雞貧血症病毒的中和構象表位的製作方法

2023-05-30 15:16:11

專利名稱：雞貧血症病毒的中和構象表位的製作方法
發明簡述本發明提供了CAV蛋白VP1的中和構象表位的形成和鑑定，其是在免疫動物中引發保護性免疫應答所需的。
具體地，本發明描述了抗CAV中和抗體的產生，在一基於這些所產生的中和抗體的診斷試驗中檢測了CAV(顆粒)。
公開了各種抗CAV疫苗載體，所有這些疫苗均比CAV的致病性要低，所有這些疫苗載體均顯示能產生所需的CAV的中和構象表位。
一種載體提供了基於在同一細胞中同時表達VP1和VP2的重組杆狀病毒的亞單位疫苗。第二種疫苗是活表達載體，其包括穩定攜帶VP1和VP2編碼序列的Marek氏症載體。第三種CAV疫苗包括遺傳學減毒的CAV毒株，其具有降低的致細胞病變效應。
背景技術：
雞貧血症病毒(CAV)是一種獨特的小病毒，其顆粒直徑為23-25nm，基因組由環狀單鏈(負鏈)DNA組成(Gelder blom et al.，1989，Northern et al.，1991 and Todd et al.，1990)。這一DNA在感染細胞中通過一種環狀雙鏈複製中間體進行擴增，其最近已被克隆並全部測序。CAV基因組長度為2319個核苷酸(Noteborn and De Boer，1990)，對從不同大陸分離的CAV毒株的DNA分析表明在不同分離物之間僅有微小差異(Meehan et al.，1992；保藏號M81223，Claessens et al.，1991；D10068，Kato et al.，1995；D3 1965和Pallister etal.，1994，Soine et al.，1993和1994；L14767)。最近，基於其基因組結構已將CAV歸類於環狀病毒科的新病毒家族。然而，CAV與這一病毒家族的其它成員之間不相關，這一家族由動物單鏈環狀DNA病毒組成，如豬環狀病毒和鸚鵡嘴羽病(beak-and-feather-disease)病毒(Noteborn and Koch，1995)。
CAV基因組含有一明顯的啟動子/增強子區(Noteborn et al.1994)，其調節CAV轉錄，CAV基因組的主要轉錄物是約2100個核苷酸的未剪接多順反子mRNA，其編碼分子量為51.6kDa(VP1)、24.0kDa(VP2)和13.3kDa(VP3或細胞編程死亡蛋白(apoptin))的三種蛋白質(Noteborn and Koch，1995，Noteborn et al.1992，Phenix et al，1994)。所有三種預期的CAV蛋白在CAV感染的細胞中均有合成(Noteborn and Koch，1995)。用在相同細胞中同時合成的(重組)VPl和VP2免疫接種能引發保護性應答，並可用作抗雞感染性貧血的亞單位疫苗(Koch et al.，1995和Noteborn and Koch，1994c)。
CAV在雞中能導致臨床和非臨床疾病，並已知是世界範圍的重要禽類病原體(McIlroy et al.，1992和McNulty et al.，1991)。幾日齡的小雞特別易受CAV感染。在這些動物嗜睡症中，觀察到在用CAV接種10天後出現厭食和貧血，感染後死亡率最大可增加至50％。隨著年齡的增加，抗性也增加(Jeurissen et al.，1992)。在1-3日齡時被CAV感染的雞的血細胞比容值下降。1-21日齡的雞感染CAV會導致特別是胸腺皮質耗竭。然而年齡稍大的雞可以無臨床症狀地繁殖，年齡稍大的雞中的CAV感染可以通過血清轉變的發生來確定。
皮質胸腺細胞的耗竭被認為能導致免疫缺陷，因而增加了同時感染並導致免疫失敗(Noteborn and Koch，1995)。胸腺細胞以及可能還有成紅細胞樣細胞的耗竭通過CAV誘導的細胞編程性死亡而發生(Jeurissen et al.，1992a)。CAV編碼的細胞編程死亡蛋白是這一現象的主要誘導物(Noteborn et al，1994)。
已發現母體抗體能給予抗CAV感染的重要保護，Vielitz等人(1991)報導接觸過CAV的母雞會產生大量抗體，並傳給每個卵孵出的小雞，這些抗體保護雞不受感染性貧血相關疾病的侵害。在用如下細胞的裂解物接種的母雞下的蛋的蛋黃中檢測到CAV中和抗體，所述的細胞已用CAV重組杆狀病毒共感染並產生所有三種CAV蛋白，或者主要產生VP1和VP2。在用CAV攻擊的由這些蛋孵出的子代中未顯出特異的臨床症狀(Koch et al.，1995)。
Vielitz和Landgrf(1988)已開發了一種抗感染性貧血的疫苗，其基於在雞胚中繁殖的CAV，目前這是唯一商品化的疫苗。免疫接種的種禽的子代得到保護，不受感染性貧血侵害。免疫接種是可能的，因為當母源性免疫消失時，禽類易受病毒感染而不發病。顯然使用基於未減毒病毒的活疫苗具有危險性。對3周齡雞進行實驗性感染會導致免疫系統功能的明顯下降(McConnell et al.，1993，and 1993a)，但不發病。根據這一發現，McIlroy(1992)提供了證據表明，在不發病情況下CAV也能導致可觀的經濟損失，即無臨床症狀的疾病會負面影響飼料轉化和平均體重及增加的藥療，兩者均導致可觀的財政負擔。目前，非致病的CAV尚未分離得到。
