Dna接種的方法

2023-05-30 12:33:21

專利名稱：Dna接種的方法
技術領域：
本發明涉及DNA接種的改進，特別是(但不排除其它地)涉及接種哺乳動物以防疾病狀態，涉及疫苗組合物和在藥物生產中使用某些化合物。
DNA疫苗通常由插入強病毒啟動子編碼抗原肽的目的基因和聚腺苷酸化/轉錄終止序列的細菌質粒載體構成。所述目的基因可以編碼整個蛋白質或僅編碼涉及病原體、腫瘤或所要保護性對抗的其它因子的抗原肽序列。所述質粒可以在細菌中生長，如大腸桿菌，然後根據想要的給藥途徑在給予宿主之前，在適宜的介質中分離製備。在給予之後，質粒被宿主細胞攝入在宿主細胞中產生編碼的肽的。為了阻止質粒在哺乳動物宿主中複製和整合到相關動物的染色體DNA中，製備的質粒載體最好不含在真核細胞中起作用的複製起點。
相對於傳統的接種方法，DNA接種具有許多優點。首先，人們預測因為由所述DNA序列編碼的蛋白質是在宿主中合成的，所以所述蛋白質的結構或構象將與疾病狀態有關的天然蛋白質相似。DNA疫苗也將可能通過產生識別保守蛋白質中表位的細胞毒性T淋巴細胞應答，而提供保護以抗病毒的不同毒株。而且，因為質粒是由宿主細胞攝入，在宿主細胞中可以產生抗原蛋白質，所以將誘髮長久的免疫應答。該技術也提供了將多樣的免疫原結合為單一製劑以易於同時進行涉及許多疾病狀態的免疫的可能性。
(1)中提供了涉及DNA接種的有幫助的背景信息。它的內容通過引用全部包括到本文中。
儘管相對於傳統接種治療，DNA接種具有了許多優點，人們仍然想要開發用於增強由給予動物的質粒DNA編碼的蛋白質誘發的免疫應答的佐劑組合物。
其中原因之一是，雖然DNA疫苗在小鼠模型中作用往往很好，但是有證據說明它在較大的物種如非人類的靈長目動物中的潛能略弱(2，3)，人們認為可預測在人類中的潛能相似。佐劑也可能有助於改正可能伴隨DNA接種的從Th1應答至Th2應答的免疫應答的不適當的偏離，特別是當直接表皮給予時(4)。最後，人們已經知道DNA本身通過CpG基元，出可以顯示一些佐劑特性(5，6，7)，這在於肌內給予DNA疫苗的小動物中很普通，但在較大的物種中或當給予小劑量的DNA時減弱，如通過「基因槍」給予。
因此，本發明的一個目的是提供可以和DNA接種法結合使用的佐劑化合物。此外一個目的是提供改善DNA接種的方法，包括如佐劑，以及包含所涉及的佐劑的組合物。本發明的其它目的將在詳述中明顯看出。然而，至今已證明達到這些目是困難的，主要歸因於與傳統疫苗技術相比，與DNA接種相關的機理不同。
文獻報導了許多動物模型中由DNA接種引起的體液免疫應答的例子。已經表明在給予為此編碼的質粒DNA之後，其中產生了針對人生長激素和人類α-1抗胰蛋白酶(8)、流感NP(9)、HIV包膜蛋白(10)、牛皰疹病毒糖蛋白(11)和B肝表面抗原(12)的抗體應答。也已經在DNA接種動物模型中證明了細胞毒性T細胞應答。已經證明產生對抗流感A的NP(13)、B肝表面抗原(HBs Ag)65和核心抗原(14)以及HIVEnv(15，16，17)的細胞毒性T細胞，這只是幾個實例。然而，有趣的是注意到輔助T細胞應答好象依賴於質粒DNA的傳遞方式。肌內給予使輔助T細胞應答傾向於Th1類應答，而主要表皮給予使免疫應答傾向於Th2類應答(4)。還注意到已經與DNA接種方法結合試驗了許多已知的免疫增強劑，獲得的成功有限，或至多也不多是混合成功。例如，GM-CSF與狂犬病毒糖蛋白(18)和癌胚抗原(CEA(19))共同表達，以及B7-1和B7-2結核分枝桿菌(M.tuberculosis)HSP 65(20)或CEA(19)共同表達，都誘發比抗原單獨表達更高的抗體效價，沒有增強細胞免疫應答的報導。同樣有趣的是，當狂犬病毒糖蛋白與編碼幹擾素-γ的DNA共同給予時，實際上對抗體應答有抑制影響(18)。
由於考慮到這一背景，最驚奇地是註明到本發明人報導了表現出不僅刺激體液免疫應答，而且同時刺激細胞免疫應答機制雙重作用的佐劑化合物。最近已經顯示出證明涉及DNA接種的顯著佐劑活性的所述化合物，已在國際專利說明書WO94/07479中公開，涉及它們的免疫增強活性。本發明人鑑定的一種具有良好的DNA疫苗佐劑活性的特定化合物是4-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸，也稱為妥卡雷瑣，它最初在歐洲0054924中描述。現在，由本發明人鑑定的適用於作為DNA疫苗佐劑的化合物以前沒有公開或提出它們很適用作DNA疫苗佐劑的體液和細胞免疫原活性的證明。
優選核苷酸序列是DNA序列。
優選在給予所述DNA序列之前約14天至之後約14天，特別優選在給予所述DNA序列之前約7天至之後約7天，優選在給予所述DNA序列之前約1天至之後約1天，給予1至7次所述化合物。最特別優選基本上與給予所述DNA序列同時給予所述化合物，並在給予所述DNA序列之後的數天內還任選地給予所述化合物。
優選每次以約0.1mg/kg至約100mg/kg的劑量給予所述化合物。
優選所述哺乳動物是人類。
優選所述化合物是4-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸；按照本發明的另一個實施方案，提供了包含編碼與疾病狀態相關的抗原肽且在合適的載體中的DNA序列的疫苗組合物，和增強在哺乳動物中由所述抗原肽引發的體液和細胞免疫應答的化合物，所述化合物選自4-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊醯胺；N，N-二乙基5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊醯胺；N-異丙基5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊醯胺；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊酸乙酯；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊腈；(±)-5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)-2-甲基戊酸；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)-2，2-二甲基戊酸；3-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)甲基苯甲酸甲酯；3-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)甲基苯甲酸；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊酸苄酯；5-[4-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)-N-丁基]四唑；7-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)庚酸；5-(2-甲醯-3-羥基-4-正丙氧基苯氧基)戊酸；5-(4，6-二氯-2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊酸；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)-N-甲基磺醯戊醯胺；4-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸乙酯；5-(4-氯-2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊酸；5-(3-乙醯氨基-2-甲醯苯氧基)戊酸；氨基胍；4-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)丁酸；6-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)己酸；4-(3-乙醯氨基-2-甲醯苯氧甲基)苯甲酸乙酯；4-(3-乙醯氨基-2-甲醯苯氧甲基)苯甲酸；2-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸；5-[4-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯基]四唑；5-(2-甲醯-3-羥基-4-甲氧基苯氧基)戊酸；3-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)丙腈；4-羥基苯乙醛；苯乙醛；4-甲氧基苯乙醛；1-羥基-2-苯基丙烷；3-苯基丙醛；4-硝基苯甲醛；4-甲醯苯甲酸甲酯；4-氯苯甲醛；4-甲氧基苯甲醛；4-甲基苯甲醛；8，10-二氧代十一酸；4，6-二氧代庚酸；戊二酮；5-甲氧基-1-四氫萘酮；6-甲氧基-1-四氫萘酮；7-甲氧基-1-四氫萘酮；2-四氫萘酮；3-羥基-1-(4-甲氧基苯基)-3-甲基-2-丁酮；2』，4』-二羥基-2-(4-甲氧基苯基)乙醯苯；2-羥基-1-(4-甲氧基苯基)-戊2烯-4酮；柚配基4』，5，6-三羥基黃酮；4』-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)乙醯苯；6，7-二羥基香豆素；7-甲氧基-2-四氫萘酮；6，7-二甲氧基-2-四氫萘酮；6-羥基-4-甲基香豆素；尿黑酸γ-內酯；6-羥基-1，2-萘醌；8-甲氧基-2-四氫萘酮；及其合適的生理可接受鹽。
