基因檢測方法
2023-05-29 16:56:16 2
專利名稱：基因檢測方法
技術領域：
本發明涉及擴增的基因的檢測方法，可應用於免疫學、分子生物學、診斷學等很多領域內。
隨著近年來基因工程技術的進步，設計出很多大量擴增微量基因的方法。使用這些方法有可能擴增樣品中的微量基因。人們了解最多的基因擴增方法是PCR(聚合酶鏈式反應)方法。此方法首先製備與含有目的基因的3′端和5′端的基因序列互補的基因片斷(引物)，然後將引物和作為基因材料的鹼基一起與樣品混合，再讓稱之為DNA聚合酶的基因合成酶作用後，就可合成目的基因。此方法由如下3個反應的重複(通常20-40循環)構成，(1)通過熱變性將DNA雙鏈解離，(2)與引物退火，(3)通過DNA聚合酶合成互補鏈。此時加熱使2條鏈的基因解離成一條鏈，由於使用的DNA聚合酶來自耐熱菌，所以每一循環不用重新補給DNA聚合酶，只是通過溫度變化使反應反覆進行，就可進行基因擴增。利用這一方法可使目的基因幾十萬倍、幾百萬倍地擴增。
現在能自動進行擴增的熱循環儀市場上有很多銷售，在醫學、診斷學、分子生物學等領域內廣泛地應用。
如上所述，雖然確立了簡便地擴增基因的方法，但作為檢測擴增的基因的方法主要還是電泳方法。這種方法是將樣品加到聚丙烯醯胺等凝膠上進行電泳，電泳後對凝膠染色，確認基因的有無，但這種方法費事、費時。儘管基因擴增幾個小時就完成了，但由於基因檢測費時間，所以用於全部的基因檢測中的時間就要2天至3天。這種方法不適合處理多個檢測樣品，基因診斷方法在臨床診斷方面不普及的理由之一就是這種基因檢測方法太費工夫。近年來嘗試用HPLC(高速液相色譜法)、毛細管電泳等檢測擴增的基因，但想要處理很多檢測樣品時，這些方法的效果不好。
人們嘗試通過粒子凝集法檢測基因，現正開拓這種技術。例如，在美國專利第5104791號中報導首先準備2種與目的基因互補的基因片斷，然後讓它結合在粒子上，再將這種粒子與目的基因結合，使發生凝集，通過測定由於凝集產生的信號檢測目的基因的存在以及存在的量。
但是，美國專利第5104791號的方法存在的問題是對於每個目的基因必須要將不同的2種基因片斷結合在粒子上。從使用與目的基因互補的基因片斷來看，該美國專利需要目的基因是一條鏈。通常DNA以雙鏈狀態存在，使用基因擴增法後得到的樣品仍是雙鏈基因。而該美國專利需要在一條鏈狀態下操作，形成一條鏈後樣品中還存在互補的基因，這當然就要與粒子上的基因片斷進行競爭結合反應。由此招致檢測靈敏度下降，作為測定方法不太令人滿意。
另外，從原理上講使用識別目的基因的抗體檢測基因是可能的。雖說是用這種方法也可能檢測由粒子凝集得到的基因，但可預想到其實施是相當困難的。基因通過4種鹼基序列保存信息，即作為基因的組成成分只有4種鹼基，製備只對特定鹼基序列反應的抗體是困難的，同時識別某一基因序列的抗體也能與這段序列非常相似的別的基因序列部分反應。這一現象稱之交差反應，這成為識別基因的抗體的大問題。即使用這一方法，也必須準備各種粒子，粒子上結合了對應於每個基因的2種以上的抗體，所以很難說這是一種簡便的方法。
人們都知道基因中有時存在著突變，且突變往往與疾病有密切關係。
