抗肝素肽的製作方法

2023-11-05 18:42:07 2

專利名稱：抗肝素肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子式為Z-Bm-(AXA)x-Bn-(AXA)y-Bo-(AXA)z-Bp的具有抗肝素活性的化合物，涉及含有它的診斷試劑，以及涉及所述的化合物在體外診斷試驗中或用於產生一種抗肝素用藥品中的用途。
未分餾的肝素(UFH)是粘多糖家族的一個天然硫酸化多糖。它主要是從豬或牛的腸黏膜中提取的。
該產品因其糖單位的組成而是不均勻的產物；其結果，分子的離子電荷也是不均勻的葡糖胺硫酸鹽單位的硫酸化程度不同，和在艾杜糖醛酸和葡糖醛酸單位中羧基功能團數目不同[1，2]。
肝素的基本物理學特徵是其多陰離子性和其高電荷密度。特別地，每個雙糖攜帶3至4個負電荷(磷酸鹽和羧酸鹽)。
肝素不同單位的特殊排列通過序列的全長中可重複形成五糖。此五糖已知是肝素的抗凝血酶III識別位點，在這兩部分之間形成了高親合力並因此產生高抗凝活性[3]。不含五糖的分子鏈實際上缺乏抗凝活性(僅1/3的肝素分子對ATIII具有此親合力)[4]。
未分餾的肝素(UFH)是一個多分散的大分子商業上的以UFH為基礎的製劑的分子量在12000和18000Da之間。這些製劑主要用於血栓形成的預防和治療作用。
有可能按分子大小分餾UFH(化學處理後)，它產生了LMWHs家族(低分子肝素)[5]。UHF對IIa和Xa因子具有相等的活性。另外一方面，LMWHs保留了高的抗Xa活性而抗IIa活性隨LMWH分子的大小而下降。由於高的抗IIa活性可能有出血的副作用，因此LMWHs可以有利地代替UFHs用作抗凝劑。
然而，在治療中使用UFH或LMWH肝素可能需要給予能中和其對循環系統抗凝作用的化合物，特別是在幹預的末期，比如體外循環。此外，在某些體外診斷試驗中，樣本中肝素的存在可能引起對結果的錯誤解釋。因此證明，有必要獲得用於診斷的具有抗肝素特性的化合物。
硫酸魚精蛋白是唯一已知能夠在體內中和肝素抗凝作用的化合物。魚精蛋白屬於富含精氨酸殘基的鹼性蛋白家族，從鮭魚精液中純化[6-7]並因其正電荷中和肝素[8-10]。
但是，魚精蛋白引起血液動力學和血液學副作用如低血壓、心動過緩、血小板減少和白細胞減少[11-15]。尤其是，已經證明魚精蛋白上的正電荷與肝素的中和作用和效力直接成比例，但也與分子的毒性成比例[16]。
多聚(L)賴氨酸和聚凝胺是已知中和肝素的其它化合物。但這些多聚陽離子對於臨床應用也顯示毒性太大。
Wakefield等人(WO 95/13083)描述了被認為毒性較小的魚精蛋白變異體。它們是具有20至40個胺基酸序列並帶有+14和+18之間正電荷的肽，其結構相當於點綴著中性胺基酸的正性殘基簇。Harris等人(EP 999219)描述了含有一連串精氨酸和丙氨酸簇的線性或支化的抗肝素肽。
但是，上面提到的資料不包括任何有關在診斷中需要有抗肝素藥物的講授。
本發明的主題是一個新合成的被用作肝素中和試劑的分子。
本發明分子的特性已經在體外診斷試劑中被特別地研究。除了它們能夠對受檢血液樣本中可能存在的肝素的作用不敏感以外，這些診斷試劑中的某些還可能必須具有低的濁度。該特性對於測定Quick時間的含凝血活素的試劑是特別重要的，特別是在用光學檢測的自動化設備上。
具有下面說明的通式I的分子有可能滿足這兩個標準。由此證明它們在中和在診斷和治療目的中由於存在肝素可能伴隨的幹擾中是特別有用的。
因此，本發明涉及具有抗肝素活性的化合物，其通式I如下Z-Bm-(AXA)x-Bn-(AXA)y-Bo-(AXA)z-Bp其中*Z的通式是
其中Cy＝-共價鍵-CH2--CO--CO-S--(CH2)n-X-其中1≤n≤2，X＝O-，S-， 其中Cx＝-共價鍵-(CH2)n-，1≤n≤5或 其中R1＝-OH，-NH2*B代表一個鹼性胺基酸並可以有利地選自賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、組氨酸、高賴氨酸和高精氨酸；m，n，o和p彼此獨立地代表2和4之間的一個整數。