通過杆狀病毒表達系統合成的重組CAV蛋白可以用作亞單位疫苗，已證明重組CAV蛋白VP1和VP2可通過母源性免疫保護小雞(Koch et al.，1995)。由於杆狀病毒載體是昆蟲特異性病毒並已知對脊椎動物無致病性，所以其可以培養並供給雞而不會有預計不到的危險(Vlak and Keus，1990)。
通常，活病毒疫苗比亞單位疫苗誘導更好的免疫應答並且相對便宜，因此，可以使用各種CAV蛋白的免疫原性知識構建減毒CAV載體或其它重組病毒載體，如禽皰疹病毒(Nakamura et al.，1992，Morgan et al.，1993)或禽痘病毒(Nazerian et al.，1992，Boyle andHeine，1993)。這些重組病毒除了表達其自身蛋白外還應表達CAV蛋白VP1和VP2，並可用於下蛋種雞和肉雞種雞的疫苗以保護其後代抵抗感染性貧血。另外，這類載體還可用作保護母源性免疫種雞抵抗無臨床症狀的疾病。
發明的詳細描述本發明涉及雞貧血症病毒(CAV)的中和構象表位結構的產生和分析。
另外，還公開了針對CAV的中和單克隆抗體的產生，這些中和抗體顯示出是針對CAV蛋白VP1的一個構象表位。
還描述了基於這些中和抗體的用於檢測CAV的診斷試劑盒，本發明提供了中和抗體中和CAV顆粒的機制的證據。
為形成VP1的中和構象表位，需在同一細胞中合成VP2。在昆蟲細胞中僅表達VP1的重組杆狀病毒不與針對CAV的中和抗體反應，但是當VP1和VP2在一個細胞中合成時，這些中和抗體將反應。
但是在純化的CAV衣殼中僅存在VP1。本發明揭示出當VP1合成時，並且最可能的是當其形成複合體產生CAV衣殼過程中，VP2暫時與VP1結合。將CAV衣殼變性會破壞中和表位，提示中和表位是一構象表位。
另外，本發明涉及預防或治療家禽感染病毒特別是感染CAV的疫苗和組合物。
具體地，本發明涉及比CAV本身的致病性低但仍能產生中和構象表位的疫苗，用這些類型的疫苗接種雞會導致產生中和抗體，因此保護動物及其後代抵抗CAV感染。
本發明涉及含有獨立於其基因組的編碼VP1或VP2的序列的杆狀病毒載體，這一重組杆狀病毒能在同一細胞中合成VP1和VP2，從而形成CAV的中和構象表位。
本發明還涉及構建含有編碼VP1、VP2蛋白的CAV序列的Marek氏症病毒(MDV)載體，特別是這一重組MDV載體以這樣一種方式合成重組CAV蛋白，即使之能合適地製備VP1的中和構象表位。
另外，本發明描述了各種減毒CAV毒株的形成，這些毒株與野生型衍生的CAV毒株相比使在雞T細胞中產生的致細胞病變效應降低。減毒CAV毒株是通過在克隆的CAV DNA基因組中引入點突變製備的，特別是位於啟動子/增強子區的序列被突變。減毒的CAV突變毒株可以產生中和構象表位。
預防或控制特別是雞中的CAV感染的方法以及製備包括CAV的序列的重組部分的方法和製備疫苗的方法也是本發明的主題。
因此，本發明提供了與雞貧血症病毒(CAV)的病毒蛋白1(VP1)的構象表位反應的中和抗體或抗體片段或其衍生物，所述的構象表位被命名為132-1，132-2或132-3的單克隆抗體識別，所述的單克隆抗體由在法國巴斯德研究所保藏，保藏號為xxxxxx，yyyyyy，zzzzzz的雜交瘤產生。確定一種抗體是否是本發明的抗體的實驗是觀察其是否與來自保藏的雜交瘤的抗體交叉反應(或競爭)。抗體的片段和衍生物是本領域公知的，不需對本領域熟練技術人員作進一步的解釋。
本發明還提供了由上述抗體識別的雞貧血症病毒的病毒蛋白1的構象中和表位，該表位可以是一個較大分子的一部分，例如它可以與一種載體結合，或者該表位可以在一多肽鏈中(以一定的間隔)重複。優選的表位是VP1的較大部分，因為這種分子將更容易地具有正確構象。
如上所述，如果構象表位優選在一個細胞中從一個載體與VP2一起產生則其僅存在於VP1上。因此，本發明提供了生產包括如上所述構象表位的病毒蛋白1的方法，該方法包括將所述的病毒蛋白1與所述CAV的病毒蛋白2在一個細胞中一起表達，其中編碼VP1的遺傳信息與編碼VP2的遺傳信息獨立地存在於一個重組載體上。
本發明還包括用於上述方法中的載體，所述的載體包括作為兩個獨立的編碼序列的編碼VP1的遺傳信息和編碼VP2的遺傳信息。優選地，這種載體基於Marek氏症病毒載體，從而可以產生能給出抗兩種病原體的保護作用的疫苗。
一種用於本發明的病毒蛋白的非常簡單並有效的表達系統是基於杆狀病毒載體的載體，如前所述，杆狀病毒通常被認為可在脊椎動物中安全使用，因為它不感染脊椎動物。
本發明還提供了產生具有非常重要的中和構象表位但是致病性降低的疫苗或疫苗成分(例如減毒病毒)的途徑。
這一點可通過提供如下方法達到，所述的方法用於提供包括本發明的中和構象表位的病毒蛋白1，所述的方法包括從編碼VP1和VP2的基因表達至少VP1和VP2的功能部分，其中至少一個基因處於衍生於轉錄起始位點上遊的CAV序列的調控區的控制之下，所述的調控區經修飾以降低其作用。以這種方式，可以產生複製不是很快並因此致病性降低(即減毒)的重組病毒。
