左旋內酯水解酶產生菌及其用於製備手性羥基酸的方法
2023-05-30 11:33:26 1
專利名稱：左旋內酯水解酶產生菌及其用於製備手性羥基酸的方法
技術領域：
本發明涉及一株高選擇性左旋內酯水解酶產生菌以及利用該菌株製備手性羥基酸或相應內酯的技術方法。
背景技術：
羥基酸，例如乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸和葡萄糖酸等，是一類非常重要的有機酸，在生物體內具有獨特的生理功能，而在食品/飼料工業上又是一類非常有用的功能添加劑。這種情形與胺基酸十分相似，二者在一定條件下也可以相互轉化。一些非天然的羥基酸，特別是具有光學活性的手性羥基酸，還可以作為「結構砌塊」用於各種天然產物和藥物分子的化學合成。
除單純的α-羥基酸之外，β-羥基酸、γ-羥基酸和羥基在末端的ω-羥基酸均可以在酸性條件下脫水閉環形成四員環、五員環或多員環的內酯化合物，分別稱為β-內酯、γ-內酯或ω-內酯。β-內酯和γ-內酯通常具有水果香味，而某些大環ω-內酯具有麝香香味，它們在食品和化妝品工業中有重要應用價值。另外，某些昆蟲激素和植物生長調節劑也是內酯化合物。內酯不但可以水解為相應的羥基酸，而且可以容易地與其它的醇/胺等親核試劑縮合形成多種羥基酯/羥基醯胺等衍生物，因此在精細化工和製藥工業具有廣泛用途。
在各種內酯化合物中，γ-內酯由於具有穩定的五員環結構，因此比較常見和有用。在α/β-位被單取代或多取代的γ-內酯，其結構存在於許多天然產物中，包含這種結構的化合物往往具有多種生物活性(例如細胞毒性和抗真菌活性)，因此該類化合物有可能被篩選為新的抗腫瘤或抗菌藥物。這類化合物分子中一般含有不對稱的手性碳原子，它們的生物活性往往是與它們的光學活性聯繫在一起的。合成光學活性的內酯化合物，並對其生物活性和構效關係進行研究是一項具有重要意義的工作，有助於人們發現新型藥物。
通過傳統的化學方法合成光學純手性內酯需要經過複雜的步驟並使用特殊的催化劑，通常產率不高，存在汙染和毒性問題等種種缺點，而生物催化合成法具有綠色化學的優點，方法簡單、條件溫和、反應較快，日益獲得廣泛的關注。
例如，α-羥基-γ-丁內酯是一種有用的光學活性物質。富士藥品工業的坂本惠司等(JP9308497)使用一種鐮孢黴菌Fusarium oxysporum催化α-羥基-γ-丁內酯的選擇性開環水解，得到(S)-(+)-α-羥基-γ-丁內酯和(R)-(+)-α-羥基-γ-丁酸，後者經過酸化內酯化，得到光學純度96％的(R)-(-)-α-羥基-γ-丁內酯，收率達40％。
又如，β-羥基-γ-丁內酯是非常重要的手性結構砌塊，(S)-β-羥基-γ-丁內酯是降血脂藥物阿伐他汀，神經介質L-(-)-肉鹼，HIV蛋白酶抑制劑氨普那韋(Amprenavir)，治療皮膚病藥羥基二十碳四烯酸，抗癌藥Aplysistatint等藥物的關鍵中間體。將(S)-(-)-β-羥基-γ-丁內酯還原可得(S)-(-)-β-羥基四氫呋喃，後者是愛滋病治療藥物的一種重要中間體；將(-)-β-羥基-γ-丁內酯轉化為(-)-5-羥甲基-1，3-唑啉-2-酮可得最新一代的抗菌藥物。此外，從(-)-β-羥基-γ-丁內酯出發還可以合成很多重要的天然化合物，而(R)-(+)-β-羥基-γ-丁內酯也是一種非常重要的有機合成中間體。目前主要由化學法合成得到(-)-β-羥基-γ-丁內酯。Henrot(Synth Commun，1986，16(2)183～190)以(-)-蘋果酸為原料，經甲酯化生成(-)-蘋果酸二甲酯，再經還原和酯交換後生成(-)-β-羥基-γ-丁內酯。Tanaka(Synthesis，1987，6570～573)以D-異抗壞血酸為原料，經六步反應合成了(-)-β-羥基-γ-丁內酯。Suzuki等(Enzym.Microb.Technol.，1999，2413-20)使用Pseudomonas sp.以及Enterobacter sp.等微生物的脫氯酶選擇性地對外消旋4-氯-3-羥基丁酸酯的(-)-對映體進行脫氯反應，得到(-)-β-羥基-γ-丁內酯和剩餘的(+)-4-氯-3-羥基丁酸酯。
