生物聚合物的光學解析裝置及方法

2023-05-30 12:31:36 2

生物聚合物的光學解析裝置及方法
【專利摘要】本發明涉及生物聚合物的光學解析裝置，其具備：生物聚合物的特性解析晶片1100，其具備固體基板1110、設置於固體基板1110的多個納米孔1120，1121、和配置於固體基板1110的導電性薄膜1130a，1130b，1131a，1131b，導電性薄膜1130a，1130b，1131a，1131b的至少一部分面向納米孔1120，1121而設置；光源和照射光學系統，其用於產生進入到納米孔1120，1121中的生物聚合物的拉曼散射光；檢測裝置，其具備拉曼散射光的聚光系統、將聚光的光在特定的波長範圍內以不同的比率分割成透射光和反射光的分離部、將分割出的光成像於檢測器的成像光學系統、和用於檢測成像後的光的二維檢測器，將外部光從上述光源和照射光學系統照射到特性解析晶片1100，在上述檢測裝置中檢測解析晶片1100中的生物聚合物的拉曼散射光，由其檢測結果解析構成生物聚合物的單體單元的特性。
【專利說明】生物聚合物的光學解析裝置及方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及使用開有納米尺寸的孔的薄膜狀的器件來解析生物聚合物的特性的裝置以及方法，特別是涉及在薄膜上形成近場，不標記DNA、RNA等核酸而進行光學檢測從而進行序列解析的器件的結構、解析裝置以及解析方法。
【背景技術】
[0002]作為實現更先進的下一代DNA測序儀的方法，使用納米孔的技術引起了關注。可認為納米孔方式的大特點在於，能夠不標記DNA、換言之不使用酶、螢光色素等試劑而進行解析。納米孔根據其形成法大致劃分而分類為2種。一種是將形成納米尺寸的開口(以下稱為「納米孔」)的通道蛋白埋設於雙分子膜的所謂的生物納米孔，另一種是對半導體材料實施微細加工而形成納米孔的所謂的固態納米孔。
[0003]另外，作為這樣的使用納米孔的DNA的解析法，目前提出了二種方法。第I方法是阻塞電流方式。即，在形成有納米孔的薄膜的兩側設置液槽，在各個液槽中設置電解質溶液和電極，對電極間施加電壓時，則電流穿過納米孔而流動。電流的大小以一次近似方式與納米孔的截面積成比例。DNA通過納米孔時，則DNA阻塞納米孔，有效截面積減少，因此電流減少。將該減少量稱為阻塞電流。以阻塞電流的大小為基礎，可識別DNA的單鏈與雙鏈的差異。另外報告了在生物孔的一個形態中，可根據阻塞電流的大小而辨別DNA的鹼基的種類(非專利文獻1，以下亦稱為「第I現有例」)。但是可認為用於生物孔的雙分子膜是有機低分子以弱的力而聚集形成的微細的薄膜，在機械穩定性方面存在問題。另外由於通道蛋白質向雙分子膜組入的工序依賴於自然現象，因此在通道的數量的控制、重現性方面存在問題。另一方面可認為，由於固態納米孔使用半導體基板等作為薄膜，從結構的穩定性的觀點考慮比生物孔有利。另外由於機械性地形成納米孔，因而也具有可實現工業化生產這樣的優點。另外也報告了除了利用半導體基板以外還利用石墨烯(graphene)來作為薄膜材料，對通過設置於其中的固態納米孔的生物分子進行分析的裝置以及方法(專利文獻I)。然而在固態納米孔方面沒有報告過成功基於阻塞電流而識別DNA的鹼基的種類。
[0004]第2方法是隧道電流方式。即，提出了如下方式:將電極對面向納米孔而相對地設置，對電極間施加電壓，測定通過納米孔的DNA與電極之間的隧道電流，根據隧道電流的大小對DNA進行解析。作為關聯技術，存在有如下報告:使用掃描探針顯微鏡，將對糖進行了修飾的核苷溶解於有機溶劑而導入納米間距電極間，計量隧道電流時，則隧道電流的平均值因鹼基的種類而不同(非專利文獻2，以下亦稱為「第2現有例」)。然而試樣是核苷(不具有磷酸)而不是鏈狀的核酸，存在有需要對試樣進行修飾、需要將試樣溶解於有機溶劑、沒有使用納米孔等實驗條件上的制約，除此以外，隧道電流存在有分布，在鹼基的種類之間存在有重疊，因此也存在有鹼基識別的能力低這樣的課題。
[0005]另一方面，作為不標記單分子的核酸而計量的其它方法，報告了 TERS(TipEnhanced Raman Scattering,針尖增強拉曼散射)法(非專利文獻3,以下亦稱為「第3現有例」)。在此方法中，在AFM(原子力顯微鏡)的探針的前端形成銀，利用AFM掃描固定於雲母基板的鏈狀核酸分子而取得核酸分子的AFM像，然後使探針接近於核酸，照射雷射。於是，在探針前端形成局部性的光的增強場(近場)，將核酸激發。對激發後的核酸所發出的拉曼散射光進行分光計量，從而取得核酸的拉曼散射光譜。所獲得的信號的S/N大於近場中所含的核酸鹼基的數，因此可獲得能夠對單個鹼基進行計量的靈敏度。另外拉曼散射光譜具有相對于波數的強度圖案這樣的二維信息，因此具有與阻塞電流、隧道電流等一維信息相比信息量飛躍性地增多、定性上的識別能力高這樣的特點。近場的大小由探針前端的曲率確定，該第3現有例的空間解析度為約IOnm的級別。將其換算為核酸的鹼基數而相當於約30鹼基部分的長度，因此在由該方法獲得的結果中大量的鹼基的信息發生重複。為了從重複的信息算出各個鹼基的信息，例如提出了反覆進行如下操作而求出序列信息的方法，所述操作為:使探針沿著核酸的鏈進行掃描，根據拉曼散射光譜的變化(差分)而推測進入到近場中的鹼基和從近場出來的鹼基(以下記作「差分法」)。為了實施該方法，需要預先將核酸固定於固體基板，另外在計量中需要包含高解析度的微動工作檯的AFM裝置，需要以亞nm的精度將AFM的探針進行三維掃描這樣的微細的操作。即，存在有裝置構成、操作複雜這樣的課題。
[0006]此外，例如在使用具有多個納米孔的器件(多納米孔)來同時解析多個DNA的鹼基序列的情況下，需要同時檢測從多個納米孔產生的信號。例如報告了，使用與4個鹼基對應的2色螢光的組合而將靶標DNA轉換為螢光標記寡核苷酸，在納米孔陣列中分析螢光標記寡核苷酸，基於產生的2色螢光信號來確定靶標DNA的鹼基序列的方法(非專利文獻4)。該方法中，需要將靶標DNA轉換為分析用的寡核苷酸的操作，此外使用螢光，因此費用
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[0007]現有技術文獻
[0008]專利文獻
[0009]專利文獻1:國際公開W02009/035647號
[0010]非專利文獻
[0011 ]非專利文獻 1: Clarke, J.et al., Nat.Nanotech.第 4 卷第 265-270 頁,2009 年
[0012]非專利文獻2: Chang, S.et al.，Nano Lett.第 10 卷第 1070-1075 頁，2010 年
[0013]非專利文獻3:Bailo, E.et al., Angew.Chem.1nt.Ed.第 47 卷第 1658-1661頁，2008年
[0014]非專利文獻4:McNally, B.et al.，Nano Lett.第 10 卷第 2237-2244 頁，2010 年
【發明內容】

[0015]發明要解決的問題
[0016]利用生物孔根據阻塞電流對生物聚合物進行解析的方法(第I現有例)的機械穩定性低，難以穩定地獲得具有重現性的結果。另外利用納米孔根據隧道電流對生物聚合物進行解析的方法(第2現有例)的鹼基的識別能力低，難以高精度地讀取核酸的鹼基序列。利用TERS對生物聚合物進行解析的方法(第3現有例)的裝置構成複雜，需要微細的操作。此外，現有例中存在多個納米孔的測定等多個試樣的同時測定困難這樣的課題。
[0017]因此，本發明的課題是，提供機械穩定性優異、以高空間解析度和靈敏度並且以簡單的裝置構成，用於解析生物聚合物的特性的裝置以及方法。此外，本發明的課題在於，提供同時地檢測即高通量、高精度地檢測由多個納米孔產生的信號的裝置以及方法。
[0018]用於解決課題的方法
[0019]本發明人為了解決上述課題而進行了深入研究，結果發現，在固體納米孔中，通過在基板上以適當的配置設置適當的導電性薄膜，或通過在固體基板上設置流路，從而可以提高基於拉曼散射來解析進入到納米孔或流路中的生物聚合物的特性時的空間解析度，而且可以改善靈敏度。此外發現，在檢測拉曼散射光時，將拉曼散射光在各波長以不同的比率進行分割，將分割出的光用具有多個檢測像素的檢測器檢測，計算出分割出的對應的圖像位置的強度的比率，從而可以以高通量檢測由多個納米孔產生的信號，可以由計算出的比率解析生物聚合物的特性。本發明是基於這些認識而完成的，具體而言，包含以下方案。
[0020][I], 一種生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，具備:
[0021]生物聚合物的特性解析晶片，其具備固體基板、設置於該固體基板的多個納米孔、和配置於該固體基板的導電性薄膜，該導電性薄膜的至少一部分面向該納米孔而設置，
[0022]光源和照射光學系統，其用於產生進入到所述納米孔中的生物聚合物的拉曼散射光，和
[0023]檢測裝置，其具備拉曼散射光的聚光系統、將聚光的光在特定的波長範圍內以不同的比率分割成透射光和反射光的分離部、將分割出的光成像於檢測器的成像光學系統、和用於檢測成像後的光的二維檢測器，
[0024]外部光從所述光源和照射光學系統照射到所述特性解析晶片，該解析晶片中的生物聚合物的拉曼散射光在所述檢測裝置中被檢測。
[0025][2], 一種生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，具備:
[0026]生物聚合物的特性解析晶片，其具備固體基板、設置於該固體基板的多個納米孔、和配置於該固體基板的導電性薄膜，該導電性薄膜的至少一部分面向該納米孔而設置，
[0027]光源和照射光學系統，其用於產生進入到所述納米孔中的生物聚合物的拉曼散射光，和
[0028]檢測裝置，其具備拉曼散射光的聚光系統、將聚光的光在每個指定的波長帶以不同的比率分割成透射光和反射光的分離部、將分割出的光成像於檢測器的成像光學系統、和用於檢測成像後的光的二維檢測器，
[0029]外部光從所述光源和照射光學系統照射到所述特性解析晶片，該解析晶片中的生物聚合物的拉曼散射光在所述檢測裝置中被檢測。
[0030][3],根據[I]或[2]所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，所述生物聚合物由至少4種單體構成，所述分離部對構成該生物聚合物的每種單體以透射光與反射光的強度比至少區分成4種的不同比率來分割光。
[0031][4],根據[I]?[3]的任一項所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，通過向所述導電性薄膜照射所述外部光，從而所述導電性薄膜在面向所述納米孔的開口部的端部產生近場，產生進入到所述納米孔中的生物聚合物的拉曼散射光。
[0032][5],根據[I]?[4]的任一項所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，所述導電性薄膜具有銳角的端部，該銳角的端部面向所述納米孔的開口部而配置。
[0033][6],根據[I]?[5]的任一項所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，所述特性解析晶片每I個納米孔具備至少2張導電性薄膜，該至少2張導電性薄膜夾著所述納米孔的開口部而相互相對地配置。
[0034][7],根據[I]?[6]的任一項所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，所述導電性薄膜由金屬形成。
[0035][8],根據[I]?[6]的任一項所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，所述導電性薄膜由石墨形成。
[0036][8-2].根據[8]所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，石墨是石墨烯。
[0037][9],根據[I]?[8]的任一項所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，所述導電性薄膜的厚度為0.1nm?10nm。
[0038][9-2].根據[I]?[9]的任一項所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，所述固體基板具有實質上透射光的薄膜部分，在該薄膜部分設置有納米孔。
[0039][9-3].根據[I]?[9]的任一項所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，在所述固體基板的表面配置有所述導電性薄膜。
[0040][10].根據[I]?[9]的任一項所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，在所述固體基板的所述納米孔的中心軸方向的中間深度配置有所述導電性薄膜。
[0041][11].根據[I]?[10]的任一項所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，所述納米孔的深度為構成生物聚合物的單體單元的3倍以上的大小。
