受內分泌擾亂子影響之基因的檢測方法

2023-05-29 16:53:21 3

專利名稱：受內分泌擾亂子影響之基因的檢測方法
技術領域：
本發明涉及影響活體穩態的內分泌擾亂子及受該物質影響之基因的檢測方法。
背景領域內分泌擾亂子(常指環境激素)統指從環境中釋放的、已發現具有激素樣活性或抗激素活性的化學物質。已報導由於內分泌擾亂子對野生動物生態系統的影響，導致(其)生殖能力改變(尤其是雄性雌性化)、生殖能力下降、生育率降低、後代存活率降低、生殖行為異常和類似情況。儘管尚未證實，已懷疑由於內分泌擾亂子對人類健康的影響，導致人類出現精子數目減少、子宮內膜異位症、不育、卵巢癌、子宮癌、前列腺癌和類似情況。
環境部「擾亂內分泌的外源化學物工作組」在間期報告(1997年7月)中報導了認為產生內分泌紊亂的物質(或物質群)。然而，此類物質據認為在未來的研究和實驗期間還會增加。
已知確定內分泌擾亂子的方法分為兩種，即體外方法和體內方法。前者方法示例包括測量與雌激素或雄激素受體結合活性的方法，和測量激素合成酶系抑制活性的方法。後者方法示例包括測量出生後不同天數大鼠體內多種激素的產生和異常的組織形成的方法，測量青蛙異常變態的方法和魚異常成熟的方法(分析化學(AnalyticalChemistry)，70(15)528A-532A(1998))。
然而，迄今尚未完全證實疑為內分泌擾亂子的物質是否確實產生內分泌紊亂。另外，倘若它們產生內分泌紊亂的話，尚未完全證實其影響機制以及可能會產生危險的攝入量和攝入時程。
例如，當前的受體結合實驗是必需和重要的初步篩選方法。然而，此方法所得的結果並不能保證內分泌擾亂子的身份。具體地，雌二醇(一種天然雌激素)、二乙基己烯雌酚(一種合成的雌激素)、異黃酮(豆類含有的一種成分，對人無害)和二酚-A(疑為內分泌擾亂子的物質)與雌激素受體結合，雖然每種物質的EC50值各不相同。這樣，不能根據此分析方法確定每一物質的內分泌幹擾活性程度。同樣，不能根據任何傳統方法來確定該活性，包括使用酵母或培養細胞的分析系統和稱重小鼠子宮的系統。
換句話說，當前測量激素受體結合活性或激素合成酶系抑制活性的方法是測定內分泌擾亂子的必需條件。但其不是充分條件。另外，體內測量對大鼠、青蛙、魚或類似物的生長或變態之影響的方法敏感性低且複雜，並需要長時間操作大量樣本。
還有，雖然可用上述傳統分析方法來分析可能的內分泌擾亂子與受體的關係，但不能用其分析下遊信號傳導系統。
如上所述，為解決環境激素的問題，需要鑑別內分泌擾亂子和確定該物質對內分泌系統的影響。這樣，需要一些方法來分析何種信號傳導通路受內分泌擾亂子的影響和何種物質產生內分泌紊亂。
發明目的本發明的主要目的是提供(1)受內分泌擾亂子影響之基因的檢測方法；(2)受內分泌擾亂子影響之基因的檢測方法，包括通過該方法對所檢測基因的表達進行測量；(3)DNA陣列，其上固定有受內分泌擾亂子影響的基因或源自該基因的DNA片段；和(4)可能產生內分泌紊亂的物質的檢測方法。
發明概述經過大量研究，本發明者構建了一種快速檢測許多受內分泌擾亂子影響之基因的方法，該方法靈敏性高並能同時操作。本發明者發現了一種應用固定有所述基因或其片段的DNA陣列來檢測內分泌擾亂子的方法。另外，本發明者構建了一種可能會產生內分泌紊亂的物質的檢測方法。這樣，本發明得以完成。
總之，本發明涉及[1]受內分泌擾亂子影響之基因的檢測方法，其特徵在於該方法包括製備取自細胞、組織或生物、含有mRNA或其cDNA的核酸樣本，該細胞、組織或生物已經與含一種內分泌擾亂子的樣本相接觸；使該核酸樣本與一種DNA陣列雜交，該陣列上固定有可能受該內分泌擾亂子影響的基因或來自受該內分泌擾亂子影響之基因的DNA片段；和通過比較該結果與用對照樣本製備的核酸樣本所得結果，選擇受該內分泌擾亂子影響的基因；[2]根據上述[1]的方法，其中應用的基因選自如下(1)核受體基因或與核受體轉錄偶聯有關的基因；(2)與激酶類信號傳導有關的基因；(3)與性腺分化有關的基因；(4)與受體類激酶有關的基因；(5)與中間纖維標誌有關的基因；(6)與細胞周期或生長調節有關的基因；(7)癌基因、與癌基因有關的基因或與腫瘤抑制有關的基因；(8)與凋亡有關的基因；(9)與DNA損傷應答、修復或重組有關的基因；(10)受體基因與受體有關的基因；(11)與細胞死亡或分化調節有關的基因；(12)與細胞黏附、遷移或侵襲有關的基因；(13)與促血管生成有關的基因；(14)與細胞侵襲有關的基因；(15)與細胞-細胞間的作用有關的基因；(16)Rho家族、GTP酶或其調節因子的基因或與之有關的基因；和(17)生長因子或細胞因子的基因或與之有關的基因，或來自該基因的DNA片段。
