磁珠分離篩選具脂肪酶抑制活性化合物及用途的製作方法

2023-05-30 09:56:56 2

專利名稱：磁珠分離篩選具脂肪酶抑制活性化合物及用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於藥物篩選方法領域，涉及應用磁珠分離和液相色譜-質譜聯用技術，分析靶標蛋白結合物，尤其涉及枳殼中具有脂肪酶抑制活性的化合物的篩選。
背景技術：
肥胖表現為脂肪細胞中三醯甘油大量堆積，脂肪組織中脂肪細胞增大增多並伴有脂肪分解受損。而脂肪分解調節異常可導致體內的游離脂肪酸濃度增高，從而使肝臟和肌肉中糖類和脂肪代謝紊亂加重，進而導致II型糖尿病等慢性疾病的發生。脂肪酶是催化體內三醯甘油第一步水解的關鍵酶。食物中的脂肪在脂肪酶的作用下被水解為單醯甘油和游離脂肪酸，在腸道被吸收，然後在體內重新合成脂肪，造成脂肪堆·積，最終可導致肥胖。因此，應用脂肪酶抑制劑可有效抑制腸道中脂肪酶對脂肪的分解催化作用，達到減少脂肪吸收、控制和降低血脂的作用。具有脂肪酶抑制活性的化合物常被用於製備減肥及降脂藥物，人們已經從天然植物中發現了很多天然的脂肪酶抑制劑。現有的脂肪酶酶抑制劑篩選方法主要採用體外酶活性抑制實驗，僅能對純化合物的活性進行評價，難以用於中藥等複雜混合物中脂肪酶抑制劑的發現。

發明內容
本發明的目的是提供一種磁珠分離篩選具脂肪酶抑制活性化合物的方法，是一種快速發現枳殼中具脂肪酶酶抑制活性的化合物的方法，採用磁珠分離與液相色譜一質譜聯用相結合的技術快速發現枳殼中具脂肪酶抑制活性的化合物，並進一步分離獲取該化合物。具體通過以下步驟實現。I.鍵合脂肪酶的磁珠製備
(1)磁珠活化取磁珠使用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸溶液清洗後加入I-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽溶液和N-羥基琥珀醯亞胺溶液混合均勻，孵育活化30min後移去上清液，並用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸溶液清洗；
(2)磁珠鍵合在活化磁珠上，加入含脂肪酶的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸溶液，震蕩混合均勻，在室溫孵育30 min進行包被，移去上清液。再用三羥甲基氨基甲烷緩衝液(Tris)清洗包被的磁珠4次，棄去清洗液，待用。2.鍵合磁珠質量考察將製備的鍵合磁珠分散在磷酸鹽緩衝液(PBS)中，使用掃描式電子顯微鏡對空白磁珠、脂肪酶鍵合磁珠的表面分別分析，檢查磁珠鍵合情況。採用傅立葉變換紅外光譜儀，測定空白磁珠、脂肪酶、脂肪酶鍵合磁珠的紅外光譜，檢查酶結合情況。3.篩選具脂肪酶抑制活性的化合物
(I)具潛在脂肪酶抑制活性的化合物初篩取100 μ I枳殼提取物水溶液2份，分別加到180 μ I分散於PBS溶液的鍵合脂肪酶磁珠和空白磁珠中，放在振蕩器上混勻，孵育I h。棄去上清液,再加入100 μ I純水清洗3次，棄去清洗液，最後使用含10%乙腈水溶液洗脫，吸取洗脫液備用，平行操作三份，取空白磁珠和酶鍵合磁珠的洗脫液進行液相色譜-質譜聯用分析，記錄峰面積；
(2)目標化合物獲取及活性驗證採用常規柱色譜分離技術分離獲取目標化合物群，再採用製備液相色譜分離、純化目標化合物或購置相對應的目標化合物標準品；採用酶抑制活性實驗驗證純化的目標化合物是否具有脂肪酶抑制活性，計算其半數抑制濃度。所述的具脂肪酶抑制活性的化合物經活性驗證後確定為柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枸橘苷。本發明的另一個目的是提供從枳殼中篩選獲得的具脂肪酶抑制活性的化合物在製備減肥及降脂藥物中的應用。本發明通過一種快速篩選枳殼中具脂肪酶抑制活性的化合物的方法，提供一類具 有脂肪酶抑制活性的化合物。與傳統方法相比，與現有方法相比，能夠從混合物中快速篩選並鑑定具有潛在脂肪酶抑制活性的化合物，進一步分離製備該類目標化合物，進行活性驗證，大大減少了分離有效成分的盲目性，提高了活性篩選效率。該篩選過程無須製備分離化合物，顯著提高了篩選效率、縮短了篩選時間。此外，本篩選方法具有快速、準確、重現性好等的特點。可推廣用於天然藥物或中藥混合物中具有脂肪酶抑制活性的化合物的快速篩選。本發明方法獲得的具脂肪酶抑制活性的化合物可在製備減肥及降脂藥物中應用。