在本發明優選的化合物中，m、n和o等於4且p等於2的化合物是更特別被注意的。
*AXA代表一個相當於下面分子式的烴基鏈-NH-(CH2)n-CO-，n是2和6之間的一個整數；x，y和z彼此獨立地代表1和6之間的一個整數。
z有利地選自下列化合物 優選地，Z是焦穀氨酸(PGlu)。
在本發明優選的化合物中，AHA相當於NH-(CH2)5-CO-的化合物，即x等於2、y和z等於1的氨基己酸是更特別被注意的。有利地，本發明涉及相當於下面分子式的化合物PGlu-K4-(AHA)2-K4-AHA-K4-AHA-K2。
上面描述的化合物具有抗肝素能力，這是由肝素化血漿與非肝素化血漿相比，Δ相對凝血時間小於10％而確定的，優選小於5％。
因此，本發明的主題還是在體外診斷試劑中應用相當於上面說明的分子式1的化合物，特別是計算血液樣本凝血時間的試劑，或檢測或分析凝血級聯各種成分的試劑，而與該樣本中是否存在肝素無關。
所述的試劑，特別是PT(凝血酶原時間)型試劑，有利地具有以630nm處OD值測定的濁度低於0.5，優選低於0.1。
根據另一個方面，本發明涉及體外診斷試劑，包括上面通式I限定的化合物，優選地是其中AXA相當於NH-(CH2)5-CO-的化合物，即x等於2、y和z等於1的己胺酸，更優選是下面分子式的化合物PGlu-K4-(AHA)2-K4-AHA-K4-AHA-K2。
這樣一種診斷試劑因此可能在血液樣本中進行檢測或分析，而與該樣本中是否存在肝素無關。
按照本發明的試劑有利地相當於傳統的凝血試驗，即測定血液樣本凝血時間試驗，或檢測或分析凝血級聯各種成分的試驗，例如分析VIIa因子、血纖維蛋白原、和蛋白C和S、PT試驗。這些試驗是本領域技術人員常用的。
根據本發明，一個優選的體外診斷試劑是包括凝血活素的試劑，以進行PT(凝血酶原時間或Quick時間)試驗。
按照本發明上面限定的化合物在這種試劑中的終濃度有利地在2和10μg/ml間。優選地，此濃度是5μg/ml。
本發明還涉及使用上面限定的通式I的化合物作為一個抗肝素劑，以製備一種藥物。
實施例1:合成本發明優選的化合物的方法

圖1的一覽表總結了合成的各種步驟。
採用適合的自動化裝置(Applied Biosystems 433A)，通過固體支持化學合成結構鏈。
為補足合成產量，通過雙偶聯加入疏水的間隔臂(AXA)。所用的樹脂是MBHA(甲基苄基氫胺)樹脂，以在從樹脂分解後回收一個中性醯胺C末端結構。這裡所用的化學是Fmoc化學，應用哌啶在每個步驟去保護。側鏈用Boc基團保護。合成器的合成規模是0.1nmole，產生大約100mg粗產物。通過用TFA(55％三氟乙酸)處理，此產物從樹脂上被分解並在側鏈上去保護。在分解溶液的體積濃縮2/3後，此產物從乙醚中沉澱。粗產物隨後被凍幹，然後通過反相HPLC，採用5μm Kromasil C18柱(20mm×250mm)，以水/乙腈0.1％TFA的梯度(從0至60％乙腈，以15ml/分鐘進行30分鐘)純化。在214nm處進行檢測並手工收集餾分。回收的純化產物的量是50mg。
在用6N HCl 120℃水解24h後，通過序列分析確證終產物的結構；然後在用PITC(苯硫異氰酸鹽)衍生後，通過反相HPLC(Kromasil C18柱，5μm，250mm×4.6mm)分析水解物。
實施例2在PT試驗中檢測本發明抗肝素劑目的是分析合併進Diagnostica Stago凝血活素試劑中的抗肝素劑的性能(抗肝素能力和濁度)。
抗肝素能力的分析是抗肝素劑的能力使試劑對血液樣本中含有的肝素不敏感檢測樣本由可能過載或不過載肝素(用1 IU/ml UFH(Calciparine25000 IU/ml，Sanofi)肝素化的血漿)的正常血漿池製備。
注釋用作陰性對照的試劑，即沒有抗肝素劑者，對於驗證血漿的肝素化是有用的。
為測定Quick時間，自動化裝置(STA Diagnostica Stago-歐洲專利0325874)移出50μl血漿樣本，令其在一個含有珠子的杯形器中37℃孵育240秒；然後將杯形器轉移進檢測區內並在樣本中添加100μl凝血活素試劑。