內分泌擾亂子的檢測方法，其特徵在於該方法包括通過上述[1]或[2]的方法對所檢測基因的表達進行測量；[4]根據[3]的方法，其中內分泌擾亂子選自以下類別(1)二氧芑(dioxins)；(2)有機氯化合物；(3)酚類；(4)鄰苯二甲酸酯；(5)芳香族烴；(6)殺蟲劑；(7)有機錫化合物(organotin)；(8)雌激素；或
(9)全氯五環癸烷(mirex)、毒殺芬(toxaphene)、丁醛肟威(aldicarb)或開蓬(kepone)；[5]可能干擾內分泌的物質的檢測方法，其特徵在於該方法包括製備取自細胞、組織或生物、含有mRNA或其cDNA的核酸樣本，該細胞、組織或生物已經與懷疑含有可能干擾內分泌之物質的樣本相接觸；使該核酸樣本與一種DNA陣列雜交，該陣列上固定有受內分泌擾亂子影響的基因或來自受該內分泌擾亂子影響之基因的DNA片段；和通過比較該結果與用對照樣本製備的核酸樣本所得結果，檢測可能干擾內分泌的物質；[6]根據上述[5]的方法，其中將可能干擾內分泌的物質劃分為(1)二氧芑；(2)有機氯化合物；(3)酚類；(4)鄰苯二甲酸酯；(5)芳香族烴；(6)殺蟲劑；(7)有機錫化合物；(8)雌激素；或(9)全氯五環癸烷、毒殺芬、丁醛肟威或開蓬；[7]檢測受內分泌擾亂子影響之基因的DNA陣列，其上固定有受內分泌擾亂子影響的基因或可能受內分泌擾亂子影響的基因，或該基因的DNA片段；[8]根據上述[7]的DNA陣列，其上固定的基因選自如下(1)核受體基因或與核受體轉錄偶聯有關的基因；(2)與激酶類信號傳導有關的基因；(3)與性腺分化有關的基因；(4)受體類激酶的基因或與之有關的基因；(5)中間纖維標誌基因或與之有關的基因；(6)與細胞周期或生長調節有關的基因；(7)癌基因、與癌基因有關的基因或與腫瘤抑制有關的基因；(8)與凋亡有關的基因；
(9)與DNA損傷應答、修復或重組有關的基因；(10)受體基因與受體有關的基因；(11)與細胞死亡或分化調節有關的基因；(12)與細胞黏附、遷移或侵襲有關的基因；(13)與促血管生成有關的基因；(14)與細胞侵襲有關的基因；(15)與細胞-細胞間的作用有關的基因；(16)Rho家族、GTP酶或其調節因子的基因或與之有關的基因；和(17)生長因子或細胞因子的基因或與之有關的基因，或來自該基因的DNA片段；和[9]根據上述[7]或[8]的DNA陣列，其中該基因或來自該基因的DNA片段固定在載玻上。
發明詳述(1)本發明檢測受內分泌擾亂子影響之基因的方法如此處所用，內分泌擾亂子(也稱為外源性內分泌擾亂子或環境激素)是指進入動物活體時可影響活體內天然產生的激素的正常活性的物質。內分泌擾亂子包括保持、提高或抑制激素正常活性的物質。可能影響激素正常活性的物質也包括在此定義內。
當前，約有70種物質(或物質群)疑為具有內分泌擾亂活性。在相應物質之分析方法的基礎上將日本環境化學協會第24次會議(1998)摘要中的物質劃分如下(1)類別1有機氯化合物(如一般的有機氯化合物、多氯化聯苯(PCB))；(2)類別2酚類(如一般的酚、二酚-A、2，4-二氯酚、五氯酚)，(3)類別3鄰苯二甲酸酯(如一般的鄰苯二甲酸酯)；(4)類別4芳香烴(如苯並芘、二-2-乙基己基己二酸酯(DEHA)、二苯甲酮、4-硝基甲苯、苯乙烯二聚體和三聚體、1，2-二溴基-3-氯丙烷、正丁苯)；(5)類別5殺蟲劑(如一般的殺蟲劑、2，4，5-T(三氯苯氧乙酸)、2，4-D(二氯苯氧乙酸)、苯菌靈、氨基連三唑、乙肟威)；(6)類別6有機錫化合物；(7)雌激素；不能劃分入上述七種類別的二氧化物；和排除在這些類別之外的物質，即全氯五環癸烷、毒殺芬、丁醛肟威或開蓬(十氯酮)。這些類別和物質見表1。
表1


已知這些物質具有以下基本活性1)對激素受體的直接活性(如合成的激素製劑、DDT、鄰苯二甲酸酯等)；2)通過其他受體的活性(如二氧化物等)；3)抑制代謝的活性(如類固醇代謝抑制劑、芳香酶或5α-還原酶抑制劑等)和4)通過其他系統的活性(如影響神經系統或免疫系統的物質)。這樣，它們的作用模式是不同的。[Kagaku(化學(Chemistry))，53(7)12-15(1998)]。