人們已經知道很多基因突變作為起因發病的疾病和成了危險因子的疾病。這些疾病當中有人們早就知道的地中海貧血病和血友病，還有近年知道的家族性肌萎縮側索硬化症和家族性早老性痴呆病等。這些疾病中有的是由於基因中的微小的一部分的變異，有時是鹼基序列中的一個鹼基變異造成的，這樣的變異稱為點突變。檢測這樣的微小變異的方法現在採用的有DGGE法、SSCP法和RFLP法。DGGE法稱之為變性劑濃度梯度凝膠電泳，利用發生點突變也會使雙鏈基因的穩定性發生變化的現象，通過在有變性劑濃度梯度的凝膠上進行電泳來檢測變異。而SSCP法叫作單鏈DNA多型高級結構解析法，利用單鏈DNA按照它的鹼基序列呈現特有的高級結構的特點，擴增的雙鏈基因解離為單鏈之後再進行非變性的聚丙烯醯胺凝膠電泳，遷移率上就產生了差別，以此為原理進行檢測。採用這個方法，數百個鹼基中既使有一個鹼基變異也可檢測出遷移率上的差別。
變異的位置一定時，通過實施RFLP法有時也可檢測其變異。這一方法稱為限制酶片斷長度多態性方法。某一變異在一定的部位發生，通過變異有時這一部位成了某一限制酶切斷的部位，有時在正常情況下可切斷部位由於變異成了切不斷的部位了。而RFLP法正是利用了這一特徵。擴增挾有變異部位的基因，使某一限制酶作用於擴增的產物，根據變異的有無，切斷部位或出現，或消失，通過電泳可檢測其變化。
這些方法雖然是連一個鹼基的變異也可檢測的很巧妙的方法，但無論那種方法其主體仍是通過電泳檢測的，所以在迅速、簡便以及處理多個檢測樣品方面並不優越。
本發明的目的在於提供一種簡便、迅速地檢測擴增後的基因的方法；提供不使用同位素的安全而且高靈敏度的檢測系統；提供簡便而迅速地檢測包含在擴增後的基因中的變異的方法。
本發明者鑑於上述情況，深入研究的結果找到了一種檢測擴增的基因的方法。首先使抗原或抗體結合於擴增時用的基因片斷上，通過使用結合了識別其抗原的抗體或識別其抗體的抗原的粒子，或者使用表面上結合了與抗原或抗體特異結合的物質的粒子，利用產生的凝集現象，檢測擴增的基因。
另外本發明者利用上述的基因檢測法，對於擴增的基因含有突變的情形，通過在擴增後讓限制酶作用，發現按粒子凝集的大小可以檢測基因被切斷還是沒被切斷，根據這一現象能夠檢測出基因的突變。
也就是說，本發明提供的基因檢測法的特徵在於將使用結合了抗原或抗體的基因片斷擴增的雙鏈基因與粒子反應，這種粒子是結合了識別上述抗原的抗體或是識別上述抗體的抗原的粒子，或者是結合了可特異地與上述抗原或抗體結合的物質的粒子，通過測定反應後粒子凝集的程度，檢測目的基因。
關於本發明的基因檢測法，其特徵是將使用結合了抗原或抗體的基因片斷擴增的雙鏈基因與粒子反應，這種粒子是結合了識別上述抗原的抗體或是識別上述抗體的抗原的粒子，或者是結合了可特異結合上述抗原或抗體的物質的粒子，通過測定反應後粒子的凝集程度檢測目的基因。若上述用於擴增的基因中存在突變部位時，本發明又提供了一種檢測基因突變的方法。即讓限制酶作用於基因，該酶因突變部位的存在而使切斷樣式發生變化，該基因或被切斷，或未被切斷，通過測定結果生成的粒子的凝集程度的變化，就可檢測基因的突變。
本發明基因檢測法的原理本發明的基因檢測法的原理如下。本發明的基因檢測法的梗概如
圖1所示。
首先將抗原或抗體預先結合在作為基因擴增原料的基因片斷上，將這種基因片斷作為引物對某些基因進行擴增，若樣品中存在目的基因，用結合了添加的抗原或抗體的基因片斷作為原料通過基因擴增法就可大量製備目的基因。因為幾乎所有擴增的基因都是由結合了抗原或抗體的基因片斷製造出來的，所以其兩端都結合著抗原或抗體。而且，抗原或抗體的結合位置不限於基因片斷的末端，無論那個位置只要結合1分子抗原或抗體就可以。結合在末端時，則結合在與擴增的方向相反的一側。