[0042][12].根據[I]?[11]的任一項所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，還具備數據處理部，其由在所述檢測裝置中被檢測到的拉曼散射光的光強度之比來解析生物聚合物的特性。
[0043][13].根據[I]?[12]的任一項所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，還具備試樣移動機構，其使生物聚合物中的單體逐個單元地進入到所述納米孔中。
[0044][14].根據[I]?[13]的任一項所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，所述生物聚合物選自由核酸、肽核酸、蛋白質、糖鏈、和適體所組成的組。
[0045][15].根據[I]?[14]的任一項所述的生物聚合物的光學解析裝置，所述生物聚合物的特性解析為核酸的鹼基序列的確定。
[0046][15-2].根據[I]?[15]的任一項所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，還具備記錄來自所述檢測裝置的計量值的幀緩衝存儲器。
[0047][16].—種生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，具備:
[0048]生物聚合物的特性解析晶片，其具備固體基板、和配置於該固體基板表面的多對導電性薄膜，成對的該導電性薄膜以一定間隔相對地配置，
[0049]光源和照射光學系統，其用於產生生物聚合物的拉曼散射光，
[0050]檢測裝置，其具備拉曼散射光的聚光系統、將聚光的光在每個指定的波長帶以不同的比率分割成透射光和反射光的分離部、將分割出的光成像於檢測器的成像光學系統、和用於檢測成像後的光的二維檢測器，
[0051]外部光從所述光源和照射光學系統照射到所述特性解析晶片，該解析晶片中的生物聚合物的拉曼散射光在所述檢測裝置中被檢測。
[0052][17].—種生物聚合物的特性解析方法，其特徵在於，包括下述工序:
[0053]在[I]?[16]的任一項所述的生物聚合物的光學解析裝置中，向特性解析晶片照射外部光，產生進入到納米孔中的生物聚合物的拉曼散射光的工序，[0054]在檢測裝置中檢測所述拉曼散射光的工序，和
[0055]基於所述拉曼散射光的檢測結果來解析生物聚合物的特性的工序。
[0056][18].根據[17]所述的生物聚合物的特性解析方法，其特徵在於，所述生物聚合物選自由核酸、肽核酸、蛋白質、糖鏈、和適體所組成的組。
[0057][19].根據[17]或[18]所述的生物聚合物的特性解析方法，其特徵在於，確定核酸的鹼基序列。
[0058][19-2].根據[17]?[19]的任一項所述的生物聚合物的特性解析方法，其特徵在於，所述生物聚合物存在於包含不能進入到所述納米孔中的第2聚合物的試料溶液中。
[0059][19-3].根據[17]?[19]的任一項所述的生物聚合物的特性解析方法，其將所述拉曼散射光的透射光和反射光的強度比與基準或對照進行比較，鑑定構成生體聚合物的單體的種類。
[0060]發明的效果
[0061]根據本發明，可以提供生物聚合物的光學解析裝置以及解析方法。本發明的解析裝置，由於基於固體納米孔方式，因此結構的穩定性高，可靠性高，而且通過拉曼散射可以二維地以高空間解析度並且高靈敏度解析生物聚合物的特性。此外，在二維地配置而成的多個納米孔中可以同時解析多個生物聚合物，因此本發明的解析裝置和解析方法簡便並且
高通量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0062]圖1是生物聚合物特性解析用的納米孔晶片的示意圖。
[0063]圖2是納米孔晶片的截面的示意放大圖。
[0064]圖3是生物聚合物的光學解析裝置的構成概略圖。
[0065]圖4是顯示試樣單元的構成概略的截面圖。
[0066]圖5是顯示具有銳角的三角形狀的金屬薄膜的結構的示意圖(A)，和顯示在該金屬薄膜的附近產生的近場的模擬結果(B)。
[0067]圖6是顯示2個三角形狀的金屬薄膜的結構的示意圖(A)，和顯示在這些金屬薄膜的附近產生的近場的模擬結果(B)。
[0068]圖7顯示核酸鹼基的典型的拉曼散射光譜。
[0069]圖8顯示實施例6中檢測到的2分割像(透射光和反射光)的光譜分布(A和B)、和每個鹼基種類的比率計算結果(C)。
[0070]圖9是生物聚合物特性解析用的納米孔晶片的變形例的示意圖。
[0071]圖10是納米孔晶片的變形例的截面的示意放大圖。
[0072]圖11是實施例2的多納米孔晶片的示意圖。
[0073]圖12是使用了多納米孔晶片的生物聚合物的光學解析裝置的構成概略圖。
[0074]圖13是實施例3的納米孔晶片的截面的示意放大圖。
[0075]圖14是實施例4的納米孔晶片的示意圖。
[0076]圖15是實施例5的納米孔晶片的示意圖。
[0077]圖16是實施例5的納米孔晶片的截面的示意放大圖。
[0078]圖17是實施例6的檢測裝置的構成概略圖。[0079]圖18是實施例6中的濾波器和反射鏡的特性圖。
[0080]圖19顯示實施例6中的其它分色鏡的例子(示意圖)。
[0081]圖20是實施例7的檢測裝置的構成概略圖。
[0082]圖21是具備具有突起狀結構的流路的特性解析晶片的構成概略圖。
[0083]圖22是顯示試樣單元的構成概略的截面圖。
[0084]圖23是具備具有突起狀結構的流路的特性解析晶片的變形例的構成概略圖。
[0085]圖24是具備具有一列金屬納米粒子的流路的特性解析晶片的構成概略圖。
[0086]圖25是具備具有一列金屬納米結構體的流路的特性解析晶片的構成概略圖。
[0087]圖26是具備具有多列金屬納米粒子的流路的特性解析晶片的構成概略圖。
[0088]圖27是具備具有多列金屬納米結構體的流路的特性解析晶片的構成概略圖。
【具體實施方式】
[0089]以下，詳細地說明本發明。本申請主張於2011年6月3日申請的日本專利申請第2011-124871號的優先權，並包含上述專利申請的說明書和/或附圖所記載的內容。
[0090]本發明涉及下述生物聚合物的光學解析裝置、以及使用該解析裝置來解析生物聚合物的特性的方法，所述生物聚合物的光學解析裝置具備:用於利用納米孔和拉曼散射(優選為針尖增強拉曼散射:TERS)來解析生物聚合物的特性的器件(生物聚合物的特性解析晶片)、用於產生拉曼散射光的光源和照射光學系統、和用於檢測拉曼散射光的檢測裝置。本發明的解析裝置中，外部光從光源和照射光學系統照射到特性解析晶片，通過檢測裝置檢測在該解析晶片中產生的生物聚合物的拉曼散射光。
[0091]首先，對生物聚合物的特性解析晶片(以下，也稱為「解析晶片」)進行說明。解析晶片具備固體基板、設置於上述固體基板的至少I個納米孔、和配置於上述固體基板的至少I張導電性薄膜。
[0092]或者，生物聚合物的特性解析晶片可以具備固體基板、和設置於上述固體基板的至少一個流路。
[0093]固體基板可由電絕緣體的材料例如無機材料以及有機材料(包括高分子材料)形成。作為電絕緣體材料的例子，列舉出矽、玻璃、石英、聚二甲基矽氧烷(PDMS)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚苯乙烯、聚丙烯。固體基板的尺寸以及厚度如果可設置納米孔則沒有特別限定，按照與後述的生物聚合物的解析時使用的解析裝置的構成要素(檢測器等)適合的方式調整。固體基板可以通過本【技術領域】的公知方法而製作，或者也可以以市售品的方式獲取。例如，固體基板可通過使用光刻以及蝕刻、雷射燒蝕、注射成型、鑄造、分子束外延、化學蒸鍍(CVD)、電子射線或會聚離子束等技術而製作。固體基板也可為了避免其它的分子向表面的吸附而進行塗布。
[0094]固體基板優選具有用於設置納米孔或流路的薄膜部分。即，將適於形成納米尺寸的孔或流路的材料及厚度的薄膜部分設置於固體基板，從而可簡便且有效率地將納米孔或流路形成於固體基板上。這樣的薄膜部分可以為與固體基板相同的材料，或者也可由其它的電絕緣體材料形成。從形成納米孔或流路的觀點考慮，薄膜部分的材料優選為例如氧化矽(SiO2)、氮化矽(SiN)、氮氧化矽(SiON)、金屬氧化物、金屬矽酸鹽等。另外，從後述的外部光的激發效率和聚光效率的觀點考慮，薄膜部分(以及根據情況為固體基板整體)優選為實質上透明。該處「實質上透明」是指可使外部光的大概50%以上、優選80%以上透射。另外，薄膜部分可以為單層也可以為多層，在多層的情況下，後述的導電性薄膜也可夾於薄膜部分的層而配置。固體基板的薄膜部分的厚度為IOnm?200nm,優選為15nm?IOOnm,更優選為20nm?50nm。薄膜部分可通過本【技術領域】中公知的技術,例如通過減壓化學氣相沉積(LPCVD)，從而形成於固體基板上。
[0095]在固體基板設置至少I個納米孔，優選設置2個以上納米孔。在本發明中「納米孔」以及「孔」是納米(nm)尺寸的孔，並且是貫通固體基板的表裡的孔、優選是貫通固體基板的薄膜部分的表裡的孔。即，本發明中使用的解析晶片被劃分到所謂的固態納米孔。另外在本發明中「開口」是指孔出去到固體基板表面的部分。在生物聚合物的特性解析時，試樣溶液中的生物聚合物、離子等從一側的開口進入納米孔，從相同或相反側的開口露出於納米孔外。
[0096]孔的尺寸(即開口尺寸)可根據解析對象的生物聚合物的種類而選擇恰當的尺寸，例如為Inm?IOOnm,優選為Inm?50nm,具體為Inm以上2nm以下,3nm以上5nm以下，IOnm以上50nm以下等等。ssDNA(單鏈DNA)的直徑為約1.5nm,用於對ssDNA進行解析的孔徑的恰當的範圍為1.5nm?IOnm左右，優選為1.5nm?2.5nm左右。dsDNA(雙鏈DNA)的直徑為約2.6nm，用於對dsDNA進行解析的孔的直徑的恰當的範圍為3nm?IOnm左右，優選為3nm?5nm左右。以其它的生物聚合物例如蛋白質、糖鏈等為解析對象的情況下也可同樣地選擇對應於生物聚合物的外徑尺寸的孔徑。納米孔的深度可通過調整固體基板或固體基板的薄膜部分的厚度而調整。納米孔的深度為構成生物聚合物的單體單元的2倍以上的大小，優選為3倍以上的大小,更優選為5倍以上的大小。例如在選擇核酸作為生物聚合物的情況下，納米孔的深度優選為鹼基3個以上的大小，例如約Inm以上。由此，可一邊控制生物聚合物的形狀和移動速度一邊使其進入納米孔，可實現高靈敏度以及高精度的解析。另外孔的形狀基本上為圓形，但是也可為橢圓形、多邊形。
[0097]可在固體基板上設置至少一個孔，在設置多個孔的情況下，優選規則性地排列。配置多個孔的間隔根據所使用的檢測器、聚光系統、分離部的能力，可以為0.1 μ m?10 μ m，優選為0.5 μ m?4 μ m。孔可通過本【技術領域】的公知方法，例如通過照射透射型電子顯微鏡(TEM)的電子束，通過使用納米光刻技術或離子束刻蝕技術等，從而形成於固體基板。
[0098]在固體基板上配置至少I張導電性薄膜。導電性薄膜可由具有導電性或光散射特性的材料形成。作為這樣的材料，列舉出金屬例如鉬、鈀、銠、釕等鉬族，金、銀、銅、鋁、鎳等；石墨例如石墨烯(可以是單層或多層中的任一個)等。
[0099]導電性薄膜的厚度根據採用的材料為0.1nm?IOnm,優選為0.1nm?7nm。導電性薄膜的厚度越小，則越可對所產生的近場進行限定，可實現高解析度且高靈敏度的解析。另外導電性薄膜的尺寸沒有特別限定，可根據所使用的固體基板以及納米孔的尺寸、所使用的激發光的波長等來適當選擇。
[0100]關於導電性薄膜的形狀，如果是可通過照射外部光而產生並且增強近場的形狀，那麼可製成任意的形狀。這樣的產生近場的探針在本【技術領域】中是公知的，例如已知:具有可通過針尖增強拉曼散射(TERS)而產生以及增強近場的銳角的端部的形狀、金屬領結結構等。
[0101]在導電性薄膜為具有銳角的端部的形狀的情況下，該端部的角度為10?80度，優選為20?60度、更優選為20?40度。關於這樣的用於形成近場光的導電性薄膜(光散射體)的優選的形狀，想參照例如日本特開2009-150899號公報。另外，導電性薄膜的端部的頂點部分也可以不是嚴密的意義上的點，也可以是帶有具有一定值以下、優選為IOnm以下的曲率半徑的圓形的形狀等。銳角的端部以外的導電性薄膜的形狀沒有特別限定，在無角的圓形、有角的情況下，只要與端部的頂點的角度相比為鈍角，則可以自由地選擇。另外導電性薄膜的整體形狀只要具有銳角的端部，就可製成任意的形狀，可製成三角形、四邊形以及五邊形等多邊形、扇形、圓形和三角形的合成形等。
[0102]另一方面，也可採用金屬領結(bow-tie)結構作為導電性薄膜的形狀。即，將圓形、橢圓形或多邊形的2張導電性薄膜按照其形狀的凸部相互相對的方式配置。關於這樣的金屬領結結構，想參照例如美國專利第6，649，894號。金屬領結結構也可視為在形成近場的區域插入了間隙(開口)的結構。通過插入間隙而導入各向異性，使檢測靈敏度得到改善。關於對這樣的技術的說明，想參照例如美國專利第6，768，556號以及美國專利第6，949，732 號。
[0103]關於導電性薄膜，只要其至少一部分面向納米孔而設置，就可配置於固體基板的表面上，或者也可配置於固體基板之間。例如，可在固體基板的表面上面向納米孔的開口部而配置。或者，可在固體基板上的納米孔的中心軸方向上的大致中間的位置(深度)配置導電性薄膜。在此情況下，導電性薄膜優選為由固體基板的薄膜部分夾著的結構。由此，近場是在納米孔的中心軸方向(深度方向)的中間附近形成，因此可一邊控制生物聚合物的形狀和移動速度一邊在納米孔內產生生物聚合物的拉曼散射光，可高精度以及高靈敏度地進行解析。另外，在將導電性薄膜配置於固體基板的情況下，優選考慮照射的外部光的偏光方向而配置。