如此處所用，受內分泌擾亂子影響的基因定義為，與對照相比上述內分泌擾亂子提高或抑制其表達的基因。該基因數可為一個、兩個或更多。其表達受內分泌擾亂子直接或間接影響的某物質基因或與之有關的基因，可作為固定在本發明的DNA陣列上的基因得以選擇。可優選應用表達得以提高的基因和表達得以抑制的基因。優選的此類候選基因(即可能受內分泌擾亂子影響的基因)的例子包括，但不限於，表2所示的基因，劃分如下(1)核受體基因或與核受體轉錄偶聯有關的基因(核受體或核受體轉錄偶聯)；(2)與激酶類信號傳導有關的基因(激酶類信號傳導)；(3)與性腺分化有關的基因(性腺分化)；(4)受體類激酶的基因或與之有關的基因(受體類激酶)；(5)中間纖維標誌基因或與之有關的基因(中間纖維標誌)；(6)與細胞周期或生長調節有關的基因(細胞周期和生長調節劑)；(7)癌基因、與癌基因有關的基因或與腫瘤抑制有關的基因(癌基因和腫瘤抑制因子)；(8)與凋亡有關的基因(凋亡)；(9)與DNA損傷應答、修復或重組有關的基因(DNA損傷應答、修復或重組)；(10)受體基因與受體有關的基因(受體)；(11)與細胞死亡或分化調節有關的基因(細胞命運和發育調節因子)；(12)與細胞黏附、遷移或侵襲有關的基因(細胞黏附、遷移和侵襲)；(13)與促血管生成有關的基因(血管生成的調節因子)；(14)與細胞侵襲有關的基因(侵襲調節因子)；(15)與細胞-細胞間的作用有關的基因(細胞-細胞間的作用)；(16)Rho家族、GTP酶或其調節因子的基因或與之有關的基因(Rho家族、小的GTP酶及其調節因子)；和(17)生長因子或細胞因子的基因或與之有關的基因(生長因子或細胞因子)。此外，其表達可能直接或間接受內分泌擾亂子影響的其他物質的基因或與之有關的基因，也包括在本發明受內分泌擾亂子影響的基因內。
表2




















可能受內分泌擾亂子影響的基因例子還有已知與二乙基己烯雌酚、二酚-A、17β雌二醇及類似物質結合的雌激素受體的基因，和與雌激素受體信號傳導通路有關的基因。
可如下所述來檢測受內分泌擾亂子影響的基因。
如此處所用，DNA陣列是指其上固定有基因或該基因的DNA片段的支持物，包括所謂的DNA晶片。可以應用能夠用來雜交的任何支持物。一般使用承物玻璃、矽晶片、硝酸纖維素膜或尼龍膜或類似物。例如，可如下製備固定到該支持物上的基因或其DNA片段。以待固定基因或其產物的GenBank序列號所鑑定的鹼基序列為基礎，應用引物分析/構建軟體比如OligoTM引物分析軟體(Takara Shuzo)可以製備本發明方法中最佳的PCR擴增引物對。根據市售PCR試劑盒所附標準方法，通過使用該引物對和基因組DNA、基因組DNA文庫或cDNA文庫模板可以獲得感興趣的PCR擴增片段。產生的DNA片段可用例如Microcon-100(Takara Shuzo)純化。在本發明的方法中可優選使用該純化的DNA片段。此外，根據已知方法例如通過向支持物中導入氨基，可以把該基因或其片段固定到該支持物上而製備DNA陣列。還有，通過應用製備DNA陣列的儀器比如自GMS製備DNA晶片的儀器來進行固定步驟，可以製備基因高密度排列並固定在其上的DNA陣列。
應用此類DNA陣列使同時測量核酸樣本中的多種核酸分子內容物成為可能，並有利於用少量核酸樣本進行測量。
本發明使用的DNA陣列上固定有任何基因或其DNA片段。優選地，使編碼有望具有內分泌擾亂活性相關功能的蛋白質的基因或源自該基因的DNA片段得以固定。若使用片段的話，可優選使用例如約1kb長的片段，但該片段並不限於特定長度。只要該片段與測試樣本中的核酸特異性雜交，其長度可比上述長度長或短。此類基因的示例包括但不限於，激素受體基因、編碼受體輔因子的基因、編碼與受體信號傳導有關的蛋白質的基因、編碼與激素的生物合成或代謝有關的蛋白質的基因和癌基因。
例如，取自對內分泌擾亂子敏感的細胞或組織(器官)的mRNA或用該mRNA作模板逆轉錄得到的cDNA，可用來作為含有因內分泌擾亂子影響而發生表達改變的基因的核酸樣本。此類mRNA在經過一段時間後或在接觸內分泌擾亂子後不同天數獲得。
接觸含有內分泌擾亂子的樣本的細胞可以是自有機體收集的細胞，或是培養細胞。只要該組織可能受內分泌擾亂子的影響，其並不限於特定組織。還有，所用的細胞或組織或有機體的來源並不限於人類。根據所用的有機體、內分泌擾亂子、受此內分泌擾亂子影響的基因或類似物(的不同)，與內分泌擾亂子的接觸時間的長短可以變化。
另一方面，使同樣取自對照細胞、組織或有機體的、含有mRNA或其cDNA的核酸樣本在嚴格條件下進行雜交。可對該核酸樣本進行如下恰當標記，這樣可以輕鬆確定是否該核酸樣本與DNA或DNA陣列雜交。
例如，可用放射性同位素、螢光物質、化學發光物質、被合適的抗體識別的抗原或類似物進行標記。或者，可首先進行雜交而不標記，然後用能發出螢光或化學發光的嵌入物質來標記。
可根據已知的方法使所得核酸樣本與DNA陣列上的DNA進行雜交。自然地，根據DNA陣列上的DNA長度在最佳條件下進行雜交和衝洗步驟。這些步驟可在例如分子克隆，實驗室手冊，第二版，9.52-9.55(1989)頁所屬的條件下進行。