優選所述化合物是4-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸。
按照本發明的進一步的實施方案，提供了在藥劑生產中化合物的用途，其中給予哺乳動物所述化合物增強了由與疾病狀態相關的抗原肽引發的體液和細胞免疫應答，所述肽是給予所述哺乳動物編碼所述肽的DNA序列表達的結果；其中所述化合物選自4-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊醯胺；N，N-二乙基5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊醯胺；N-異丙基5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊醯胺；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊酸乙酯；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊腈；(±)-5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)-2-甲基戊酸；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)-2，2-二甲基戊酸；3-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)甲基苯甲酸甲酯；3-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)甲基苯甲酸；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊酸苄酯；5-[4-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)-N-丁基]四唑；7-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)庚酸；5-(2-甲醯-3-羥基-4-正丙氧基苯氧基)戊酸；5-(4，6-二氯-2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊酸；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)-N-甲基磺醯戊醯胺；4-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸乙酯；5-(4-氯-2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊酸；5-(3-乙醯氨基-2-甲醯苯氧基)戊酸；氨基胍；4-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)丁酸；6-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)己酸；4-(3-乙醯氨基-2-甲醯苯氧甲基)苯甲酸乙酯；4-(3-乙醯氨基-2-甲醯苯氧甲基)苯甲酸；2-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸；5-[4-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯基]四唑；5-(2-甲醯-3-羥基-4-甲氧基苯氧基)戊酸；3-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)丙腈；4-羥基苯乙醛；苯乙醛；4-甲氧基苯乙醛；1-羥基-2-苯基丙烷；3-苯基丙醛；4-硝基苯甲醛；4-甲醯苯甲酸甲酯；4-氯苯甲醛；4-甲氧基苯甲醛；4-甲基苯甲醛；8，10-二氧代十一酸；4，6-二氧代庚酸；戊二酮；5-甲氧基-1-四氫萘酮；6-甲氧基-1-四氫萘酮；7-甲氧基-1-四氫萘酮；2-四氫萘酮；3-羥基-1-(4-甲氧基苯基)-3-甲基-2-丁酮；2』，4』-二羥基-2-(4-甲氧基苯基)乙醯苯；2-羥基-1-(4-甲氧基苯基)-戊2烯-4酮；柚配基4』，5，6-三羥基黃酮；4』-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)乙醯苯；6，7-二羥基香豆素；7-甲氧基-2-四氫萘酮；6，7-二甲氧基-2-四氫萘酮；6-羥基-4-甲基香豆素；尿黑酸γ-內酯；6-羥基-1，2-萘醌；8-甲氧基-2-四氫萘酮；及其合適的生理可接受鹽。
優選所述化合物是4-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸，並且優選每次以約0.1mg/kg至100mg/kg的劑量給予所述化合物。
按照本發明的再一實施方案，提供了用於如上所概述方法分開、順序或同時給予的組分的組合物，包含編碼抗原肽的所述核苷酸序列和增強由所述抗原肽引發的細胞和體液免疫應答的所述化合物。
淋巴結T細胞體外應答Ova肽的增殖(在0.5％的小鼠血清存在於)。結果表明了T細胞對於在PBS中的卵清蛋白(不含佐劑)和單獨的PBS、單獨的和結合Ova肽的完全弗氏佐劑(CFA)、單獨的和結合Ova肽的細菌脂多糖(LPS)以及單獨的和結合Ova肽的卡介菌(HK-BCG)的應答。
圖2淋巴結T細胞應答單獨的和結合了佐劑LPS、CFA、GM-CSF和熱殺傷單核細胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)(HKLM)的編碼卵清蛋白的pDNA或DNA(PVAC.Ova)的增殖。
圖3用表達Mhsp65的pDNA免疫後，妥卡雷瑣對分枝菌hsp65的特異性抗體應答的影響。用20μg pDNA隔三星期分兩次免疫小鼠。兩星期之後，抽取它們的血，並通過ELISA檢測特異性IgG(a)、IgG2a(b)和IgG1(c)抗-重組體M.hsp65蛋白。p*≥0.1，特異性抗體應答沒有顯著的不同。在(a)中在p3或p3，T和p3M.65之間以及p3M.65和p3M.65G或p3M.65，T之間比較，在(b)中在p3或p3，T和p3M.65或p3M.65G之間比較，和在(c)中在p3和或p3，T和p3M.65Gub之間比較，p**≤0.05，。在(a)中在p3或p3，T和p3M.65 G或p3M.65，T之間比較，在(b)中在p3和或p3，T和p3M.65，t之間，和p3M.65和p3M.65，t之間比較，在(c)中在p3和或p3，T和p3M.65，T之間比較，p***≤0.003，。分別與p3和p3M.65相比時，p和h是顯著的。
圖4妥卡雷瑣對增殖性T細胞應答的影響。pDNA免疫小鼠的脾細胞在或者有單獨的S6c-E4或感染表達EBNA-4的牛痘的S6c-E4 9S6C-VE4)的情況下，或者有單獨的S6C-gpt對照腫瘤細胞或感染牛痘TK對照牛痘構建物9S6C-gptV)的情況下培養。刺激指數如方法一節中描述的計算。
圖5pDNA免疫的小鼠中的IFNγ應答和妥卡雷瑣對它的影響。用p3、E4或E4，T免疫各組小鼠，並在體外用腫瘤S6C-E$、S6C-gpt或不用任何物質刺激脾細胞72小時。通過特異性ELISA檢測IFNγ效價。
圖6在妥卡雷瑣處理的小鼠中細胞毒性T細胞應答明顯增強。用p3M.65、p3M.65，γ或p3M.65，T免疫各組HLA-A2/kb轉基因小鼠兩次。用HLA-A2結合(biding)肽P$培養脾細胞5-6天，然後將其作為常規51Cr釋放分析中的效應物。如方法一節中描述的，採用Jk-A2kb作為目標，用P4、用無關的肽(Inf)或不用任何物質進行脈衝處理。
圖7在妥卡雷瑣處理的小鼠中腫瘤生長物(outgrowth)抑制明顯增強。用p3、E4或E4，T免疫各組ACA小鼠三次，接著用104 S6C腫瘤細胞攻擊。當腫瘤直徑達到20mm時處死小鼠。
圖8在基因槍免疫後經妥卡雷瑣處理的小鼠中IFNγ產量提加。
用或者單獨的或與妥卡雷瑣結合的pVACl.PR(圖8a)或EBNA-4(圖8b)、或者各自的陰性質粒，通過基因槍分別免疫C57BL/6小鼠或ACA小鼠。將脾細胞與核蛋白肽或表達EBNA-4抗原的腫瘤細胞或抗原陰性腫瘤細胞一起培養。通過特異性ELISPOT分析(圖8b)或特異性ELISA分析(圖8a)確定IFNγ效價。
