一種參芪多糖組合物及其製備方法
2023-05-30 15:17:26
專利名稱：一種參芪多糖組合物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種增強免疫力的參芪多糖組合物及其製備方法。
背景技術：
參芪扶正注射液是由黨參、黃芪提取其有效成分製成的中藥注射液，具有扶正固本、提高人體免疫功能、改善患者症狀的作用，臨床常用於腫瘤的輔助治療。但是因為中藥注射液成分複雜，且參芪扶正注射液開發時間較早，當時的技術條件落後，藥物的純化程度和質量控制均存在著不可避免的問題，越來越不符合現代臨床用藥的要求。一些臨床不良反應時有發生，例如河北醫科大學第四腫瘤醫院內科報導參芪扶正注射液導致嚴重皮疹一例；廣州中醫藥大學報導參芪扶正注射液致嚴重出血兩例；雲南省腫瘤醫院報導參芪扶正注射液致嚴重過敏反應一例，等等。並且現有參芪扶正注射液說明書也指出非氣虛症患者用藥後會出現出血症狀，部分患者用藥後可能會出現口腔炎、嗜睡、感覺異常。
黨參和黃芪都是傳統常用中藥，具有補中益氣的功效，現代藥理學證明均具有增強免疫力的作用。實驗證明黨參所含的多糖部分是其有效成分，主要含有葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和木糖形成的雜多糖；黃芪主要含有皂苷類化合物和黃芪多糖，其中黃芪多糖是增強免疫力作用的有效成分。現在市場上生產的參芪扶正注射液適應症較廣，在用於抗腫瘤輔助用藥等增強免疫力功效時因為皂苷類成分的存在，增加了不良反應的風險，並且並不是所有的多糖類成分都是有效成分，通過研究認為一定分子量範圍的多糖才有活性。因此對參芪製劑進行有針對性的進一步開發，是非常有意義的。
發明內容
本發明的目的之一是提供一種參芪多糖組合物，本發明的另一個目的是提供該組合物的製備方法，本發明還有一個目的是提供參芪多糖組合物在製備增強免疫力方面製劑中的應用。
本發明的參芪多糖的組合物，是由1-3份的黨參和1-3份的黃芪提取純化的多糖組成，其中分子量範圍為10000-100000的多糖佔總固形物的80％以上。其中優選黨參和黃芪的質量比是1∶1。
本發明參芪多糖組合物，可以按以下步驟製成1)按比例取黨參和黃芪過粉碎機打成粗顆粒，加入5-8倍量80％-95％的藥用乙醇提取兩次，過濾後藥渣備用；2)藥渣加入6-10倍量去離子水提取兩次，過濾後合併濾液減壓濃縮至相對密度1.15-1.25之間，不斷攪拌下加入95％藥用乙醇至乙醇濃度為75-85％，靜置24小時，固液分離得粗多糖；3)粗多糖溶於水，過強極性大孔吸附樹脂，收集流出液，加入1倍量床體積的去離子水洗脫，合併流出液和洗脫液；4)所得溶液過截流分子量100000的超濾柱超濾，棄去分子量超過100000的物質，收集超濾液；5)所得超濾液過截流分子量10000的超濾柱超濾，棄去分子量小於10000的物質，收集超濾母液減壓濃縮並烘乾，即得參芪多糖組合物。
其中第二步醇沉步驟優選加入95％乙醇調節純度至80％。
其中第三步樹脂純化步驟優選強極性大孔吸附樹脂為ADS-7樹脂或D280樹脂。
本發明的參芪多糖組合物的製備方法，是按以下步驟實現的1)按比例取黨參和黃芪過粉碎機打成粗顆粒，加入6倍量85％的藥用乙醇提取兩次，過濾後藥渣備用；2)藥渣加入8倍量去離子水提取兩次，過濾後合併濾液減壓濃縮至相對密度1.20-1.25之間，不斷攪拌下加入95％藥用乙醇至乙醇濃度為75-85％，靜置24小時，固液分離得粗多糖；3)粗多糖溶於水，過強極性大孔吸附樹脂(優選ADS-7或D280樹脂)，收集流出液，加入1倍量床體積的去離子水洗脫，合併流出液和洗脫液；