[0104]另外，導電性薄膜相對於各納米孔配置至少一張即可，可以是奇數也可以是偶數。例如，導電性薄膜可相對於各納米孔而配置I張、2張、3張、4張或其以上。如後述的實施例中記載那樣，存在多張導電性薄膜時，則形成強的光的部位，因此優選相對於各納米孔配置2張以上導電性薄膜。或者，以上述的形狀為I單元，導電性薄膜也可製成具有多個單元的I張薄膜。關於具體的例子，可製成實施例5那樣的連結著2個單元的薄膜結構物。
[0105]關於導電性薄膜，優選將其端部面向納米孔的開口部而配置。更具體而言，將導電性薄膜配置於正交於納米孔中心軸的面內，且將薄膜的端部面向納米孔的開口部而配置。另外在配置至少2張導電性薄膜的情況下，優選使這些導電性薄膜夾著納米孔的開口部而相互相對而配置。在這樣的情況下，將外部光照射於導電性薄膜，從而在導電性薄膜面向納米孔的端部產生近場，產生進入納米孔的生物聚合物的拉曼散射光。
[0106]導電性薄膜可通過本【技術領域】的公知方法而製作，配置於固體基板。例如，由銀形成導電性薄膜的情況下，可通過濺射將所希望的厚度的銀薄膜形成於基板，然後通過電子束而形成所希望的形狀。另外由單層的石墨烯形成導電性薄膜的情況下，可通過將由石墨製作的石墨烯放置於支撐基板，照射電子束而形成希望的形狀的石墨烯。
[0107]通過對上述的解析晶片照射外部光，從而可將進入到上述納米孔中的生物聚合物激發而產生拉曼散射光，基於該拉曼散射光的檢測結果對生物聚合物的特性進行解析。優選的是，通過對解析晶片的導電性薄膜照射外部光，從而在該導電性薄膜面向納米孔的開口部的端部形成近場，利用該近場光對生物聚合物進行二維性的掃描。所形成的近場的厚度基本上與導電性薄膜的厚度同等、即，導電性薄膜正交於納米孔的中心軸，因而所形成的近場的中心軸方向的厚度與導電性薄膜的厚度為同等程度。因此，通過使用上述的解析晶片，可以以高空間解析度且高靈敏度對生物聚合物進行解析。
[0108]此外，代替納米孔，而在成對配置的導電性薄膜之間，即在流路中導入生物聚合物，使其沿著固體表面移動，從而可以檢測生物聚合物的拉曼散射光。形成流路的導電性薄膜對可以導入生物聚合物，並且優選以適合於拉曼散射的間隔配置。流路優選由導電性薄膜形成，但也可以由其它材質形成。此外，流路的寬度、形狀等，考慮解析對象的生物聚合物的種類和大小、產生的近場等，只要是本領域技術人員，就能夠適宜設計。
[0109]一實施方式中，在流路的至少I處形成具有尖銳端的突起形狀。關於突起形狀，只要是可以產生近場的形狀，則可以以任意的數目和位置、任意的形狀來形成。例如，可以與納米孔相關地形成上述的導電性薄膜的形狀。作為一例，突起形狀，可以相對於流路的行進方向，在流路的2個壁面中的任一個上形成，或者相對於流路的行進方向從流路的2個壁面相對地形成。
[0110]其它實施方式中，在流路的至少I處，橫斷流路地固定有I列以上金屬納米粒子或金屬納米結構體。金屬納米粒子或金屬納米結構體，只要是可以產生近場，則可以以任意的數目和位置，以任意的形狀和材質形成。
[0111]通過向上述解析晶片照射外部光，從而進入到上述流路中的生物聚合物被激發而產生拉曼散射光，可以基於該拉曼散射光的檢測結果來解析生物聚合物的特性。優選地，向解析晶片的流路中的突起形狀、金屬納米粒子或金屬納米結構體的部分照射外部光，從而在該部分產生近場，使用該近場而產生拉曼散射，二維地掃描生物聚合物。所形成的近場的厚度基本上與流路的厚度同等。因此，通過使用上述解析晶片，從而可以以高空間解析度並且高靈敏度，而且以高的S/N比，來解析生物聚合物。
[0112]接下來，對用於產生拉曼散射光的光源和照射光學系統進行說明。
[0113]光源可以使用照射可以產生拉曼散射光的波長的外部光(激發光)的本【技術領域】中公知的光源。作為光源，例如，沒有限定，但可以使用氪(Kr)離子雷射器、釹(Nd)雷射器、氬(Ar)離子雷射器、YAG雷射器、氮雷射器、藍寶石雷射器等，照射波長約400?900nm的外部光。所產生的拉曼散射光是由通常的拉曼散射、共振拉曼散射、針尖增強拉曼散射(TERS)、表面增強拉曼散射(SERS)等產生的光。
[0114]此外，為了從光源向解析晶片照射外部光並進行收束，優選使用與光源組合，具備透鏡(透鏡和物鏡)、反射鏡(半透明反射鏡、分色鏡等)、擴束器、ND濾波器的照射光學系統。關於照射光學系統，為了使背景信號(background signal)降低,可以與濾波器(帶通幹涉濾波器等)或濾波器組件、共焦針孔、遮光板、吸收端等組合。這樣的用於產生拉曼散射光的裝置構成在本【技術領域】中是公知的，只要是本領域技術人員，就可以選擇適宜優選的構成要素。
[0115]接著對檢測裝置進行說明。檢測裝置具備:阻斷激發光的濾波器、拉曼散射光的聚光系統、將聚光的光在特定的波長範圍內以不同的反射率分割成透射光和反射光的分離部、將分割出的光成像於檢測器的成像光學系統、和用於檢測成像後的光的二維檢測器。
[0116]作為拉曼散射的聚光系統，可以使用I個或多個物鏡、和/或I個或多個反射鏡。根據需要，可以具備I個或多個濾波器。關於分離部，只要是根據波長而以不同的比率(反射率)將光分割成透射光和反射光，就沒有特別限定。可以遍及特定的波長範圍的整個區域，全部以不同的比率進行分割。例如，可以使用分色鏡、或具有同樣特性的其它鏡。分色鏡的特性的一例如圖18(B)所示，越是高的波數的光，以越高的比率使光透射(或反射)。此外，其它鏡的特性的一例如圖19所示，以每個特徵性拉曼散射峰的波數成階梯狀變化的比率使光透射(或反射)。優選地，關於上述分離器，構成生物聚合物的單體的每個種類，透射光與反射光的強度比可以僅區分成至少該種類的數目(例如至少4種)的方式，在特定的波長範圍內以不同的比率分割光。
[0117]關於成像光學系統，只要是可以在所使用的二維檢測器中成像光，則沒有特別限定，可以使用例如I個或多個成像透鏡(aromatic lens ( 7口774'7夕>>:^)等)。
[0118]二維檢測器可以將成像後的光學像轉換成電信號而作為二維的圖像輸出。此外根據使用的解析晶片中的納米孔的數目和配置、流路的形狀，可以使用I個或多個二維檢測器。作為這樣的二維檢測器，可舉出CCD(電荷耦合元件)區域傳感器、CMOS(互補型金屬氧化膜半導體)區域傳感器、其它高靈敏度元件的區域傳感器等。所使用的二維檢測器可以為適當的像素尺寸和像素數，此外對其形式(背面照射型、正面照射型等)也沒有特別限定。優選地，二維檢測器，具有分別檢測以不同的比率分割而成的透射光和反射光的像素。關於二維檢測器，為了防止伴隨檢測的高速化的靈敏度降低，優選使用光電倍增機構，例如具有圖像增強器、或在元件內部具有信號的倍增功能的電子倍增型CCD照像機(EM-CCD)等。此外，如果二維檢測器的幀率(運作速度)為IkHz以上，則特別優選。
[0119]另外，檢測裝置優選具備可直接記錄拉曼散射光的圖像信息的大容量存儲器，由此可不介由電纜、板(board)、電腦等而高速地進行解析。例如，本發明的解析裝置優選進一步具備記錄來自檢測裝置的計量值的幀緩衝存儲器。另外，本發明的解析裝置也可與用於將來自上述檢測裝置的計量值進行數位化並輸出的輸出裝置(例如電腦、監視器)連接。
[0120]如上所述，檢測裝置中，拉曼散射光通過聚光系統被聚光，在分離部中例如在各波長以不同的反射率分割成透 射光和反射光，分割出的光被成像而用二維檢測器檢測。這樣的檢測裝置的構成和運作方法在例如國際公開W02010/150468號和US2012/097864A1中記載。本說明書的實施例中，將這樣的檢測裝置稱為「2分割比率分光檢測裝置」。
[0121]在本發明中，不使拉曼散射波長分散，作為2個分割出的二維像而計量，因此可以同時檢測來自二維地高密度地配置的多個納米孔或流路的拉曼散射光，能夠高通量地解析通過多個納米孔或流路的生物聚合物。
[0122]本發明的解析裝置優選還具備數據處理部，其由在檢測裝置中被檢測到的拉曼散射光的光強度之比來解析生物聚合物的特性。這樣的數據處理部為例如計算機組件。
[0123]另外本發明的解析裝置優選具備試樣移動機構，即，可控制生物聚合物的移動速度的機構。試樣移動機構例如在預定的時機使生物聚合物中的單體逐一單元地進入到解析晶片的納米孔或流路中。作為這樣的機構，可使用例如通過電泳驅動生物聚合物的試樣驅動裝置(任意函數發生器、電極等)。利用這樣的試樣移動機構，從而可按照生物聚合物中的單體依次地進入到納米孔或流路中並脫離的方式控制生物聚合物的移動，可隨著時間經過而檢測對應於各個單體(結構單元)的拉曼散射光。
[0124]另外，作為控制生物聚合物的移動速度的方法，存在有提高包含生物聚合物的試樣溶液的粘性的方法。例如通過控制解析晶片周圍的溫度，降低試樣溶液的溫度，使試樣溶液的粘性變高，從而可抑制生物聚合物的布朗運動。或者，向試樣溶液中添加除了測定對象以外的第2聚合物，從而可提高試樣溶液的粘性，同時可使生物聚合物的立體結構為直鏈狀，因此可控制生物聚合物的形狀和移動速度。此時，作為第2聚合物，優選使用大於納米孔的內徑或流路的寬度的尺寸的聚合物，更優選使用三維地交聯而得到的聚合物，從而使第2聚合物無法進入到納米孔中，可排除由不是測定對象的第2聚合物引起的拉曼散射。
[0125]控制生物聚合物的移動速度的其它的方法為:對存在於解析晶片的上部和下部或流路的各個試樣溶液施加壓力差的方法。將與生物聚合物利用電泳而要通過納米孔或流路的力相反的方向的力施加於生物聚合物，從而可降低生物聚合物通過納米孔或流路的速度。
[0126]通過一邊控制生物聚合物的形狀和/或移動速度一邊進入到解析晶片的納米孔或流路，從而使生物聚合物的主軸與納米孔或流路的中心軸大致一致。通過試樣移動機構驅動生物聚合物，從而使生物聚合物通過納米孔或流路，使構成生物聚合物的單元要素(單體)依次通過解析晶片中形成的近場。即，沿著聚合物的主軸方向而排列的單體依次暴露於近場，吸收光，產生拉曼散射光。通過利用檢測裝置檢測和計量該拉曼散射光，從而依次獲得來源於單體的拉曼散射光的信息。
[0127]在本發明中，使用上述的本發明的生物聚合物的光學解析裝置，可進行生物聚合物的特性解析。在本發明中「生物聚合物」是指:多個單元結構的低分子(單體、monomer)連結而得到的多聚物(低聚物)、高分子(聚合物)之中，存在於生物體的生物聚合物以及由存在於生物體的生物聚合物衍生的生物聚合物。具體包括:核酸，例如單鏈DNA(ssDNA)以及雙鏈DNA(dsDNA)、單鏈RNA(ssRNA)以及雙鏈RNA(dsRNA)、包含DNA和RNA的雜交核酸等；肽核酸；蛋白質以及肽，例如由D-以及L-胺基酸形成的蛋白質以及肽；糖鏈，例如多糖、糖蛋白質中的糖鏈；適體，例如RNA適體等。另外，生物聚合物中包括包含自然中不存在的序列、構成要素的聚合物，例如也包括具有聚㈧、聚⑴、聚(G)、聚(C)等序列或任意的序列的人為地合成出的聚合物分子。另外，生物聚合物中也包括:由本【技術領域】中公知的核酸擴增技術(例如聚合酶鏈式反應)製備出的核酸、載體中克隆的核酸。包含這些生物聚合物的試樣的製備方法在本【技術領域】中是周知的，本領域技術人員可根據生物聚合物的種類適當選擇製備方法。
[0128]在本發明中所謂「解析」，是指生物聚合物的特性解析。在優選的實施方式中，所謂「解析」，是指解析作為構成生物聚合物的單元的單體的序列順序，例如解析核酸的鹼基序列。為了進行生物聚合物的特性解析，檢測構成生物聚合物的每個單體(在生物聚合物為核酸的情況下為鹼基)的拉曼散射光，基於其檢測結果，進行單體的定性(識別)。
[0129]拉曼散射光，通過上述的檢測裝置，在每個波長以不同的比率分割成透射光和反射光，透射光強度與反射光強度在二維檢測器中作為二維像而被檢測到。可以由該拉曼散射光的光強度之比來解析生物聚合物的特性，即進行構成生物聚合物的單體的定性。因此，本發明中，依次獲得構成生物聚合物的單體的拉曼散射光，將所獲得的拉曼散射光的檢測結果與(基準)標準比較，判定單體的定性(即種類)，通過時間序列地依次實行這些工序，從而可進行序列解析，即，確定生物聚合物中單體排列的順序。
[0130]實施例
[0131]以下，通過實施例以及附圖來更具體地說明本發明。但是，以下的實施例並非對本發明進行限定。
[0132][實施例1]單孔構成的納米孔晶片和使用了該納米孔晶片而進行的生物聚合物的特性解析
[0133]使用圖1說明本發明的生物聚合物的特性解析用的納米孔晶片的構成的一個例子。圖1為納米孔晶片100的示意圖。如圖示那樣納米孔晶片100由基板110、納米孔120、以及導電性薄膜130等構成。如圖示那樣，將與基板110的最寬廣的面(以下基板面)平行的平面定義為xy面，將導電性薄膜130和納米孔120連結的方向定義為χ軸，將與xy面垂直的方向定義為z軸。納米孔120與基板面大致垂直地形成，換言之納米孔的中心軸與z軸平行。
[0134]圖2為本實施例的納米孔晶片100的包含納米孔120的中心軸121的xz截面的示意放大圖。基板110在Z軸上方的基板面具有薄膜部分111，進一步在其上方具有導電性薄膜130。另外基板在z軸下方具有錐體狀的窪部(以下稱為「窗部112」)，在該處基板的薄膜部分111露出。在該窗部112的薄膜部分111形成納米孔120。如圖示那樣，導電性薄膜130的I個端部131面向納米孔120的開口部的上端。如圖1中略記那樣，該端部131的平面形狀為尖銳端，該尖銳端面向納米孔120。