再如，(-)-α-羥基-β，β-二甲基-γ-丁內酯，俗稱D-(-)-泛解酸內酯，是製備D-泛酸鈣和D-泛醇的重要合成中間體。D-泛酸鈣(又稱維生素B5)是重要的維生素之一，廣泛用於醫藥、飼料和食品行業中。Gl_nzer等(EnzymeMicrobTechnol，1988，10689～690)使用脂肪酶對O-乙醯泛解酸內酯進行拆分，Adam等(Synthesis，1988，5373～375)則使用腈水解酶製備了(-)-泛解酸內酯，也有人(Appl. Microbiol，1974，27(1)130～134；Enzyme Microb Technol，1987，9(7)411～416；Agric Biol Chem，1987，51289～290；Agric Biol Chem，1987，513011～3016；TetrahedronAsymmetry，1994，5(8)1419～1423)嘗試利用氧化還原酶通過不對稱氧化還原反應製備(-)-泛解酸內酯；1994年日本京都大學Shimizu等(Appl.Microbiol. Biotechnol，1995，44333～338)使用Fusarium oxysporum AKU3702催化拆分消旋泛解酸內酯；2002年我國江南大學孫志浩等人(Process Biochem，2002，38545～549)使用Fusariummoniliforme SW-902酶法拆分泛解酸內酯，均得到光學純度較高的D-(-)-泛解酸內酯。
綜上所述，在現有的手性羥基酸合成技術中，無論是化學拆分法還是現有的生物法都已取得一定進展，但仍然存在底物濃度比較低，產物光學純度不夠高，催化劑活力不夠強等或這或那的缺點，影響了這些方法在工業上的應用效果。
發明內容
本發明需要解決的技術問題是公開一株左旋內酯水解酶產生菌及其用於製備手性羥基酸的方法，以克服現有技術的缺陷。
本發明提到的左旋內酯酶產生菌—鐮孢菌Fusarium proliferatumNirenberg ECU2002，是最近從土壤中新分離到的一株專一性(-)-內酯水解酶產生菌，該菌株已於2005年10月17日保藏在中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC1494。
本發明菌株的分離篩選方法簡述如下採集了不同環境條件下400份土壤樣品，分別使用γ-丁內酯，DL-泛解酸內酯，DL-泛解酸鈉，D-泛酸鈣，D-(-)-泛解酸內酯，L-(+)-泛解酸內酯，或D-泛解酸鈉等為唯一碳源進行富集培養，篩選(-)-內酯水解酶產生菌。
(1)將土樣置於試管中，加入2mL富集培養基A(g/L)(底物1.0，NaNO34.0，KH2PO44.0，MgSO40.1，KCl0.5，ZnSO4·7H2O0.1，CuSO4·5H2O0.05)，在30℃，200r/min富集培養1天，保留有明顯微生物生長跡象的試管，每管取0.2mL富集培養液，加入裝有1.8mL已滅菌的富集培養基B(g/L)(底物5.0，NaNO34.0，KH2PO44.0，MgSO40.1，KCl0.5，ZnSO4·7H2O0.1，CuSO4·5H2O0.05)，在30℃，200r/min培養1～2天，每管取0.1mL富集培養液塗布於加有溴酚藍指示劑的平板培養基C(g/L)(底物5.0，甘油10，酵母膏7.5，蛋白腖7.5，瓊脂20)上，30℃培養2～3天。有水解活性的菌株在平板培養基C上產生水解圈，菌落周圍的培養基由藍色變為黃色，經進一步分離純化獲得單菌落。