4)所得溶液過截流分子量100000的超濾柱超濾，棄去分子量超過100000的物質，收集超濾液；5)所得超濾液過截流分子量10000的超濾柱超濾，棄去分子量小於10000的物質，收集超濾母液減壓濃縮並烘乾，即得參芪多糖組合物。
我們還提供了參芪多糖在製備增強免疫力藥物方面的用途，包括參芪多糖注射液和注射用參芪多糖凍乾粉。
本發明所製備參芪多糖，有針對性的提取純化了黨參和黃芪中具有免疫增強作用的多糖部分，去除了其它成分，並且進一步篩分了多糖的分子量範圍，結合現代大孔吸附樹脂技術和超濾技術，截取了生理活性更強的10000-100000分子量段的參芪多糖。藥理實驗證明，我們開發的參芪多糖有很強的免疫增強效果，療效確切，並且無毒副作用。進一步開發的新型增強免疫製劑參芪多糖注射液和注射用參芪多糖凍乾粉質量穩定，可控，安全有效。
具體實施例實施例1參芪多糖的製備取5kg黨參和5kg黃芪過粉碎機打成粗顆粒，加入60升90％的藥用乙醇80℃提取3h，放出提取液，再加入60升90％乙醇80℃提取2h，合併兩次提取液回收乙醇。藥渣揮幹溶劑後加入70升去離子水回流提取2h，放出提取液，再加入70升去離子水回流提取2h，合併兩次水提液過濾，續濾液減壓濃縮至相對密度1.15-1.25之間(實測值1.18)，不斷攪拌下加入95％藥用乙醇至乙醇濃度為75％，靜置24小時，固液分離得粗多糖。粗多糖充分溶解於15升去離子水中，過濾後續濾液上預處理好的AB-8樹脂(天津市南開大學化工廠生產)(床體積BV＝10L)，收集流出液，再加入1倍床體積的去離子水洗脫，合併流出液和洗脫液。所得溶液先用截流分子量十萬的超濾柱超濾，單獨收集分子量超過十萬的物質濃縮後烘乾(樣品編號樣品1)，收集超濾液。所得超濾液過截流分子量一萬的超濾柱超濾，單獨收集分子量小於一萬的物質濃縮後烘乾(樣品編號樣品2)，收集超濾母液減壓濃縮並烘乾，即得參芪多糖組合物。樣品編號SQDT-1實施例2參芪多糖的製備取5kg黨參和5kg黃芪過粉碎機打成粗顆粒，加入70升85％的藥用乙醇80℃提取3h，放出提取液，再加入70升85％乙醇80℃提取2h，合併兩次提取液回收乙醇。藥渣揮幹溶劑後加入90升去離子水回流提取2h，放出提取液，再加入90升去離子水回流提取2h，合併兩次水提液過濾，續濾液減壓濃縮至相對密度1.15-1.25之間(實測值1.23)，不斷攪拌下加入95％藥用乙醇至乙醇濃度為85％，靜置24小時，固液分離得粗多糖。粗多糖充分溶解於15升去離子水中，過濾後續濾液上預處理好的ADS-7樹脂(天津市南開合成有限公司生產)(床體積BV＝10L)，收集流出液，再加入1倍床體積的去離子水洗脫，合併流出液和洗脫液。所得溶液先用截流分子量十萬的超濾柱超濾，棄去分子量超過十萬的物質，收集超濾液。所得超濾液過截流分子量一萬的超濾柱超濾，棄去分子量小於一萬的物質，收集超濾母液減壓濃縮並烘乾，即得參芪多糖組合物。樣品編號SQDT-2實施例3參芪多糖的製備取5kg黨參和5kg黃芪過粉碎機打成粗顆粒，加入80升80％的藥用乙醇80℃提取3h，放出提取液，再加入80升80％乙醇80℃提取2h，合併兩次提取液回收乙醇。藥渣揮幹溶劑後加入70升去離子水回流提取2h，放出提取液，再加入70升去離子水回流提取2h，合併兩次水提液過濾，續濾液減壓濃縮至相對密度1.15-1.25之間(實測值1.25)，不斷攪拌下加入95％藥用乙醇至乙醇濃度為80％，靜置24小時，固液分離得粗多糖。