[0135]下面使用圖3說明本發明的生物聚合物的光學解析裝置的構成的一個例子。圖3為本實施例的生物聚合物的光學解析裝置200的構成概略圖。解析裝置200由光源210、括束器220、分色鏡230、物鏡240、濾波器250、2分割比率分光檢測裝置260 (詳細內容記載於實施例6以及7中)、終端270、xyz微動工作檯600、試樣驅動裝置700、試樣單元300、個人電腦等計量控制裝置(沒有圖示)等構成。在試樣單元300中收納納米孔晶片100。
[0136]圖4所示為試樣單元300的構成概略的xz截面圖。試樣單元300由納米孔晶片100、上部部件310、下部部件320、螺絲類(沒有圖示)等構成。下部部件320在其內部形成O-環330、試樣用流路410、420、430、試樣用腔室440、電極用腔室450，另外形成試樣用連接埠 460、470、電極用連接埠 480。在下部部件320中介由試樣用連接埠 460、470而氣密性連接試樣送液管(沒有圖示)，另外介由電極用連接埠 480而氣密性連接銀氯化銀電極(沒有圖示)。銀氯化銀電極的具有氯化銀的端收納於電極用腔室450(沒有圖示)，其具有銀的端(以下，銀端)露出於電極用連接埠 480的外部。在上述試樣送液管、試樣用連接埠 460、試樣用流路410、試樣用腔室440、試樣用流路420、電極用腔室450、試樣用流路430、試樣用連接埠 470、試樣送液管中，沒有間隙地(沒有氣泡的混入)充滿試樣溶液(沒有圖示)。因此，試樣用腔室440內的試樣溶液在電極用腔室450中與銀氯化銀電極接觸，兩者電化學性地導通。在上部部件310方面也與下部部件320同樣。
[0137]下面使用圖1至圖8說明本發明的納米孔晶片的運作的概要。首先進行試樣單元300的準備。具體而言，在上部部件310與下部部件320之間夾著納米孔晶片100並且由O-環330壓接，氣密地形成上部及下部的試樣用腔室540以及440。從試樣送液管導入IOOmM KCl水溶液作為試樣溶液，在試樣用腔室540、440、電極用腔室450中裝滿試樣溶液。
[0138]下面將試樣單元300設置於解析裝置200。具體而言，將試樣單元300固定於微動工作檯600。使用微動工作檯600、未圖示的目視用光學系統，從而將光學系統的焦點對準到試樣單元300內的納米孔晶片100的薄膜部分111。將設置於試樣單元300的2個銀氯化銀電極連接於試樣驅動裝置700。試樣驅動裝置700內置電壓源或電流源，可以以上部試樣用腔室540為基準，對下部試樣用腔室440施加電壓。
[0139]解析裝置的光學系統如下運作。具體而言，將從光源210出射的雷射通過擴束器220 (或透鏡對、光束整形器等)而整形後，利用分色鏡230進行反射，利用物鏡240，聚光於納米孔晶片100的薄膜部分111。雷射通過薄膜部分111而照射導電性薄膜130，其端部131(面向納米孔120的開口部)產生強的近場光。如果在形成該近場光的區域(以下稱為「近場」)導入生物聚合物，則近場光激發生物聚合物，產生構成生物聚合物的單體所特有的拉曼散射光。將拉曼散射光用物鏡240聚光，通過分色鏡230，利用濾波器250來除去瑞利散射光和反斯託克斯線，將拉曼散射光中的斯託克斯線入射至2分割比率分光檢測裝置260，使用2分割比率分光檢測裝置260(斯託克斯線的)作為強度比的差異而檢測拉曼散射光的透射和反射光譜的差異。通過了薄膜部分111、導電性薄膜130的光由終端270向吸收或無關係的方向擴散。
[0140]作為測定對象的生物聚合物的一個例子，DNA的測定順序如以下那樣。即，作為試樣，使用了例如將長度IOkb (knt)的單鏈DNA按照成為InM的濃度的方式溶解於IOOmM KCl水溶液而得到的試樣。將其作為下部試樣溶液導入試樣用腔室440。使用試樣驅動裝置700對下部試樣用腔室440施加IOOmV的負電壓時，則穿過納米孔120，從而試樣溶液中的離子發生電泳，電流(離子電流)流動。在近場最初僅存在水和KC1，因此僅觀測到水的拉曼散射光。DNA通過電泳從下部試樣用腔室440穿過納米孔120而向上部試樣用腔室540電泳。DNA通過納米孔120時，作為DNA的構成要素的核酸鹼基進入到在導電性薄膜130的端部131形成的近場之中。於是，產生該鹼基特有的拉曼散射光，通過2分割比率分光檢測裝置260取得基於其拉曼散射光譜的強度比。繼續進行DNA的電泳時，則核酸鹼基也移動，脫離到近場之外。於是，該鹼基特有的拉曼散射光消失。進一步繼續進行泳動時則DNA的序列上的下一個鹼基同樣地依次進入以及脫離近場，反覆進行這樣的工序，隨著時間經過而取得基於對應鹼基的序列的拉曼散射光譜的強度比的變化。為了使每個各鹼基成為不同的強度比，隨著時間經過地取得其信號，由其時間變化求出DNA的鹼基序列。以上是本實施例的運作的概要。
[0141]以下，對各構成要素進行詳細說明。
[0142]按照以下的順序製作出本實施例中的納米孔晶片100。使用矽基板作為基板110，通過LPCVD (減壓化學氣相沉積)在其表面形成厚度約20nm的氧化膜(該氧化膜最終成為薄膜部分111)。通過電子束(EB)刻蝕在基板底面形成窗部的圖案，通過反應性離子蝕刻而去除表面層，然後通過KOH(氫氧化鉀)溼法蝕刻而去除矽，從而形成了具有薄膜部分111的窗部112。作為導電性薄膜130，通過濺射在基板表面上形成了銀的薄膜。銀的膜厚為約5nm。在銀的薄膜之上塗布抗蝕劑，通過EB刻蝕而形成圖1所示的三角形樣的圖案，通過蝕刻去除三角形樣圖案以外的區域的銀，去除了抗蝕劑。最後，用透射型電子顯微鏡(TEM)觀測基板，對三角形的端部131照射TEM的電子束，從而形成了納米孔120。納米孔的內徑為約10nm。在本實施例中使用氧化矽而形成薄膜部分111，但是也可同樣地使用氮化矽等。
[0143]本實施例中作為導電性薄膜130的材料使用了銀，但是此材料不限定於銀，如果是一般而言具有導電性的材料則可使用任意的材料，一般而言可優選使用金屬。作為可用作導電性薄膜的其它的金屬，有鉬、鈀、銠、釕等鉬族的金屬，金、銅等。
[0144]在本實施例中試樣單元300、特別是上部部件310和下部部件320的中央部(將試樣用腔室440、540與外部隔開的部分)採用了透明的部件。作為可採用的透明部件，有玻璃、石英、在光源波長中透明度高的丙烯酸類等塑料材料。下部部件320的中央部採用透明的部件，從而可將來源於光源210的雷射高效地照射於納米孔晶片100。另外上部部件310的中央部採用透明的部件，從而通過了納米孔晶片100的透射光、散射光可沒有發生反射地通過，抑制背景光。[0145]在圖3和圖4中物鏡240與試樣單元300 (所含的納米孔晶片100)稍稍離開而圖示，但是在實際的裝置中優選兩者儘量靠近。優選物鏡240與納米孔晶片100的距離為3mm以下，優選為1mm以下地接近。由此，可提高基於激發光的激發效率、散射光的聚光效率，進行高靈敏度的測定。另外物鏡240優選使用液浸型。物鏡優選為高數值孔徑，數值孔徑^ 0.8是特別良好的。
[0146]本實施例中的生物聚合物的光學解析裝置以與第3現有例同樣的顯微鏡一體型雷射器拉曼分光裝置為基礎而構築。其中，作為xyz微動工作檯600，使用顯微鏡附帶的工作檯，沒有使用AFM用的壓電工作檯。在本實施例中使用了輸出lmW、波長53Inm的Kr離子雷射器作為光源210。作為試樣驅動裝置700，使用任意函數發生器、根據需要將任意函數發生器與衰減器(電阻分壓器)組合而使用。試樣驅動裝置700可輸出輸出電壓範圍為O至±10V的DC、或任意的波形。作為任意波形的典型例，列舉出脈衝波，脈衝的峰的時間寬度為10納秒單位，並且脈衝的峰的電壓值也在上述的輸出電壓範圍中，可任意輸出。
[0147]以下，對本實施例的運作進行詳細說明。
[0148]納米孔晶片100的基板110主要由矽(Si)形成。基板的厚度為約700 μ m。基板的薄膜部分111由氧化矽(SiO2)形成，厚度也薄至約20nm。因此，基板的窗部112中，雷射通過薄膜部分111而照射導電性薄膜130。通過用雷射照射導電性薄膜130，從而在其端部131產生強的近場。該近場的z方向的厚度與導電性薄膜130的厚度為同等程度，即5~IOnm左右。
[0149]在窗部112以外，基板110具有約700 μ m厚度。作為基板110的材料的Si將雷射吸收、反射、散射，因而雷射基本上不到達在窗部112以外的區域之上形成的薄膜部分111、在其上形成的導電性薄膜130。因此，除了該窗部112以外的區域中可抑制導電性薄膜130中的近場的形成。即，通過上述的構成，具有如下特點:可將導電性薄膜130中的近場的形成主要限定於窗部112的區域、特別限定於作為目標的端部131，可抑制除了目標以外的區域中的背景光的產生。
[0150]以下，關於本實施例以及後述的變形例中採用的結構，敘述通過模擬近場的形成進行解析並且比較而得到的結果。
[0151]如本實施例那樣使光入射於三角形的導電體時，使用FTDT法(時間區域光傳播Solver OptiFDTD, Optiwave System Inc.)計算其附近中產生的近場光分布。在該計算中，將解析區域的尺寸在X、Y、Z各個方向，製成0.3 X 0.2 X 2.6um (另外，X、Y、Z是僅僅圖5和圖6中使用的坐標系，Y是垂直於XZ平面的方向)。另外導電體的材料設為銀，厚度為10nm，前端尖角設為90度。入射波設為波長780nm的平面波，在遠離導電體的面一個波長的位置產生了波源(λ=780ηπι)。入射波的偏光方向為X方向。關於邊界條件，XY側面為周期的邊界條件，Z方向側面為吸收邊界條件。網孔尺寸在整個計算區域中均勻地為2.6nm。
[0152]圖5的A是解析出的結構的示意圖。另外，在圖5的B中，將近場強度密度(I)的計算結果與入射波的強度密度(Iin)之比的XY平面分布繪製於縱軸。如圖示那樣在薄膜三角形的前端產生最強的光的部位，其最大值按照入射強度比計為約1100倍。
[0153]另外，在設置2個該三角形的薄膜、使頂點相互隔開3nm而相對的情況下，也進行計算，將其結果示於圖6的A和B。這相當於後述的變形例。在此情況下，可獲得約7100倍的增強效果。
[0154]總結以上的模擬的結果時，則示出了通過使用如本實施例、特別是如後述的變形例那樣的結構以及形狀的導電性薄膜，從而形成較強地具有光電場的增強效果的近場。
[0155]DNA剛進入納米孔120後，在觀測到來源於鹼基的拉曼散射光的時間點，使用試樣驅動裝置700，從而可降低施加於下部試樣用腔室440的電壓的絕對值，可降低DNA的電泳速度。另外，在降低施加電壓的絕對值的狀態下使電壓的極性反轉(將下部試樣用腔室440設為陽電壓)，從而可以以低的速度使DNA鏈在反方向上泳動。在此條件下，進行泳動直到觀測不到來源於鹼基的拉曼散射光為止，從而可將DNA鏈的前端推回至近場之外。從該狀態起，在降低施加電壓的絕對值的狀態下將電壓的極性進行歸原(將下部試樣用腔室440設為陰電壓)，從而可從DNA鏈的先頭起慢慢泳動，反覆進行拉曼散射計量。由此可以在以充分的精度計量拉曼散射光譜所必需的時間中，將作為測定對象的鹼基留在近場之中。
[0156]使用試樣驅動裝置700,可將施加於下部試樣用腔室440的電壓設為一定(DC),此外也可設為脈衝波，以短的周期反覆進行DNA的泳動和停止。在此情況下，可調節脈衝波的脈衝寬度(脈衝寬度變調)。降低I周期之內的脈衝為ON的時間的比例(佔空比)並且提高該OFF的時間的比例，從而可縮短I周期之內的泳動時間並且使該停止時間變長。例如使用頻帶IOOMHz的任意函數發生器從而以IOns單位使脈衝寬度可變，因此將I周期的長度設為例如IOms的情況下，佔空比可以以1/1，000, 000的解析度進行調節。即，可根據佔空比以極其高的解析度(低)調節DNA鏈的平均移動速度。另外通過與脈衝高度(pulse-height)的調節(脈衝高變調)組合，也可進一步精密地調節泳動速度。通過控制泳動電壓、其脈衝寬度，從而在以充分的精度計量拉曼散射光譜所必需的時間中，可將作為測定對象的鹼基留在近場之中。另外，通過在停止時間內取得拉曼散射光譜，從而也可避免因測定對象在計量中進入或脫離近場而導致信號變動的不良情況，也可使計量值高精度化。
[0157]另外，也可使施加於下部試樣用腔室440的電壓在正壓與負壓之間周期性地反覆。此時，按照通過時間平均而得到的電壓為稍稍負壓的方式進行調節，從而與將電壓簡單地設為一定的負壓的情況相比，可將DNA鏈穩定地拉長，且可慢慢地穿過納米孔120而泳動到上部試樣用腔室540，可靈敏度良好地計量基於DNA鏈中的各個鹼基的拉曼散射。
[0158]作為控制DNA鏈的泳動速度的其它方法，提高試樣溶液的粘性是有效的。如果追加控制納米孔晶片周圍的溫度的機構，降低試樣溶液的溫度，則試樣溶液的粘性變高，同時可抑制DNA鏈的布朗運動，因此成為對於DNA鏈的拉曼散射計量而言良好的條件。另外，向試樣溶液中添加除了測定對象以外的聚合物，從而可提高試樣溶液的粘性，同時可將DNA鏈的立體結構製成直鏈狀，因此成為對於DNA鏈的拉曼散射計量而言良好的條件。作為聚合物，也可使用毛細管電泳用的分離介質。優選使用大於納米孔的內徑、進一步優選三維地交聯而得到的聚合物，從而不會妨礙測定，可僅僅提高粘性。特別是根據後述的實施例的圖13，可將增強場即計量區域閉入於納米孔內部，在此情況下，不是測定對象的聚合物不進入計量區域，而可僅僅使作為測定對象的生物聚合物例如DNA鏈進入到測定區域，可排除由不是測定對象的聚合物引起的拉曼散射。