若將結合了對抗原或抗體具有親合性的抗體或抗原的粒子添加到基因擴增後的樣品中，使粒子與擴增的基因反應後產生凝集。生成的凝集可以目測也可測定其濁度、吸光度等，用雷射照射流過鞘流室中的每個粒子，通過測定產生的散射光的強度也可了解凝集的程度。利用這一方法檢測擴增的基因其檢測靈敏度更高。另外，若將粒子直徑作得再適當些，也有可能利用電阻法進行測定。但若考慮到檢測器的堵塞等問題，最好還是用光學上的方法測定。凝集粒子的檢測採用全自動免疫凝集測定裝置(例如東亞醫用電子株式會社制、PAMIA-30)通過光學測定凝集膠乳粒子的大小，可以迅速而且高靈敏度、高精度地進行。
在突變檢測方面的應用本發明的檢測基因突變的方法，是將抗原結合在作為基因擴增原料的基因片斷上，使用這一基因片斷對某些基因進行擴增，如果樣品中存在含有變異部分的目的基因，則以結合有添加抗原的基因片斷為原料，利用基因擴增法就可大量製備目的基因。因為大部分擴增的基因是由結合了抗原的基因片斷製造出來的，所以其兩端都結合著抗原，同時擴增的基因中含有變異部分。
將結合了對抗原有親和性的抗體的粒子加入到基因擴增後的樣品中，使它與擴增的基因反應就會生成凝集。生成的凝集可以通過目測，也可用儀器測定其濁度、吸光度等。若讓它流過上述那樣的鞘流裝置，使雷射照射流過的每個粒子，通過測定照射產生的前方散射光強度也可了解凝集的程度。
這時，由於擴增的基因中存在著突變，若是正常的檢測樣品，不能被切斷的基因中出現某一限制酶的切斷部位時，通過該限制酶作用於擴增的基因後，若是被切斷則粒子的凝集程度降低，若是沒被切斷，則粒子的凝集程度沒有變化。因此由於突變的存在不僅會新生成限制酶切斷部位，而且因突變的存在有時在正常檢測樣品中可被特定的限制酶切斷的部位也變得不能被切斷了。所以，製備限制酶作用於基因擴增後的樣品後得到的產物或不讓酶作用的產物，然後通過研究對應於讓酶作用和不作用的凝集反應可以了解該基因中有無突變。
另外，無論是在基因與結合抗體的粒子反應前或反應後添加限制酶都沒關係。但反應前添加有利於直接使用市售的粒子凝集測定裝置(例如，東亞醫用電子(株)的PAMIA系列)。
通過本發明的方法能夠檢測的突變包括很多以前用RFLP法測定的家族性肌萎縮性側索硬化症、家族性高膽固醇血症、紅細胞酶異常症、血支友病等。本發明的方法與以前用電泳檢測的RELP法相比較，使用本方法可以更簡便地進行基因診斷。
作為結合在作為引物使用的與含有目的基因區域的3′端以及5′端的基因序列互補的基因片斷上的抗原或抗體有很多種可以利用，但儘可能使用分子量小的，以避免基因擴增時的麻煩。從這個意義上講最好是結合低分子的抗原、即半抗原，如生物素、FITC(異氰酸螢光素)等。
下面敘述使用結合了抗原的基因片斷的情況。
結合抗原的基因片斷可利用本行業眾所周知的方法製備。例如，要製備生物素化的引物，利用生物素化核苷酸(BIOTINdXTM、從和光純藥工業(株)可得到)和通常的核苷酸，通過ABI社的自動合成裝置可以合成。如上所述，生物素分子最理想是結合在3′末端和5′末端，但也不局限於此，只要不妨礙下面的擴增反應也可結合在引物的中間部分。而利用寡核苷酸生物素標記試劑盒(ァマシャム社制)等也可以在寡核苷酸的末端結合上1分子生物素。另外，想要的生物素化的引物也可委託寶酒造(株)等公司合成。