粗多糖充分溶解於15升去離子水中，過濾後續濾液上預處理好的D280樹脂(天津市南開大學化工廠生產)(床體積BV＝10L)，收集流出液，再加入1倍床體積的去離子水洗脫，合併流出液和洗脫液。所得溶液先用截流分子量十萬的超濾柱超濾，棄去分子量超過十萬的物質，收集超濾液。所得超濾液過截流分子量一萬的超濾柱超濾，棄去分子量小於一萬的物質，收集超濾母液減壓濃縮並烘乾，即得參芪多糖組合物。樣品編號SQDT-3。
實施例4參芪多糖的製備取5kg黨參和5kg黃芪過粉碎機打成粗顆粒，加入80升80％的藥用乙醇80℃提取3h，放出提取液，再加入80升80％乙醇80℃提取2h，合併兩次提取液回收乙醇。藥渣揮幹溶劑後加入70升去離子水回流提取2h，放出提取液，再加入70升去離子水回流提取2h，合併兩次水提液過濾，續濾液減壓濃縮至相對密度1.15-1.25之間(實測值1.25)，不斷攪拌下加入95％藥用乙醇至乙醇濃度為80％，靜置24小時，固液分離得粗多糖。粗多糖充分溶解於15升去離子水中，過濾後續濾液上預處理好的D280樹脂(天津市南開大學化工廠生產)(床體積BV＝10L)，收集流出液，再加入1倍床體積的去離子水洗脫，合併流出液和洗脫液。所得溶液先用截流分子量十萬的超濾柱超濾，棄去分子量超過十萬的物質，收集超濾液，所得超濾液過截流分子量一萬的超濾柱超濾，棄去分子量小於一萬的物質，收集超濾母液減壓濃縮並烘乾，即得參芪多糖組合物。樣品編號SQDT-4。
實施例5參芪多糖的製備取5kg黨參和5kg黃芪過粉碎機打成粗顆粒，加入50升85％的藥用乙醇80℃提取3h，放出提取液，再加入50升85％乙醇80℃提取2h，合併兩次提取液回收乙醇。藥渣揮幹溶劑後加入70升去離子水回流提取2h，放出提取液，再加入70升去離子水回流提取2h，合併兩次水提液過濾，續濾液減壓濃縮至相對密度1.15-1.25之間(實測值1.24)，不斷攪拌下加入95％藥用乙醇至乙醇濃度為80％，靜置24小時，固液分離得粗多糖。粗多糖充分溶解於15升去離子水中，過濾後續濾液上預處理好的ADS-7樹脂(天津市南開合成有限公司生產)(床體積BV＝10L)，收集流出液，再加入1倍床體積的去離子水洗脫，合併流出液和洗脫液。所得溶液先用截流分子量十萬的超濾柱超濾，棄去分子量超過十萬的物質，收集超濾液。所得超濾液過截流分子量一萬的超濾柱超濾，棄去分子量小於一萬的物質，收集超濾母液減壓濃縮並烘乾，即得參芪多糖組合物。樣品編號SQDT-5。
實施例6注射用參芪多糖凍乾粉的製備取SQDT-5樣品20g，充分溶解於500ml注射用水中，冷藏24小時過濾，濾液加入30g甘露醇，過0.45微米的微孔濾膜，加注射用水定容至600ml，溶液加熱至80℃左右，加入0.6g活性炭，保持溫度20分鐘，過濾，精濾，分裝於7ml西林瓶中每支3ml，加塞，凍幹，壓蓋，加鋁蓋即得注射用參芪多糖凍乾粉。批號凍乾粉sqdg-1實施例7注射用參芪多糖凍乾粉的製備取SQDT-5樣品20g，充分溶解於500ml注射用水中，冷藏24小時過濾，濾液加入24g甘露醇，過0.45微米的微孔濾膜，加注射用水定容至600ml，溶液加熱至80℃左右，加入0.6g活性炭，保持溫度20分鐘，過濾，過0.22微米的微孔濾膜，分裝於7ml西林瓶中每支3ml，加塞，凍幹，壓蓋，加鋁蓋即得注射用參芪多糖凍乾粉。