圖9妥卡雷瑣增強了由基因槍DNA免疫誘發的裂解性CTL應答用編碼流感病毒核蛋白的質粒DNA免疫C57B1/6小鼠，並且皮下給予(圖9a)或口服給予(圖9b)或不給予妥卡雷瑣。用A/PR8/34病毒體外重刺激脾細胞。採用標準銪釋放技術測定用H-2Db限制的NP肽脈衝處理的MHC匹配目標細胞的特異性溶胞作用。
發明詳述在整個本說明和附加的權利要求書中，除非上下文需要，否則詞語「包含(comprise)」和「包括(include)」或變化如「包含(comprising)」、「包含(comprises)」、「包括(including)」、「包括(includes)」都將解釋為包括在內，也就是說，採用這些詞語將意味著可能包括沒有詳述的整數或要素。
如上所述，本發明涉及接種方法，且特別涉及接種方法的改進，包括將編碼抗原蛋白或抗原肽的DNA引入哺乳動物中，以使所述蛋白或肽在所述哺乳動物體中表達，由此在哺乳動物中誘發對抗所述抗原蛋白或抗原肽的免疫應答。這種技術是眾所周知的，並如上面所提到在(1)中全面描述。
可以採用按照本申請的接種方法保護哺乳動物以抵抗各種各樣的疾病狀態，如病毒感染、細菌感染或寄生蟲感染、癌症、變應性疾病和自身免疫病。採用按照本發明的方法或組合物可以保護以防或治療的一些障礙或疾病狀態的具體例子如下病毒感染甲、乙、丙、丁和戊型肝炎病毒，HIV，皰疹病毒1、2、6和7，巨細胞病毒，水痘-帶狀皰疹病毒，乳頭瘤病毒，EB病毒，流感病毒，副流感病毒，腺病毒，柯薩奇病毒，細小核糖核酸病毒，輪狀病毒，呼吸道合胞病毒，痘病毒，鼻病毒，風疹病毒，乳多空病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒。
細菌感染誘發TB和麻風的分枝菌，肺炎鏈球菌，需氧革蘭氏陰性菌，支原體，葡萄球菌感染，鏈球菌感染，沙門氏菌，衣原體。
寄生的瘧疾，利什曼病，錐蟲病，弓形體病，血吸蟲病，絲蟲病。
癌症乳腺癌，結腸癌，直腸癌，頭部和頸部癌症，腎癌，惡性黑色素癌，前列腺癌。
變應性由室內塵蟎、花粉和其它環境變應原引起的鼻炎。
自身免疫病全身性紅斑狼瘡。
人們會認識到這些具體疾病只是通過舉例提到，並不想限制本本申請提到的將在哺乳動物系統中表達以誘發抗原應答的所述DNA序列，可以編碼整個蛋白質或僅編碼能夠引發抗原應答的短肽序列。貫穿本說明和附加的權利要求書中，短語「抗原肽」包括能夠在有關的動物中誘發免疫應答的所有肽序列或蛋白質序列。然而，最優選所述DNA序列將編碼與疾病狀態相關的整個蛋白質，因為在動物系統中表達整個蛋白質更可能模擬天然的抗原呈遞，並因此引起全面的免疫應答。涉及具體疾病狀態的已知抗原肽的一些非限制性例子包括如下HBV-PreS1 PreS2和表面env蛋白、核心和polHIV-gp120 gp40、gp160、p24、gag、pol、env、vif、vpf、vpu、tat、rev、nef乳頭狀瘤-E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、L1、L2HSV-gL、gH、gM、gB、gC、gK、gE、gD、ICP47、ICP36、ICP4流感-血細胞凝集素(haemaggluttin)、核蛋白TB-分枝菌超氧化物岐化酶、85A、85B、MPT44、MPT59、MPT45、HSP10、HSP65、HSP70、HSP90、PPD 19kDa Ag、PPD38kDa Ag。
為了在哺乳動物細胞中獲得表達所述抗原肽，編碼所述抗原肽的DNA序列必需存在於合適的載體系統中。例如，選擇的所述載體可以包含細菌質粒以及按正確順序布置的強病毒啟動子和聚腺苷酸化/轉錄終止序列，以獲得所述抗原肽的表達。包括這些組分和任選的如增強子、限制酶位點和選擇基因如抗生素抗性基因的其它組分的載體的構建，是本領域熟練的人員所熟知的，並且在Maniatis等人(21)中詳細解釋。
因為阻止所述質粒在哺乳動物宿主中複製並整合入所述動物的染色體DNA中是很重要的，所以將優選產生不合在真核細胞中有作用的複製起點的所述質粒。
按照本發明的方法和組合物可以用於涉及所有哺乳動物的預防或治療過程的方面，所述哺乳動物包括，例如，家禽、家畜、實驗動物、農場動物、捕獲的野生動物和最優選的人類。
上面所述的由本發明人鑑定的顯示出增強通過給予DNA疫苗引發的體液和細胞免疫原性活性的良好活性的化合物是已知的化合物，先前在WO94/07479中報導具有增強劑特性。特別優選化合物4-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸，它也稱為妥卡雷瑣，它最初在EP0054924中描述，且報導為具有免疫增強劑活性並且可用於治療各種各樣的疾病，包括HIV、HBV、HCV、腫瘤和鐮狀細胞貧血。人們認為所報導的妥卡雷瑣的活性可以解釋為它能夠形成希夫鹼，並因此替代生理供體或羰基而為CD4 Th-細胞提供共同刺激信號。先前已經報導妥卡雷瑣增強CD4-Th細胞應答，與Th2相比，選擇性地有利於Th1-型(22)，而本發明人已經證明它能夠增強了鼠模型中的TH1和TH2兩種同種型。
提及由本發明的所述化合物引起的由抗原肽激發的體液和細胞免疫應答的增加，用來表達血清抗體水平和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)水平將由於給予所述化合物而與伴隨單獨給予編碼抗原肽的DNA序列的水平相比分別提高了。可以用本領域眾所周知的方法定量分析這一水平，這將在附加的實施例中進一步解釋。
包含編碼抗原肽的DNA序列的載體可以用各種各樣的方法給予。可將裸露形式(那就是未與脂質體製劑、病毒載體或轉染促進蛋白結合的裸露DNA)給予的所述載體懸浮於合適的介質中，例如緩衝鹽溶液如PBS，然後經肌內、皮下、腹膜內或靜脈內注射，儘管較早的一些數據表明肌內或皮下注射是優選的(23)，(它的全部內容通過引用包括在本文中)。另外所述載體可以由如脂質體包囊或包膠囊於聚交酯co-乙交酯(PLG)的顆粒中(25)，經由口腔、鼻或肺的途徑給予。按照本發明的優選實施方案，同樣可以皮內給予所述載體，優選藉助基因槍(特別是粒子轟擊)給予技術的使用。這種技術可以包括凍幹包含所述載體的懸浮液，接著將所述載體包被在金珠粒上，然後在高壓下給予金珠粒於表皮中，例如(26)中所述的。傳遞DNA的數量將大大地不同，這取決於所免疫的哺乳動物的種類和重量、所治療/保護以防的疾病狀態的性質、所採用的接種方案(即單一給予與重複給藥)、給藥途徑和所選的佐劑化合物的效力和劑量。基於這些變量，開業醫生或獸醫專業人員將易於確定合適的劑量水平。
包括編碼抗原肽的DNA載體可以一次性給予或重複給予，例如，1至7次，優選1至4次，間隔時間約1天至約18個月。然而，該治療方案又是根據有關動物的種類和大小、所治療/保護以防的疾病、給予DNA的量、給藥途徑、所選擇的佐劑化合物的效力和劑量以及對於獸醫或開業醫生顯而易見的其它因素而大大不同。
這裡詳述的佐劑化合物可以相似地經由不同的給藥途徑給予，例如，經由口腔、鼻、肺、肌內、皮下、皮內或局部途徑。這種給予可以在給予DNA序列之前約14天至之後約14天進行，優選在給予DNA序列之前約7天至之後約7天進行，更優選在給予DNA序列之前約24小時至之後24小時進行，而且特別優選是基本上與給予DNA序列同時進行。「基本上同時」的意思是優選在給予DNA序列的同時給予所述化合物，或者如果不是這樣，則至少在給予DNA序列的前後幾小時內進行。在最優選的治療方案中，基本上在給予DNA序列的同時給予所述化合物，然後在給予DNA序列之後至多14天內大約天天重複給予，優選初始給予之後3天內天天進行。明顯地，按照上面提到的變量類型，該方案可根據需要而改變。根據這些變量，再次給予的劑量也將很不一樣，但是可以如在約0.1mg/kg至約100mg/kg的範圍內變動，其中「每公斤」是指相關的哺乳動物的體重。最好在每次隨後的給予或加強給予DNA序列時重複這種佐劑化合物的給予。最優選地，所述給予劑量在約0.1mg/kg至約10mg/kg之間，最好在約1mg/kg至約5mg/kg之間。
雖然所述佐劑化合物可以以原化學狀態給予，但最好以藥用組合物的形式給予。這就是說，所述化合物最好與一種或多種藥學上或獸醫學上可接受的載體以及任選的其它治療組分結合。所述載體必須是「可接受的」，它的意思是可與製劑的其它組分相容，且對其接受者無害。所述製劑的特性根據所要用的給藥途徑而自然地改變，且可以通過製藥領域中眾所周知的方法製備。所有方法都包括將本發明的化合物(所述佐劑化合物)和合適的一種載體或多種載體結合在一起。一般地說，通過均勻地且緊密地將所述化合物與液體載體或細碎的固體載體結合在一起，或與這兩者結合在一起，然後，若有必要，使製品成形為所要的製劑。適用於口服給予的本發明的製劑的存在形式可以為分離的單位如膠囊、扁囊劑或片劑，它們都包含了預定量的活性組分；粉劑或顆粒劑；水性液體或非水液體中的溶液或懸浮液；或水包油液體乳液或油包水乳液。所述活性組分也可以大丸劑、幹糖藥劑或糊劑存在。