[0159]為了實現降低DNA的電泳速度的目的，也可採用可實現微小的泳動速度、且將其準確地控制的其它的方法。作為第I方法，可將能夠高靈敏度地檢測上下的試樣用腔室(440以及540)間的電壓的一對計量電極分別新地(除了既存的銀氯化銀電極另外)設置於上下的試樣用腔室。在此情況下，以使用一對計量電極計量出的實際的電壓為基礎，通過反饋控制施加於銀氯化銀電極的電壓，從而可準確地對上下的試樣用腔室之間施加規定的微小電壓。作為第2方法，可採用恆電位方式。在此情況下，將既存的I對銀氯化銀電極分別視為試樣極和對電極，並且在對電極側的試樣用腔室440以及540新地設置參照極，可按照試樣極與參照極之間的電壓成為設定了的值的方式，控制在試樣極和對電極中流動的電流。通過以上的方法，可將規定的微小電壓準確地施加於上下的試樣用腔室440以及540間，可實現微小的泳動速度、且將其準確地控制。作為第3方法，可採用恆電流方式(Galvano Stat mode)。在此情況下，將既存的I對的銀氯化銀電極分別視為試樣極和對電極，可一邊監控從一方流向另一方的電流一邊按照成為規定值的方式反饋控制。通過此方法，從而可將規定的微小電流準確地流到上下的試樣用腔室440以及540間，可實現微小的泳動速度、且將其準確地控制。
[0160]說明控制DNA鏈通過納米孔120的速度的進一步其它的方法。如果使充滿於下部試樣用腔室440的試樣溶液和充滿於上部試樣用腔室540的試樣溶液中具有壓力差，從而將與DNA鏈想要利用電泳而通過納米孔的力相反的方向的力施加於DNA鏈，那麼可降低DNA鏈通過納米孔的速度。例如，對充滿於下部試樣用腔室440的試樣溶液施加大氣壓，另一方面通過泵機構、壓電機構對充滿於上部試樣用腔室540的試樣溶液施加大氣壓以上的壓力時，則可產生從上部試樣用腔室540朝向下部試樣用腔室440的方向即，與DNA鏈的電泳為反方向的壓力。該壓力差也可通過基於上部和下部的試樣溶液的組成差例如離子濃度差等的滲透壓而控制。通過該壓力差，從而在與DNA鏈的電泳相反的方向，S卩，從上部試樣用腔室540朝向下部試樣用腔室440的方向，使試樣溶液在納米孔120中以塊體運動的方式流動，也可降低DNA鏈的通過速度。該試樣溶液流動也可通過使納米孔120的內表面具有電荷，使納米孔120內部產生電滲透流從而實現。試樣溶液流動也可進一步產生以下那樣的效果。試樣溶液按照包入DNA鏈的方式流動，使DNA鏈在納米孔120內部在其中心軸附近局部存在，同時可將DNA鏈在中心軸方向拉長。這可使DNA鏈的各鹼基穩定地通過增強場的中央，可實現精度高的拉曼散射計量。
[0161]圖7表示核酸鹼基的典型的拉曼散射強度(光譜)的例子。4種鹼基A、C、T以及G，分別在特徵性的波數(以下亦稱為「特徵帶」)中，散射光強度顯示為峰。該例子中的A、T、G的特徵帶的峰分別由al、tl、gl表示，波數分別為約730,1180,650011' C的峰位置Cl (即約1730CHT1)與T的峰位置t2(即1600CHT1)稍稍重複，但是通過考慮T所固有的特徵帶tl的有無而可辨別T和C。在上述以外，作為C和T的特徵帶，也存在有可適用C:1260cm-\T:1360cm-1的可能性。這樣在識別峰本身而進行檢測的情況下，例如需要以IOcnT1的解析度檢測拉曼散射光譜。即，需要將每I處納米孔為400cm-1?lSOOcm—1的波數範圍以140分割以上分割並檢測，因此檢測器需要大量的像素數。此外，由於以大量的像素進行測定，因此在期望高速地測定的情況下是不適合的。如本實施例那樣，通過利用2分割比率分光檢測裝置，作為強度比的差異而檢測拉曼散射光的光譜的差異，從而每I處納米孔基本上能夠以2像素的信號進行檢測和識別，使檢測器的像素少，並能夠低成本化，也能夠高速重複測定。另外，具體而言，如圖8所示，將拉曼散射光在特定的波長範圍內分別以不同的比率分割為透射光和反射光，可以由透射光與反射光的強度比率識別4種鹼基(詳細內容在實施例6中記載)。
[0162]在本實施例中例示出取得A、C、T、G的光譜而進行DNA的解析的情況，但是本發明的應用範圍不受限於此。例如通過對U的光譜進行解析，從而可進行RNA的解析。另外通過取得甲基化C的光譜，從而可直讀DNA的甲基化。進一步通過取得胺基酸的光譜，從而可進行肽、蛋白質的解析，另外通過取得糖的光譜，從而可進行糖鏈的解析。
[0163]本實施例的生物聚合物的光學解析裝置基於固態納米孔，因此具有結構的穩定性高並且可靠性高這樣的特點。另外本實施例以拉曼光譜為指標進行單體種類的判定。光譜計量中，由於具有強度比和強度這樣的二維信息，因此與隧道電流強度等一維信息相比信息量飛躍性地增多，定性上的識別能力高，因此具有鹼基的識別能力高這樣的特點。本實施例將近場固定於納米孔120的開口部，使用試樣驅動裝置700，使DNA泳動，控制了與近場的相對位置關係。由此，無需將核酸預先固定於固體基板110，也不必需要高解析度的微動工作檯、AFM。另外不必需要以亞nm的精度將AFM的探針二維地掃描這樣的微細的操作。SP，具有裝置構成、操作變得簡便這樣的特點。
[0164][實施例1的變形例]
[0165]作為實施例1的變形例，可實施如下述的構成那樣的納米孔晶片100a。圖9為基於本變形例的納米孔晶片IOOa的不意圖。如圖不那樣納米孔晶片IOOa由基板110、納米孔120、以及導電性薄膜130a、130b等構成。即，在具有2張相當於實施例1中的導電性薄膜130的導電性薄膜方面，與(僅具有一張導電性薄膜130)實施例1不同。圖10是本變形例的納米孔晶片IOOa的包含納米孔120的中心軸121的xz截面的示意放大圖。如圖示那樣，導電性薄膜130a、130b形成於薄膜部分111的z軸上方，它們的端部131a、131b分別面向納米孔120的開口部的上端，相互地相對。即，導電性薄膜130a和130b隔著與納米孔120的孔徑大致同樣的距離而設置。
[0166]用於本變形例的納米孔晶片IOOa的解析裝置、運作與實施例1同樣。不同的是，通過雷射照射而生成的近場光在導電性薄膜130a、130b的端部131a、131b的間隙中產生。另外，如從由實施例1表示的模擬結果獲知的那樣，來源於兩者的導電性薄膜的近場光相互地增強疊合，近場的強度增強。另外，通過導電性薄膜130a、130b的存在，使得近場的X方向的分布受限制，局限於納米孔120的孔徑程度。作為結果，本變形例的近場的形狀的對稱性高，因此均勻性高。另外本變形例中，近場的強度如上述那樣按照入射光量比計為約7，000倍左右之高(圖6)，因此為高靈敏度，近場具有在空間上均勻並且空間解析度也高這樣的特點。
[0167][實施例2]多納米孔解析裝置構成
[0168]使用圖11說明本發明的生物聚合物特性解析用的多納米孔晶片的構成的一個例子。圖11是本實施例2的多納米孔晶片1100的示意圖。如圖示那樣多納米孔晶片1100由基板1110、納米孔1120、1121、以及導電性薄膜1130a、1130b、1131a、1131b等構成。如圖示那樣，本實施例的多納米孔晶片1100是，在I個基板1110上具有多個由納米孔以及相對的導電性薄膜等形成的上述變形例的單元結構、即，圖10中例示的單元結構。[0169]下面，使用圖12說明本實施例中的生物聚合物的光學解析裝置的構成的一個例子。圖12是本實施例2的進行生物聚合物的特性解析的多通道解析裝置2000的構成概略圖。多通道解析裝置2000由光源210、括束器220、分色鏡230、物鏡240、濾波器250、2分割比率分光檢測裝置2010、終端270、xyz微動工作檯600、試樣驅動裝置700、試樣單元300、個人電腦等計量控制裝置(沒有圖示)等構成。試樣單元300中收納多納米孔晶片1100。
[0170]接下來說明本實施例的運作的概略。本實施例2的運作與實施例1同樣，但作為納米孔晶片使用具有多個單元結構的多納米孔晶片1100。因此，在多納米孔晶片1100上的多個場所，來源於試樣的拉曼散射光分別獨立地產生。該拉曼散射光用物鏡240聚光，通過分色鏡230，利用濾波器250來除去瑞利散射光後，在2分割比率分光檢測裝置2010的檢測面上成像。來自各個納米孔開口部的拉曼散射光作為聚合物的每個種類以不同的比率對其強度進行了分割的2分割像來檢測，能夠同時地檢測、識別來自多納米孔的拉曼散射光。在使拉曼散射波長分散而檢測的以往方式的情況下，如實施例1所記載那樣，每I處納米孔需要為140以上的像素。在二維檢測器的像素尺寸為8微米、成像倍率60倍的情況下，如果在基板上與相鄰的納米孔的距離為20微米左右，則發生光譜的重疊，難以測定。本發明中，可以不使拉曼散射波長分散，而作為亮點的像而測定，因此可以在來自相鄰地配置的納米孔的分散像不重疊的情況下進行測定。因此，可以在多納米孔晶片上窄地配置納米孔彼此的間隔。例如，能夠以0.5微米?幾微米左右的正方格子的格子點狀地配置，能夠高密度配置。特別是在拉曼散射測定中，由於以高析像度、高NA的透鏡進行檢測，因此視場尺寸變小。可以如本實施例那樣以高密度配置，從而能夠進行更多的納米孔的測定，可以使解析的通量提高。
[0171]此外，在進行波長分散的情況下，相對於多納米孔晶片1100的光學系統中心軸的設置位置能夠每次測定而變化，因此每次每個納米孔都需要由該檢測面上的位置進行像素坐標與波長的關係，即波長校正，但在本實施例的情況下，僅僅檢測亮點的像即可，因此不需要波長校正等操作，可以簡便地進行計量。
[0172]利用電泳通過納米孔的DNA鏈一般為高速。例如施加電壓IOOmV時，鹼基長IOkb (knt)的單鏈DNA的納米孔通過時間為約lms，每一鹼基的增強場停留時間(假定增強場的空間性的變寬為無限小)不過於0.1 μ S。因此，在此條件下為了獨立地計量來源於各鹼基的拉曼散射信號，需要將2分割比率分光檢測裝置2010的運作速度設為IMHz以上。利用以往的顯微鏡系統高靈敏度地計量螢光、磷光、散射光等的情況下，特別是同時計量二維狀地分布的測定對象的情況下，檢測器的運作速度通常為30Hz以下，特別快速的速度也是不足ΙΚΗζ。因此將檢測器的運作速度設為IKHz以上、優選為1MHz，這是在本發明中通過組合納米孔和通過納米孔的DNA鏈的拉曼散射光譜計量而產生的新的課題。作為實現這樣的超高速檢測的手段，與以往的顯微鏡系統中通常使用的CCD(電荷耦合元件)相比，優選為CMOS (互補型金屬氧化膜半導體)。在CXD中按照檢測元件整體、或者以I列單元使像素依次進行AD轉換，與此相對，在CMOS中也可對二維狀地排列的全部檢測像素同時進行AD轉換，可將AD轉換所需要的時間縮短幾百?幾千倍。不限於CMOS，如果每個檢測像素是具有AD轉換功能的檢測器則可獲得同樣的效果。另外，為了削減將由檢測器取得的大量的信號介由電纜、板(board)轉送於控制用電腦、書寫入內置的硬碟等所需要的時間，因而在檢測器中內置大容量的存儲器、從而不經由上述而保管大量的信號，這也有效。另一方面，伴隨著檢測的高速化，各個計量的曝光時間顯著降低。為了防止由此導致的靈敏度降低，對於本發明而言優選的構成是:導入增強場、使用液浸型的高數值孔徑物鏡、或者檢測器使用雪崩光電二極體等高靈敏度元件，或具有圖像增強器、電子倍增型CCD (EM-CCD)等倍增機構，等等。即，在本發明中，優選使用具有倍增機構的檢測器。
[0173]根據本實施例2則可對於多個納米孔同時取得拉曼散射光譜，因此具有計量的多重度高，結果的可靠性高這樣的特點。此外，具有在進行多重度高的計量的情況下通量高這樣的特點。
[0174]作為本實施例的變形例，也可對各個納米孔逐一地設置獨立的試樣用腔室，使用各個納米孔同時地計量不同的試樣。另外，該變形例具有可並列地計量多個試樣因而通量高這樣的特點。
[0175]另外本例中，是在導電性薄膜對(例如，1130a與1130b，或，1131a與1131b)之間形成納米孔，生物聚合物通過該納米孔內的構成。也可以通過改變納米孔，將導電性薄膜對之間設為流路來實施。通過與基板面平行地使生物聚合物移動，使其通過導電性薄膜對(1130a與1130b，或，1131a與1131b等)之間，此時同樣地檢測產生的拉曼散射光，從而可以並列地計量多個試樣，能夠進行通量高的解析。
[0176][實施例3]三明治結構的納米孔晶片
[0177]使用圖13說明本發明的進行生物聚合物特性解析的納米孔晶片的構成的一個例子。圖13是本實施例3的納米孔晶片IOOb的包含納米孔120的中心軸121的xz截面的示意放大圖。基板110在z軸上方的基板面具有薄膜部分111a，在其上具有導電性薄膜130a、130b，進一步在其上具有薄膜部分111b。其它與實施例1的變形例(圖10)同樣。
[0178]本實施例3的納米孔晶片IOOb的製作法與實施例1 (的變形例)類似，但是通過EB刻蝕形成導電性薄膜130a、130b的圖案後,通過派射形成膜厚約20nm的由SiO2形成的薄膜部分11 Ib，其後通過TEM而形成納米孔這一點不同。薄膜部分11 Ib薄因此納米孔晶片IOOb的外觀與實施例1 (的變形例)同樣，即如圖9那樣。