以結合了如上所述製備的抗原的基因片斷作為引物，利用PCR等方法擴增基因。基因擴增可採用本行業眾所周知的方法進行。例如運用結合抗原的引物，核苷酸混合物、DNA聚合酶，使用Perkin Elmer公司的熱循環儀進行PCR反應，就可得到雙鏈基因。
另外要製備結合了識別上述抗原的抗體或製備結合了與上述抗原特異結合的物質的粒子。
作為粒子可使用各種各樣的粒子，但粒子流經鞘流室進行分析時，粒徑均一是很重要的，為此目的人們認為粒徑均一的膠乳粒子是最有用的。關於粒徑，若是能檢測凝集程度的粒子，就不太受限制，例如可使用從積水化學工業(株)得到的粒徑為0.8μm的無泡的聚苯乙烯膠乳等。
作為結合於粒子表面的抗體可使用各種各樣的抗體，本發明的理想的狀態下，擴增的基因其兩端有相同的抗原，從這點看使用相應於該抗原的單克隆抗體是可行的。通常不能單獨應用於凝集法的單克隆抗體也可以通過使用這一方法用一種抗體引起粒子的凝集。
上述美國第5104791號專利，使用2種與目的基因互補的基因片斷，讓它與目的基因結合產生凝集。但這個方法存在的問題是對於每一個目的基因，粒子上必須結合兩種不同的基因片斷。而本發明的優點是用於檢測的抗體結合粒子只要使用同樣標記的抗原，只用一種基因片斷就夠了。所以，檢測任意基因時也只用一種粒子就可檢測，這是本發明的最大優點。
還有，本發明使用的抗體並不是對目的基因的抗體，可選擇任意抗體，所以通過使用特異性高的抗體，或通過使用絕對進不到待測樣品中的抗原，就能夠準確、高靈敏度地進行目的反應。這也是本發明所能提供的測定系統。
另外，只要能與本發明使用的抗原特異結合的物質，不只是抗體，都可用於結合到粒子上。例如，可利用生物素-抗生物素蛋白或是生物素-鏈球菌抗生物素蛋白，配體-受體，糖鏈-凝集素，或是酶-抑制劑的特異結合，將其中一方結合在引物上，另一方結合在粒子上就可使用了。這種情況下，結合了抗原的引物必須不能妨礙基因擴增。
如上所述，本發明的優點是只要將相同抗原結合在引物上，無論要檢測的目的基因是什麼，用於檢測的結合抗體粒子只要一種就夠了。因為粒子上的抗體與結合在基因片斷上的抗原結合，所以檢測任意的基因時也只用一種粒子就可檢測了。而且即使改變結合在每個引物的3′端和5′端的抗原也沒關係。但必須準備結合了對應於各個抗原的抗體的粒子。為了使試劑的組成簡單化，最好是將結合於引物上的抗原作成相同的。
可以採用本行業眾所周知的方法將與抗體或抗原特異結合的物質結合到粒子上，如，物理吸附法，共價結合法等方法，其中物理吸附法操作簡單。作為一般的方法，例如，可將抗體溶液與粒子懸濁液混合，4℃下讓它反應一夜或在25℃下反應數小時來完成。
將擴增的雙鏈基因與結合了一種物質的粒子反應，該物質是一種與識別上述抗原的抗體結合的或與上述抗原特異結合的物質。通過抗原抗體反應而產生粒子的凝集，獲得2聚體，3聚體、4聚體等凝集體。每個凝集體或未凝集的粒子通過鞘流室時通過測定雷射照射後生成的散射光強度就可知道凝集的程度。這些操作若採用上面例舉的全自動免疫測定裝置，則測定簡便、快速。圖2給出了採用這樣的全自動免疫測定裝置所得到的粒度分布。凝集體的存在表示樣品中存在目的基因。採用本發明的方法可以簡單地測定出目的基因的存在和存在的量。
可以使用本發明的基因檢測法檢測的目的基因不僅包括DNA，也包含RNA。例如目的基因是mRNA時，只要預先用逆轉錄酶製備出cDNA後就可以進行基因擴增。
以下用實施例詳細說明本發明，但本發明的範圍不局限於此。實施例1通過檢測使用了生物素化引物的PCR產物來檢測人基因組DNA。