片劑可以通過壓制或模製，任選含有一種或多種附加組分製成。可以通過在合適的機器中將任選與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、潤滑、表面活性劑或分配劑混合的自由流動形式如粉劑或顆粒劑的所述活性組分壓片，而製備壓制的片劑。可以通過在合適的機器中模製用惰性液體稀釋劑潤溼的粉狀化合物製備模製片劑。
所述片劑可以任選地包衣或刻痕並配製以便提供緩慢釋放或控制釋放所述活性組分。
用於經由如肌內、腹膜內或皮下給藥途徑注射的製劑包括水性和非水性無菌注射液，所述注射液可以包含抗氧化劑、緩衝劑、抑細菌劑和使所述製劑與接受者的血液等滲的溶質；和可以包含懸浮劑和增稠劑的水性和非水性無菌懸浮液。所述製劑可以存在於單劑量或多劑量容器中，如密封安瓿和密封管形瓶中，且可以在冷凍乾燥(凍幹)條件下儲存，只需要在緊接使用之前加入無菌液體載體如注射用水。臨時注射溶液和懸浮液可以由先前描述的類型的無菌粉劑、顆粒劑和片劑製備。提供適用於經由口腔含化或鼻腔肺給予的製劑，以使包含所述活性組分、直徑理想的在0.5至7微米範圍內的微粒，傳遞到接受者的支氣管樹中。該製劑可能為細碎的粉末形式，可以方便地或者存在於可刺穿的膠囊中，合適的如明膠膠囊，用於吸入設備；或者作為自噴射(self-propelling)製劑，包含活性組分、一種合適的液體推進劑和任選的其它組分如表面活性劑和/或固體稀釋劑。也可以使用其中所述活性組分以溶液或懸浮液的微滴形式分配的自噴射製劑。這種自噴射製劑與本領域所知道的類似，並可由建立的方法製備。它們合適地由具有所要的噴射特性的手動操作閥或自動操作閥提供；該閥最好是計量類型的，它的每次操作傳遞固定的體積，如50-100μL。
在另一個可能性中，所述活性組分可以是溶液的形式用於霧化器或噴霧器中，從而應用加速的氣流或超聲波攪拌以產生用於吸入的細小的霧微滴。
適用於鼻內給予的製劑一般包含形式相似於所述的用於肺部給予的製劑，儘管該製劑最好含有的微粒直徑在約10微米至約200微米範圍內，使能夠在鼻腔內滯留。可以通過適當採用合適粒徑的粉劑或選擇合適的閥來達到這一點。其它合適的製劑包括粗粉劑，微粒直徑在約20微米至約500微米，用於通過緊保持在鼻子之上的容器經過鼻腔快速吸入給予；和滴鼻劑在水性或油性溶液中包含約0.2-5％w/w的所述活性組分。
WO094/07479提供了包含按照本發明的所述佐劑化合物的合適製劑的例子，它的內容通過引用全部包括在本文中。
在本發明的優選實施方案中，包含編碼所述抗原肽的DNA序列的所述載體可以在與所述佐劑化合物相同的製劑中給予。在特別優選的實施方案中，以適用於基因槍給予的形式製備所述佐劑化合物，且基本上與給予所述DNA序列的同時經所述途徑給予。為製備適合於使用這種方法的製劑，必須將所述佐劑化合物凍幹並附著在如適用於基因槍給予的金珠粒上。
即使不配製在一起，在給予所述DNA序列的位點或該位點附近給予所述佐劑化合物也是合適的。
其它藥用製劑的詳細描述可以在(24)中找到，它的內容通過引用全部包括在本文中。
現在參考以下非限制性實施例，進一步描述本發明實施例1與肽免疫對比，DNA接種中常規佐劑的活性將表達卵清蛋白抗原的特異性受體的TCR-轉基因小鼠的淋巴樣細胞轉移到普通的同源小鼠中。然後用含或不含佐劑的Ova肽皮下免疫這些小鼠。三天之後，取出局部淋巴結細胞，並通過將含氚標記胸苷摻入DNA中的方法測定它們對卵清肽蛋白的增殖應答。這提供了對體內發生的對免疫應答的特異性T-細胞誘發程度的測定。與模擬免疫(●)對比，用單獨的Ova肽免疫(○)導致顯著但水平低的T-細胞誘發。細菌脂多糖(LPS)(△)、完全弗氏佐劑(CFA)(□)和卡介菌(HK-BCG)()都提供了顯著的應答增強。在缺少免疫抗原的情況下，給予細菌脂多糖(LPS)(▲)、完全弗氏佐劑(CFA)(■)和卡介菌(HK-BCG)()，對隨後Ova肽應答而增殖的影響最小。
將表達卵清蛋白抗原的特異性受體的TCR-轉基因小鼠的淋巴樣細胞轉移到普通的同源小鼠中。然後用質粒DNA(pVACl)或編碼卵清蛋白(pVACl.0va)的質粒DNA構建物皮下免疫這些小鼠，且皮下給予或不給予佐劑。三天之後，取出局部淋巴結細胞，並通過摻入氚標記胸苷到DNA中的方法測定它們對Ova肽的增殖應答。這提供了體內發生的對免疫應答的特異性T-細胞誘發程度的測定。用完全弗氏佐劑中的Ova肽免疫對照組而產生基本上的T-細胞誘發(◆)。與用空載體(○)免疫對比，用pVAl.Ova(△)的DNA免疫產生顯著的T-細胞誘發。然而，與常規肽免疫對比，沒有一種佐劑能夠增強這種對DNA免疫的應答。LPS(▲)、熱殺傷單核細胞增生利斯特氏菌(HKLM)()、GM-CSF(◇)和完全弗氏佐劑(CFA)()都不能增強對DNA接種的應答。[採用HKLM為佐劑，用空載體對照可以見到反常的高應答]。
實施例2妥卡雷瑣增強抗原特異性抗體的產生分析妥卡雷瑣對用編碼分枝桿菌熱激蛋白65(M.hsp65)抗原的質粒DNA免疫的影響，並將妥卡雷瑣的影響與表達細胞因子GM-CSF和IFNγ的質粒的影響比較。
用20μg的質粒(p3)肌內(i.m.)免疫各組各組小鼠。可以從p3M.65免疫的小鼠的血清中檢測到顯著量的針對M＞hsp65的抗體，但在用p3免疫的小鼠中沒有檢測到(圖3a)。當在皮下給予M.hsp質粒9p3M.65，T)的同時皮下給予1mg的妥卡雷瑣時抗體效價明顯增加。與此對比，在用對照質粒和妥卡雷瑣(p3，T)免疫的小鼠中沒有檢測到特異性抗體應答增加，排除了因為與妥卡雷瑣給予相關的高程度免疫增強而引起的非特異性交叉反應性抗體普通增加導致所觀察的效應的可能性，(圖3a)。
我們也在同樣實驗中對比妥卡雷瑣的影響和注射表達細胞因子GM-CSF和IFNγ的質粒的影響。p3M.65質粒單獨給予或與GM-CSF表達質粒(p3M.65，G)、IFNγ表達質粒(p3M.65，γ)或GM-CSF和IFNγ表達質粒(p3M.65，Gγ)的混合物等摩爾結合給予。與p3M65對比，當免疫包含GM-CSF質粒時，抗-M.hsp65效價明顯增加。與GM-CSF質粒對M.hsp65特異性抗體應答的加強影響對比，跟先前公布的數據一致，當包含IFNγ表達質粒時抗體應答不明顯。兩種細胞因子的結合好象對抗GM-CSF質粒的增強作用，減弱應答至基本相似於當只用p3M.65免疫時的水平(沒有列出數據)。總起來說，這些結果說明，妥卡雷瑣具有增強由M.hsp65抗原基因免疫誘發的抗體應答的有效能力，與GM-CSF質粒的作用相當。
我們已經分析了同種型抗-M.hsp65抗體。p3M.65免疫的小鼠產生顯著量的IgG2a抗-M.hsp65抗體。這種效價在接受妥卡雷瑣的小鼠中顯著(P＝0.003)增加(圖3b)。這種Th1相關抗體應答的明顯增強是用p3M.65，G免疫時特有的，p3M.65γ或p3M.65，Gγ沒有這樣的效應。在免疫中包括IFNγ表達質粒沒有增強IgG2a抗-M.hsp65抗體應答。
在接受p3M.65，G、p3M.65γ、p3M.65，Gγ的小鼠中沒有檢測到顯著量的Th2相關的抗-M.hsp65 IgG1抗體應答。然而，與p3免疫的小鼠對比，在接受p3M.65，T的小鼠中誘發顯著量(p＝0.003)的這種應答，而在pM.65G免疫的小鼠中誘發的程度較小(p＝0.027)(圖3c)。
把我們的數據收集在一起證明作為基因免疫的結果，特異性抗體應答的顯著增強可以通過給予妥卡雷瑣達到。儘管這種給予強烈地增強Th1相關應答，它的確也誘發Th2相關的抗體應答。這是第一次報導妥卡雷瑣增強特異性抗體應答的生成物。
實施例3妥卡雷瑣增強特異性T-細胞增殖應答。
接下來我們分析妥卡雷瑣對通過用表達EB病毒(EBV)核抗原4號(EBNA4)的pDNA接種誘發的T細胞增殖應答的影響。用對照質粒p3或用EBNA-4表達質粒(E4)或用加上妥卡雷瑣處理的E4(E4，T)肌內免疫各組小鼠。在用同源EBNA-4轉染的癌系(S6C-E4)刺激時，從E4免疫小鼠的脾細胞培養物中檢測出最小增殖應答。有趣的是，在用E4肌內免疫並用妥卡雷瑣皮下處理的小鼠的脾細胞中獲得對S6C-E4的強烈得多的增殖應答(圖4)。EBNA-4牛痘感染刺激物(S6C-VE4)同樣誘發了比如先前報導的經E4免疫和E4，T免疫的小鼠的脾細胞中的S6C-E4更高的增殖應答。採用以下公式以模擬指數(SI)計算增殖SI＝對應S6C-EBNA-4轉染子(EBNA-4牛痘感染的)的脾細胞增殖/對應S6C-gpt(TK-牛痘感染的)對照感染子的脾細胞增殖。再一次，這種應答是抗原調節的(focus)，因為在分別對應S6C-gpt或對照TK-牛痘感染的S6c-gptV的S6C-E4或EBNA-4牛痘感染細胞的對照免疫小鼠(p3)的脾細胞中沒有可檢測到的增殖(圖4)。