批號凍乾粉sqdg-2實施例6參芪多糖注射液的製備取SQDT-3參芪多糖5g，充分溶解於800ml注射用水中，冷藏24小時過濾，濾液加入2.0g的亞硫酸氫鈉，充分溶解，補加注射用水至5000ml後煮沸，再加入2.5g的活性炭煮沸20分鐘脫碳，過濾，0.22微米微孔濾器過濾後分裝於100ml瓶中，115℃滅菌20分鐘，製成輸液。批號輸液sqsy-1實施例7參芪多糖注射液的製備取SQDT-3參芪多糖6g，充分溶解於800ml注射用水中，冷藏24小時過濾，濾液加入2.0g的亞硫酸氫鈉，充分溶解，補加注射用水至5000ml後煮沸，再加入3.0g的活性炭煮沸20分鐘脫碳，過濾，0.22微米微孔濾器過濾後分裝於100ml瓶中，115℃滅菌20分鐘，製成輸液。批號輸液sqsy-2實施例8不同分子量分布的參芪多糖對小鼠非特異性免疫功能的影響實驗藥物實施例1製備的樣品2低分子量參芪多糖(＜10000分子量)，用生理鹽水配製成30mg/ml，60mg/ml兩種濃度藥液。實施例1製備的樣品1高分子量參芪多糖(10000-100000分子量)用生理鹽水配製成30mg/ml，60mg/ml兩種濃度藥液。
生理鹽水。
實驗動物雌性健康Balb/c小鼠，體重18～22g實驗方法取雌性健康小鼠50隻，隨機分為5組，生理鹽水空白對照組，低分子參芪多糖(低)劑量(300mg/kg)，低分子參芪多糖(高)劑量(600mg/kg)，高分子量參芪多糖(低)劑量(300mg/kg)，高分子量參芪多糖(高)劑量(300mg/kg)，每組10隻。分別給小鼠皮下注射各組藥物，連續注射7d。第8天處死小鼠稱重，解剖，取脾臟，胸腺準確稱重。結果用臟器指數(mg/10g)＝胸腺或脾重量(mg)/小鼠體重*10g。結果見表1表1 不同分子量參芪多糖對小鼠免疫器官，脾指數，胸腺指數的影響
注與空白組對比**P＜0.01實施例9參芪多糖體外對小鼠脾細胞增殖反應影響實驗藥物參芪多糖凍乾粉針sqdg-1，用生理鹽水配製成10mg/ml，30mg/ml，60mg/ml三種濃度藥液。參芪注射液，刀豆蛋白(ConA)，生理鹽水。
實驗動物雌性健康Balb/c小鼠，體重18～22g。
實驗方法脫頸處死小鼠後，無菌取小鼠脾臟，加Hank′s液磨碎，過濾(200目)，洗滌，懸浮於10％NBS-RPIM-1640營養液中，配製成細胞濃度為(1×1010·L-1)脾細胞懸液。在96孔培養板中，每孔加入100μl脾細胞懸液。實驗分為9組，每組10孔。1組空白組(10％NBS-RPIM-1640營養液，100μl)。2組參芪多糖(低)100mg/L，100μl。3組參芪多糖(中)300mg/L，100μl。4組參芪多糖(高)600mg/L，100μl。5組參芪注射液對照組(300mg/L)，100μl。6組ConA(5mg·L-1)誘導脾細胞增殖對照組(50μlConA+50μl 10％NBS-RPIM-1640營養液)。7組參芪多糖(低)+ConA組(50μl ConA+50μl參芪多糖100mg/L)。8組參芪多糖(中)+ConA(50μl ConA+50μl參芪多糖300mg/L)。9組參芪多糖(高)+ConA組(50μlConA+50μl參芪多糖600mg/L)。分別加入各組藥液於培養板中，置37℃，飽和溼度，5％CO2的條件下培養48h，終止前6h，每孔加入[3H]-TdR 20μl(7.4Bq/孔)。培養結束後，用多頭細胞收集器將細胞收集於49型玻璃纖維濾紙上，80℃烘乾，置閃爍杯中加入閃爍液1ml(0.5％PPO和0.05％POPOP的二甲苯溶液)，BeckmanL5-6500型液閃計數儀上讀取如[3H]-TdR dpm值，以反應脾細胞增殖程度。結果見表2。
