或者在N-端平截了2個胺基酸。
實施例9Leu-水蛭素與源於大腸桿菌PCF020菌毛蛋白前體蛋白(fotA)的信號序列的融合蛋白的合成按照實施例1中所述的方案進行構建，其中不同的是使用兩種新引物代替引物smompaf1/f2，所述兩種新引物在對水蛭素基因的特異性方面和被限制酶EcoR1識別的序列方面與smompa引物具有相同的特徵但編碼源於大腸桿菌PCF020菌毛蛋白前體蛋白(fotA)的所需信號序列(Viboud，G.l.，Jonson，G.，Dean-Nystrom，E.和Svennerholm，A.M.傳染免疫學(Infect.Immun.)64(4)，1233-1239(1996))。
引物pcf1-ala具有下列序列5′TGGTTTCAGC TTTAGTAAGC GGGGTTGCAT TTGCTCTTACGTATACTGAC TGCAC 3′[SEQ ID NO.18]引物p-pcf2具有下列序列5′TTTTGGGAAT TCATGAAAAA GACAATTATG TCTCTGGCTG TGGTTTCAGCTTTAGTAAGC 3′[SEQ ID NO.19]在這種情況下，引物pcf1-ala按照實施例1被用於PCR1中而引物p-pcf2被相應地用於PCR2中。所述表達與利用大腸桿菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表達進行比較。結果發現所獲得的表達率為在對比試驗中所獲得的表達率的約40％。
實施例10Leu-水蛭素與源於鼠傷寒沙門氏菌外膜蛋白(fimD)的信號序列的融合蛋白的合成按照實施例1中所述的方案進行構建，其中不同的是使用兩種新引物代替引物smompaf 1/f2，所述兩種新引物在對水蛭素基因的特異性方面和被限制酶EcoR1識別的序列方面與smompa引物具有相同的特徵但編碼源於鼠傷寒沙門氏菌外膜蛋白的所需信號序列(Rioux，C.R.，Friedrich，M.J.和Kadnet，R.J.；細菌學雜誌(J.Bacteriol.)172(11)，6217-6222(1990))。
引物styfimf1具有下列序列5′CGGCGCTGAG TCTCGCCTTA TTTTCTCACC TATCTTTTGC Ccttacgtat actgactgca 3′[SEQ ID NO.20]引物styfimf2具有下列序列
5′ttttttgaattca TGTCATT TCATCACCGG GTATTTAAAC TGTCGGCGGT GAGTCTC 3′[SEQ ID NO.21]在這種情況下，引物styfimf1按照實施例1被用於PCR1中而引物styfimf2被相應地用於PCR2中。所述表達與利用大腸桿菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表達進行比較。結果發現所獲得的表達率為在對比試驗中所獲得的表達率的約10％。
實施例11在大腸桿菌中的表達本實施例描述了水蛭素的表達。為了達到這一目的，將轉化體的細胞接種到1-5ml的多份LB培養基中並在28℃下利用培養搖床以220rpm振蕩培養大約20小時，所述LB培養基含25mg/ml氨苄青黴素和0.5-2mM的IPTG(異丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)。接著，測定光密度，然後離心細胞懸液並測定澄清的上清液中的水蛭素。
歐洲專利0 448 093中記載的Ala-水蛭素通過該專利所記載的分泌突變體WCM100中質粒pCM7053的表達與Refludan的表達平行進行。這使得直接進行表達率的比較成為可能。
如美國專利5,616,476中記載的，能夠進行大規模的表達。Refludan然後能夠通過該專利的實施例5和6中描述的方法來純化。
實施例12水蛭素濃度的測定通過GrieBbach等的方法(血栓形成研究(Thrombosis Research)37，347-350，1985)進行水蛭素濃度的測定。為了達到這個目的，在測量系列中包括確定量的Refludan標準品以建立校準曲線。因而可以直接以mg/l表述產率。表1編碼水蛭素的DNA序列以及翻譯成的胺基酸1 CTTACGTATACTGACTGCACTGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGATCTAAC60L T Y T D C T E S G Q N L C L C E G S N -61 GTTTGCGGCCAGGGTAACAAATGCATCCTTGGATCCGACGGTGAAAAGAACCAGTGCGTT 120V C G Q G N K C I L G S D G E K N Q C V -121 ACTGGCGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTCATAACGACGGCGACTTCGAAGAGATCCCT 180T G E G T P K P Q S H N D G D F E E I P -181 GAGGAATACCTTCAGTAATAGAGCTCGTCGACCTGCAGCCCAAGCTT227(SEQ ID NO.22]E E Y L Q * * ----------------------------[SEQ ID NO.23]
表2