實施例4妥卡雷瑣顯著增強Th-1細胞因子的產生pDNA免疫與以包括IFNγ在內的Th1細胞因子的產生為特徵的佔優勢的Th-1應答有關。為評價妥卡雷瑣增強Th-1應答的能力，用p3、E4或E4且同時皮下給予妥卡雷瑣來肌內免疫小鼠。與p3免疫小鼠的對照脾細胞的產生或對S6C-gpt應答的產生相比，用E4免疫的小鼠產生的IFNγ如果有也是很少的，僅對用S6C-E4特異性刺激應答而產生IFNγ。有趣的是，用e4免疫並用妥卡雷瑣處理的小鼠的脾細胞對用S6C-E4特異性體外刺激應答產生最高量的IFNγ，而對用S6C-gpt的對照刺激不應答。我們在任何組別的脾細胞培養物中不能檢測對特異性刺激應答的Th2細胞因子IL-4的產生(數據沒有列出)。因此，我們推斷，與pDNA接種一起給予妥卡雷瑣是促進特異性Th1佔優勢的細胞因子應答的很有效的方法。
通過妥卡雷瑣加強特異性CTL應答為了研究妥卡雷瑣對通過pDNA接種誘發的特異性細胞毒性T-細胞(CTL)應答的影響，我們用p3M.65、p3M.65γ或p3M.65，T免疫HLAA2轉基因小鼠兩次。在最後一次免疫的兩星期之後，用從分枝桿菌hsp65分子衍生的HLA-A2限制肽表位刺激免疫小鼠脾細胞一次，測試培養物對抗用或不用所述相關肽或對照HLA A2限制流感肽脈衝處理的HLA-A2/kb Jurkal(Jk-A2/kbds)細胞系的特異性CTL活性。用p3M.65和妥卡雷瑣(p3M.65，T)免疫的小鼠脾細胞發展了高的對抗用相關M.hsp65表位脈衝處理的目標細胞的CLT活性，而它們對抗用或不用對照流感肽脈衝處理的Jk-A2/kb細胞的裂解活性低得多(圖6)。相反，用p3M.65而沒有任何共同刺激劑免疫的小鼠的脾細胞幾乎完全沒有活性。與從只用p3M.65免疫的小鼠得來的脾細胞的活性對比，IFNγ質粒(p3M.65γ)與p3M.65疫苗一起包括增強了脾細胞的CTL活性，但這種細胞毒性只佔用妥卡雷瑣處理的小鼠脾細胞所觀測到的30-50％。因此我們推斷當與pDNA接種一起給予時，妥卡雷瑣是增強特異性CTL產生的很有效的藥劑。
實施例6妥卡雷瑣在用表達EB病毒核抗原4(EBNA-4)的質粒免疫之後，對體內抑制腫瘤生長物的影響EB病毒已經牽連一些癌症。我們分析了妥卡雷瑣對用表達EBNA-4的質粒進行pDNA接種導致的體內腫瘤生成物抑制的影響(圖7)。或者用40μg的對照模擬質粒pCDNA3(P3)、表達EBNA-4的質粒(E4)經肌內注射免疫小鼠，或者用40μg表達EBNA-4的質粒經肌內注射免疫小鼠，接著在1、2、3和4天之後皮下給予妥卡雷瑣200μg-即每隻小鼠總共給予800μg妥卡雷瑣(E4T)。這一免疫方案在初始免疫之後一個月和兩個月重複。在最後一次免疫的兩星期之後，用104S6C-E4腫瘤細胞皮下攻擊小鼠。當腫瘤直徑達到20mm時處死小鼠。圖7表明了妥卡雷瑣顯著增強了EBNA-4抑制腫瘤生成物的能力。
實施例7妥卡雷瑣在小鼠中對通過基因槍免疫誘發的CTL細胞因子應答的影響。
細胞毒性T淋巴細胞(CTL)產生幹擾素γ(IFNγ)是在消除病毒感染中重要的細胞介導的免疫應答的主要度量。
採用流感NP抗原(圖8a)用編碼A/PR8/34流感病毒核蛋白的DNA質粒(pVACl.PR)通過基因槍以兩個劑量水平(10ng和100ng)或用空載體通過基因槍免疫C57BL/6小鼠。免疫14天之後收集脾臟，並且用NP肽(10μM)體外重刺激脾細胞，只通過CD8細胞毒性T細胞與重組人IL-2(50ng/ml)一起來識別。通過測定產生細胞因子的個別細胞的數目的ELISPOT檢定法，檢測每10e6個脾細胞的IFNγ陽性細胞(平均±S.E.M.；n＝3隻小鼠)。在免疫時或者在DNA表皮內接種的位點皮下(s.c.)(2×1mg)給予小鼠妥卡雷瑣，或者通過經口管飼法(15mg/kg)從免疫當天開始的5天內天天給予妥卡雷瑣。皮下給予妥卡雷瑣對免疫產生小的但顯著的CTL細胞因子應答的增強，而經口給予的妥卡雷瑣產生雙倍應答。
採用EB病毒核抗原4(EBNA-4)(圖8b)用編碼EBNA-4的DNA質粒(E4)或空載體(P3)通過基因槍免疫小鼠。每次注射給予2μg DNA，每隻小鼠給予兩次不重疊的注射。在第1、2、3和4天皮下給予小鼠妥卡雷瑣(E4T)200μg。小鼠兩個月之後用同樣的免疫和處理方案加強。兩星期後，用表達EBNA-4抗原的腫瘤細胞(S6C-E4)或用抗原陰性腫瘤細胞(S6C-gpt)體外刺激脾細胞72小時。然後收集上清夜液，並通過特異性ELISA檢測IFNγ效價。妥卡雷瑣顯著地增強IFNγ的產生。
實施例8妥卡雷瑣對通過基因槍DNA免疫誘發的裂解性CTL應答的影響CD8CTL裂解目標細胞是通過免疫系統消除病毒感染的主要機制。可以採用攜帶病毒肽並用銪標記的目標細胞檢測裂解性CTL。
皮下給予妥卡雷瑣(圖9a)用編碼流感病毒核蛋白(NP)的DNA質粒(10ng)免疫C57BI/6小鼠，皮下(sc)給予或不給予妥卡雷瑣。在免疫之後14天處死小鼠，並用由病毒(A/PR8/34)脈衝處理的經輻射的脾細胞體外重刺激(5天)。採用標準銪釋放技術測定用H-2Db-限制NP肽脈衝處理的MHC-匹配的目標細胞(EL4細胞)的特異性裂解。對於所有對照非特異性裂解小於15％。在表皮內基因槍免疫位點皮下給予妥卡雷瑣。
口腔給予妥卡雷瑣(圖9b)用編碼流感病毒核蛋白(NP)的質粒DNA(10ng)免疫C57B1/6小鼠，經口給予或不給予妥卡雷瑣。免疫14天之後處死小鼠，用由病毒(A/PR8/34)脈衝處理的經輻射的脾細胞體外重刺激(5天)。採用標準銪釋放技術測定用H-2Db-限制NP肽脈衝處理的EL4細胞的特異性裂解。對於所有對照非特異性裂解小於15％。從免疫當天開始5天內天天通過經口管飼法給予妥卡雷瑣(15mg/kg)。
實驗結果討論在這裡，我們介紹了簡單而很有效的增強pDNA免疫的方法，所述方法基於通過形成希夫鹼為T細胞提供共同刺激信號。我們的幾個發現說明這個方法能夠迴避pDNA接種導致的通常遇到的效率限制問題。這些包括觀察到在大多數免疫動物中誘發特異性免疫應答，而採用編碼細胞因子的載體的方法在那方面的效率小得多(數據沒有列出)。與單獨給予pDNA接種或結合表達細胞因子基因的pDNA給予pDNA接種對比，所述增強也與所述應答的大量增加有關，並且觀察到特異性抗體效價增加和增殖性及細胞毒性T細胞應答增強。
誘發充分的免疫應答需要免疫系統的多種組分的參與，而pDNA免疫因誘發體液應答和細胞應答(包括CTL應答)而滿足這一需要，發現妥卡雷瑣增強了所有這些應答。此外，儘管增強pDNA免疫的其它模式將導致偏T細胞免疫應答的抗體，但共同注射妥卡雷瑣的結果是全面增強包括增強Th1和Th2相關抗體應答的的兩種形式的特異性免疫。因此可以考慮在基於細胞的免疫應答或基於抗體的免疫應答對宿主有益的情況下將pDNA接種與妥卡雷瑣結合。
也通過IgG∶IgM最高比，與其它免疫方法對比進行檢測，特異性抗體產物的產生顯著增加(數據沒有列出)。這指出了在生產單克隆抗體時採用這種方法的潛在優勢。
通過增殖、細胞因子產生和細胞毒性檢測，妥卡雷瑣增強pDNA誘發的對hsp65、流感NP和EBNA-4的特異性T細胞應答的顯著能力是特別重要的。抗分枝桿菌感染的保護性免疫依賴於能夠分泌巨噬細胞活化細胞因子(包括IFNγ)的CD4+T細胞和能夠消滅感染的巨噬細胞的細胞毒性CD8+細胞。對EBV感染的保護性免疫依賴於CD4+和CD8+T細胞應答，且已經證明抵抗移植後移植性淋巴組織增生性疾病的基於T細胞的免疫治療是有效的。因為結合妥卡雷瑣的pDNA接種有利於CD4和CD8介導的應答，如本文所示，這是用於對抗細胞內細菌和病毒的新型T細胞疫苗的有吸引力的接種方式。
妥卡雷瑣是已經用於臨床試驗的在化學上充分確定的分子。這應當在基於pDNA的接種方法中，簡化這種藥劑的批准程序。而且，由於表明它是系統性活性的，不需要局部共同給予pDNA和妥卡雷瑣，如本文通過結合肌內pDNA免疫和皮下注射妥卡雷瑣所表明的。可以證明將皮內「彈道」傳遞pDNA疫苗接種與經口給予妥卡雷瑣結合是很有吸引力的免疫方法，特別是在因為伴隨注射的血液傳播感染或培養的小斑(stigmata)的危險而應避免腸胃外免疫的情況下。
總之，在這裡我們提出數據第一次表明採用希夫鹼形成的藥劑作為增強由pDNA接種誘發的特異性免疫應答的簡單有效的方法。這些數據可用於臨床和工業設置。
實驗方法質粒構建和試驗將所有的基因都插入到pCDNA3載體(Invitrogen BV，NV Leek，荷蘭)中。採用Eco RI和Sal I從質粒pRIB1300(由Dr.R.v d Zee誠懇地提供，Utrecht大學，Utrecht，荷蘭)切下牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)hsp65 cDNA，並將其亞克隆到pCDNA3 MCS的Eco RI和Xho I位點中。用限制性作圖確定所得到的質粒(p3M.65)的基因的識別和定向。在通過採用Lipofectine(Life technologies，Paisley，蘇格蘭)經脂轉染法用p3M.65轉染的COS-7溶胞產物中檢測hsp蛋白的表達和產生。溶胞產物在12％的SDS-PAGE凝膠中電泳，之後在PVDF膜(BioRad，CA)上進行蛋白質印跡，並用抗分枝桿菌hsp65特異性單克隆抗體DC-16(由Juraj Ivanyi博士友好地提供，倫敦，英國)進行免疫檢測。然後用結合山羊抗-小鼠Ig的二級鹼性磷酸酶(Southern Biotech，AL)檢測，採用wester藍色底物系統(Promega，Madison，Wisconsin)進行顯色。