圖I是空白磁珠、脂肪酶、脂肪酶鍵合磁珠的紅外光譜圖，其中1A、1B、1C分別為脂肪酶、空白磁珠以及鍵合脂肪酶磁珠的紅外光譜圖。圖2是脂肪酶鍵合磁珠洗脫液的液相色譜一質譜聯用分析譜圖。
具體實施例方式下面將結合附圖和實施例進一步說明本發明的實質內容及有益效果，該實施例僅用於說明本發明而非對本發明的限制。實施例所用儀器
Agilent 1100型液相色譜系統；Finnigan LCQ Deca XPplus離子講質譜儀,配有電噴霧(ESI)電離源和Xcalibur I. 3工作站(美國 Thermo Finnigan公司)；Spectramax M2 酶標儀(北京九宇鑫泰生物技術有限公司)；傅立葉變換紅外光譜儀(日本Jasco公司)。實施例I鍵合脂肪酶的磁珠製備 I、試劑
脂肪酶(提自豬胰酶)、1_乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)均購自Simga公司；羧基磁珠(規格10 mg/ml)購自Invitrogen公司；其它試劑均為分析純。25 mmol/L的MES溶液配製稱取MES適量，加水溶解，加I mol/L氫氧化鈉溶液調pH至6，製成濃度為25mmol/L的MES溶液。50 mg/ml EDC溶液配製稱取EDC適量，快速溶解在冷的25 mmol/L的MES溶液中，製成濃度為50 mg/ml的EDC溶液。臨用時新鮮配製。50 mg/ml NHS溶液配製稱取NHS適量，快速溶解在冷的25mmol/L的MES溶液中，製成濃度為50 mg/ml的NHS溶液。臨用時新鮮配製。
lmg/ml脂肪酶酶溶液配製稱取脂肪酶lmg，快速溶解在冷的25 mmol/L的MES溶液中，製成濃度為I mg/ml的脂肪酶溶液。臨用時新鮮配製。10 mmol/L磷酸鹽(PBS)緩衝液配製稱取磷酸二氫鈉適量，加水溶解，製成濃度為10 mmol/L的磷酸二氫鈉溶液，另稱取磷酸氫二鈉適量，加水溶解，製成濃度為10 mmol/L的磷酸氫二鈉溶液。量取10 mmol/L的磷酸二氫鈉溶液81. 5 ml與磷酸氫二鈉溶液18. 5ml，混勻即得。50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩衝液配製稱取三羥甲基氨基甲烷適量，加水溶解，加O. I mo I/L鹽酸溶液調節pH至7. 4，製成50 mmol/L Tris緩衝溶液。2、鍵合脂肪酶的磁珠的製備
(I)磁珠活化取100 μ I磁珠於I. 5 ml離心管中，加入等體積25mmol/L的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(pH 6)溶液清洗兩次，每次10 min，棄去清洗液，加入50 μ I新鮮配置50mg/ml EDC溶液和50 μ I的50 mg/ml NHS溶液溶液，混合均勻，在室溫下緩慢傾斜旋轉孵 育30 min。孵育後，把管子放於磁鐵上4 min，移除上清液，使用100 μ I的25mmol/L MES溶液清洗兩次。(2)磁珠鍵合在活化磁珠中，加入I mg/ml脂肪酶溶液60 μ 1，再加入25 mmol/L MES溶液40 μ 1，震蕩混合均勻，在室溫孵育30 min,或4°C緩慢傾斜旋轉孵育2 h，孵育後，把管子放於磁鐵上4 min，移除上清液。加50 mmol/L Tris緩衝液300 μ I衝洗包被的磁珠4次，加質量分數為0. 25 %的牛血清白蛋白Tris緩衝液100 μ I,震蕩混合均勻，棄去上清液。3、鍵合磁珠質量考察