通過比較對照核酸樣本的雜交結果與取自已接觸了含有一內分泌擾亂子的樣本的細胞、組織或有機體的核酸樣本所得結果，可以檢測兩種核酸樣本中信號強度明顯不同的基因。具體地，使陣列與標記如上的核酸樣本雜交。應用具體的測量儀器比如層析譜或圖象分析儀來檢測雜交陣列的放射活性、螢光、發光或類似物的信號強度。在信號強度差異的基礎上可以檢測因一內分泌擾亂子影響而發生顯著表達變化的基因。
通過應用能夠檢測多種標記(如兩類螢光)的多波長檢測螢光分析儀，可以比較同一DNA陣列上對照核酸樣本的基因表達和同一DNA陣列上接觸了一內分泌擾亂子的細胞、組織或有機體的核酸樣本的基因表達。例如，使取自接觸有一內分泌擾亂子的細胞的核酸樣本螢光標記上Cy3-dUTP，而對照樣本螢光標記上Cy5-dUTP。通過等量混合核酸樣本並使該混合物與DNA陣列雜交而表現出的顏色差異，可以檢測兩種核酸樣本基因表達的差異。根據結果可檢測因該內分泌擾亂子影響而發生顯著表達變化的基因。
該基因也可用作檢測一內分泌擾亂子的指數。
通過比較作為表達水平指數的信號強度和用對照樣本製備的核酸樣本所得信號強度，來選擇受一內分泌擾亂子影響的基因。例如，通過使含有一內分泌擾亂子的樣本的螢光信號值除以對照樣本的螢光信號值來計算數值。數值大於1.00表示用受試物質處理可促進該基因的表達。數值小於1.00表示用受試物質處理可抑制該基因的表達。數值等於1.00表示用受試物質處理不影響該基因的表達。若促進表達的話，該數值大於1.10，優選1.30，更優選2.00。若抑制表達的話，該數值小於0.90，優選0.80，更優選0.70。
如上所述，根據本發明的方法可同時、體外、快速並高敏地計策手內分泌擾亂子影響之基因的表達(例如細胞內核受體基因和參與下遊信號傳導通路的大量基因)。另外，可能會發現已知基因參與曾經未知的信號傳導通路。
(2)如下所述應用受內分泌擾亂子影響之基因的表達作為指數，可以檢測該內分泌擾亂子。
製備一種DNA陣列，如上所述其上固定有已證實受一內分泌擾亂子影響的基因。
如上所述製備懷疑受該內分泌擾亂子影響的細胞、組織或有機體的核酸樣本。再如上所述使該核酸樣本進行雜交。以信號強度之間的差異為基礎可確定基因表達的變化。以結果為基礎可確定該內分泌擾亂子的存在。
在另一實施方案中，可如下確定一內分泌擾亂子的存在。製備與已證實受該內分泌擾亂子影響之基因的mRNA相競爭的RNA或DNA。用該RNA或DNA作為內標物進行競爭性RT-PCR。然後通過RT-PCR定量確定受影響基因的表達水平。
如上所述，根據本發明的方法，用受內分泌擾亂子影響之基因(如細胞內核受體基因或大量下遊基因的一種)的表達作為指數可基本並輕鬆判定該內分泌擾亂子存在與否。
(3)可如下檢測可能干擾內分泌的物質此處所用的可能干擾內分泌的物質是指可能影響活體內天然分泌的激素之正常活性的物質。該定義包括活性已得到證實和活性尚未得到證實的物質。
按照上述(1)所述方法，通過以上述方式固定已證實受內分泌擾亂子影響的基因來製備檢測可能干擾內分泌之物質的DNA陣列。
如上所述，從已接觸懷疑含有可能干擾內分泌之物質的樣本的細胞、組織或有機體製備核酸樣本。再如上所述使該核酸樣本進行雜交。以信號強度之間的差異為基礎可確定基因表達的變化。以結果為基礎可判定作為內分泌擾亂子的物質。
不僅在DNA陣列上全部DNA發生信號變化的情況下，而且在部分DNA發生變化的情況下，基於所得結果可認為某物質是內分泌擾亂子。具體地，若發現部分DNA發生強度變化，按照上述(1)的方法可通過再選擇受該物質作用影響的基因來優化檢測方法，這樣可更確切地檢測與該物質一樣產生內分泌紊亂的物質。
在另一實施方案中，如上所述製備與已證實受內分泌擾亂子影響之基因的mRNA相競爭的RNA或DNA。用該RNA或DNA作為內標物進行競爭性RT-PCR。基於基因的表達可定量檢測內分泌擾亂程度。可優選使用任何方法來檢測或定量如上述(1)所述獲得的受內分泌擾亂子影響之基因的表達，只要該方法能用於檢測/定量該基因。
(4)本發明的DNA陣列此處所用的DNA陣列是指其上固定有基因或其DNA片段的支持物，並包括所謂的DNA晶片。
能夠用於雜交的任何支持物可用於本發明的DNA陣列。一般地，使用承物玻璃、矽晶片、硝酸纖維素或尼龍膜或類似物。優選地，可優先使用由無孔並具有光滑表面的材料製成的支持物(如玻璃比載玻片)。可使用表面上可通過共價鍵或非共價鍵固定DNA的任何支持物。優選使用表面具有親水或疏水功能基的支持物。支持物表面的優選功能基的例子包括但不限於，羥基、氨基、巰基和醛基、羧基和醯基。該功能基可以是支持物本身的表面特性，或可通過表面處理將其導入。表面處理的支持物的例子包括用市售的矽偶聯劑比如氨基烷基矽處理或用聚陽離子比如多聚賴氨酸或多聚乙烯亞胺處理的玻璃。一些處理的載玻片可購得。