生物素化引物的調製擴增人基因組DNA中β球蛋白區域的DNA(參照Saiki，R.K.等(1988)Science，239，487-491)，利用膠乳凝集檢測其產物。
檢測的樣品是人白血球，引物是寶酒造(株)銷售的β球蛋白引物試劑盒中具有與PC03和KM38引物相同的鹼基序列的末端結合了1分子生物素的生物素化引物。通過PC03和KM38擴增的基因片斷的大小是167bp。
作成的引物的鹼基序列如下所示。
PC03-BiotinBiotin-ACACAACTGTGTTCACTAGCKM38-BiotinTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG-Biotin上面的生物素化引物是使用ABI社的自動合成裝置合成的。樣品製備使用人血液作為樣品。檸檬酸三鈉鹽用作抗凝劑，將採集的血液離心分離(3000rpm，15分鐘)取淡黃色層(buffy coat)。再用生理鹽水稀釋採取的淡黃色層，製成每10μl含有大約100000，10000，1000個白血球的樣品，使用自動血球計數裝置F-800(東亞醫用電子株式會社)測定白血球數。因為血液中的DNA大部分是來自白血球，所以使用異硫氰酸胍方法(分子細胞生物學基礎實驗法，南江堂)從白血球中製備PCR用的DNA樣品。基因擴增使用Perkin Elmer公司的熱循環儀進行PCR反應。
用於PCR反應的溶液組成如下緩衝液(200mM Tris buffer，pH8.4；15mM MgCl21mg/ml BSA) 5μl精製水 39.5μl10mM d NTP混合液 1μl生物素化的引物(各10μM)各1μlPC03-BiotinKM38-BiotinTaq DNA聚合酶(Ampli TaqTM，寶酒造(株)0.5μl提取的DNA溶液2μl
PCR反應共進行20循環，每一循環反應如下94℃45秒，55℃25秒，72℃3分鐘。
結合抗生物素抗體的膠乳的製備將粒徑0.78μm的聚苯乙烯膠乳(積水化學社制)於10mM PBS，pH7.0緩衝液中配成5％(w/v)濃度的溶液，然後向裡面加入抗生物素抗體(單克隆抗體Biodesign公司制)，比例是每1ml膠乳分散液加50μg。於4℃下反應24小時。然後離心(12000rpm，10分鐘)，再添加與開始量相同的含1mg/mlBSA的0.1M PBS緩衝液使粒子分散。再進行一次離心，使粒子在同樣的緩衝液中分散，就製成了結合抗生物素抗體的膠乳。凝集反應向10μl PCR反應後的樣品中加入10μl結合了抗生物素抗體的膠乳粒子(0.5％)；再加入80μl含有1mg/ml BSA的0.1M磷酸緩衝液，於45℃下反應15分鐘，然後測定膠乳粒子的凝集率。這個反應以及測定是利用全自動免疫測定裝置PAMIA-30(東亞醫用電子株式會社)，測定前方散射光強度。
凝集率用凝集的粒子數相對於總粒子數的百分數表示的。下面的表1給出了測定結果。就象表1所表明的那樣即使從每10μl有1000個白血球的樣品也可得到很高的凝集率。若是不含有白血球DNA的樣品(用於PCR的溶液組成中不含提取的白血球DNA)，就不會形成膠乳凝集；若是含有白血球DNA的樣品就會看到凝集。由此可以理解膠乳試劑通過與PCR產物的生物素反應而產生了凝集。白血球數(個/10μl) 100000 1000010000凝集率(P/T％) 43.240.5 35.93.4實施例2人血紅蛋白基因突變的檢測採用本發明的方法進行了人血紅蛋白基因突變的檢測。生物素化引物的製備引物用的是與寶酒造(株)銷售的β球蛋白引物試劑盒的鹼基序列相同的引物。其中，有6種部位不同的引物在銷售，通過它們的組合可擴增9種不同大小的基因片段。