這種病毒顆粒也是本發明的一部分，如上所述，修飾優選地位於啟動子/增強子區，並且最優選的是修飾位於啟動子/增強子區的12bp插入片段中。
由本發明的任何方法得到的重組病毒顆粒也是本發明的一部分，用於本發明的方法的核酸也是本發明的一部分，如包括編碼至少VP1的功能部分的基因和編碼VP2的功能部分的基因的載體，其中至少一個基因處於調控序列的控制之下，所述的調控序列經修飾以降低其作用。
本發明的抗體和表位還可用於針對試劑盒中用於檢測或確定樣品中是否存在CAV或CAV抗體。
本發明還提供了用於治療和預防CAV相關疾病的疫苗，所述疫苗包括本發明的抗體或表位及合適給藥的佐劑和/或合適給藥的賦型劑；本發明還提供了用於治療和預防CAV相關疾病的疫苗，所述疫苗包括本發明的重組病毒顆粒及合適給藥的佐劑和/或合適給藥的賦型劑。
本發明將基於如下實驗部分更詳細地說明，這僅是為舉例描述的目的，不應看作是對保護範圍的限制。
實驗純化CAV顆粒以誘導抗CAV的中和單克隆抗體為產生抗CAV的中和單克隆抗體，用純化的CAV顆粒注射小鼠。
用MILLITAN 300-kDa濾膜(Millipore，USA)將1升CAV感染的MDCC-MSB1細胞培養物上清濃縮40倍，將上清對10mMTris(pH8.7)-1mM EDTA(TE)緩衝液透析。然後向該CAV衣殼懸液中加入十二烷基硫酸鈉(SDS)至終濃度為0.5％，在37℃保溫30分鐘。最後在30％蔗糖墊層上沉澱CAV衣殼，將含CAV衣殼的沉澱物重懸於1ml TE緩衝液中。用100μl CAV衣殼懸液注射小鼠兩次。
體外中和試驗將候選單克隆抗體的上清以1∶2稀釋並製成2倍稀釋系列，將稀釋的上清與104-105 TCID50 CAV-Cux-1保溫1小時(VonBulow et al.，1983，Von Bulow，1985)。約10萬個用Marek氏症病毒轉化的T細胞系MDCC-MSB1的細胞被稀釋的上清和病毒的這一混合物感染(Yuasa，1983，Yuasa et al，1983)。
免疫螢光分析和免疫過氧化物酶分析用80％丙酮固定細胞並如Noteborn等人(1990)描述，將細胞與CAV特異性單克隆抗體和螢光素綴合的山羊抗小鼠IgG進行免疫螢光分析。
如Jeurissen等人(1988)所述，用CAV特異性單克隆抗體進行重組VP1/VP2-MDV感染的CEF的免疫過氧化物酶染色。
酶聯免疫吸附分析(ELISA)用在50mM碳酸氫鈉pH9.6中以1∶10,000稀釋的CAV特異性中和單克隆抗體132.1包被微滴孔(Greiner，FRG)，用含0.05％Tween80的自來水洗孔三次。用含4％馬血清、51g/l NaCl和0.05％Tween80的磷酸緩衝鹽水(飽和緩衝液)100μl在37℃飽和孔30分鐘，用含0.05％Tween80的自來水洗孔三次。然後，混合50μl未稀釋的雞血清和50μl濃縮30倍的含CAV顆粒的上清或50μl含重組VP1和VP2蛋白的昆蟲細胞的裂解物，並將其加到每孔中，在37℃保溫1小時，用含0.05％Tween80的自來水洗孔三次。向每孔中加入100μl在飽和緩衝液中的1∶2000倍稀釋的過氧化物酶標記的兔抗小鼠免疫球蛋白G綴合物，在37℃保溫1小時，再次用含0.05％Tween 80的自來水洗孔三次。向孔中加入100μl四甲基聯苯胺、乙酸鈉和過氧化氫酶的標準溶液，在室溫保溫10分鐘。用10％硫酸阻斷反應。如標準方法在450nm檢測各個孔。
杆狀病毒和昆蟲細胞重組杆狀病毒AcRP23-lacZ(Bishop，1992)得自英國牛津NERC病毒學研究所的R.Possee博士，如Summers and Smith(1987)所述方法純化基因組DNA。草地夜蛾(Sf9)細胞得自美國組織培養物保藏中心(CRL 1711)。如Summers and Smith(1987)所述，杆狀病毒原液在鋪滿的單層細胞上培養，並在含10％胎牛血清的TC-100培養基(GIBCO/BRL)中培養懸液。
CAV DNA的克降所有CAV DNA序列最初均來自質粒DNA pIc-20H/CAV-EcoRI(Noteborn and De Boer，1990)，用質粒DNA進行的所有克隆步驟原則上根據Maniatis等人(1982)所述的方法進行。
在大腸桿菌HB101菌株中進行DNA轉化。所有質粒均在攪拌的大體積培養物中擴增，通過CsCl梯度然後通過在Sephacryl-S500柱上過濾或在QIAGEN層析柱上過濾而純化。
重組VP1/VP2桿狀病毒的構建和篩選用帶有線性化重組杆狀病毒AcRP23-lacZ DNA的重組轉移載體pAcVP1/VP2 DNA轉染Sf9細胞，在同源重組後獲得重組杆狀病毒，其在多角體單元中摻入了分別在p10或多角體基因的啟動子調控下的兩個CAV蛋白VP1和VP2來取代lacZ。首先，通過檢測在杆狀病毒感染的昆蟲細胞的噬斑中缺少β-半乳糖苷酶活性來鑑定重組CAV病毒，然後通過在雜交實驗中用CAV特異性DNA探針確定CAV DNA序列整合進杆狀病毒基因組。