將內分泌擾亂子影響的基因或其DNA片段固定在本發明的DNA陣列上。該DNA陣列可以是DNA微陣列，其中在變性條件下將基因或其DNA片段的雙鏈DNAs排列並固定到同一支持物上。至少一部分固定的DNA可以是單鏈。此處的DNA陣列可通過在變性條件下將雙鏈DNA點排到同一支持物上來製備。本發明DNA陣列的排列密度沒有具體的限制。例如，可優選使用高密度的DNA陣列比如DNA以100點/平方釐米或更高密度固定在其上的陣列。
本發明中待排列和固定到支持物上的DNA片段沒有具體限制。大體上，優先使用長度為50個鹼基或更多的雙鏈多聚核苷酸或其衍生物，通過聚合酶鏈反應(PCR)或類似物進行酶促擴增而製備之，並在固定到支持物上時通過為固定DNA而發生的變性，將其轉化為單鏈DNA或其衍生物。該衍生物可發生促使其固定到支持物表面上的修飾。衍生物的例子包括但不限於，該DNA 5』端導入功能基比如氨基或巰基的DNA。
例如，用基因組DNA文庫或cDNA文庫作為模板通過PCR或類似方法擴增的DNA可用作固定到支持物上的基因或DNA片段。也可使用以已知的核苷酸序列為基礎合成的寡聚核苷酸。本領域已知能夠用於雜交的非DNA的核酸(例如通過體外轉錄製備的RNA)可替代DNA進行固定。根據已知方法例如通過向支持物導入氨基，使該基因或其DNA片段固定到支持物上，可製備DNA陣列。通過應用DNA陣列製備儀比如自GMS製備DNA晶片的儀器進行固定，可製備本發明的DNA陣列，其上排列和固定有基因。
使編碼具有參與激素活性發揮之功能的蛋白質的基因或其片段固定到本發明使用的DNA陣列上。若使用片段的話，雖然該片段的長度沒有具體限制，可優選使用例如長度約100b到約1kb的片段。只要該片段與受試樣本的核酸特異性雜交，其長度可短或長於上述長度。此類基因的例子包括但不限於，激素受體基因、編碼受體輔因子的基因、編碼與受體信號傳導有關蛋白質的基因、編碼與激素的生物合成或代謝有關蛋白質的基因、癌基因及類似物。另外，可固定例如根據上述(1)中的方法所得的手內分泌擾亂子影響的基因。還有，既然所有受內分泌擾亂子影響的基因可根據上述(1)的方法獲得，可製備檢測受內分泌擾亂子影響之基因的DNA陣列，其上固定有全部此類基因。
如上所述，通過應用本發明的方法和DNA陣列，可體外、快速並高敏地檢測例如細胞內核受體基因和與下遊信號傳導通路有關的基因。這樣，可基本上並輕鬆判定可能干擾內分泌之物質的存在與否。
以下實施例將進一步詳細說明本發明，但無意限制本發明的範圍。
實施例1受內分泌擾亂子影響的基因見表3所示。
表3


如下製備含有3』非翻譯區、約1kb的這些基因的cDNA片段。
簡而言之，用人類或小鼠的細胞或組織的mRNA(Clontech)做模板，通過逆轉錄PCR(RT-PCR)來擴增興趣cNDA片段。通過分析鹼基序列來證實所擴增的cDNA是興趣片段。乙醇沉澱回收所擴增的片段，以1μM濃度溶於10mM碳酸鹽緩衝液(pH9.5)。另外，同樣製備看家基因β肌動蛋白基因和陰性對照PUC18質粒。用製備DNA晶片(GMS)的儀器將這些片段點到已導入氨基(Sigma)的承物玻璃上並通過紫外照射固定。承物玻璃先用0.2％SDS衝洗，隨後用蒸餾水衝洗，乾燥後便製成DNA陣列。
實施例2(1)給小鼠給藥將10隻雌性小鼠(2天大)分成內分泌擾亂子給藥組和不給藥組。以0.1mg/小鼠/天的給藥劑量向每隻給藥組的小鼠靜脈注射可能干擾內分泌的己烯雌酚(DES)，注射兩天。在第4天去卵巢，用mRNA提取試劑盒(Qiagen)製備mRNA。用混合物進行CDNA合成反應，每一混合物含有約3μg mRNA、寡聚DT引物、Cy3-dUTP(Amersham)(給藥組)或Cy5-dUTP(Amersham)(非給藥組)dNTPS和逆轉錄酶(Gibco-BRL)。混合物經凝膠濾過，減壓濃縮，溶於4XSSC/0.2％SDS以製備螢光標記的cDNA。
(2)培養細胞的處理在含5％胎牛血清(FBS)的DME培養基中培養人乳腺癌細胞MCF-7。胰酶消化後以2×105個細胞/孔鋪於12孔板內。在同樣的培養基中溫育細胞24小時。去除培養基後在含有或沒有10pM 17β-雌二醇、含5％人類血清的DME培養基中培養細胞72小時，該人血清已通過碳-葡聚糖處理而去除類固醇激素。收集細胞並按照實施例2-(1)所述提取mRNAs。
用混合物進行cDNA合成反應，每一混合物含有3μg的mRNA、寡聚dT引物、Cy3-dUTP(接觸17β-雌二醇的細胞)、Cy5-dUTP(不接觸17β-雌二醇的細胞)、dNTPS和逆轉錄酶(Gibco-BRL)。該混合物經凝膠濾過，減壓濃縮，溶於4XSSC/0.2％SDS以製備螢光標記的cDNA。