序列表110Aventis Pharma Deutschland GmbH120用於由大腸桿菌分泌到培養基中來製備Leu-水蛭素的信號序列1301999/L055140DE 19944870.11411999-09-1815019944870.11511999-09-1816033170PatentIn Ver.2.1210121131212DNA213合成序列220223合成序列的描述misc特徵4001tttttttaag cttgggctgc aggtcsdnhn d 31210221154212DNA213合成序列220223合成序列的描述misc特徵4002tggcactggc aggtttcgct accgtagcgc aagcccttac gtatactgac tgca 54210321157212DNA213合成序列220223合成序列的描述misc特徵4003ttttttgaat tcatgaaaaa gacagctatc gcattagcag tggcactggc aggtttc 57210421158212DNA213合成序列220223合成序列的描述misc特徵4004ggttctctta ttgccgctac ttctttcggc gttctggcac ttacgtatac tgactgca 58210521156212DNA213合成序列220223合成序列的描述misc特徵4005ttttttgaat tcatgaaaaa caccttgggc ttggccattg gttctcttat tgccgc 56210621161212DNA213合成序列220223合成序列的描述misc特徵4006gttgccgtcg cagcgggcgt aatgtctgct caggcaatgg ctcttacgta tactgactgc 60a 61210721159212DNA213合成序列220223合成序列的描述misc特徵4007ttttttgaat tcatgatgat tactctgcgc aaacttcctc tggcggttgc cgtcgcagc 59210821163212DNA213合成序列220223合成序列的描述misc特徵4008ctaccctgat gggtaccgct ggtctgatgg gtaccgctgt tgctcttacg tatactgact 60gca63210921160212DNA213合成序列220223合成序列的描述misc特徵4009ttttttgaat tcatgaaaaa aatgaacctg gctgtttgca tcgctaccct gatgggtacc 602101021161212DNA213合成序列220223合成序列的描述misc特徵40010ctgatcccgt tctttgcagc gttctgcctg ccggttttcg cgcttacgta tactgactgc 60a 612101121156212DNA213合成序列220223合成序列的描述misc特徵40011ttttttgaat tcatgtccat ccagcacttc cgcgtcgccc tgatcccgtt ctttgc 562101221153212DNA213合成序列220223合成序列的描述misc特徵40012gctgccgctg ctgttcaccc cggttaccaa agcgcttacg tatactgact gca 532101321157212DNA213合成序列220223合成序列的描述misc特徵40013ttttttgaat tcatgaaaca gtcgaccatc gcgctggcgc tgctgccgct gctgttc 572101421153212DNA213合成序列220223合成序列的描述misc特徵40014gctgagctgc ctgatcaccc cggtgtccca ggcgcttacg tatactgact gca 532101521157212DNA213合成序列220223合成序列的描述misc特徵40015ttttttgaat tcatgaaaca gagcgcgatc gcgctggctc tgctgagctg cctgatc 572101621164212DNA213合成序列220223合成序列的描述misc特徵40016ctttcgctga gtatggcgtt ggggatttca ctgcccgcat gggcacttac gtatactgac 60tgca 642101721165212DNA213合成序列220223合成序列的描述misc特徵40017ttttttgaat tcatgaaatc gcggtacaaa cgtttgacct ccctggcgct ttcgctgagt 60atggc 652101821155212DNA213合成序列220223合成序列的描述misc特徵40018tggtttcagc tttagtaagc ggggttgcat ttgctcttac gtatactgac tgcac 552101921160212DNA213合成序列220223合成序列的描述misc特徵40019ttttgggaat tcatgaaaaa gacaattatg tctctggctg tggtttcagc tttagtaagc 602102021160212DNA213合成序列220223合成序列的描述misc特徵40020cggcgctgag tctcgcctta ttttctcacc tatcttttgc ccttacgtat actgactgca 602102121157212DNA213合成序列220223合成序列的描述misc特徵40021ttttttgaat tcatgtcatt tcatcaccgg gtatttaaac tgtcggcgct gagtctc 5721022211267212DNA213合成序列220223合成序列的描述基因40022cttacgtata ctgactgcac tgaatctggt cagaacctgt gcctgtgcga aggatctaac 60tytdctsgnc cgsngtttgc ggccagggta acaaatgcat ccttggatcc gacggtgaaa 120agaaccagtg cgttvcggnk cgsdgkncva ctggcgaagg taccccgaaa ccgcagtctc 180ataacgacgg cgacttcgaa gagatccctt ggtkshndgd gaggaatacc ttcagtaata 240gagctcgtcg acctgcagcc caagctt 267210232115212PRT213合成序列220223合成序列的描述肽40023Glu Glu Tyr Leu Gln1 52102421130212PRT213合成序列220223合成序列的描述信號40024Met Lys Arg Asn Arg Phe Phe Asn Thr Ser Ala Ala Ile Ala Ile Ser1 5 10 15Ile Ala Leu Asn Thr Phe Phe Cys Ser Met Gln Thr Ile Ala