凝血時間用下面的方法測定在固定的粘度下，杯形器中珠子的振動幅度(用一個電磁場保持振動)是固定的。當粘度升高時(凝固表現)，珠子的振動幅度下降。
用此幅度變化計算來決定凝血時間。
抗肝素能力用下面的方法計算測定肝素化和非肝素化血漿間的Δ相對時間，即[{CT(肝素化血漿)-CT(非肝素化血漿)}/CT(非肝素化血漿)×100]其中CT＝凝血時間當此Δ時間小於10％時，根據本發明的化合物的抗肝素能力被評估為是顯著的。濁度分析對於在診斷中，特別是在凝血活素試驗(PT)中的應用，濁度應當儘可能低。
此濁度通過在分光光度計(Uvikon 940，Kontron)上檢測630nm處的OD值而測定。
注釋用作陰性對照的試劑，即沒有抗肝素劑者，對於檢測此抗肝素劑對試劑濁度的影響是有用的。
實施例3引進疑血活素型試劑中的、根據本發明的各種抗肝素劑的性能(抗肝素能力和濁度)分析(與沒有抗肝素劑的對照(C)比較的結果)5μg/ml抗肝素劑抗UFH能力濁度Δ時間0/1 IU/ml OD 630(％) nmC 99.20.0471415-5 PGlu-K4-(AHA)2-K4-AHA-K4-AHA-K24.5 0.0691415-4 THC-K4-(AHA)2-K4-AHA-K4-AHA-K25.9 0.1481415-3 Hyp-K4-(AHA)2-K4-AHA-K4-AHA-K23.4 0.1341415-2 Thi-K4-(AHA)2-K4-AHA-K4-AHA-K25.7 0.1041394 Pro-K4-AHA-K4-APA-K3-APA-K26.4 0.3991401 Pro-K4-AHA-K4-APA-K4-APA-K28.1 0.4881403P Pro-K2-AHA-K4-APA-K4-APA-K27.1 0.2051403PK Pro-K3-AHA-K4-APA-K4-APA-K28.7 0.2831404 Pro-K4-AHA-K3-APA-K3-APA-K27.6 0.1471405 Pro-K4-(AHA)2-K4-AHA-K4-AHA-K24.2 0.3231408-2 Pro-K4-AHA-K3-APA-K4-APA-K26.9 0.0401411 Pro-K4-(AHA)2-K4-APA-K3-APA-K26.5 0.086其中APA相當於分子式為-(CH2)2-CO-的氨基丙酸參考文獻1.Casu，B.(1985)Adv.Carbohydr.Chem.4351-1342.Constanta，等人.(1993)Angewandte Chemie，Vol.32，No.12，1671-18183.Lormeau，H.，等人.(1995)Thromb.Haemostasis 741474-14774.Mayo，K.M.，等人.(1995)Biochem.J.312357-3655.Mardiguian，J.(1992)主編.Doutremepuich ch.Marcel Dekker inc.7-126.McKay，D.J.，等人.(1986)Eur.，J.Biochem.158361-2667.Kurt，F.(1973)Protamines，Institut für Vegetative Physiologie，Frankfurt，Germany8.Jacques，L.B.(1973)Can.Med.Assoc.J.1081291-12979.Cundall，R.B.，等人.(1979)J.Chem.Soc.Perkins Trans.II87910.Racanelli，A.，等人.(1985)Semin.Thromb.Hemostasis 11176-18911.Horrow，J.C.(1985)Anesth.Analg.64348-36112.Cook，J.J.，等人.(1992)Circulation 851102-110913.Weller J.M.，等人.(1985)J.Allergy.Clin.Immunol.75297-30314.Wakefield T.W，等人.(1990)Ann.Surg.212387-39515.Telen A.N.，等人.(1977)Thromb.Res.10，399-410Delucia，A.，等人.(1993)J.Vasc.Surg.1049-58