免疫沉澱分析感染後二天，將細胞與Promix標記物(ICN，USA)保溫，4小時後在E1A緩衝液(50mM Tris(pH7.5)，0.1％Triton-X-100，250mMNaCl，50mM NaF和5mM EDTA)中裂解細胞，並與針對VP2的單克隆抗體111.1在4℃保溫2小時，用E1A緩衝液洗並在PAA-SDS凝膠上分離。
MDV DNA轉染進CEF為了構建重組VP1/VP2 MDV，根據Graham and Van der Eb(1973)所述的方法進行純化的重組VP1/VP2 MDV轉移載體和DNA的共轉染，所述的DNA分離自用MDV Rispens分離物感染的雞胚成纖維細胞(CEF)。
用突變的CAV基因組轉染雞T細胞用EcoRI消化各種突變的CAV克隆，重新環化含有CAV(突變)序列的EcoRI片段，並通過Noteborn等人(1991)所述的DEAE-葡聚糖方法用該片段轉染MDCC-MSB1細胞。作為對照，用pCAV-EcoRI克隆平行進行整個程序。
結果和討論抗CAV的中和單克隆抗體的產生
Noteborn和Koch(1994)描述了兩種CAV特異性單克隆抗體，一種是針對VP2，而另一種針對VP3，這些單克隆抗體均未顯出CAV特異性中和活性，更重要的是這些單克隆抗體沒有一個是針對VP1。我們認為可以有針對VP1的中和單克隆抗體，因為衣殼主要含有VP1(Todd et al.，1990)。下面我們將描述抗CAV中和抗體的產生。
為了產生抗CAV的中和單克隆抗體，用純化的CAV顆粒注射小鼠。
為進行抗CAV的(中和)單克隆抗體的第一次篩選，用同時合成VP1和VP2的重組VP1/VP2桿狀病毒感染的昆蟲細胞(見下述)包被微滴孔。1∶1000稀釋度的具有高中和效價的CAV特異性抗血清特異地與重組VP1和/或VP2產物反應(見下述)。獲得了特異地與重組VP1/VP2產物反應的幾個不同的雜交瘤細胞系。
CAV特異性血清中和試驗表明所獲得的這些單克隆抗體中有三種具有抗CAV的中和活性，這三種CAV特異性中和單克隆抗體分別命名為132.1、132.2和132.3(在法國巴斯德研究所保藏，保藏號為xxxx、yyyy和zzzz)。
抗CAV的中和單克隆抗體的顯微鏡檢測免疫螢光分析表明三種中和單克隆抗體132.1、132.2和132.3識別CAV感染的MDCC-MSB1細胞中的特殊結構，這些單克隆抗體均不與未感染的MDCC-MSB1細胞反應。
用電子顯微鏡觀察與抗CAV的中和抗體(132.1)或單克隆抗體111.1(抗VP2)或111.3(抗VP3)保溫的純化CAV顆粒。Todd等人(1990)已報導純化的CAV衣殼僅含有很可能是VP1的50kDa蛋白質。通過免疫金標記檢測各種單克隆抗體，僅發現中和單克隆抗體132.1與CAV顆粒結合，單克隆抗體132.1與CAV顆粒的結合導致病毒裂解。另外顯示與中和單克隆抗體132.1保溫而裂解的CAV衣殼不與抗VP2或VP3的單克隆抗體結合。
這些結果揭示了中和單克隆抗體的作用機制它們引起病毒衣殼的裂解，由此導致產生非感染性顆粒。另外，這些數據表明純化的CAV顆粒(幾乎)僅含有VP1。
中和單克隆抗體是針對VP1上的一個構象表位肽掃描分析(Geysen等，1984)揭示3種中和單克隆抗體中沒有一種與從VP1或VP2或VP3衍生的12聚體有明顯反應。為簡明起見僅有用單克隆抗體132.1獲得的數據示於

圖1(針對VP1)或圖2(針對VP2)。這些結果表明中和單克隆抗體是針對一構象表位。
這些數據通過下述實驗證實。於天然條件下印跡到尼龍濾膜上的純化的CAV顆粒仍能與中和單克隆抗體132.1反應，然而當在SDS存在下煮沸後，CAV衣殼蛋白不再與單克隆抗體132.1結合。
如Noteborn等(1994b)所述用部分純化的CAV顆粒和單克隆抗體132.1、132.2或132.3在天然條件下進行免疫沉澱實驗，結果表明這些單克隆抗體能沉澱一種約50kDa的蛋白質。
從所有得出的結果可以總結出中和單克隆抗體是針對VP1的一個構象表位。
基於抗CAV的中和抗體的酶聯免疫吸附分析(ELISA)我們開發了一種複合體捕獲阻斷(CTB)-ELISA，可以使用從CAV感染的MDCC-MSB-1細胞得到的富集CAV顆粒或通過上述杆狀病毒系統合成的重組VP1/VP2蛋白。
來自CAV感染的雞的血清中含有阻斷CAV衣殼或重組VP1/VP2上的所有表位的抗體，這意味著CAV衣殼或重組VP1/VP2將不與包被的單克隆抗體132.1結合，然而陰性血清將允許CAV衣殼或重組VP1/VP2與包被的132.1結合。小於用陰性對照血清檢測的信號的0.5倍的信號將定為是陽性信號。
我們的CTB-ELISA的檢測水平是在血清中和試驗中測定的24-25的效價值，這是非常靈敏的。分析了400多個血清，與血清中和試驗比較後表明96.5％的在血清中和試驗中確定為陽性血清的血清在CTB-ELISA中呈陽性，98.3％的在血清中和試驗中確定為陰性血清的血清在CTB-ELISA中呈陰性。