在本實施例中合成了與PC03和PC04引物相同的鹼基序列，製備了其末端結合1分子生物素分子的引物，用作生物素化引物。利用PC03和PC04擴增的基因片斷的大小是110bp。製備的引物的鹼基序列如下PC03Biotin-ACACAACTGTGTTCACTAGCPC04CAACTTCATCCACGTTCACC-Biotin上面的生物素化引物是委託寶酒造合成的。試樣配製用上述的一組引物可檢測的突變有codon 17 mutant allele。(密碼17變異的等位基因)這一突變是在無意義區發生了由A向T的突變，這一變異使用限制酶NheI，用RFLP法可以檢測，也就是若是正常的檢測樣品通過這一組引物生成的PCR產物，用NheI是切不開的，酶作用後即使進行電泳也只在110bp處檢測出一條帶，但發生突變的檢測樣品出現了利用酶可以切斷的位置，電泳上就變成了87bp帶，若是混合樣品就應出現兩條帶110bp和87bp。
樣品製備根據Clin，Biochem，26 497-503，1993的方法進行。使用的樣品有正常的人血液和已知在上述部位發生突變的人血液。
在基因組DNA提取時使用了Pharmacia公司的Rapid PrepGonomic DNA Isolation Kits for Blood製備出PCR使用的樣品。基因擴增PCR是使用Perkin Elmer公司的熱循環儀進行的，使用的試劑是寶酒造(株)的Gene Amp。
PCR反應液的組成如下緩衝液(200mM Tris Buffer，pH8.4，15mMMgCl21mg/ml BSA) 5μl精製水 39.5μl10mM d NTP混合液1μl生物素化引物(各10μm) 1μlTaq DNA聚合酶 0.5μl
PCR反應一個循環包括94℃1分鐘，55℃2分鐘，68℃2分鐘，共進行35個循環。結合抗生物素抗體的膠乳的製備將粒徑0.78μm的聚苯乙烯膠乳於20mM Tris-buffer pH7.0中配成5％(w/v)的濃度，然後向其中添加抗生物素抗體(單克隆抗體Biodesign公司制)。每1ml膠乳液加50μg抗體，於40℃下反應24小時。然後離心(12000rpm，10分鐘)，再添加與起初同樣量的含有1mg/mlBSA的0.1M PBS溶液使粒子分散。再進行一次離心，使粒子再在同樣的溶液中分散製成結合抗生物素抗體的膠乳。凝集反應首先為了確認通過PCR基因是否擴增了，向10μl的PCR後的樣品中加入10μl結合了抗生物素抗體的膠乳粒子(0.5％)，再加入80μl含有1mg/ml的BSA的0.1M磷酸緩衝液，於45℃反應15分鐘後測定膠乳粒子的凝集率。測定採用了東亞醫用電子(株)制全自動免疫測定裝置PAMIA-30。
其次，為了進行突變的檢測，取同樣的PCR後的樣品10μl，添加10μl緩衝液製成一種溶液，另外再取同樣的10μl PCR後樣品，但添加10μl含有Nhe I10個單位的緩衝液製成另一種溶液，將兩種溶液在37℃溫育過夜，然後各自進行與上述相同的操作，之後再與粒子反應，通過PAMIA-30測定。凝集率以凝集的粒子數佔整個粒子數的百分比來表示。