(3)使標記的cDNA與DNA陣列雜交將上述(1)製備的等量的Cy3-標記cDNA和Cy5-標記cDNA一起混合併且進行熱變性。將5μl的混合物加到如實施例1製備的DNA陣列上。將蓋玻片放在混合物上且其邊緣用薄膜密封。在40-45℃溫育10小時之後，去除蓋玻片。DNA陣列用0.2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC各衝洗30分鐘，然後風乾。應用微陣列掃描儀(GMS)分析在DNA陣列上各個點的螢光信號。而且，對上述(2)中獲得的標記的DNA進行相似的操作。
結果，觀察到DES給藥小鼠的卵巢和接觸17-β雌二醇的MCF-7細胞有明顯的信號改變。這樣，可發現內分泌擾亂子影響的基因。
實施例3
(1)製備DNA陣列從列在實施例1表3中的基因裡選取33個基因。所選基因在表4中列出。β-肌動蛋白基因和pBR322質粒分別用作看家基因和作為陰性對照。
表4


應用在表4中列出的相應的引物對，依據實施例1中描述的方法來製備這些基因的大約100b到1kb的cDNA片段，並且將其點到支持物上以製備DNA陣列。應用人UniGene DNA(遺傳學研究)所含的相應的基因的引物來擴增組織蛋白酶G、NGF受體和CSF1受體基因。
(2)測定內分泌擾亂子的影響測定用多種內分泌擾亂子對培養細胞處理2或24小時所造成的影響。
處理2小時在含有10％胎牛血清(FBS)的DME培養基中培養人乳腺癌MCF-7細胞。用胰蛋白酶消化後，將2×106細胞種植於10cm培養皿上。將這些細胞在含有5％胎牛血清(FBS)的DME培養基中培養24小時，該血清已用活性碳-葡聚糖處理而去除了類固醇激素。在去除培養基後，將這些細胞在含有10nM17-β雌二醇(E2)、10 nM己烯雌酚(DES)或5μM二酚-A(BisA)的相同的培養基中培養2小時。作為對照，也同樣製備不在這些化學物質中培養的細胞。如實施2(1)中所述收集該處理的細胞，並提取總RNAs。
處理24小時在含有10％胎牛血清(FBS)的DME培養基中培養人乳腺癌MCF-7細胞。用胰蛋白酶消化後，將2×106細胞種植於10cm培養皿上。在相同的培養基中將該細胞溫育24小時。在去除培養基後，將這些細胞在含有5％人血清和10nM17-β雌二醇(E2)、10 nM己烯雌酚(DES)或5μM二酚-A(BisA)的DME培養基中培養24小時，該人血清用活性碳-葡聚糖處理已去除類固醇激素。作為對照，也同樣製備不在這些化學物質中培養的細胞。如實施2(1)中所述收集該處理的細胞，並提取總RNAs。
(3)用DNA酶處理在上述(2)中製備的總RNAs。製備12μl含有大約100-300μg總RNA、10μl10×AMV緩衝液(生命科學)和10U的DNA酶I(Takara Shuzo)的反應混合物，37℃溫育10分鐘，用苯酚/氯仿提取兩次，然後進行乙醇沉澱。部分用來測定所產生的總RNAs的濃度。
(4)應用在上述(3)製備的總RNAs中的一種來進行逆轉錄反應。反應混合物的成分如下所述。
反應混合物A大約130μg總RNA、10μg寡聚-dT引物(TakaraShuzo)和20μl經焦碳酸二乙酯(DEPC，Wakeo Pure化學工廠)處理的水。
反應混合物B12μl5×AMV核糖核酸酶緩衝液(生命科學)、0.5mM的dATP、dCTP和dGTP、0.2mMdTTP、60U RNA酶抑制劑(Takara Shuzo)和0.1mMCy3-標記dUTP(Amersham Pharmacia)。
在70℃將反應混合物A溫育10分鐘，然後在冰上冷卻。向其加入反應混合物B，所產生的混合物在42℃下溫育5分鐘。向其加入大約60U的AMVRNA酶(生命科學)。再加入DEPC-處理的水使最終容量達60μl。所產生的RT反應混合物在42℃下溫育70分鐘。向反應混合物加入7.5μl 500mM EDTA溶液和15μl的1M氫氧化鈉。在60℃將該混合物溫育1小時以降解模板RNA。冷卻至室溫後，向該混合物中加入37.5μl 1M的tris-鹽酸(PH7.5)。應用MICROCON YM-30(Millipore)將該溶液濃縮至20μl，向其加入200μl含有1 mM EDTA的10mMtris-鹽酸，然後將產生的混合物濃縮至20μl。這樣獲得的Cy3標記的cDNA溶液用於後來的雜交。