[0179]本實施例3的運作與實施例1 (的變形例)同樣，但是以下的點不同。第1，導電性薄膜130a、130b由薄膜部分Illb被覆著，因此可與試樣相互作用的近場局限於納米孔120的內部。剩餘的近場被封入薄膜部分111a、薄膜部分Illb的內部，因此無法與包含生物聚合物的試樣相互作用。因此具有如下特點:不產生來源於存在於除了作為目標的納米孔120內部以外的空間中的試樣的背景信號，S/N高。第2，近場形成於納米孔120的中心軸方向的恰好中央附近，因而通過納米孔而限制著作為試樣的DNA等生物聚合物的xy方向的運動，因此試樣可與均勻的近場相互作用，因此具有所獲得的信號的重現性高這樣的特點。第3，在通過納米孔120的過程中DNA在軸方向伸長，因而具有如下特點:可消除高級結構，可按順序將各個鹼基導入近場，試樣的序列上的觀測區域與測定時刻的對應關係簡單化，容易解析。
[0180][實施例4]通電於導電性薄膜的納米孔晶片
[0181]使用圖14說明本發明的生物聚合物特性解析用的納米孔晶片的構成的一個例子。圖14是本實施例4的納米孔晶片IOOc的示意圖。如圖示那樣納米孔晶片IOOc由基板110、納米孔120、以及導電性薄膜130a、130b、布線圖案132a、132b、觸點133a、133b等構成。布線圖案132a、132b、觸點133a、133b分別與導電性薄膜130a、130b電導通。[0182]布線圖案132a、132b、觸點133a、133b與上述的實施例中的導電性薄膜130a、130b同樣地形成了。不同的是，使用了金作為布線圖案、觸點的材質，布線圖案採用了 I微米作為厚度，觸點採用了 100微米作為厚度等等。
[0183]本實施例4的生物聚合物的光學解析裝置與實施例1?3同樣，但是以下的點不同。即，本實施例4中，從觸點133a、133b介由卡緣連接器(card edge connector)(沒有圖示)，按照成為反相位的方式連接於試樣驅動裝置700的第2電壓輸出。
[0184]本實施例4的運作與上述的各實施例同樣，但是以下的點不同。即，在本實施例4中，從試樣驅動裝置700將脈衝狀的電壓施加於試樣用腔室，從而使生物聚合物穿過納米孔120而泳動了。另外，通過雷射器照射而在導電性薄膜130a、130b的端部形成了近場。試樣驅動裝置700的脈衝為OFF之時，泳動電壓被解除，並且觸點133a、133b被施加反相位、即，ON脈衝，該脈衝電壓通過布線圖案132a、132b傳輸到導電性薄膜130a、130b，施加於其端部131a、131b(沒有圖示)。於是，作為生物聚合物的DNA的磷酸基被誘引到導電性薄膜130a、130b的陽極側的端部，因而這個期間可暫時地強制性地停止DNA的泳動。在這個期間，取得基於生物聚合物的拉曼散射光的強度比。同樣地，試樣驅動裝置700的脈衝為ON之時,施加泳動電壓,並且觸點133a、133b被施加反相位、即OFF脈衝，解除DNA的泳動的暫時強制停止，因而再次開始DNA的泳動。這個期間未檢出拉曼散射光。
[0185]在本實施例4中具有如下特點:不僅通過泳動電流的脈衝驅動，而且通過使基於對導電性薄膜的電壓施加而進行的生物聚合物的強制停止/解除與泳動電流的脈衝同步地進行，從而可更精密地控制生物聚合物通過納米孔的移動。
[0186][實施例5]使用了石墨烯作為導電性薄膜的納米孔晶片
[0187]使用圖15和圖16而說明本發明的生物聚合物特性解析用的納米孔晶片的構成的一個例子。圖15是本實施例5的納米孔晶片IOOd的示意圖。納米孔晶片IOOd由基板110、納米孔120、以及導電性薄膜130c、130d等構成。如圖示那樣本實施例5與實施例3類似，但是主要是以下的點不同。第1，使用了單層的石墨、即，石墨烯(graphene)作為導電性薄膜130c、130d。第2，導電性薄膜130c、130d的平面形狀按照由框狀的結構將周圍包圍的形式而相互地連結著。換言之，導電性薄膜130c、130d是具有空隙134a、134b的I張薄膜狀的結構物。(空隙134a、134b也在納米孔120的部分處相互地連結著)。第3，納米孔120的直徑採用了 2nm這一點不同。
[0188]圖16是包含納米孔120的中心軸121的xz截面的示意放大圖。由於放大率高，因此未圖示導電性薄膜130c、130d的外框。
[0189]本實施例5的納米孔晶片IOOd的製作法與實施例3類似，但是在基板110上形成薄膜部分Illa後的工序不同。S卩，另行,使用機械剝離法從石墨製作石墨烯(graphene),通過光學顯微鏡確認是單層。使用Schneider等人的Nano Letters (2010) 10, 1912中記載的楔固(wedging)法，將該石墨烯轉送於作業用的支撐基板之上。使用高焦點的TEM(加速電壓300kV)，從而對支撐基板連同石墨烯照射電子束而對碳進行衝壓，形成了空隙134a、134b及其連結部分。從TEM取出支撐基板，再次使用楔固(wedging)法，從而將實施了上述加工的石墨烯轉送於基板110的薄膜部分Illa之上。其後與實施例3同樣地，通過濺射形成薄膜部分111b，進一步使用TEM(對空隙134a、134b的連結部分照射電子束)形成了納米孔 120。[0190]本實施例5的運作與實施例3同樣，但是以下的點不同。第1，由石墨烯形成導電性薄膜130c、130d，因此其厚度為約0.3nm、極其薄。因此，在其端部131a、131b之間形成的近場的厚度也為Inm以下、極其薄，就連DNA的鹼基數也為I?3鹼基左右，具有空間解析度高這樣的特點。即，具有如下特點:基於上述的差分法的解析的誤差少，並且可以以更高的準確度識別鹼基的種類。第2，由於導電性薄膜130c、130d由石墨烯形成，因此其端部131a、131b的厚度為極其薄，在厚度方向考慮時則銳尖。關於近場，前端是銳尖時則具有電場集中而增強效果變高這樣的特點。第3，具有如下特點:由於導電性薄膜130c、130d由石墨烯(即碳)形成，因而與銀相比對於在水溶液中的氧化等的穩定性高。另外，在本實施例中使用了單層的石墨烯，但是也可使用2層至15層左右的石墨烯。即使在使用這些多層的石墨烯或石墨的情況下，也可形成5nm以下的極其薄的導電性薄膜，因此不僅可獲得與上述同樣的效果，而且也具有強度高這樣的特有的效果。第4，具有納米孔的內徑小因而可抑制試樣的通過速度這樣的特點。
[0191]作為本實施例5的變形例，可採用撤去導電性薄膜130c、130d的外框而分別獨立，如實施例4那樣拉出布線而連接於外部裝置的方法。通過採用隧道電流的計量裝置作為外部裝置，從而可計量出穿過導電性薄膜130c、130d的端部131a、131b間的試樣而流動的隧道電流。該變形例具有端部的厚度薄因而隧道電流計量中的空間解析度高這樣的特點。將該變形例與實施例1至實施例5組合，從而可同時進行拉曼測定和隧道電流測定。通過互補地使用兩者的結果，從而可提高解析結果的可靠性。另外，也可通過使用一方的結果而檢測出DNA的鹼基的存在，取得另一方的計量時機的同步，從而提高計量的S/N，提高解析結果的可靠性。
[0192]另外，可將本發明的設置有導電性薄膜的納米孔晶片適用於螢光計量方式、例如，使用螢光探針的納米孔測序儀。在此情況下，通過活用利用導電性薄膜而形成的近場，從而可實現高靈敏度、且高的空間解析度。
[0193]進一步，將構成上述的本發明的各要素、以往的技術組合2種以上，從而進一步提高解析精度，這也是有效的。
[0194][實施例6]2分割比率分光檢測裝置
[0195]使用圖17說明關於本發明的生物聚合物的光學解析裝置中的檢測裝置的構成的一例。圖17是本實施例6的生物聚合物解析用的檢測裝置的構成圖。圖3和圖12所記載的光源、擴束器的部分省略了。
[0196]作為測定基板使用納米孔晶片100或多納米孔晶片1100。以下的說明中對多納米孔晶片1100的情況進行說明。從基板上的多個納米孔120，分別獨立地產生來源於試樣的拉曼散射光。該拉曼散射光用物鏡240聚光，通過分色鏡230，利用濾波器250除去瑞利散射光後，用2分割比率分光檢測裝置260檢測。2分割比率分光檢測裝置260由2分割比率分光檢測裝置用分色鏡32、輔助濾波器17a、17b、成像透鏡18a、18b、二維傳感器照像機19a、19b、二維傳感器照像機控制器20a、20b構成。
[0197]被聚光了的拉曼散射光利用2分割比率分光檢測裝置用分色鏡32而分離成每個波長以不同的比率分割出的光束。將分離出的光束分別通過輔助濾波器17a、17b，使該像用成像透鏡18a、18b成像於二維傳感器照像機19a、19b (高靈敏度冷卻二維CXD照像機)，進行檢測。照像機的曝光時間的設定、光圖像的攝取時機等的控制介由二維傳感器照像機控制器20a、20b而控制PC21來進行。另外，濾波器組件250中，組合使用作為光源的雷射除去用的節點濾波器、與使進行檢測的波長帶透射的帶通幹涉濾波器。雷射除去用的節點濾波器使用所使用的雷射器專用的周知的特性的濾波器。將帶通幹涉濾波器(和輔助濾波器17a，17b)的概略特性示於圖18(A)中，將2分割比率分光檢測裝置用分色鏡32的概略特性示於圖18(B)中。另外橫軸作為波數而表示。
[0198]另外，裝置具備自動對焦機構、以及用於基板位置調整等的透射光照明、反射光照明、透射光/反射光觀察用鏡筒、和TV照像機(沒有圖示)、和監視器22。可以用滷素照明等實時地觀察基板1100的狀態。
[0199]作為本實施例中使用的二維傳感器照像機19a、19b，使用CCD區域傳感器。可以使用各種像素尺寸、像素數的CCD區域傳感器。例如，使用像素尺寸為16X16微米且像素數512X512像素的高靈敏度電子倍增型冷卻CXD照像機。另外，作為二維傳感器照像機，除了 CCD區域傳感器以外，一般可以使用C-MOS區域傳感器等攝像照像機等。CCD區域傳感器中，根據結構，有背面照射型、正面照射型，可以使用任一種。此外，如本實施例那樣在元件內部具有信號的倍增功能的電子倍增型CCD照像機(EM-CCD)等也在實現高靈敏度化方面是有效的。此外，傳感器期望為冷卻型，為一 20°C左右以下，從而可以降低傳感器所具有的暗噪聲，可以提聞測定的精度。
[0200]每I處納米孔的CXD的必要像素為3X3像素左右或其以上，在該中央部檢測納米孔中的拉曼散射的亮點。在512X512像素的(XD區域傳感器的情況下，也能夠同時地檢測最大29000個納米孔中的拉曼散射，進行識別。如果擴大納米孔彼此的配置間隔，則與其對應地同時計量納米孔數減少。在納米孔的尺寸為其以上、或基板尺寸更寬廣的情況下，也能夠對區域進行劃分而分割進行計量。該情況下，在工作檯下部配置用於使基板的位置移動的X — Y移動機構部，用控制PC21控制向照射位置的移動、光照射、光像檢測。本實施例中X — Y移動機構部未圖不。
[0201]接下來對拉曼散射光的檢測和識別進行說明。具體而言，從多納米孔晶片1100的多個納米孔，檢測來源於試樣的拉曼散射光，識別該試樣成分，即鹼基的種類並測定強度的方式進行說明。
[0202]圖17中，將對二次傳感器照像機((XD照像機)19a、19b的綜合成像倍率設為20倍，計量來自各納米孔的拉曼散射光。在多納米孔晶片1100內的納米孔配置成4微米X4微米的格子狀的情況下，將納米孔彼此的間隔分割成5份而以CCD像素檢測。
[0203]例如，使用分散元件進行波長分散的情況下，格子點的最接近的間隔為4微米，以CCD像素數計為5像素。在5像素以內使拉曼散射光譜分散，進行光譜分離實質上困難。此夕卜，實際的成像圖像中，各個納米孔的發光亮點不收納於I像素而具有擴展，因此遍及數像素而成像，重疊進一步變大，因此光譜分離變得更困難。
[0204]本實施例中，由於不使來自納米孔的拉曼散射光分散而進行成像，因此這樣的限制消失。對於高密度地配置的多納米孔晶片的測定是有效的。
[0205]各鹼基的拉曼散射光(例如圖7)分別以不同的比率到達二維CXD照像機19a、19b。二維CXD照像機19a、19b中，沒有波長方向的信息，僅獲得亮點的亮度信息。具體而言，拉曼散射光分離成由圖7所示的光譜與圖18(B)所示的光譜的累積來確定的反射光像和透射光像，獲得各自的亮點。圖8中顯示亮點為分別來源於A、C、G、T的拉曼散射像時的各亮點所含的光譜分布和比率。圖8(A)是相當於圖7的拉曼散射光的各鹼基的透射光光譜成分，(B)是反射光光譜成分。由於各鹼基的拉曼散射光譜(圖7)不同，因此每個鹼基種類利用2分割比率分光檢測裝置用分色鏡32進行透射的光譜成分與進行反射的光譜成分不同，檢測到的透射強度與反射強度不同。即，如圖8(C)那樣，對於每個鹼基種類，相對於全部強度的透射強度的比率不同，可以由該比率來識別鹼基種類，能夠判定通過納米孔的鹼基。這樣，使用每個波長以不同的比率分割的分色鏡，分割一個亮點的光強度，將它們利用不同的像素進行檢測，從而可以識別來自4種鹼基的拉曼散射，並進行檢測。對於控制PC21，從各CCD照像機的圖像，挑選出各納米孔的亮點，計算出其強度之比，識別鹼基的種類。
[0206]另外，可以使用的分色鏡的特性不限於本實施例所示的特性，只要是具有使4種以上的拉曼散射的反射強度與透射強度的比率為不同(可以區分)組合的特性，則能夠適用。此外除了 DNA的鹼基序列以外也可以適用於RNA序列等。
[0207]此外，二維CXD照像機19a、19b不需要為2個，也可以為I個。該情況下只要在使分割出的像成像於相同二維CCD照像機時，將圖像橫向錯開等而使位置不同即可。
[0208]本實施例中，對4種鹼基的識別進行了說明，但也能夠為3種，此外5種、6種以上的組合也能夠使用。