(2)將單菌落接種到100mL豐富培養基D(甘油10，酵母膏7.5，蛋白腖7.5)，30℃，160r/min培養2～3天。經過抽濾或者離心得到溼菌體，加入10mL磷酸鉀緩衝液(100mM，pH7.0)和1％(w/v)的底物α-羥基-γ-丁內酯，在30℃，160r/min反應12h。加入乙酸乙酯萃取剩餘底物，將剩餘水相中的產物內酯化後用乙酸乙酯萃取，取樣分析水解產物羥基酸和剩餘底物內酯的光學純度。
(3)通過反覆篩選，分離得到一株產專一性(-)-內酯水解酶的鐮孢菌株(Fusarium proliferatum Nirenberg ECU2002)。
所說的鐮孢菌(Fusarium proliferatum Nirenberg ECU2002)具有如下微生物學特徵在固體培養基上培養三天，產生大量粉紅色基內菌絲，其氣生菌絲呈白色絨毛狀，有黃色色素產生，其菌落直徑約為25mm；在液體培養基中為絲狀體，初期有較多小型分生孢子，大小為6～15μm×3～4μm，後期有褐色色素產生。分生孢子梗分枝，孢子梗長約25μm，聚生或散生，小分生孢子以鏈狀著生於散生或聚生的孢子梗上，在低倍顯微鏡下觀察，在孢子梗上，分生孢子鏈呈「V」型。沒有觀察到大型分生孢子，也無厚垣孢子，可在溫度10～60℃，pH4.0～9.0和NaCl濃度0～7％(w/v)的環境中生存。
該菌株經德國DSMZ公司鑑定為Fusarium proliferatum Nirenberg類群。與以前文獻(Appl.Microbiol.Biotechnol，1995，44333～338；Process Biochem，2002，38545～549)報導的Fusarium moniliforme SW-902和Fusariumoxysporum AKU3702有明顯的不同，其主要不同之處在於本發明的Fusarium proliferatum ECU2002為粉紅色真菌，初期有較多小型分生孢子，產酶發酵時間較短為1～2天，而文獻報導的Fusarium moniliforme SW-902和Fusarium oxysporum AKU3702為白色真菌，其孢子呈珠狀較大，Fusarium moniliforme SW-902產酶發酵時間為2～3天，Fusarium oxysporumAKU3702產酶發酵時間較長為5～7天，而Fusarium oxysporum AKU3702更是一種植物致病菌。此外，本發明的Fusarium proliferatum ECU2002能水解多種內酯底物生成相應的手性羥基酸，並且對底物的濃度耐受性很強，如催化D-(-)-泛解酸內酯水解時底物濃度可高達75％w/v(文獻報導的底物濃度一般為10～30％，w/v)，經過重結晶後，產物(-)-內酯的光學純度超過99％ee。
本發明的鐮孢菌(Fusarium proliferatum Nirenberg ECU2002)可以用於製備手性羥基酸，包括如下步驟(1)將所說的鐮孢菌(Fusarium proliferatum Nirenberg