ELISA方法收集免疫小鼠的血清，並如較早前描述的那樣用於直接ELISA。重組分枝桿菌hsp65(由R.v d Zee博士友好地提供)以濃度為4μg/ml碳酸鹽緩衝液使用，於4℃下過夜包被96孔板(Msxisorp，Nunc，丹麥)。血清以1∶100稀釋液雙份加入，在4℃下溫育過夜。採用結合山羊抗-小鼠血清的IgG(小鼠IgM預吸附的)、IgG2a和IgG1特異性鹼性磷酸酶(Southern Biotech)檢測結合的抗體。
小鼠已經描述了用於本研究的HLA-A2*0201/Kb轉基因小鼠(由L.Sherman博士友好地提供，Scripps實驗室，San Diengo，Ca)。這些小鼠表達嵌合的MHC II類I分子，所述分子的α1和α2結構域是HLA-A*0201分子的結構域，而α3跨膜結構域和細胞質結構域是小鼠H2 Kb分子的結構域。這種結構允許T細胞上的小鼠CD8分子的結合位點與嵌合分子的α3結構域相互作用。採用HLA-A*0201特異性FITC-結合的單克隆抗體(One Lambda，Ca)確認HLA-A*0201/Kb的表面表達並採用FACSCAN(Becton DickinsonCo.，Mountain View，Ca)通過流動細胞計量術進行評價。已經描述了C575BI/6小鼠。這些小鼠具有確定的流感病毒核蛋白CTL表位。從Jackson(Jackson實驗室，Bar Harbor，Main)購買ACA(H-2f)小鼠。在Karonlinska研究所MTC動物房中在我們的SP環境下繁殖並保持小鼠。
免疫通過肌內免疫完成基因免疫。從採用Qiagen質粒giga試劑盒(Qiagen GmbH，Hilden，德國)的LB氨苄青黴素大腸桿菌培養物中製備質粒。採用分光光度計和分析型凝膠電泳確定濃度和純度。按照Davis等人的方法，採用20μg pDNA/100ul/肌肉的對照質粒(P3)、EBNA-4表達質粒附加對照質粒p3(E4)、p3M.65表達質粒附加對照質粒p3(p3M.65)、p3M.65附加GM-CSF表達質粒(p3M.65G)或p3M.65附加IFNγ表達質粒(9p3M.65γ)在可再生脛骨前肌注射小鼠。以等摩爾量混合質粒。或者按照Fynan等人(27)的方法，採用10ng或100ng的編碼A/PR8/34流感病毒核蛋白的DNA質粒(pVACl.PR)或空載體、或2ng的編碼EBNA-4的質粒(E4)或對照載體p3，通過基因槍進行免疫。妥卡雷瑣處理的小鼠用E4、p3M.65或pVACl.PR(E4，T、p3M.65，t和pVACl.NP PR(Tuc sc)分別地免疫，或者同時每次皮下注射妥卡雷瑣1mg，或者在4天中每隻小鼠每天皮下注射200μg的妥卡雷瑣。小鼠在誘發兩星期後以同樣劑量接受加強。
細胞系Jurkat A*0201/kb(Jk-A2/kb)是一種用HLA-A80201/Kb嵌合基因穩定轉染的人類T細胞白血病0HLA-A*0201陰性細胞系(由W.M.Kast博士友好地提供，Loyola大學，Maywood III)。從源於ACA小鼠中的自發的乳腺癌中得到S6C細胞系。S6C-gpt和S6C-E4分別是對照質粒和EBNA-4轉染子(由George Klein博士友好地提供，MTC，Karolinska研究所，斯德哥爾摩)。通過體內在同源ACA小鼠中和體外在補充以10％的牛胎血清(FBS)、100U/ml的青黴素、100μg/ml的鏈黴素、50μM 2-巰基乙醇和2mM L-穀氨醯胺的RPMI 1640中傳代維持所有的細胞系。
增殖試驗從免疫的小鼠中收穫脾細胞。製備單細胞懸浮液，並且將細胞在補充以10％的FBS和L-glu和抗生素的IMDM中重懸浮。通過每毫升混合3×106個腫瘤細胞製備脾細胞和腫瘤細胞的混合培養物(MSTC)。培養物在7.5％的CO2中於37℃下培養5天。將1μCi氚標記的胸苷加入到U-型底96孔板的每個孔中。細胞在與上面一樣的條件下培養18小時並收穫，並採用β讀板儀(Wallac，Turku，芬蘭)測定氚標記的胸苷的摻入量。所述試驗以一式三份進行，並採用公式計算刺激指數(SI)SI＝對應S6C-EBNA-4轉染子(或EBNA-4牛痘感染的)的脾細胞增殖/對應S6C-gpt(或TK-牛痘感染的)對照轉染子的脾細胞增殖。
細胞因子分析通過每毫升混合3×106個脾細胞與3×105個腫瘤細胞製備脾細胞(來自E4免疫的小鼠)和腫瘤細胞的混合培養物(MSTC)。在培養72小時後收集上清夜，並採用市場上可購得的用於小鼠細胞因子ELISA的匹配抗體對(Immunokontact，Bioggio，瑞士)，按照廠家說明測試γ幹擾素(IFNγ)和IL-4的存在。
特異性CTL系的產生和細胞毒性分析如下在12孔板中製備肽特異性CTL系。將來自免疫或對照非免疫小鼠的脾細胞以每孔6×106個接種，並與3×106個肽脈衝處理(5μg/ml的P4)的同源脾細胞共同培養。6-8天之後，通過如下的51Cr釋放檢測細胞介導的細胞毒性。1百萬個目標細胞在有200μCi51Cr鉻酸鈉(Amersham，英國)的情況下培養1小時，在完全培養基中清洗3次並以105個細胞/ml在有或缺少10μg有關(P4)或無關(流感NP 58-66)肽的情況下在完全培養基中重懸浮。通過在V型底96孔板中以最終體積200μl一式三份以不同的效應物與目標之比培養5×103個目標細胞。細胞在37℃培養4小時，之後收穫上清夜並用於採用以下公式確定特異性裂解特異性釋放百分率＝100×(實驗釋放-自發釋放)/(最大釋放-自發釋放)。
應當理解，僅通過實施例的方法描述了本發明，我們認為，根據本文的公開內容對技術人員顯而易見的各種修改和/或改變也屬於所附權利要求書所確定的本發明的範圍和精神內。
參考文獻1.Donnelly J.等人，「DNA疫苗」Annu.Rev.Immunol.1997，15617-48。
2.Donnelly，J.J.，Friedman A.，Martinez D.，Montogomery，D.L.，Shiver，J，W.，Motzel，S.L.，Ulmer，J.B.，Liu，M.A.1995.原型DNA疫苗增強的抗流感病毒抗原遺傳漂變保護的臨床前效力。Nature Med.1583-87。
3.Lu，S.，Arthos，J.，Montefiori，D.C.，Yasutomi，Y.，Manson，K，.Mustafa，F.，Johnson，E.，Santoro，J.C.Wissink，J.，Mullins，J，I.，Haynes，J.R.，Letvin，N，L.，Wyand，M.，Robinson，H.L.1996.在獼猴中試驗猿猴免疫缺陷病毒DNA疫苗。J.Virol.703978-91。
4.Fuller，D.H.Haynes，J.R.，1994.接受基於DNA糖蛋白120疫苗的小鼠中1型HIV糖蛋白120-特異性細胞毒性細胞免疫應答和體液免疫應答的定性增進。AIDS Res.Hum.Retrovir.101433-41。
5.Krieg，A.M.，Yi，A-K.，Matson，S.，Waldschmidt，T.J.，Bishop.G.A.，Teasdale，R.，Koretsky，G.A.Klinman，D.M.，1995.細菌DNA中的CpG基元誘發直接B-細胞活化。Nature 374546-48。
6.Messina，J.P.，Gilkeson，G.S.，Pisetsky，D.S.，1991.通過細菌DNA體外刺激鼠淋巴細胞增殖。J.Immunol.1471759-64。
7.Yamamoto，S.，Yamamoto，T.，Kataoka，T.，Kuramoto，E.，Yano，O.，Tokunaga，T.，1992.誘發TNF和增強TNF-介導的天然殺傷活性需要在合成的寡核苷酸中的單一迴文序列。J.Immunol.1484072-76。
8.Tang，D.C.，Devit，M.，Johnston，S.A.，1992.基因免疫是誘發免疫應答的簡單方法。Nature 356152-54。
9.Yankauckas，M.A.，Morrow，J.E.，Parker S.E.，Abai，A.，Rhodes，G.H.，Dwarki，V.J.，Gromkowski，S.H.1993.通過肌內注射包含NP基因的質粒DNA誘髮長期抗核蛋白細胞免疫和體液免疫。DNACell Riol 12771-76。
10.Wang，B.，Boyer，J.，Srikantan，V.，Coney，L.，Carrano，R.，Phan，C.，Merva，M.，Dang，K.，Agadjanyan，M.，Gilbert L.，Ugen，K.E.，Williamson，W.V.，Weiner，D.B.1993.DNA接種在小鼠和非人類靈長目動物中誘發抗1型人類免疫缺陷病毒的中和免疫應答。DNA CellBiol.12799-805.