表2 參芪多糖體外對小鼠脾細胞增殖反應影響
注與1組空白組對比**P＜0.01與6組(ConA)對比△△P＜0.01實施例10參芪多糖對正常和化療小鼠脾細胞分泌細胞因子的影響實驗藥物參芪多糖凍乾粉針sqdg-2，用生理鹽水配製成10mg/ml，30mg/ml，60mg/ml三種濃度藥液。參芪注射液，刀豆蛋白(ConA)，環磷醯胺，IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IFN-r酶標抗體及試劑，生理鹽水。
實驗動物雌性健康Balb/c小鼠，體重18～22g。
實驗方法取Balb/c小鼠100隻，隨機分為10組，每組10隻。正常小鼠給藥組分5組生理鹽水空白對照組，參芪多糖高中低(600mg/L，300mg/L，100mg/L)三劑量組，參芪注射液組(300mg/L)；化療小鼠給藥組分5組環磷醯胺化療空白組，參芪多糖高中低(600mg/L，300mg/L，100mg/L)三劑量治療化療組，參芪注射液組(300mg/L)治療化療組。分別給小鼠皮下注射各組藥物，連續注射7d，第4天時所有化療小鼠組均腹腔注射環磷醯胺(200mg/kg BW)，第8天脫頸處死小鼠，取小鼠脾臟，加Hank′s液磨碎，過濾(200目)，洗滌，懸浮於10％ NBS-RPIM-1640營養液中，配製成濃度為(1×1010·L-1)脾細胞懸液，加到24孔培養板中，每孔0.5ml，再加0.5ml ConA(10mg/ml)，置37℃，飽和溼度，5％CO2的條件下培養48h，離心吸上清液，然後用ELISA測定IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IFN-r細胞因子的含量。結果見表3，表4。
表3 參芪多糖對正常小鼠脾細胞分泌細胞因子能力的影響
注與空白組對比*P＜0.05，**P＜0.01表4 參芪多糖對化療後小鼠脾細胞分泌細胞因子能力的影響
注與空白組對比*P＜0.05，**P＜0.01實施例11對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響實驗藥物參芪多糖凍乾粉針sqdg-2，用生理鹽水配製成10mg/ml，30mg/ml，60mg/ml三種濃度藥液。參芪注射液，生理鹽水。
實驗動物雌性健康Balb/c小鼠，體重18～22g。
實驗方法取50隻雌性健康Balb/c小鼠，隨機分為5組，生理鹽水空白對照組，參芪多糖高中低(600mg/L，300mg/L，100mg/L)三劑量組，參芪注射液組(300mg/L)，每組10隻。分別給小鼠皮下注射各組藥物，連續注射7d。第8天脫頸處死小鼠，迅速剪開腹腔皮膚，無菌注射Hank′s溶液3ml於腹腔中，輕揉腹部，抽取腹腔液，1000r/min離心10min，取上清液。用PH7.4磷酸緩衝液定容至5ml，加入0.5％雞紅細胞0.4ml，於37℃，5％CO2養箱孵育30min。取適量離心推片，用瑞氏液染色1分鐘，再加等量蒸餾水，輕輕混合，經5分鐘後用蒸餾水衝洗，待幹，油鏡下觀察鏡檢，計算吞噬百分數＝(吞噬CRBC的巨噬細胞數/計數的巨噬細胞數)×100％和吞噬指數＝(被吞噬的CRBC數/計數的巨噬細胞數)。結果見表5。
表5 參芪多糖對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響