測定結果如下所示，正常檢測樣品即使讓限制酶作用凝集率也不變化，而密碼17中有突變的檢測樣品，雖然不進行酶反應的樣品的凝集率與正常檢測樣品一樣沒有太大變化，但讓酶作用後，卻看到了凝集率下降。這是由於在有突變的檢測樣品中因突變出現了NheI的切點，限制酶切斷了PCR產物，使得膠乳引起的凝集反應下降。由此表明，利用膠乳凝集反應有可能檢測出點突變。
不含限制酶的樣品含限制酶的樣品正常檢測樣品21.3％ 20.4％含突變檢測樣品 22.9％ 5.6％
凝集率(P/T)％(凝集的粒子總數/總粒子數)×100使用本發明可以簡便、迅速而且高精度地檢測出擴增後的基因。本發明的最大優點是若予先製備結合了一種與識別抗原的抗體或抗原特異地結合的物質，則不管目的基因的種類如何，只要用這種粒子就可測定目的基因的存在以及存在的量。同時由於本發明的基因檢測法不使用同位素，所以很安全。本發明的基因檢測法不僅可用於DNA的檢測，也適用於RNA的檢測，因此可用於愛滋病、肝炎等很多疾病的診斷，特別是它能迅速地進行許多樣品的診斷，所以這種方法是非常有用的。
另外若使用本發明的檢測基因中突變的方法，可以在非常短的時間內簡便地檢測出以前用RFLP等方法檢測的突變。
附圖的簡單說明圖1表示本發明的基因檢測法的簡圖。
圖2採用全自動免疫測定裝置得到的粒度分布圖。
權利要求
1.一種基因檢測法，其特徵在於，將使用結合了抗原或抗體的基因片斷擴增的雙鏈基因與一種粒子反應，該粒子是結合了識別上述抗原的抗體或是識別上述抗體的抗原的粒子，也可以是結合了與上述抗原或抗體特異結合的物質的粒子，通過測定反應後粒子的凝集程度檢測目的基因。
2.一種檢測基因突變的檢測法，是將使用結合了抗原或抗體的基因片斷擴增的雙鏈基因與一種粒子反應，該粒子是結合了識別上述抗原的抗體或是識別上述抗體的抗原的粒子，也可以是結合了與上述抗原或抗體特異結合的物質的粒子，通過測定反應後粒子的凝集程度來檢測目的基因，當用於上述擴增的基因中存在著突變部位時，使由於該突變部位的存在其切斷形式發生變化的限制酶作用，酶作用後，基因被切斷，或未被切斷，通過測定結果生成的粒子凝集程度的變化，就可檢測基因的突變。
3.權利要求1或2中記載的方法，其特徵是上述粒子是粒徑均一的膠乳。
4.權利要求1或2中記載的方法，其特徵是通過用光照射流過鞘流池中的粒子產生的散射光強度來測定凝集程度。
5.權利要求4中記載的方法，其中散射光是前方散射光。
6.權利要求1或2中記載的方法，其中，結合於基因片斷的是抗原，粒子表面上結合的是識別上述抗原的抗體。
7.權利要求6中記載的方法，其中，抗原是半抗原。
8.權利要求6或7中記載的方法，其中，抗體是單克隆抗體。
9.權利要求6-8中任一項記載的方法，其中，基因片斷上結合的抗原是1種，而且粒子表面結合的抗體是1種單克隆抗體。
全文摘要
本發明提供一種簡便、快速檢測擴增後的基因的方法。其特徵是將使用結合了抗原或抗體的基因片斷擴增的雙鏈基因與一種粒子反應，該粒子是結合了識別上述抗原的抗體或是識別上述抗體的抗原的粒子，也可以是結合了與上述抗原或抗體特異結合的物質的粒子。通過測定反應後粒子的凝集程度來檢測目的基因。同時本發明也提供了利用上述方法檢測基因中突變的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1163939SQ9710314
公開日1997年11月5日 申請日期1997年3月13日 優先權日1997年3月13日
發明者福田滋弘 申請人:東亞醫用電子株式會社