2025302102521121212PRT213合成序列220223合成序列的描述信號40025Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Leu Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala1 5 10 15Thr Val Ala Gln Ala202102621122212PRT213合成序列220223合成序列的描述信號40026Met Lys Asn Thr Leu Gly Leu Ala Ile Gly Ser Leu Ile Ala Ala Thr1 5 10 15Ser Phe Gly Val Leu Ala202102721125212PRT213合成序列220223合成序列的描述信號40027Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala1 5 10 15Gly Val Met Ser Ala Gln Ala Met Ala20 252102821125212PRT213合成序列220223合成序列的描述信號40028Met Lys Lys Met Asn Leu Ala Val Cys Ile Ala Thr Leu Met Gly Thr1 5 10 15Ala Gly Leu Met Gly Thr Ala Val Ala20 252102921123212PRT213合成序列220223合成序列的描述信號40029Met Ser Ile Gln His Phe Arg Val Ala Leu Ile Pro Phe Phe Ala Ala1 5 10 15Phe Ser Leu Pro Val Phe Ala202103021121212PRT213合成序列220223合成序列的描述信號40030Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr1 5 10 15Pro Val Thr Lys Ala202103121121212PRT213合成序列220223合成序列的描述信號40031Met Lys Gln Ser Ala Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Ile Thr1 5 10 15Pro Val Ser Gln Ala202103221127212PRT213合成序列220223合成序列的描述信號40032Met Lys Ser Arg Tyr Lys Arg Leu Thr Ser Leu Ala Leu Ser Leu Ser1 5 10 15Met Ala Leu Gly Ile Ser Leu Pro Ala Trp Ala20 252103321124212PRT213合成序列220223合成序列的描述信號40033Met Ser Phe His His Arg Val Phe Lys Leu Ser Ala Leu Ser Leu Ala1 5 10 15Leu Phe Ser His Leu Ser Phe Ala20
權利要求
1.一種含有一種信號序列的水蛭素前體，該信號序列選自粘質沙雷氏菌的外膜蛋白、螢光假單胞菌的oprF蛋白、大腸桿菌的lamb B蛋白和腐敗希瓦氏菌的延胡索酸還原酶的信號序列，所述信號序列上具有C-端連接的Leu-水蛭素的序列。
2.如權利要求1所述的水蛭素前體，其中所述信號序列選自粘質沙雷氏菌的外膜蛋白和腐敗希瓦氏菌的延胡索酸還原酶的信號序列。
3.一種製備Leu-水蛭素的方法，其中如權利要求1或2所述的水蛭素前體以中間體的形式存在，其中，(a)製備一種含有編碼水蛭素前體的DNA序列的表達質粒；(b)在適當的大腸桿菌細胞中表達得自於(a)的表達質粒；(c)水蛭素前體從大腸桿菌中分泌出來並同時被加工；和(d)從培養基中分離Leu-水蛭素。
4.如權利要求1或2所述的水蛭素前體用於製備Leu-水蛭素的用途。
5.如權利要求4所述的水蛭素前體的用途，其被用於如權利要求3所述的方法中。
6.一種尋找用於在大腸桿菌中分泌表達任何目的蛋白的合適信號肽的方法，其中(a)在大腸桿菌中表達水蛭素或一種水蛭素衍生物，該水蛭素衍生物具有抗血栓形成作用和在其與一種待測信號肽進行N-端連接的N末端具有一個確定的胺基酸aax；(b)通過測定培養上清液中的水蛭素活性來確定表達率；(c)採用各種信號肽重複步驟(a)和(b)；(d)通過比較由步驟(b)中測到的水蛭素活性表示的表達率來選擇合適的信號肽。
7.水蛭素或一種水蛭素衍生物用於尋找一種信號肽的用途，所述水蛭素衍生物具有抗血栓形成作用和在其N末端具有一個確定的胺基酸aax，所述信號肽能夠有效分泌一種由所述信號肽和任何其它目的蛋白組成的前體蛋白並且同時去除源於大腸桿菌的信號肽，所述目的蛋白具有N-末端胺基酸aax。
8.如權利要求7所述的方法，其中aax是亮氨酸。
9.一種通過在大腸桿菌中的分泌表達來製備任何目的蛋白的方法，其中(a)通過如權利要求6所述的方法尋找一種合適的信號肽；(b)在大腸桿菌中表達一種編碼一種前體蛋白的核酸構建體，所述前體蛋白由得自(a)的合適信號肽和目的蛋白組成；和(c)從培養上清液中分離所述的目的蛋白。
10.如權利要求9所述的在大腸桿菌中製備任何目的蛋白的方法，其中所述目的蛋白的N-端胺基酸是亮氨酸，並且所述表達通過一種核酸構建體來進行，所述核酸構建體中的編碼信號肽的序列編碼一種選自粘質沙雷氏菌的外膜蛋白、螢光假單胞菌的oprF蛋白、大腸桿菌的lamb B蛋白和腐敗希瓦氏菌的延胡索酸還原酶的信號肽。
全文摘要
本發明涉及一種含有一種信號序列和Leu－水蛭素序列的水蛭素前體及其製備方法和用途,並涉及一種尋找用於在大腸桿菌中分泌表達任何目的蛋白的信號序列的方法和用於在大腸桿菌中分泌表達任何目的蛋白的方法。
文檔編號G01N33/50GK1374970SQ00812955
公開日2002年10月16日 申請日期2000年9月1日 優先權日1999年9月18日
發明者P·哈伯曼, R·班德 申請人:阿文蒂斯藥物德國有限公司