重組VP1/VP2轉移載體的構建將CAV蛋白VP1和.VP2的編碼序列克隆到杆狀病毒轉移載體pAcUW51(貨號21205P)中，該載體可從PharMingen，San Diego，USA購得。這一載體如圖3所示，其含有多角體蛋白側翼區，在該區中間是杆狀病毒多角體蛋白啟動子和p10啟動子以及為兩個轉錄單位所需的含聚腺苷化信號的3』非編碼轉錄序列。該轉移載體含有在細菌中複製所需的原核序列。
質粒pET-16b-VP2(Noteborn等，日期未公開)含有380-1512位的CAV DNA序列，這一CAV DNA片段含有VP2編碼序列，兩側為484bp3』非編碼CAV DNA序列，在VP2的起始密碼子下遊106bp處，發現了位於另一讀框中的VP3起始密碼子。用限制性內切酶NdeI和NheI處理質粒pET-1 6b-VP2，用Klenow聚合酶補平粘端。分離到0.8kb CAV DNA片段。用BamHI線性化質粒pAcUW51，用Klenow聚合酶補平粘端並用鹼性磷酸酶(CIP)處理。將0.8kb CAV DNA片段與線性化的pAcUW51 DNA連接，通過限制性內切酶分析確定pAcUW51中的VP2方向。這一構建物命名為pUW-VP2。
質粒pET-16b-VP1(Noteborn等，日期未公開)含有853-2319位的CAV DNA序列，這一CAV DNA插入片段含有VP1蛋白的完整編碼序列，兩側為117bp 3』非編碼CAV DNA序列。用限制性內切酶NdeI和EcoRI處理質粒pET-16b-VP1，用Klenow聚合酶補平粘端。分離到1.45kb CAV DNA片段。用EcoRI線性化質粒pUW-VP2，用Klenow聚合酶補平粘端並用鹼性磷酸酶(CIP)處理。將1.45kbCAV DNA片段與線性化的pUW-VP2連接，通過限制性內切酶分析確定與p10啟動子單位反方向的VP1方向，這一最終構建物pAcVP1/VP2示於圖3。
重組VP1/VP2桿狀病毒的構建將編碼VP1和VP2的開放讀框獨自地克隆進一個單一桿狀病毒轉移載體pAcUW51，編碼VP1的CAV序列在杆狀病毒p10啟動子的調控之下，而VP2在杆狀病毒多角體蛋白啟動子的調控之下。用「裸露」杆狀病毒DNA和轉移載體DNA轉染Sf9昆蟲細胞，同源重組後得到已摻入VP1/VP2表達單位的杆狀病毒，該VP1/VP2表達單位已整合進重組杆狀病毒的多角體蛋白區取代了lacZ單位。鑑定重組杆狀病毒喪失了β-半乳糖苷酶活性並整合了CAV DNA序列。
CAV蛋白VP1和VP2在Sf9細胞中的表達通過考馬斯亮藍染色和用Promix(ICN，USA)或3H-亮氨酸(Amersham，UK)標記蛋白以及PAA-SDS凝膠電泳分析在用重組VP1/VP2桿狀病毒感染的Sf9細胞中CAV蛋白VP1和VP2的同時表達。
在PCT/NL94/00168中表明用重組VP1桿狀病毒感染的昆蟲細胞的裂解物中含有52kD的CAV特異性蛋白，並且在感染的昆蟲細胞中由重組VP2桿狀病毒表達VP2產生30kDa的主要特異性產物。用重組VP1/VP2桿狀病毒感染昆蟲細胞導致合成52kD和30kD的兩種CAV特異性蛋白。CAV特異性產物可以作為放射性標記的蛋白帶或考馬斯亮藍染色的蛋白帶而檢測到。後一結果表明在重組VP1/VP2桿狀病毒感染的昆蟲細胞中兩種產物均以相對較高的水平產生。用重組lacZ杆狀病毒感染的Sf9細胞不含這些CAV特異性蛋白。
因此我們獲得如下證據，即用重組VP1/VP2桿狀病毒感染的Sf9細胞的粗裂解物接種母雞能誘導抗CAV的中和抗體。
VP2在形成VP1的構象中和表位中的作用如PCT/NL94/00168中和Koch等人(1995)所報導的，獲得中和及保護性免疫應答需要重組CAV蛋白VP1和VP2的同時合成而非簡單的混合，這些資料提示VP2是一非結構蛋白，其在感染的某一階段是病毒裝配和/或VP1的正確構象所需的，由此導致中和表位的形成。需要VP2的一個解釋可能是它是一種支架蛋白，在病毒顆粒的裝配中需要它但是在最終產物中不存在(Leibowitz and Horwitz，1975)。支架蛋白的例子有腺病毒的IVa2和39kDa蛋白(D』Halluinet al.，1978；Persson et al.，1979)。這些蛋白作為形成所謂的輕衣殼的支架，但是在下一步驟中去除。VP2可能在形成CAV病毒顆粒過程中起類似的作用，但是在這一階段我們不能完全排除如下可能性，即在純化的CAV製劑(Todd et al.，1990)的電印跡中，或在上述和免疫金標記的VP2特異性單克隆抗體保溫的裂解的CAV顆粒的電子顯微鏡照片中有檢測不到的(非常)少量的VP2與VP1結合形成構象中和表位。最近，報導了在梯度純化的CAV中存在VP2的說服力不強的證據(Buchholz，1994)。