ECU2002)在包含碳、氮、磷及其它無機鹽的培養基中進行發酵，獲得培養物；所說的培養基的組成和濃度(g/L)如下甘油10～50，蛋白腖1～20，酵母膏1～20，硝酸銨1～10，無機鹽NaCl0.1～2；MgSO4·7H2O0.1～2；FeSO4·7H2O0.01～0.05；ZnSO4·7H2O0.01～0.05；CuSO4·5H2O0.001～0.01；pH5～9，溫度25～35℃，基於培養基體積的接種量為1～10％v/v，培養時間12～48小時；(2)將催化劑與需要拆分的底物手性內酯化合物接觸，進行對映選擇性催化水解反應，然後從反應產物中收集未水解的(+)-內酯和由(-)-內酯水解生成的(+)-羥基酸；底物內酯的濃度為1～75％(w/v)，基於底物內酯重量的催化劑使用量為0.25～1.5克細胞/克內酯或者0.25～10單位酶/克內酯，反應溫度為25～40℃，pH6.0～8.0，反應時間為0.1～40h；選用γ-丁內酯作為內酯水解酶活力測定的底物，採用如下方法測定內酯水解酶的活力在10mL含有2％(w/v)γ-丁內酯的水相反應體系中，加入催化劑，在30℃，磁力攪拌條件下滴加0.1M的NaOH，維持反應液pH為7.0，測定消耗100μlNaOH溶液所需的時間。酶活單位(U)的定義為在上述條件下，1min催化1μmolγ-丁內酯水解為對應的羥基酸所需的酶量。
所說的催化劑是下列形式中的任意一種(1)將鐮孢黴菌ECU2002進行液體或固體培養後，通過離心或過濾收集到的菌絲體(含有大部分(-)-內酯酶)；(2)去除菌體後所剩餘的發酵上清液(含有小部分分泌到胞外的游離(-)-內酯酶)；(3)採用研磨或勻漿等方法將菌絲體破碎，再用水或緩衝液抽提所得的無細胞提取液；(4)採用適當的方法，例如凝膠包埋、戊二醛交聯或載體吸附等，處理上述含有活性酶組分的物料所得到的固定化細胞或固定化酶；所說的內酯底物包括但不限於β-丁內酯，α-羥基-γ-丁內酯，α-羥基-β，β-二甲基-γ-丁內酯(俗稱泛解酸內酯)，α-乙醯基-γ-丁內酯，β-羥基-γ-丁內酯，正丁基苯肽等。
優選的底物內酯為(±)-泛解酸內酯。
本發明的菌株產酶穩定，立體選擇性好，可以直接用發酵獲得的菌絲體作為酶源，水解拆分外消旋內酯得到高光學純度的手性羥基酸和剩餘內酯。
使用本發明的拆分工藝，能簡單方便地獲得各種類型的高光學純度手性羥基酸，是一種具有廣泛應用前景的生產方法，可以滿足迅速發展的醫藥工業的需要，以下通過具體實施例對本發明的技術內容作進一步的描述。
圖1為固定化細胞催化的多批次水解拆分反應結果。
圖2為固定化酶催化的多批次水解拆分反應結果。
圖3為固定化酶催化拆分75％(w/v)泛解酸內酯的反應進程。
具體實施例方式
實施例1鐮孢黴菌Fusarium proliferatum ECU2002的發酵培養斜面及平板培養基(g/L)甘油30，酵母膏7.5，蛋白腖7.5，瓊脂20。在121℃滅菌15分鐘，滅菌後冷卻、製成平板、接種，30℃培養2天。發酵培養基(g/L)甘油30；蛋白腖10；酵母膏10；NH4NO33；無機鹽(g/L)(NaCl1；MgSO4·7H2O1；FeSO4·7H2O0.02；ZnSO4·7H2O0.03；CuSO4·5H2O0.005)；pH7.5。121℃滅菌15分鐘，滅菌後冷卻、接種，接種量2％，在30℃，轉速160r/min的條件下進行發酵，培養2天菌體乾重達到18g/L，產酶可達90U/L以上，比活為5U/g。
實施例2細胞碎片的固定化1)取50g鐮孢菌Fusarium proliferatum ECU2002細胞，加入5g石英砂研磨1h進行細胞破壁，12,000rpm離心15min，上清液為無細胞抽提液，沉澱為細胞碎片。
2)取細胞碎片5g，加入不同的載體，將細胞碎片固定化後測活，並於4℃貯存1周後測定其殘餘活力(結果見表1)。
3)以戊二醛固定化細胞碎片為酶源，(±)-泛解酸內酯為底物，反應體積20mL，底物濃度為2M，投入固定化細胞碎片10g，反應溫度為30℃，滴加3M氨水維持反應液pH恆定在7.0，反應時間24h後，轉化率為34.4％，產物(-)-泛解酸內酯的光學純度為94.6％。