11.Cox，G.，Zamb，T.J.，Babiuk，L.A.1993.注射質粒DNA的小鼠和牛中牛皰疹病毒-1-免疫應答。J.Virol.675664-67。
12.Davis，H.L.，Michel，M.L.，Whalen，R.G.，1993.基於DNA的免疫誘發B肝表面抗原的連續分泌和高水平的循環抗體。Human Mol.Genet.21847-51。
13.Ulmer，J.B.，Donnelly，J.J.Parker，S.E.，Rhodes，G.H，Felgner，P.L.，Dwarki，V.J.，Gromokowski，S.H.，Deck，R.R.，Dewitt，C.M.，Friedman，A.，Hawe，L.A.，Leander，K.R.，Martinez，D.，Perry，H.C.，Shiver，J.W.，Montgomery，D.L.，Liu，M.A.，1993.通過注射編碼病毒蛋白的DNA提供抗流感的異源保護。Science 2591745-49.
14.Kuhober，A.，Pudollek，H-P，Reifenberg，K.，Chisari，F.V.，Schlicht，H-J，Reimann，J.，Schirmbeck，R.，1996.在H-2b小鼠中DNA免疫誘發抗B肝核心抗原的抗體和細胞毒性T細胞應答。J.Immunol.1563687-95.
15.Okuda，K.，Bukawa，H.，Hamajima，K.，Kawamoto，S.，Sekigawa，K.I.，Yamada，Y.，Tanaka，S.I.，Ishii，N，Aoki，I.，Nakamura，M.，Yamamoto，H.，Cullen，BR.，Fukushima，J.，1995.在直接注射編碼1型HIV env和rev基因產物的DNA之後誘發強有力的體液和細胞介導的免疫應答。Aids Res.Human Retrovir.11933-43。
16.Liu，M.A.，Davies，M.E.，Yasutomi，Y.，Perry，HC.，Letvin，N.L.，Shiver，J.W.，1994.通過DNA疫苗產生的抗HIV的免疫應答。Retroviruses of Human AIDS and Related Animal Diseases，M.Girard，B.Dodet編輯，第197-200頁.LyonFond.Mercel-Merieux。
17.Shiver，J.W.，Perry，H.C.，Davies，M.E.，Freed，D.C.，Liu，M.A.，1995.在HIV多核苷酸接種後的細胞毒性T-淋巴細胞和輔助T細胞應答。Ann.N.Y.Acad.Sic.772198-208。
18.Xiang，Z.Q.，Ertl，H.，1995.通過與表達細胞因子的質粒共同接種操縱質粒編碼的病毒抗原的免疫應答。Immunity 2129-35。
19.Conry，R.M.，Widera，G.，Lobuglio，A.F.，Fuller，J.T.，Moore，S.E.，Barlow，D.L.，Turner，J.，Curiel，D.T.，1996.增強多核苷酸免疫的選擇的策略。Gene Therapy 367-74。
20.Tascon，R.，Stavropoulos，E.，Colston，M.J.，Lowrie，D.B.1996.多核苷酸接種誘發顯著的抗分枝桿菌的保護性免疫應答。Vaccines 96，F.Brown，R.M.Chanock，M.S.Ginsbert，R.A.Lerner編輯，第45-49頁.Cold Spring Harbor，NYCold Spring Harbor Lab.Press。
21.Maniatis，T.，Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，「分子克隆實驗室手冊」，Cold Spring Harbour Laboratory，Cold Spring Harbour Press，第1-3卷，第二版，1989。
22.Rhodes等人，「用共同刺激性希夫鹼生成藥物治療性增強免疫系統，」Nature，377，第71-75頁，1995。
23. Brohm W等人，「誘發小鼠體液和細胞免疫應答的質粒DNA接種途徑，」Vaccine，第16卷，第9/10期，第949-954頁，1998。
24.Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCompany，Easton，Pennysylvania(1985)。
25.Vordermeier，H.M.，Coombs，A.G.A.，Jenkins，P.McGee，J.P.，O』Haga，D.T.Davis，S.S.和Singh，M.用於結核病疫苗的合成的傳遞系統捕捉於可生物降解的PLG微粒中的結核分枝桿菌38kDa蛋白的免疫評價。Vaccine 131576-1582 1995。
26.Haynes JR.McCabe DE.Swain WF.Wedera G.Fuller JT.微粒介導的核酸免疫。Journal of Biotechnology.4437-42，1996。
27.Fynan，E.F.，Webster，R.G.，Fuller，D.H.，Haynes J.T.，Santoro，J.C.，和Rohinson，H.L.，(1993)DNA疫苗通過胃腸外、黏膜和基因槍接種的保護性免疫。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9011478。
權利要求
1.接種哺乳動物以防疾病狀態的方法，包括給予所述哺乳動物在合適載體中的編碼與所述疾病狀態相關的抗原肽的核苷酸序列；另外給予所述哺乳動物增強由抗原肽激發的體液和細胞免疫應答的化合物，所述化合物選自4-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊醯胺；N，N-二乙基5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊醯胺；N-異丙基5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊醯胺；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊酸乙酯；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊腈；(±)-5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)-2-甲基戊酸；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)-2，2-二甲基戊酸；3-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)甲基苯甲酸甲酯；3-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)甲基苯甲酸；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊酸苄酯；5-[4-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)-N-丁基]四唑；7-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)庚酸；5-(2-甲醯-3-羥基-4-正丙氧基苯氧基)戊酸；5-(4，6-二氯-2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊酸；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)-N-甲基磺醯戊醯胺；4-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸乙酯；5-(4-氯-2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊酸；5-(3-乙醯氨基-2-甲醯苯氧基)戊酸；氨基胍；4-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)丁酸；6-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)己酸；4-(3-乙醯氨基-2-甲醯苯氧甲基)苯甲酸乙酯；4-(3-乙醯氨基-2-甲醯苯氧甲基)苯甲酸；2-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸；5-[4-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯基]四唑；5-(2-甲醯-3-羥基-4-甲氧基苯氧基)戊酸；3-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)丙腈；4-羥基苯乙醛；苯乙醛；4-甲氧基苯乙醛；1-羥基-2-苯基丙烷；3-苯基丙醛(proponionaldeyde)；4-硝基苯甲醛；4-甲醯苯甲酸甲酯；4-氯苯甲醛；4-甲氧基苯甲醛；4-甲基苯甲醛；8，10-二氧代十一酸；4，6-二氧代庚酸；戊二酮；5-甲氧基-1-四氫萘酮；6-甲氧基-1-四氫萘酮；7-甲氧基-1-四氫萘酮；2-四氫萘酮；3-羥基-1-(4-甲氧基苯基)-3-甲基-2-丁酮；2』，4』-二羥基-2-(4-甲氧基苯基)乙醯苯；2-羥基-1-(4-甲氧基苯基)-戊2烯-4酮；柚配基4』，5，6-三羥基黃酮(flavonone)；4』-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)乙醯苯；6，7-二羥基香豆素；7-甲氧基-2-四氫萘酮；6，7-二甲氧基-2-四氫萘酮；6-羥基-4-甲基香豆素；尿黑酸γ-內酯；6-羥基-1，2-萘醌；8-甲氧基-2-四氫萘酮；及其合適的生理可接受鹽。
2.按照權利要求1的方法，其中在給予所述核苷酸序列之前約14天至之後14天給予所述化合物1至7次。
3.按照權利要求1的方法，其中在給予所述核苷酸序列之前約7天至之後約7天給予所述化合物1至7次。
4.按照權利要求1的方法，其中在給予所述核苷酸序列之前約24小時至之後約24小時給予所述化合物。
5.按照權利要求1的方法，其中基本上與給予所述核苷酸序列的同時給予所述化合物。
6.按照權利要求1至5的任一項的方法，所述方法以約1天至約18個月的間隔重複1至4次。
7.按照權利要求1至6的任一項的方法，其中經由口、肺、肌內、皮下或皮內途徑給予所述核苷酸序列。
8.按照權利要求7的方法，其中採用基因槍傳遞技術給予所述核苷酸序列。
9.按照權利要求1至8的任一項的方法，其中經由口、鼻、肺、肌內、皮下、皮內或局部途徑給予所述化合物。
10.按照權利要求1至8的任一項的方法，其中採用基因槍傳遞技術給予所述化合物。