[0209]本實施例中，作為分色鏡32，使用在指定的波數範圍內具有透射率實質上大致為0%?大致為100%的大致線形的特性的2色性鏡,但也可以為大致10%?大致80%的大致線形的特性。此外根據所使用的多個散射光譜，在每個任意的波數帶，透射率、反射率可以為不同特性的分割鏡。例如，也同樣能夠是每個特徵性的拉曼散射峰的波數，階梯狀地變化的特性的鏡(圖19中示意地圖示)。
[0210]根據本實施例，精密配置多個納米孔，在具備多個檢測像素的多個檢測器的特定像素中分別成像來源於進入到各納米孔的生物聚合物的拉曼散射光，測定每個檢測器的強度比，從而可以識別構成生物聚合物的單體的種類。特別是可以用I臺或2臺作為檢測器的二維C⑶照像機來檢測識別3種或4種以上單體。由此，可以抑制裝置成本。當然，也能夠每I分子都進行檢測。
[0211]此外，本實施例中，使用將納米孔以一定間隔的格子狀地配置的基板。通過格子狀地配置納米孔，從而透射像與反射像內的相對應的亮點的識別變得容易。在不使用格子狀地配置捕捉區域的基板的情況下也對應。在隨機地形成的情況下，只要比較兩者的圖像，進行圖案解析，或參照基準標記，判定相互地對應的亮點即可，由此也可獲得同樣的效果。
[0212]此外，每I個發光亮點的CXD的像素數為5 X 5像素，但能夠調整為4X 4像素、5 X 4像素、4 X 3像素、3 X 3像素等。即使以這些像素數進行檢測，也可以高效率地檢測識別高密度地捕捉的分子。
[0213][實施例7]2分割比率分光檢測裝置的其它構成
[0214]對本發明的生物聚合物的光學解析裝置中的檢測裝置的構成的一例進行說明。圖20是本實施例7的生物聚合物特性解析用的檢測裝置的構成圖。與圖17同樣地，圖3和圖12所記載的光源、擴束器的部分省略了。
[0215]作為測定基板，使用納米孔晶片100或多納米孔晶片1100。以下的說明中，對於多納米孔晶片1100的情況進行說明。從基板上的多個納米孔，分別獨立地產生來源於試樣的拉曼散射光。該拉曼散射光用物鏡240聚光，通過分色鏡230，利用濾波器250來除去瑞利散射光後，用2分割比率分光檢測裝置2010檢測。2分割比率分光檢測裝置2010由2分割比率分光檢測裝置用分色鏡32、反射鏡40a、40b、40c、輔助濾波器17a、17b、成像透鏡18c、二維傳感器照像機19c、二維傳感器照像機控制器20c構成。
[0216]首先，利用用於分割的分色鏡32，每個波長以不同的比率分割成透射光和反射光。對於分割出的光束，反射光用反射鏡40a反射，以指定的角度導入成像透鏡18c中。透射光用反射鏡40b和40c彎折，以其它指定的角度導入相同成像透鏡18c中。兩光束以不同的角度入射到成像透鏡18c，從而相對於二維傳感器照像機19c (高靈敏度冷卻二維CXD照像機)，錯開各自的圖像而進行成像。為了除去雜散光，輔助濾波器17a、17b使用帶通幹涉濾波器。根據情況，可以不使用輔助濾波器。二維傳感器照像機19c的圖像介由二維傳感器照像機控制器20c而由控制PC21收集並進行解析。另外，使分割透射光與分割反射光的光路的長度儘量相同，但也可以不是一定相同。圖中成像倍率是兩光束相同，但也可以為不同。只要判斷為相同亮點的分割透射光像和分割反射光像，就能夠解析。
[0217]根據本實施例，由於可以用I臺二維CCD照像機檢測來源於多個納米孔的拉曼散射光，因此計量變得簡便，同時不需要進行二維CCD照像機的由個體差引起的靈敏度校正，此外，也不需要控制測定的時機，因此測定精度提高。
[0218][實施例8]具備具有突起狀結構的流路的特性解析晶片
[0219]使用圖21說明本實施例的生物聚合物特性解析用納米流路晶片的構成的一實施例。納米流路晶片800由基板810、流路820、覆蓋玻璃840等構成。在覆蓋玻璃840上，具有用於在與流路820的兩端相當的位置導入測定試樣的開口部851、和用於導出的開口部852。流路820由基板810上的導電性薄膜形成，在中央的觀察區域830具有突起結構831，產生實施例1記載的增強場。即，在流路的I處形成具有尖銳端的突起形狀(突起狀結構)，該突起形狀相對於流路的行進方向而形成於流路的一個壁面。
[0220]進行本實施例的生物聚合物的特性解析的解析裝置的構成與實施例1同樣(參照圖3)，但試樣單元的構成是不同的。圖22是顯示試樣單元8300的構成概略的截面圖。試樣單元8300由納米流路晶片800、上部部件8310、下部部件8320、螺絲類(沒有圖示)等構成。關於上部部件8310，在其內部形成O —環8330、試樣用流路8340、8350、電極用流路8360、8370、試樣用連接埠 8341、8351、電極用連接埠 8361、8371。上部部件8310介由試樣用連接埠 8341、8351而氣密性地連接試樣送液管(沒有圖示)，此外介由電極用連接埠 8361、8371而氣密性地連接銀氯化銀電極(沒有圖示)。具有銀氯化銀電極的氯化銀的端收納於電極用流路腔室(沒有圖示)，該具有銀的端(以下，銀端)露出在電極用流路的外部。上述試樣送液管、試樣用流路8340和8350、試樣用連接埠 8341和8351、電極用流路8360和8370、電極用連接埠 8361和8371中，無間隙(無氣泡的混入)地充滿試樣溶液(沒有圖示)。因此，試樣單元8300和納米流路晶片800內的試樣溶液與銀氯化銀電極接觸，兩者電化學地導通。
[0221]使用圖3、圖21和圖22對本實施例的運作的概要進行說明。首先進行試樣單元8300的準備。具體而言，在上部部件8310與下部部件8320之間夾著納米流路晶片800而以O —環8330壓接，氣密性地連接試樣用流路8340和8350與納米流路晶片800的開口部851和852。從試樣送液管導入IOOmM KCl水溶液作為試樣溶液，在試樣單元8300的試樣用流路8340、8350、電極用流路8360、8370、試樣用連接埠 8341、8351、電極用連接埠8361、8371、和納米流路晶片800的流路820中充滿試樣溶液。
[0222]接下來將試樣單元8300設置於解析裝置200。具體而言，將試樣單元8300固定於微動工作檯600。使用微動工作檯600和未圖示的目視用光學系統，使光學系統的焦點與試樣單元8300內的納米流路晶片800的觀察區域部分830 —致。將設置於試樣單元8300的2個銀氯化銀電極連接於試樣驅動裝置700。試樣驅動裝置700內置電壓源或電流源，可以將試樣導入側的電極用連接埠 8361作為基準，向試樣導出側的電極用連接埠 8371施加電壓。
[0223]解析裝置的光學系統、和作為測定對象的DNA的測定步驟如實施例1所示。取得利用電泳而使測定試樣通過形成於導電性薄膜860的端部831的近場時的增強拉曼散射光的時間變化。
[0224]本實施例的納米流路晶片製作法與實施例1 (的變形例)中的導電性薄膜130的製作法是同樣的。在矽基板810上形成金薄膜860，塗布抗蝕劑後，利用EB刻蝕形成圖21所示的測定區域830的圖案，利用蝕刻除去其以外的區域的金，除去抗蝕劑，最後使覆蓋玻璃840蓋上而固定。關於突起結構831的尺寸，與實施例1是同等的。此外夾持於突起結構831和導電性薄膜860的流路820的寬度為約30nm。其與實施例1所記載的納米孔的孔徑大致相同，能夠不凝集地通過例如DNA分子。
[0225]本實施例中作為導電性薄膜860的材料而使用了金，但該材料不限定於金，可以適合使用一般具有導電性的材料，一般為金屬。作為能夠作為導電性薄膜而使用的其它金屬，有鉬、鈀、銠、釕等鉬族的金屬，銀、銅等。
[0226]本實施例中使用的覆蓋玻璃840的材料為玻璃、石英、光源波長下透明度高的丙烯酸系等塑料材料等。
[0227]本實施例中，測定試樣沿著流路而與基板810水平地行進。即，本實施例的生物聚合物特性解析用晶片，在並非具有納米孔而是具有納米尺寸的流路這方面，與實施例1是不同的。該結構的優點在於不需要在基板的上下設置試樣用腔室。實施例1中，由於在物鏡與晶片之間存在試樣用腔室，因此在觀察時有時由於由腔室內部的試樣溶液產生的信號而背景光增加。根據本實施例，由於可以排除該影響，因此噪聲成分減少。此外不用試樣用腔室，從而與以往任何時候相比都可以使物鏡接近於測定區域。因此，能夠使用與實施例1相比NA更高的透鏡，因此信號強度增加。結果是具有下述特徵:與實施例1相比，可以以高的S/N進行觀察。
[0228]另外作為與本實施例接近的變形例，能夠如下述的構成那樣實施納米流路晶片800a。圖23是本變形例的納米流路晶片800a的示意圖。基本構成與上述實施例和圖21類似，但如圖示那樣納米流路晶片800a，在測定區域具有2個突起形狀831、832方面與(僅具有I個突起形狀831)圖21不同。2個突起形狀的端部從流路的左右壁面分別相互相對。端部的間隔為約30nm。其與圖21的情況下的納米孔的孔徑大致相同，能夠不凝集而通過例如DNA分子。
[0229]用於本變形例的納米孔晶片800a的解析裝置、運作也同樣。關於本變形例的效果的特徵，也如上所述。此外，也能夠使本實施例和變形例所記載的流路820在基板810表面上二維地多個配置。[0230][實施例9]具備具有一列納米粒子的流路的特性解析晶片
[0231]使用圖24對本實施例的生物聚合物特性解析用納米流路晶片的構成的一實施例進行說明。納米流路晶片900由基板910、流路920、覆蓋玻璃940等構成。在覆蓋玻璃940上，具有用於在與流路920的兩端相當的位置導入測定試樣的開口部951、和用於導出的開口部952。流路920由基板910上的導電性薄膜960形成，在中央的觀察區域930，遍及流路920的整個寬度而固定有一列納米粒子931，產生實施例1記載的增強場。如圖示所示本實施例與實施例8類似，但在測定區域不存在突起形狀，取而代之的是固定納米粒子，這方面是不同的。其它與實施例8同樣。
[0232]本實施例的晶片製作方法如下所述。首先按照實施例8的步驟，製作納米尺寸的流路920。在基板表面塗布抗蝕劑，通過EB刻蝕形成流路圖案。接下來，固定金納米粒子931。在包含流路920的基板910整體塗布抗蝕劑，利用EB刻蝕(正)形成用於在流路上固定金納米粒子931的圖案。進行後烘烤，用純水衝洗，形成流路的一部分露出的狀態。利用濺射而在露出部分形成SiO2薄膜後，利用丙酮除去抗蝕劑。最終形成在流路920的底的一部分存在SiO2薄膜的狀態。使矽烷偶聯劑反應，在SiO2薄膜上加成官能團。相對於上述官能團而使金納米粒子931反應，進行結合。最後使覆蓋玻璃940蓋上，進行固定。
[0233]本實施例9的運作與實施例1 (的變形例)是同樣的。在使用了金納米粒子931的情況下，增強場產生於各個粒子的周邊和粒子間的間隙。使流路920的高度(與導電性薄膜960的膜厚相等)與金納米粒子931的直徑同等，使流路920的寬度為金納米粒子931的直徑的整數倍，從而金納米粒子931最密地填充於流路920，其結果是，測定試樣通過增強場。
[0234]根據本實施例，通過使用金納米粒子931而可以獲得與實施例8同樣的效果。此外與實施例8相比，具有可以比較簡便地製作晶片這樣的特徵。
[0235]本實施例中，作為納米粒子931的材料而使用了金，但該材料不限定於金，可以適合使用一般具有導電性的材料，一般為金屬。作為能夠作為導電性薄膜而使用的其它金屬，有鉬、鈀、銠、釕等鉬族的金屬，銀、銅等。此外，固定樹脂制的珠後，利用濺射而將各種金屬進行表面塗布，然後利用加熱等而排除樹脂成分，也可獲得同樣的效果。
[0236]另外作為與本實施例接近的變形例，能夠如下述的構成那樣實施納米流路晶片900a。圖25是本變形例的納米流路晶片900a的不意圖。基本構成與圖24類似,但如圖不那樣納米流路晶片900a，在測定區域930a具有圓筒狀的金屬結構體931a這方面與圖24的情況不同。
[0237]本變形例的製作方法與流路920的製作方法同樣，採用EB刻蝕。用於本變形例的納米流路晶片900a的解析裝置、運作與實施例8是同樣的。關於本變形例的效果的特徵，也如實施例8所記載。本變形例中配置了圓筒狀的金屬結構體931a，但其形狀也可以為三稜柱、四稜柱等多稜柱狀。此外，也能夠使本實施例和變形例所記載的流路920 二維地多個配置於基板910表面。
[0238][實施例10]具備具有多列納米粒子的流路的特性解析晶片
[0239]使用圖26說明本實施例的生物聚合物特性解析用納米流路晶片的構成的一實施例。納米流路晶片1000由基板1010、流路1020、覆蓋玻璃1040等構成。在覆蓋玻璃1040上，具有用於在與流路1020的兩端相當的位置導入測定試樣的開口部1051、和用於導出的開口部1052。流路1020由基板1010上的導電性薄膜1060形成，在中央的觀察區域1030，遍及流路1020的整個寬度而固定有多列納米粒子1031，產生實施例1記載的增強場。如圖示那樣本實施例與實施例9類似，但在不是固定有一列而是多列納米粒子1031這方面是不同的。其它與實施例9同樣。
[0240]本實施例的晶片製作方法與實施例9同樣。本實施例的運作與實施例8 (的變形例)同樣，但在以下方面是不同的。在使用了金納米粒子的情況下，增強場產生於各個粒子的周邊和粒子間的間隙。因此，與實施例8相比可以以寬範圍產生增強場。實施例8中的增強場限定於突起形狀的前端部分的直徑30nm的範圍，但根據本實施例，具有可以將增強場的範圍擴大到最大為雷射的照射斑的尺寸這樣的特徵。此外與實施例8和實施例9相比，具有可以提高每I像素的信號強度這樣的特徵。