注與空白組對比*P＜0.05，**P＜0.0權利要求
1.一種參芪多糖的組合物，由1-3份的黨參和1-3份的黃芪提取純化的多糖組成，其中分子量範圍為10000-100000的多糖佔總固形物的80％以上。
2.如權力要求1所述的參芪多糖組合物，其特徵是是由1份的黨參和1份的黃芪提取純化的多糖組成。
3.如權力要求1或2所述的參芪多糖組合物，是按以下步驟製成的1)按比例取黨參和黃芪過粉碎機打成粗顆粒，加入5-8倍量80％-95％的藥用乙醇提取兩次，過濾後藥渣備用；2)藥渣加入6-10倍量去離子水提取兩次，過濾後合併濾液減壓濃縮至相對密度1.15-1.25之間，不斷攪拌下加入95％藥用乙醇至乙醇濃度為75-85％，靜置24小時，固液分離得粗多糖；3)粗多糖溶於水，過強極性大孔吸附樹脂，收集流出液，加入1倍量床體積的去離子水洗脫，合併流出液和洗脫液；4)所得溶液過截流分子量100000的超濾柱超濾，棄去分子量超過100000的物質，收集超濾液；5)所得超濾液過截流分子量10000的超濾柱超濾，棄去分子量小於10000的物質，收集超濾母液減壓濃縮並烘乾，即得參芪多糖組合物。
4.如權力要求3所述的參芪多糖組合物，其特徵是加入95％乙醇調節純度至80％。
5.如權力要求3或4所述的參芪多糖組合物，其特徵是所述的強極性大孔吸附樹脂為ADS-7樹脂。
6.如權力要求3或4所述的參芪多糖組合物，其特徵是所述的強極性大孔吸附樹脂為D280樹脂。
7.一種參芪多糖組合物的製備方法，是按以下步驟製備的1)按比例取黨參和黃芪過粉碎機打成粗顆粒，加入6倍量85％的藥用乙醇提取兩次，過濾後藥渣備用；2)藥渣加入8倍量去離子水提取兩次，過濾後合併濾液減壓濃縮至相對密度1.20-1.25之間，不斷攪拌下加入95％藥用乙醇至乙醇濃度為75-85％，靜置24小時，固液分離得粗多糖；3)粗多糖溶於水，過強極性大孔吸附樹脂，收集流出液，加入1倍量床體積的去離子水洗脫，合併流出液和洗脫液；4)所得溶液過截流分子量100000的超濾柱超濾，棄去分子量超過100000的物質，收集超濾液；5)所得超濾液過截流分子量10000的超濾柱超濾，棄去分子量小於10000的物質，收集超濾母液減壓濃縮並烘乾，即得參芪多糖組合物。
8.如權力要求7所述的參芪多糖注射液的製備方法，其特徵是第三步中所述的大孔吸附樹脂為ADS-7或D280樹脂。
9.權力要求1或3所述的參芪多糖在製備增強免疫力藥物方面的用途，包括注射液或注射用凍乾粉。
10.如權力要求9所述得參芪多糖在製備增強免疫力藥物方面的用途，其特徵是製備成注射用凍乾粉。
全文摘要
本發明涉及一種參芪多糖的組合物，由1－3份的黨參和1－3份的黃芪提取純化的多糖組成，其中分子量範圍為10000－100000的多糖佔總固形物的80％以上。本發明所製備參芪多糖，有針對性的提取純化了黨參和黃芪中具有免疫增強作用的多糖部分，去除了其它成分，並且進一步篩分了多糖的分子量範圍，結合現代大孔吸附樹脂技術和超濾技術，截取了生理活性更強的10000－100000分子量段的參芪多糖。藥理實驗證明，我們開發的參芪多糖有很強的免疫增強效果，療效確切，並且無毒副作用。進一步開發的新型增強免疫製劑參芪多糖注射液和注射用參芪多糖凍乾粉質量穩定，可控，安全有效。
文檔編號A61P37/00GK1813787SQ20051010132
公開日2006年8月9日 申請日期2005年11月18日 優先權日2005年11月18日
發明者王偉, 劉二偉 申請人:廣東大光藥業有限公司