(I)電鏡分析將製備的鍵合磁珠分散在10 mmol/L PBS緩衝液中，使用掃描式電子顯微鏡對空白磁珠、脂肪酶鍵合磁珠的表面分別進行掃描成像，檢查磁珠鍵合情況。空白磁珠表面非常粗糙，脂肪酶鍵合磁珠表面比較光滑，可見明顯的蛋白積聚情況，表明脂肪酶已鍵合於磁珠表面。(2)鍵合情況考察將空白磁珠、脂肪酶、脂肪酶鍵合磁珠離心濃縮至幹後，溴化鉀壓片後，使用傅立葉變換紅外光譜儀，測定空白磁珠、脂肪酶、脂肪酶鍵合的磁珠的紅外光譜，表徵其性狀見附圖I。圖1A、1B、1C分別為脂肪酶、空白磁珠以及鍵合脂肪酶磁珠的紅外光譜圖。由圖可見，脂肪酶在1655CHT1處存在醯胺鍵的紅外吸收(圖1A)，空白磁珠在1655CHT1處無紅外吸收(圖1B)，而圖IC中在1655CHT1處也出現了醯胺鍵的紅外吸收。由此表明，磁珠表面已經成功鍵合上脂肪酶。:實施例2枳殼總黃酮提取物中具有脂肪酶抑制活性的化合物篩選 I、藥品與試劑
柚皮苷、4-甲基傘形酮油酸酯標準品購自Sigma公司，橙皮苷、新橙皮苷標準品購自上海融禾醫藥科技發展有限公司，枸橘苷標準品購自上海同田生物技術股份有限公司，枳殼總黃酮提取物購自長沙康爾佳製藥集團有限公司。10 mmol/L磷酸鹽(PBS)緩衝液配製稱取磷酸二氫鈉適量，加水溶解，製成濃度為10 mmol/L的磷酸二氫鈉溶液，另稱取磷酸氫二鈉適量，加水溶解，製成濃度為10 mmol/L的磷酸氫二鈉溶液。量取10 mmol/L的磷酸二氫鈉溶液81. 5 ml與磷酸氫二鈉溶液18. 5ml，混勻即得。
脂肪酶鍵合磁珠溶液配製取上述用I mg空白磁珠製備的鍵合脂肪酶的磁珠，力口入10 mmol/L PBS緩衝液180 μ I，震蕩混合均勻。空白磁珠溶液配製取100 μ I空白磁珠(含空白磁珠I mg)，活化後加入10mmol/L的PBS緩衝液180 μ I，震蕩混合均勻。2、脂肪酶抑制活性篩選系統由環形磁鐵、鍵合脂肪酶的磁珠、液相色譜-質譜聯用儀組成。3、枳殼總黃酮提取物中具有脂肪酶抑制活性的化合物篩選
稱取10 mg積殼總黃酮提取物加入I ml純水,超聲15 min, 10000 rpm離心5 min,吸取上清液備用。取20 μ I上清液，分別加到180 μ I脂肪酶鍵合磁珠和空白磁珠溶液中，放在振蕩器上混勻，孵育I h。然後放於磁鐵上，使磁珠與溶液分開，棄去溶液，加100 μ I水振搖清洗3次，每次15 min。最後使用10%乙腈水溶液，使脂肪酶變性，配體洗脫下來,置·
液相色譜一質譜聯用分析條件為Agilent SB-C18色譜柱(4. 6mmX 250mm, 5 μ m)。流動相A 0. 1%的甲酸-水，流動相B :乙腈。線性洗脫梯度0 min, 10%B ；50 min, 20%B ；65 min, 55%B ；75 min, 60%B ；90 min, 95%B ;流速 lmL/min，柱溫 30°C，進樣量 20 μ L，檢
測器二極體陣列檢測器，波長掃描範圍為190-400 nm。質譜採用負離子掃描模式檢測，掃描方式為一級、二級全掃描，質量掃描範圍m/z 100 - 2000，碰撞氣高純氦，霧化氣高純氮，噴霧電壓-4. 5kV，毛細管電壓-15V，毛細管溫度350°C，鞘氣流速30 arb，輔助氣流速10 arbο脂肪酶鍵合磁珠洗脫液分析譜圖參見附圖2。由圖2看出酶鍵合磁珠的洗脫液有4個明顯的色譜峰。說明枳殼總黃酮中這4個化合物對脂肪酶有潛在抑制活性。表I列出了這4個化合物的保留時間、紫外、質譜碎片等信息，其紫外最大吸收為280/330nm，鑑定推斷化合物f 4分別是黃酮類化合物柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枸橘苷。經過與購置的標準品比對，最終鑑定化合物I為柚皮苷，化合物2與化合物3分別為橙皮苷與新橙皮苷，化合物4為枸橘苷，其化學結構如下。
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目標化合物獲取
根據分析鑑定結果，從Sigma公司購置柚皮苷標準品，從上海融禾醫藥科技發展有限公司購置橙皮苷和新橙皮苷標準品，從上海同田生物技術股份有限公司購置枸橘苷標準品，供後續脂肪酶活性驗證實驗使用。3、脂肪酶抑制活性驗證