在下列實驗中，提供了當VP2同時合成時僅(優勢)存在VP1的中和表位的證據。用表達VP1、VP2的重組CAV杆狀病毒(見PCT/NL94/00168)或者VP1加VP2感染昆蟲細胞，在感染後3或4天收集感染的Sf9細胞，並用CAV特異性中和單克隆抗體132.1對其進行免疫螢光測試。僅含CAV特異性蛋白VP2的細胞根本不與單克隆抗體132.1反應，僅含VP1的細胞在與單克隆抗體132.1保溫後僅顯示出非常微弱的免疫螢光信號，然而用同時表達VP1和VP2的重組VP1/VP2桿狀病毒感染的昆蟲細胞與中和單克隆抗體132.1的結合非常強。表達VP1、VP2或VP1加VP2的昆蟲細胞的放射性標記裂解物的平行PAA-SDS凝膠電泳顯示當VP1單獨表達或與VP2一起表達時，其表達水平是相同的。
VP1和VP2的相互作用是暫時的VP1的中和表位僅當VP2存在時才能形成，所以其是構象區分的表位，這提示VP1和VP2在一短時間內互相結合。通過在非常溫和條件下的免疫沉澱，我們檢測了是否VP1能與VP2結合，用合成VP1、VP2或VP1加VP2的重組杆狀病毒感染Sf9昆蟲細胞。
結果清楚表明當VP2單獨合成或在VP1存在下，單克隆抗體111.1能沉澱VP2。在除了VP2還表達VP1的情況下，VP1很少與VP2共沉澱。當在VP2不存在下合成VP1時，單克隆抗體111.1不能沉澱VP1。這些數據表明VP1和VP2(僅以相對較少的量)互相結合，在這一結合期間，VP1可能獲得能產生中和表位的構象。
開發抗CAV感染的疫苗的基礎上述提供的結果顯示為誘導抗CAV的中和抗體，需要VP1有一特殊構象。在杆狀病毒表達系統中，這一正確VP1構象僅當同時合成VP1+VP2或者VP1+VP2+VP3時才是可能的。用例如十二烷基硫酸鈉變性VP1也能破壞VP1的中和表位，提示VP1中和表位是一種構象表位。
用於接種下蛋母雞的重組CAV產物VP1+VP2或者VP1+VP2+VP3可以通過杆狀病毒系統合成，這些CAV蛋白還可通過其它表達系統合成，例如酵母細胞，通過(反轉錄)病毒感染或在哺乳動物細胞系統中的基因擴增(CHO-dhfr系統)。
理論上說，VP1片段(與VP2或VP2和VP3聯合)的表達足以誘導保護性免疫應答。VP1的12聚體不能與抗CAV的中和抗體反應這一事實提示需要較大的VP1片段才能得到正確的VP1構象以形成中和表位。然而應理解的是微小的胺基酸突變或幾個胺基酸的缺失不會影響VP1中和表位的形成。
由CAV開放讀框編碼的2或3個蛋白能誘導保護性免疫應答這一事實也可用於開發活病毒載體。VP1+VP2或者VP1+VP2+VP3的編碼序列可以克隆到活病毒載體中。
在活病毒載體中，CAV蛋白中的一種，VP1、VP2或VP3單獨也可能適於誘導抗CAV的保護性免疫應答，通過活病毒載體表達上述CAV蛋白之一的片段也可能足以誘導保護性免疫應答。
VP3導致雞單核細胞的編程性細胞死亡這一事實(PCT/NL94/00168；Noteborn等，1994a)有利於構建不表達VP3的活病毒載體。Marek氏症病毒的複製可能被VP3誘導的編程性細胞死亡負面影響。
或者，可以產生引發抗CAV感染的中和保護性免疫應答所需的具有所需構象的表達VP1的減毒CAV。
重組MDV-VP1/VP2轉移載體的構建將編碼CAV蛋白VP1和VP2的序列克隆到Marek氏症病毒(MDV)轉移載體pMD-US10-SV(Koch，未出版資料)中，該轉移載體含有兩側有MDV US10區的SV40早期啟動子，和用於在細菌中擴增的原核序列。該轉移載體的示意圖見圖4。
將368-2319位核苷酸的CAV編碼序列插入到pMD-US10-SV轉移載體中，使之在SV40早期啟動子的調控下。這一重組轉移載體用限制性內切酶消化檢測，並命名為pMD-US10-SV-VP1/VP2。
通過在549位引入一點突變(T變為A)而在編碼VP3的基因中引入另一個終止密碼子(Noteborn，未出版資料)，因此插入的CAV序列僅表達VP1和VP2。用載體pMD-US10-SV-VP1/VP2轉染的雞胚成纖維細胞(CEF)的間接免疫螢光分析證實確實有VP1和VP2的表達，而不表達VP3。
重組VP1/VP2 MDV的構建使用磷酸鈣轉染法將重組轉移載體pMD-US10-SV-VP1/VP2DNA和MDV(Rispens分離物)轉染CEF細胞。同源重組後，獲得重組MDV，其在US10區摻入了CAV編碼序列(Nakamura et al.，1992)。驗證該重組VP1/VP2 MDV表達VP2。通過平行噬斑純化和使用針對VP2的單克隆抗體的免疫過氧化物酶分析，得到了幾個100％純化的重組VP1/VP2 MDV獨立毒株。
重組VP1/VP2 MDV的鑑定通過PCR和限制性內切酶分析確定CAV-DNA序列正確整合進MDV基因組。通過各種純化的重組VP1/VP2 MDV的後續傳代，表明它們是穩定的。沒有得到(部分)喪失了VP1/VP2表達單位的重組子。
通過間接免疫螢光證實了用重組VP1/VP2 MDV感染的CEF細胞中CAV蛋白VP1和VP2的同時表達，使用了抗VP2的單克隆抗體CVI-CAV-111.1(111.1)和抗VP1的單克隆抗體CVI-CAV-132.1(132.1)。
單克隆抗體132.1是針對VP1的一個中和表位，中和抗體132.1能識別與VP2同時合成的重組MDV表達的VP1這一事實提示所需的中和表位存在於MDV表達的VP1上。因此，用重組VP1/VP2 MDV免疫接種雞將導致誘導中和/保護性抗體應答。除了合成CAV VP1和VP2蛋白之外，重組VP1/VP2 MDV將合成誘導抗MDV感染的保護性免疫應答所需的MDV蛋白。