[0241]在使用元件尺寸為16um/像素的EM-CXD，以放大倍率20倍進行觀察的情況下，CXD的I像素相當於納米流路晶片1000上的0.8um。納米粒子1031的直徑為0.lum，在流路1020以最密填充固定的情況下，在相當於CCDl像素的區域中，金納米粒子1031在流路1020的行進方向上存在大約10列。即，I像素所示的信號強度成為由大約10列金納米粒子1031產生的增強效果的累計。例如將在實施例9中泳動速度為I時測定試樣存在於增強場的時間設為I的情況下，本實施例中泳動速度為I時測定試樣存在於增強場的時間為
10。即，通過使用上述構成的納米流路晶片1000，可以以大約10倍的泳動速度獲得與實施例9同等的效果。
[0242]如上所述，根據本實施例，能夠進行更高效地並且簡便的增強觀察。此外本實施例特別適於生物體單體擔載體中的測定。
[0243]另外作為與本實施例接近的變形例，能夠如下述的構成那樣實施納米流路晶片IOOOa0圖27是本變形例的納米流路晶片IOOOa的示意圖。基本構成與圖26類似，但如圖示那樣納米流路晶片1000a，在測定區域1030a具有圓筒狀的金屬結構體1031a方面與圖26的情況是不同的。
[0244]本變形例的製作方法與流路1020的製作方法同樣，採用EB刻蝕。本變形例的用於納米流路晶片IOOOa的解析裝置、運作與實施例8是同樣的。關於本變形例的效果的特徵，如實施例8所記載。本變形例中，配置了圓筒狀的金屬結構體1031a，但該形狀也可以為三稜柱、四稜柱等多稜柱狀。此外，也能夠將本實施例和變形例所記載的流路1020 二維地多個配置於基板1010表面。
[0245]本說明書中引用的全部的刊物、專利以及專利申請，以參考方式將其全文併入本說明書中。
[0246]產業上的可利用性
[0247]本發明提供生物聚合物的光學解析裝置以及解析方法。本發明的解析裝置基於固態納米孔方式，因此結構的穩定性高並且可靠性高，另外可以通過拉曼散射而二維地以高空間解析度並且高靈敏度對生物聚合物的特性進行解析。此外，由於可以在多個納米孔中同時地解析多個生物聚合物，因此本發明的解析裝置和解析方法簡便並且高通量。因此，本發明可用於期望對生物聚合物的特性進行解析的領域例如生物技術、生物化學、醫療等領域中。
[0248]符號的說明[0249]17a，17b輔助濾波器
[0250]18a，18b，18c 成像透鏡
[0251]19a，19b，19c 二維傳感器照像機
[0252]20a, 20b, 20c 二維傳感器照像機控制器
[0253]21 控制 PC
[0254]22監視器
[0255]32 2分割比率分光檢測裝置用分色鏡
[0256]40a, 40b, 40c 反射鏡
[0257]100,100a, 100b, 100c, IOOd 納米孔晶片
[0258]110 基板
[0259]111，Illa基板的薄膜部分
[0260]Illb薄膜部分
[0261]112基板的窗部
[0262]120納米孔
[0263]121納米孔的中心軸
[0264]130,130a, 130b, 130c, 130d 導電性薄膜
[0265]131，131a，131b導電性薄膜的端部
[0266]132a, 132b 布線圖案
[0267]133a，133b 觸點
[0268]134a, 134b 空隙
[0269]200解析裝置
[0270]210 光源
[0271]220擴束器
[0272]230分色鏡
[0273]240 物鏡
[0274]250濾波器、濾波器組件
[0275]260 2分割比率分光檢測裝置
[0276]270 終端
[0277]300試樣單元
[0278]310上部部件
[0279]320下部部件
[0280]330 O-環
[0281]410，420，430 試樣用流路
[0282]440 (下部)試樣用腔室
[0283]450電極用腔室
[0284]460，470試樣用連接埠
[0285]480 (下部)電極用連接埠
[0286]540 (上部)試樣用腔室
[0287]580 (上部)電極用連接埠[0288]600 xyz微動工作檯
[0289]700試樣驅動裝置
[0290]800,800a納米流路晶片[0291 ]810 基板
[0292]820 流路
[0293]840覆蓋玻璃
[0294]851,852 開口部
[0295]830,830a觀察區域，測定區域
[0296]831，832突起結構，端部
[0297]860導電性薄膜
[0298]900,900a納米流路晶片
[0299]910 基板
[0300]920 流路
[0301]930,930a觀察區域，測定區域
[0302]931 納米粒子
[0303]931a圓筒狀的金屬結構體
[0304]940覆蓋玻璃
[0305]951,952 開口部
[0306]960導電性薄膜
[0307]1000，IOOOa納米流路晶片
[0308]1010 基板
[0309]1020 流路
[0310]1030，1030a觀察區域，測定區域
[0311]1031納米粒子
[0312]1031a圓筒狀的金屬結構體
[0313]1040覆蓋玻璃
[0314]1051,1052 開口部
[0315]1060導電性薄膜
[0316]1100多納米孔晶片
[0317]1110 基板
[0318]1120,1121 納米孔
[0319]1130a, 1130b, 1131a, 1131b 導電性薄膜
[0320]2000多解析裝置
[0321]2010 2分割比率分光檢測裝置
[0322]8300試樣單元
[0323]8310上部部件
[0324]8320下部部件
[0325]8330 O —環
[0326]8340試樣用流路[0327]8341試樣用連接埠
[0328]8350試樣用流路
[0329]8351試樣用連接埠
[0330]8360電極用流路
[0331]8361電極用連接埠
[0332]8370電極用流路
[0333]8371電極用連接埠。
【權利要求】
1.一種生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，具備: 生物聚合物的特性解析晶片，其具備固體基板、設置於該固體基板的多個納米孔、和配置於該固體基板的導電性薄膜，該導電性薄膜的至少一部分面向該納米孔而設置， 光源和照射光學系統，其用於產生進入到所述納米孔中的生物聚合物的拉曼散射光，和 檢測裝置，其具備拉曼散射光的聚光系統、將聚光的光在特定的波長範圍內以不同的比率分割成透射光和反射光的分離部、將分割出的光成像於檢測器的成像光學系統、和用於檢測成像後的光的二維檢測器， 外部光從所述光源和照射光學系統照射到所述特性解析晶片，該解析晶片中的生物聚合物的拉曼散射光在所述檢測裝置中被檢測。
2.一種生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，具備: 生物聚合物的特性解析晶片，其具備固體基板、設置於該固體基板的多個納米孔、和配置於該固體基板的導電性薄膜，該導電性薄膜的至少一部分面向該納米孔而設置， 光源和照射光學系統，其用於產生進入到所述納米孔中的生物聚合物的拉曼散射光，和 檢測裝置，其具備拉曼散射光的聚光系統、將聚光的光在每個指定的波長帶以不同的比率分割成透射光和反射光的分離部、將分割出的光成像於檢測器的成像光學系統、和用於檢測成像後的光的二維檢測器， 外部光從所述光源和照射光學系統照射到所述特性解析晶片，該解析晶片中的生物聚合物的拉曼散射光在所述檢測裝置中被檢測。
3.根據權利要求1所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，所述生物聚合物由至少4種單體構成，所述分離部對構成該生物聚合物的每種單體以透射光與反射光的強度比至少區分成4種的不同比率來分割光。
4.根據權利要求1所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，通過向所述導電性薄膜照射所述外部光，從而所述導電性薄膜在面向所述納米孔的開口部的端部產生近場，產生進入到所述納米孔中的生物聚合物的拉曼散射光。
5.根據權利要求1所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，所述導電性薄膜具有銳角的端部，該銳角的端部面向所述納米孔的開口部而配置。
6.根據權利要求1所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，所述特性解析晶片，每I個納米孔具備至少2張導電性薄膜，該至少2張導電性薄膜夾著所述納米孔的開口部而相互相對地配置。
7.根據權利要求1所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，所述導電性薄膜由金屬形成。
8.根據權利要求1所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，所述導電性薄膜由石墨形成。
9.根據權利要求1所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，所述導電性薄膜的厚度為0.1nm~10nm。
10.根據權利要求1所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，在所述固體基板的所述納米孔的中心軸方向的中間深度配置有所述導電性薄膜。
11.根據權利要求1所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，所述納米孔的深度為構成生物聚合物的單體單元的3倍以上的大小。
12.根據權利要求1所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，還具備數據處理部，其由在所述檢測裝置中被檢測到的拉曼散射光的光強度之比來解析生物聚合物的特性。
13.根據權利要求1所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，還具備試樣移動機構，其使生物聚合物中的單體逐個單元地進入到所述納米孔中。
14.根據權利要求1所述的生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，所述生物聚合物選自由核酸、肽核酸、蛋白質、糖鏈、和適體所組成的組。
15.根據權利要求1所述的生物聚合物的光學解析裝置，所述生物聚合物的特性解析為核酸的鹼基序列的確定。
16.一種生物聚合物的光學解析裝置，其特徵在於，具備: 生物聚合物的特性解析晶片，其具備固體基板、和配置於該固體基板表面的多對導電性薄膜，成對的該導電性薄膜以一定間隔相對地配置， 光源和照射光學系統，其用於產生生物聚合物的拉曼散射光， 檢測裝置，其具備拉曼散射光的聚光系統、將聚光的光在每個指定的波長帶以不同的比率分割成透射光和反射光的分離部、將分割出的光成像於檢測器的成像光學系統、和用於檢測成像後的光的二維檢測器， 外部光從所述光源和照射光學系統照射到所述特性解析晶片，該解析晶片中的生物聚合物的拉曼散射光在所述檢測裝置中被檢測。
17.—種生物聚合物的特性解析方法，其特徵在於，包括下述工序: 在權利要求1所述的生物聚合物的光學解析裝置中，向特性解析晶片照射外部光，產生進入到納米孔中的生物聚合物的拉曼散射光的工序， 在檢測裝置中檢測所述拉曼散射光的工序，和 基於所述拉曼散射光的檢測結果來解析生物聚合物的特性的工序。
18.根據權利要求17所述的生物聚合物的特性解析方法，其特徵在於，所述生物聚合物選自由核酸、肽核酸、蛋白質、糖鏈、和適體所組成的組。
19.根據權利要求17所述的生物聚合物的特性解析方法，其特徵在於，確定核酸的鹼基序列。
20.一種生物聚合物的特性解析晶片，其特徵在於，是具備固體基板、和設置於所述固體基板的至少一個流路的生物聚合物的特性解析晶片，通過照射外部光，產生進入到所述流路中的生物聚合物的拉曼散射。
21.根據權利要求20所述的生物聚合物的特性解析晶片，其特徵在於，所述流路由導電性薄膜形成。
22.根據權利要求21所述的生物聚合物的特性解析晶片，其特徵在於，在所述流路的至少I處形成具有尖銳端的突起形狀，該突起形狀相對於流路的行進方向而形成於流路的2個壁面中的任一個。
23.根據權利要求21所述的生物聚合物的特性解析晶片，其特徵在於，在所述流路的至少2處形成具有尖銳端的突起形狀，該突起形狀相對於流路的行進方向而從流路的2個壁面相對地形成。
24.根據權利要求22或23所述的生物聚合物的特性解析晶片，其特徵在於，所述突起形狀產生近場，使用所述近場而產生所述拉曼散射。
25.權利要求21所述的生物聚合物的特性解析晶片，其特徵在於，在所述流路的至少I處，橫斷流路地固定有I列以上金屬納米粒子。
26.根據權利要求25所述的生物聚合物的特性解析晶片，其特徵在於，所述金屬納米粒子產生近場，使用所述近場而產生所述拉曼散射。
27.根據權利要求21所述的生物聚合物的特性解析晶片，其特徵在於，在所述流路的至少I處，橫斷流路地固定有I列以上金屬納米結構體。
28.根據權利要求27所述的生物聚合物的特性解析晶片，其特徵在於，所述金屬納米結構體產生近場，使用所述近場而產生所述拉曼散射。
【文檔編號】G01N21/65GK103582809SQ201280027201
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年5月29日 優先權日:2011年6月3日
【發明者】高橋智, 隈崎修孝 申請人:株式會社日立高新技術