表1 不同載體固定細胞碎片的催化活力
實施例3～13Fusarium proliferatum ECU2002固定化細胞對一系列內酯化合物的水解活力以下列表2中一系列內酯為底物，底物濃度為100mM，反應體積10mL，投入0.2g固定化細胞(以15mM戊二醛在30℃交聯3h所得的細胞)，在30℃、磁力攪拌下反應0.1～0.5h後測定活力。表2列出了不同內酯水解時，固定化細胞所表現出來的相對活力。以γ-丁內酯的活力為100％，固定化細胞對結構比較複雜的內酯(比如說正丁苯肽)的水解效果不是很明顯，酶的活力僅為25％。固定化細胞對α-取代內酯表現了很高的活力，當底物為α-羥基-γ-丁內酯時，活力最大，為γ-丁內酯活力的54倍之多。以(±)-泛解酸內酯和(-)-泛解酸內酯為例，固定化細胞活力分別為γ-丁內酯活力的14.7和21倍。
表2. 固定化細胞對一系列內酯化合物的催化活性
實施例14～17以Fusarium proliferatum ECU2002粗酶提取物拆分手性內酯以ECU2002粗酶提取物為酶源，(±)-β-丁內酯、(±)-α-羥基-γ-丁內酯、(±)-β-羥基-γ-丁內酯和(±)-泛解酸內酯為底物，反應體積20mL，底物濃度為100mM，投入粗酶13U，反應溫度為30℃，反應時間為0.2～12h，滴加NaOH維持反應液pH恆定在7.0，通過鹼消耗量計算轉化率。通過實驗發現(±)-泛解酸內酯作為底物時，2h轉化率即高達38.2％，特別是產物(-)-泛解酸內酯的光學純度最高達到98.2％ee。而(±)-α-羥基-γ-丁內酯，結果與(±)-泛解酸內酯相似，但是它的反應時間大大縮短，轉化率達到44.2％，產物的二光學純度96.3％ee時，僅需0.2h，反應初速度也最快，達52.6μM/min，此時酶的對映選擇率(E值)為26.7。
表3 內酯酶的粗提取物對幾種手性內酯化合物的催化拆分效果
實施例18固定化細胞催化的多批次催化反應(泛解酸內酯濃度20％)在底物(±)-泛解酸內酯濃度為1.5M(20％w/v)的50mL反應體系中，加入戊二醛交聯固定化的細胞15g，在30℃、160rpm的條件下反應10h，加入氨水調節控制反應的pH在6.5～7.0。重複操作30次，以游離細胞為對照。結果如圖1所示，固定化催化劑可反覆回用30次以上，可進行多次酶促水解反應，而且均達到了令人滿意的拆分效果，具有潛在的工業應用價值。
實施例19固定化酶催化的多批次反應(泛解酸內酯濃度為35％w/v)1)固定化酶的製備在冰浴中，向細胞粗提液中緩慢加入二分之一體積的冷丙酮，緩慢攪拌0.5h後加入20mM戊二醛交聯4h，於4℃、14,000rpm離心15min，並以生理鹽水洗滌2次。2)在底物(±)-泛解酸內酯濃度為2.7M(35％w/v)的20mL反應體系中，加入60U固定化酶，在30℃，120rpm的條件下反應6h，加入氨水(3M)調節控制反應的pH在6.5～7.0，重複操作10次。結果如圖2所示，在10次水解反應後，固定化酶的活力下降了33％，酶的半衰期大約為17個批次，產物的光學純度保持95％ee以上。在第10次水解反應時，反應的轉化率仍然能夠維持在30％左右，產物經過10次反應後累積至大約30g。上述結果表明了此固定化內酯酶具有良好的對映選擇性和很好的操作穩定性。
實施例20用固定化酶催化拆分高濃度(75％w/v)的(±)-泛解酸內酯在20mL的反應體系中，加入底物濃度為5.7M(75％w/v)的(±)-泛解酸內酯，並投入40.0U的固定化酶，在160rpm，30℃反應，滴加氨水(3M)控制反應pH在7.2。反應進程如圖3所示，反應進行36h後，轉化率為36.8％，此時產物(-)-泛解酸內酯的光學純度仍然＞90％ee。經過重結晶後產物的光學純度可達到＞99％ee。