基於克隆的CAV基因組pCAV/EcoRI產生減毒CAV用CAV-EcoRI克隆產生活的感染性CAV顆粒，為此，將完整的CAV插入片段即2319bp EcoRI片段從細菌序列中分離並用DNA聚合酶處理重新環化。然後用重新環化的EcoRI片段轉染例如MDCC-MSB1細胞，幾天後將產生野生型CAV。
可以在CAV-EcoRI克隆的CAV序列中導入突變，然後分離、重新環化並轉染進MDCC-MSB1細胞，理論上可以得到突變的CAV而不是野生型CAV，並且如果突變體致病性降低，則得到了減毒CAV。產生減毒CAV的完整策略見圖5所示。
含有突變的啟動子/增強子區的CAV基因組的構建CAV的啟動子/增強子區的一個顯著特徵是由12bp插入序列間隔的4或5個近乎完全的21bp重複序列組成的序列(Noteborn et al.，1991)，這一區域參與CAV轉錄的調控(Noteborn et al.，1994b)。
為產生減毒CAV，我們在CAV-EcoRI克隆的12bp插入序列/直接重複區中導入了突變(Noteborn et al.，1991)，野生型CAV和各種CAV突變體的突變的啟動子/增強子區示於圖6。Nae突變體完全不含12bp/直接重複區，取而代之的是引入了一個NaeI位點(5』-GCCGGC-3』)，其在圖6中示為「N」。
CAV-EcoRI含有5個直接重複序列，所有其它突變體含有4個原始的直接重複序列。稱為「6bp」、「12bp」、「24bp」的各種CAV突變體含有變化的12bp插入序列。突變體「wt in Nae」以及稱為「野生型」的原始CAV-EcoRI克隆含有原始12bp插入序列5』-AAGAGGCGTTCC-3』。
CAV突變體「6bp」、「12bp」、「18bp」、「24bp」和「wtin Nae」均含有位於12bp插入序列/直接重複區兩側的額外序列，在這一區域的5』位點引入了接頭5』-GCCCATGT-3』，在3』位點引入了接頭5』-GATCCGCC-3』。
突變的CAV基因組導致產生減毒的感染性CAV為確定突變的CAV基因組是否能產生活CAV顆粒，首先檢測VP3的合成。在轉染後的各個時間點上，用丙酮固定各種轉染的MDCC-MSB1細胞培養物的一部分，並用抗VP3的單克隆抗體經間接免疫螢光分析，同時將1ml每種培養物加入到9ml補加10％胎牛血清的新鮮RPMI培養基中。
在6天和11天後，分別約有15％和90％的用「野生型」重新環化的CAV基因組DNA轉染的培養MDCC-MSB1細胞含有VP3(細胞轉染後經一次傳代)。
發現缺少完整12bp插入序列/直接重複區的CAV突變基因組「Nae」不產生感染性病毒顆粒。轉染後6天，最多有2℃的細胞產生VP3，這是由於「Nae」DNA的瞬時表達所致。用僅編碼VP3並已知不能在真核細胞中複製的表達質粒pRSV-VP3(Noteborn etal.，1994b)進行的實驗獲得了類似的百分比。在3周後及幾次傳代後，在Nae-DNA轉染的MDCC-MSB1細胞培養物中不再存在VP3。
在轉染後各種時間間隔，用突變的DNA基因組「6bp」、「12bp」、「18bp」、「24bp」和「wt in Nae」轉染的MDCC-MSB1培養物中VP3陽性細胞的百分比顯著低於用野生型DNA基因組轉染的培養物中的VP3陽性細胞的百分比。這些數據提示各種CAV突變體比野生型CAV複製速度慢，特別是突變體「6bp」和「18bp」降低了它們的複製速率。很可能12bp插入序列的突變導致突變CAV的病毒傳播降低。這些實驗的結果示於圖7。
後來，我們用來自用所有檢測的突變CAV-DNA基因組轉染的細胞的上清感染新鮮的MDCC-MSB1培養物，除了來自「Nae」-DNA轉染的細胞的上清之外，所有上清均證明含有感染性病毒顆粒。對於這些用含「突變病毒」的上清感染的培養物，可以通過間接免疫螢光表明存在含VP3的細胞。
CAV突變體具有降低的致細胞病變效應與實施檢測VP3合成的實驗平行分析了轉染細胞是否會編程性細胞死亡。已知CAV在感染後2-3天會誘導編程性細胞死亡。為此，用碘化丙錠染色細胞，碘化丙錠能強染色「正常」DNA，而對編程性細胞死亡的DNA染色較弱和/或不規則。轉染後11天幾乎所有用「野生型」DNA轉染的MDCC-MSB1細胞均發生編程性細胞死亡，而用各種突變CAV-DNA基因組轉染的細胞的大部分沒有發生編程性細胞死亡。發現CAV突變體「6bp」和「18bp」的誘導編程性細胞死亡的能力大大降低。
減毒CAV的DNA分析通過聚合酶鏈反應和對12bp插入序列/直接重複區及側翼序列的序列分析表明，對於各種CAV突變體「6bp」、「12bp」、「18bp」、「24bp」和「wt in Nae」，原始的突變並未改變。這些結果提示各種CAV突變體是穩定的，至少在MDCC-MSB1中培養約1個月後是如此，並且這些CAV突變體確實是活的並在培養的雞T細胞中的致細胞病變效應降低。