權利要求
1.一種具有抗肝素活性的化合物，其通式I為Z-Bm-(AXA)x-Bn-(AXA)y-Bo-(AXA)z-Bp其中*Z的通式是 其中Cy＝-共價鍵-CH2--CO--CO-S--(CH2)n-X-其中1≤n≤2，並且X＝O-，S-， 其中Cx＝-共價鍵-(CH2)n-，1≤n≤5或 其中R1＝-OH，-NH2*B代表一個鹼性胺基酸；m，n，o和p彼此獨立地代表2和4之間的整數。*AXA代表一個相當於下面分子式的烴基鏈-NH-(CH2)n-CO-，n是2和6之間的整數；x，y和z彼此獨立地代表1和6之間的整數。
2.根據權利要求1所述的化合物，特徵性在於Z選自下列化合物-4-氨基吡咯烷-2-羧酸-氮雜環丁烷-2-羧酸-2-羧基嗎啉酸-1，3-二氫-2H-異吲哚羧酸-4-羥基吡咯烷-2-羧酸-吲哚基-2-羧酸-異哌啶甲酸-焦穀氨酸-甲基哌啶-2-羧酸-吡咯烷-2-羧酸-2-氧噻唑烷-4-羧酸-噻唑烷羧酸-四氫異喹啉-2-羧酸
3.根據權利要求1和2任一項所述的化合物，其特徵在於Z是焦穀氨酸(PGlu)，其分子式是
4.根據權利要求1至3任一項所述的化合物，其特徵在於B選自賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、組氨酸、高賴氨酸和高精氨酸。
5.根據權利要求1至4任一項所述的化合物，其特徵在於B是賴氨酸。
6.根據權利要求1至5任一項所述的化合物，其特徵在於m、n和o等於4，p等於2。
7.根據權利要求1至6任一項所述的化合物，其特徵在於AXA相當於分子式NH-(CH2)5-CO-(氨基己酸)。
8.根據權利要求1至7任一項所述的化合物，其特徵在於x等於2，y和z等於1。
9.根據權利要求1至8任一項所述的化合物，其特徵在於所述的化合物相當於分子式PGlu-K4-(AHA)2-K4-AHA-K4-AHA-K2。
10.根據權利要求1至9任一項所述的化合物，其特徵在於它具有抗肝素能力，其是在凝固試驗中，由肝素化血漿與非肝素化血漿之間Δ相對凝血時間小於10％而測定的，優選小於5％。
11.一種體外診斷試劑，含有根據權利要求1至10任一項所述的化合物。
12.根據權利要求11所述的試劑，用於計算血液樣本的凝血時間，而與該樣本中是否存在肝素無關。
13.根據權利要求11所述的試劑，用於檢測或分析凝血級聯的各種成分，而與該樣本中是否存在肝素無關。
14.根據權利要求11所述的試劑，其特徵在於所述的試劑是PT試劑。
15.根據權利要求11所述的試劑，其特徵在於它含有下面分子式的化合物PGlu-K4-(AHA)2-K4-AHA-K4-AHA-K2。
16.根據權利要求11所述的試劑，其特徵在於在630nm處OD值測定的濁度低於0.5，優選低於0.1。
17.根據權利要求11所述的試劑，包括終濃度在2和10μg/ml之間的通式I的化合物。
18.根據權利要求11所述的試劑，其特徵在於在所述的試劑中化合物的終濃度是5μg/ml。
19.在體外診斷試劑中根據權利要求1至10任一項所述的化合物用於計算血液樣本的凝血時間，或檢測或分析血液樣本中凝血級聯的各種成分中的用途，該計算或測試或分析與該樣本中是否存在肝素無關。
20.根據權利要求1至10任一項所述的化合物作為抗肝素劑在製備藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及分子式為Z－B
文檔編號A61P7/02GK1447818SQ01814258
公開日2003年10月8日 申請日期2001年8月14日 優先權日2000年8月17日
發明者G·康坦, F·洛爾 申請人:斯塔戈診斷公司