權利要求
1.一株產左旋內酯水解酶的鐮孢黴菌Fusarium proliferatum NirenbergECU2002，保藏號為CGMCC 1494。
2.採用權利要求1所述的鐮孢菌Fusarium proliferatum NirenbergECU2002製備手性羥基酸的方法，包括如下步驟(1)將所說的鐮孢菌(Fusarium prolifetratum Nirenberg ECU2002)在包含碳、氮、磷及無機鹽的培養基中進行發酵，獲得培養物；(2)將細胞培養物進行處理後作為催化劑，催化外消旋手性內酯化合物的對映選擇性水解，提取未被水解的(+)-內酯和由(-)-內酯水解生成的(+)-羥基酸；所說的內酯底物包括但不限於β-丁內酯，α-羥基-γ-丁內酯，α-羥基-β，β-二甲基-γ-丁內酯，α-乙醯基-γ-丁內酯，β-羥基-γ-丁內酯，正丁基苯肽。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所說的培養基的組成和濃度(g/L)如下甘油10～50，蛋白腖1～20，酵母膏1～20，硝酸銨1～10，無機鹽NaCl 0.1～2；MgSO4·7H2O 0.1～2；FeSO4·7H2O 0.01～0.05；ZnSO4·7H2O0.01～0.05；CuSO4·5H2O 0.001～0.01。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，培養條件為pH 5～9，溫度25～35℃，基於發酵培養基體積的接種量為1～10％(v/v)，培養時間12～48h。
5.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，底物內酯的濃度為1～75％(w/v)，基於底物內酯重量的催化劑使用量為0.25～1.5克細胞/克內酯或者0.25～10單位酶/克內酯，反應溫度為25～40℃，pH 6.0～8.0，反應時間為0.1～40h。
6.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，底物內酯為(±)-泛解酸內酯。
7.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，催化劑為下列形式中的任意一種(1)將鐮孢黴菌ECU2002進行液體或固體培養後通過離心或過濾收集到的菌絲體；(2)去除菌體後所剩餘的發酵上清液；(3)採用研磨或勻漿等方法將菌絲體破碎，再用水或緩衝液抽提所得的無細胞提取液；(4)固定化細胞或固定化酶。
全文摘要
本發明公開了一株左旋內酯專一性水解酶產生菌及其用於製備手性羥基酸的方法。所說的酶產生菌為鐮孢黴菌Fusarium proliferatum NirenbergECU2002，保藏號為CGMCC 1494。以該黴菌的菌絲體、粗酶提取物或它們的固定化衍生物為生物催化劑，對一系列外消旋的手性內酯進行對映選擇性水解拆分，製備獲得了多種光學活性的(+)－羥基酸和(+)－內酯，後者可化學水解為(－)－羥基酸。其中，(+)－α－羥基－β，β－二甲基－γ－丁酸，即俗稱的D－(+)－泛解酸，經過簡單的酸化處理，即可製備獲得在飼料和日化工業上非常有用的手性中間體D－(－)－泛解酸內酯。
文檔編號C12N11/00GK1935977SQ20061011733
公開日2007年3月28日 申請日期2006年10月19日 優先權日2006年10月19日
發明者許建和, 張仙, 潘江, 徐毅 申請人:華東理工大學