取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枸橘苷等4個標準品配製成濃度為1、5、10、50、100、250yg/ml的待測品溶液，各取20 μ I加入20 μ I濃度為lmg/ml的脂肪酶溶液，置於在96孔板中，在37°C震蕩混勻孵育10 min後，加O. I mmol/L 4-甲基傘形酮油酸酯溶液20 μ I,在37°C震蕩混勻孵育30 min後，再加入O. 2 mol/L碳酸氫鈉溶液80 4 1^停止反應，在371震蕩10 min，於405 nm波長處測定吸收值，計算脂肪酶抑制抑制活性。測試結果參見表2，4個化合物中有3個化合物具有較好的脂肪酶抑制活性，其中柚皮苷的IC5tl大於250 μ g 無顯著的脂肪酶抑制活性，而其餘三個化合物均具有脂肪酶抑制活性。其中橙皮苷和新橙皮苷IC50值分別為48. 04 μ g · mL-1與52. 45 μ g · mL-1，枸橘苷的IC5tl值為46. 18，其脂肪酶抑制活性未見報導。
表2柚皮宜、橙皮宜、新橙皮盤、枸橘耷!旨肪酶抑制活性
權利要求
1.一種磁珠分離篩選具脂肪酶抑制活性化合物的方法，其特徵在於，通過以下步驟實現 (1)鍵合脂肪酶的磁珠製備 (a)磁珠活化取磁珠使用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸溶液清洗後加入I-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽溶液和N-羥基琥珀醯亞胺溶液混合均勻，孵育活化30min後移去上清液，並用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸溶液清洗； (b)磁珠鍵合在活化磁珠上，加入含脂肪酶的乙磺酸溶液，震蕩混合均勻，在室溫孵育30 min進行包被，移去上清液，再用三羥甲基氨基甲烷緩衝液清洗包被的磁珠，棄去清洗液，待用; (2)鍵合磁珠質量考察將製備的鍵合磁珠分散在磷酸鹽緩衝液中，使用掃描式電子顯微鏡對空白磁珠、脂肪酶鍵合磁珠的表面分別分析，檢查磁珠鍵合情況；採用傅立葉變換紅外光譜儀，測定空白磁珠、脂肪酶、脂肪酶鍵合磁珠的紅外光譜，檢查酶結合情況； (3)篩選具脂肪酶抑制活性的化合物 (a)具脂肪酶抑制活性化合物的初篩取100μ I枳殼提取物水溶液2份，分別加到180μ I分散於磷酸鹽緩衝液的鍵合脂肪酶磁珠和空白磁珠中，放在振蕩器上混勻，孵育，棄去上清液，再加入純水清洗3次，棄去清洗液，最後使用含10%乙腈水溶液洗脫，吸取洗脫液備用，取空白磁珠和酶鍵合磁珠的洗脫液進行液相色譜-質譜聯用分析，記錄峰面積； (b)目標化合物獲取及活性驗證採用常規柱色譜分離技術分離獲取目標化合物群，再採用製備液相色譜分離、純化目標化合物或購置相對應的目標化合物標準品；採用酶抑制活性實驗驗證純化的目標化合物是否具有脂肪酶抑制活性，計算其半數抑制濃度。
2.根據權利要求I所述方法製備的具脂肪酶抑制活性的化合物的方法，其特徵在於，所述的具脂肪酶抑制活性的化合物分別是柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枸橘苷。
3.根據權利要求I所述方法製備的具脂肪酶抑制活性的化合物在製備減肥及降脂藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種快速篩選枳殼中具脂肪酶抑制活性的化合物的方法，採用磁珠分離與液相色譜－質譜聯用相結合的技術快速篩選枳殼中具脂肪酶抑制活性的化合物，與傳統方法相比，與現有方法相比，能夠從混合物中快速篩選並鑑定具有潛在脂肪酶抑制活性的化合物，進一步分離製備該類目標化合物，進行活性驗證，大大減少了分離有效成分的盲目性，提高了活性篩選效率。該篩選過程無須製備分離化合物，顯著提高了篩選效率、縮短了篩選時間。此外，本篩選方法具有快速、準確、重現性好等的特點。可推廣用於天然藥物或中藥混合物中具有脂肪酶抑制活性的化合物的快速篩選。本發明方法獲得的具脂肪酶抑制活性的化合物可在製備減肥及降脂藥物中應用。
文檔編號G01N30/02GK102841150SQ20121030483
公開日2012年12月26日 申請日期2012年8月25日 優先權日2012年8月25日
發明者程翼宇, 王毅, 張玉峰 申請人:浙江大學