從用各種CAV突變體感染的MDCC-MSB1培養物分離的DNA的Southern印跡分析表明所有活CAV突變體產生野生型CAV所產生的所有CAV DNA，在野生型和突變CAV中均檢測到雙鏈複製中間體和單鏈DNA。
減毒CAV合成CAV特異性中和表位用中和單克隆抗體CVI-CAV132.1和抗VP2的單克隆抗體CVI-CAV111.2和抗VP3的單克隆抗體CVI-CAV85.1進行的間接免疫螢光分析表明，所有突變的CAV基因組均能合成CAV蛋白VP1、VP2和VP3。更重要的是中和單克隆抗體132.1與用各種CAV突變體感染的細胞反應，這一發現提示突變的CAV將產生所需的中和CAV特異性表位，該表位將被針對CAV免疫接種的雞的免疫系統識別，從而引發保護性免疫應答。
可以得出如下結論，基於CAV克隆pCAV-EcoRI可以製備突變的CAV基因組，導致產生活的突變CAV顆粒，這些CAV突變體在培養的雞T細胞中的複製比野生型CAV慢，由這些CAV突變體導致的致細胞病變效應也比野生型CAV低，所有CAV突變體均能產生所有的CAV蛋白，從而產生所需的VP1上的中和表位。
因此，這些CAV突變體是CAV的減毒版本。
附圖描述圖1示出用來自VP1的肽(12聚體)對132.1型中和單克隆抗體的肽掃描分析。
圖2示出用來自VP2的肽(12聚體)對132.1型中和單克隆抗體的肽掃描分析。
圖3示出重組轉移載體pUW-VP1/VP2的示意圖。
圖4示出重組轉移載體pMD-US10-SV-VP1/VP2的示意圖。
圖5示出基於含有野生型CAV的2319bp的質粒pCAV/EcoRI產生減毒CAV突變體的策略。
圖6示出各種突變的和野生型CAV毒株的CAV啟動子/增強子區的示意性結構。
圖7示出在轉染突變的或野生型環化DNA後各種突變CAV和野生型CAV的VP3表達速率，VP3表達速率以VP3陽性MDCC-MSB1細胞的百分比給出。
圖8為CAV的序列。
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權利要求
1.一種中和抗體或抗體片段或其衍生物，其與雞貧血症病毒(CAV)的病毒蛋白1(VP1)的一個構象表位反應，所述的構象表位被命名為132-1，132-2或132-3的單克隆抗體識別，所述的單克隆抗體由在法國巴斯德研究所保藏，保藏號為xxxxxx，yyyyyy，zzzzzz的雜交瘤產生。
2.一種由權利要求1的抗體識別的雞貧血症病毒的病毒蛋白1的構象中和表位。
3.一種用於生產包含權利要求2的構象表位的病毒蛋白1的方法，所述方法包括在一個細胞中將所述的病毒蛋白1與所述的CAV的病毒蛋白2一起表達，其中編碼VP1的遺傳信息和編碼VP2的遺傳信息獨立地存在於一個重組載體中。
4.一種用於權利要求3的方法中的載體，包括作為兩個獨立編碼序列的編碼VP1的遺傳信息和編碼VP2的遺傳信息。
5.權利要求4的載體，其是基於Marek氏症病毒載體的載體。
6.權利要求4的載體，其是基於杆狀病毒載體的載體。
7.一種提供包括權利要求1的中和構象表位的病毒蛋白1的方法，所述方法包括從編碼VP1和VP2的基因表達至少VP1和VP2的功能部分，其中所述的基因處於衍生於轉錄起始位點上遊的CAV序列的調控序列的控制之下，所述的調控序列經修飾以降低其作用。
8.權利要求3或7的方法，其中VP1是以病毒顆粒的形式提供。
9.權利要求7的方法，其中所述的修飾位於啟動子/增強子區。
10.權利要求9的方法，其中所述的修飾位於啟動子增強子區的12bp插入序列中。
11.由權利要求7-10任一項所述的方法獲得的重組病毒顆粒。
12.一種用於權利要求7-10任一項所述的方法中的核酸，所述的核酸包括編碼至少VP1的功能部分的基因和編碼VP2的功能部分的基因，至少一種所述的基因處於一調控序列的控制之下，所述的調控序列經過修飾以降低作用。
13.一種用於檢測或確定樣品中是否存在CAV或抗CAV抗體的診斷試劑盒，其使用權利要求1的抗體和/或權利要求2的表位。
14.一種用於治療或預防CAV相關疾病的疫苗，包括權利要求1的抗體或權利要求2的表位以及適合給藥的佐劑和/或賦型劑。
15.一種用於治療或預防CAV相關疾病的疫苗，包括權利要求11的重組病毒顆粒以及適合給藥的佐劑和/或賦型劑。
全文摘要
本發明描述了雞貧血症病毒的構象中和表位的產生以及用於預防或治療CAV感染的組合物,特別是比CAV本身致病性低的疫苗。所有這些組合物均顯示能合成抗CAV感染的保護性免疫應答所需的構象中和表位。本發明提供了從CAV基因組衍生的重組DNA分子,以及整合進其它病毒載體中的CAV基因組的重組DNA片段。具體地,這些組合物包括抗CAV感染的亞單位疫苗,重組活病毒疫苗以及減毒疫苗。本發明還提供了抗CAV的中和抗體的生產方法以及用於檢測CAV的診斷試劑盒。
文檔編號C12P21/02GK1194001SQ96195434
公開日1998年9月23日 申請日期1996年6月7日 優先權日1995年6月7日
發明者馬休斯·許貝特斯·馬麗亞·諾泰博恩, 古斯·科克 申請人:埃斯庫拉普公司