11.按照權利要求9或10的方法，其中每次以約0.1mg/kg至約100mg/kg的劑量給予所述化合物。
12.按照權利要求1至11的任一項的方法，其中所述哺乳動物是人類。
13.按照權利要求1至12的任一項的方法，其中所述化合物是4-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸。
14.包含核苷酸序列和化合物的疫苗組合物，所述核苷酸序列編碼與疾病狀態相關的抗原肽且在合適的載體中，所述化合物將增強哺乳動物中由所述抗原肽激發的體液和細胞免疫應答，所述化合物選自4-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊醯胺；N，N-二乙基5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊醯胺；N-異丙基5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊醯胺；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊酸乙酯；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊腈；(±)-5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)-2-甲基戊酸；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)-2，2-二甲基戊酸；3-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)甲基苯甲酸甲酯；3-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)甲基苯甲酸；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊酸苄酯；5-[4-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)-N-丁基]四唑；7-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)庚酸；5-(2-甲醯-3-羥基-4-正丙氧基苯氧基)戊酸；5-(4，6-二氯-2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊酸；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)-N-甲基磺醯戊醯胺；4-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸乙酯；5-(4-氯-2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊酸；5-(3-乙醯氨基-2-甲醯苯氧基)戊酸；氨基胍；4-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)丁酸；6-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)己酸；4-(3-乙醯氨基-2-甲醯苯氧甲基)苯甲酸乙酯；4-(3-乙醯氨基-2-甲醯苯氧甲基)苯甲酸；2-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸；5-[4-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯基]四唑；5-(2-甲醯-3-羥基-4-甲氧基苯氧基)戊酸；3-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)丙腈；4-羥基苯乙醛；苯乙醛；4-甲氧基苯乙醛；1-羥基-2-苯基丙烷；3-苯基丙醛；4-硝基苯甲醛；4-甲醯苯甲酸甲酯；4-氯苯甲醛；4-甲氧基苯甲醛；4-甲基苯甲醛；8，10-二氧代十一酸；4，6-二氧代庚酸；戊二酮；5-甲氧基-1-四氫萘酮；6-甲氧基-1-四氫萘酮；7-甲氧基-1-四氫萘酮；2-四氫萘酮；3-羥基-1-(4-甲氧基苯基)-3-甲基-2-丁酮；2』，4』-二羥基-2-(4-甲氧基苯基)乙醯苯；2-羥基-1-(4-甲氧基苯基)-戊2烯-4酮；柚配基4』，5，6-三羥基黃酮；4』-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)乙醯苯；6，7-二羥基香豆素；7-甲氧基-2-四氫萘酮；6，7-二甲氧基-2-四氫萘酮；6-羥基-4-甲基香豆素；尿黑酸γ-內酯；6-羥基-1，2-萘醌；8-甲氧基-2-四氫萘酮；那就是及其合適的生理可接受鹽。
15.按照權利要求14的所述疫苗組合物，它為適宜於經由口、鼻、肺、肌內、皮下和皮內途徑給予的形式。
16.按照權利要求14的所述疫苗化合物，它為適宜於採用基因槍傳遞技術給予的形式。
17.按照權利要求14至16的任一項的疫苗組合物，其中所述化合物是4-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸。
18.化合物在藥物生產中的用途，其中給予哺乳動物所述化合物增強由與疾病狀態相關的抗原肽激發的體液和細胞應答，給予所述哺乳動物編碼所述肽的核苷酸序列導致所述肽的表達；其中所述化合物選自4-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊醯胺；N，N-二乙基5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊醯胺；N-異丙基5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊醯胺；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊酸乙酯；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊腈；(±)-5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)-2-甲基戊酸；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)-2，2-二甲基戊酸；3-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)甲基苯甲酸甲酯；3-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)甲基苯甲酸；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊酸苄酯；5-[4-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)-N-丁基]四唑；7-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)庚酸；5-(2-甲醯-3-羥基-4-正丙氧基苯氧基)戊酸；5-(4，6-二氯-2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊酸；5-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)-N-甲基磺醯戊醯胺；4-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸乙酯；5-(4-氯-2-甲醯-3-羥基苯氧基)戊酸；5-(3-乙醯氨基-2-甲醯苯氧基)戊酸；氨基胍；4-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)丁酸；6-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)己酸；4-(3-乙醯氨基-2-甲醯苯氧甲基)苯甲酸乙酯；4-(3-乙醯氨基-2-甲醯苯氧甲基)苯甲酸；2-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸；5-[4-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯基]四唑；5-(2-甲醯-3-羥基-4-甲氧基苯氧基)戊酸；3-(2-甲醯-3-羥基苯氧基)丙腈；4-羥基苯乙醛；苯乙醛；4-甲氧基苯乙醛；1-羥基-2-苯基丙烷；3-苯基丙醛；4-硝基苯甲醛；4-甲醯苯甲酸甲酯；4-氯苯甲醛；4-甲氧基苯甲醛；4-甲基苯甲醛；8，10-二氧代十一酸；4，6-二氧代庚酸；戊二酮；5-甲氧基-1-四氫萘酮；6-甲氧基-1-四氫萘酮；7-甲氧基-1-四氫萘酮；2-四氫萘酮；3-羥基-1-(4-甲氧基苯基)-3-甲基-2-丁酮；2』，4』-二羥基-2-(4-甲氧基苯基)乙醯苯；2-羥基-1-(4-甲氧基苯基)-戊2烯-4酮；柚配基4』，5，6-三羥基黃酮；4』-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)乙醯苯；6，7-二羥基香豆素；7-甲氧基-2-四氫萘酮；6，7-二甲氧基-2-四氫萘酮；6-羥基-4-甲基香豆素；尿黑酸γ-內酯；6-羥基-1，2-萘醌；8-甲氧基-2-四氫萘酮；及其合適的生理可接受鹽。
19.按照權利要求18的用途，其中所述藥物為適宜於經由口、鼻、肺、肌內、皮下或皮內途徑給予的形式。
20.按照權利要求19的用途，其中所述藥物為適用於採用基因槍傳遞技術給予的形式。
21.按照權利要求18至20的任一項的用途，其中所述化合物是4-(2-甲醯-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸。
22.按照權利要求18至21的任一項的用途，其中所述化合物以每次約0.1mg/kg至100mg/kg的劑量給予。
23.按照權利要求18至22的任一項的用途，其中所述藥物還包含所述核苷酸序列。
24.在按照權利要求1的方法中用於分開、按序或同時給予的組分的組合物，它包含編碼抗原肽的核苷酸序列和增強由所述抗原肽激發的細胞和體液免疫應答的所述化合物。
全文摘要
接種哺乳動物以防疾病狀態的方法,它包括給予所述哺乳動物在合適的載體中的編碼與所述疾病狀態相關的抗原肽的核苷酸序列;另外給予所述哺乳動物增強由所述抗原肽激發的體液和細胞免疫反應,所述化合物選自本文所包含的名單中,其中所述化合物最好是妥卡雷瑣或其適宜的生理可接受鹽或酯。
文檔編號A61K39/39GK1326358SQ99812463
公開日2001年12月12日 申請日期1999年8月25日 優先權日1998年8月26日
發明者J·查羅, R·基斯林 申請人:葛蘭素集團有限公司