(5)將上述(4)中製備的Cy3標記的cDNA熱變性，並且將整個溶液加到上述(1)製備的DNA陣列上。將蓋玻片放在混合物上並且其邊緣用薄膜密封。在40-45℃溫育10小時之後，去除蓋玻片。DNA陣列用0.2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC各衝洗30分鐘，然後風乾。應用微陣列掃描儀(GMS)分析在DNA陣列上各個點的螢光信號。一種物質處理的樣本的螢光信號值除以對照樣本的螢光信號值而獲得的代表性數值見表5。在表5中，數值高於1.00表示通過該物質處理後該基因的表達增強。數值低於1.00表示通過該物質處理後該基因的表達降低。數值等於1.00表示通過該試驗物質處理後該基因的表達未受影響。
表5

在許多情況下，可能由內分泌擾亂活性幹擾所致的野生動物生殖的異常和人類精子生成能力的降低，認為是由特定階段的內分泌活動信號降低和受到幹擾所造成的。因此，認為除過度表達的基因外，應注意與對照細胞的表達相比表達受到抑制的基因。例如，如表5所示，在本實施例1所用的基因中，發現E2刺激後許多認為與雌激素作用密切相關的基因表達上調(例如P300/CBP、ACTR、RIP140、TIF2、PDGF受體和VEGF受體基因)，但關於其通路、機制或類似機理知之甚少。用可幹擾內分泌的DES處理24小時可活化除C-Myc外幾乎所有的基因。發現DES處理2小時可抑制N-CoR/SMRT和ARA70(核受體或核受體轉錄偶聯)、P38γ(數據未列)和JNK2(激酶類信號傳導)及PDGF受體(受體類激酶)基因的表達。另一方面，用懷疑具有內分泌擾亂活性的BisA處理2小時可抑制ACTR(核受體或核受體轉錄偶聯)和VEGF受體(受體類激酶)基因的表達。認為BisA處理後對基因的影響要小於DES刺激後所觀察到的影響。BisA處理24小時抑制JNK2和BMK2(激酶類信號傳導)及VEGF受體(受體類激酶)基因的表達。這樣，發現BisA處理後對基因表達的控制方式不同於DES刺激。如上所述，應用本發明的晶片提供了一種方法，其中，根據處理物質和處理時間的不同發現表達信號有明顯的變化。可明顯檢測受內分泌擾亂子影響的基因尤其是表達受內分泌擾亂子抑制的基因。
工業應用如上所述，本發明的方法是很有效的，因為其能同時、體外、快速和高敏地檢測受內分泌擾亂子影響的大量基因。而且，本發明提供可用來快速並高敏地檢測受內分泌擾亂子影響之基因的DNA陣列。本發明的方法也可用來檢測參與未知信號傳導通路的基因。另外，本發明的高效性還在於，採用據本發明方法所得的大量受內分泌擾亂子影響之基因的表達作指數，可判定內分泌擾亂子或可能干擾內分泌的物質存在與否。
序列表SEQ ID NO1所設計的擴增Smad3 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO2所設計的擴增Smad3 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO3所設計的擴增VEGF受體mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO4所設計的擴增VEGF受體mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO5所設計的擴增ACTR mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO6所設計的擴增ACTR mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO7所設計的擴增N-CoR/SMRT mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO8所設計的擴增N-CoR/SMRT mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO9所設計的擴增efp mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO10所設計的擴增efp mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO11所設計的擴增c-Myc1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO12所設計的擴增c-Myc1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO13所設計的擴增維生素D受體mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO14所設計的擴增維生素D受體mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO15所設計的擴增c-Myc2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO16所設計的擴增c-Myc2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO17所設計的擴增Bax mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO18所設計的擴增Bax mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO19所設計的擴增JNK1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO20所設計的擴增JNK1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO21所設計的擴增p38 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO22所設計的擴增p38 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO23所設計的擴增TRIP1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO24所設計的擴增TRIP1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO25所設計的擴增ARA70 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO26所設計的擴增ARA70 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO27所設計的擴增胰島素受體mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO28所設計的擴增胰島素受體mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO29所設計的擴增PDGF受體mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO30所設計的擴增PDGF受體mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO31所設計的擴增CSF1受體-2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO32所設計的擴增CSF1受體-2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO33所設計的擴增FGF受體mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO34所設計的擴增FGF受體mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO35所設計的擴增p38γmRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO36所設計的擴增p38γmRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO37所設計的擴增Bcl-X mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO38所設計的擴增Bcl-X mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO39所設計的擴增c-Myc3 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO40所設計的擴增c-Myc3 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO41所設計的擴增PS2蛋白質mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO42所設計的擴增PS2蛋白質mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO43所設計的擴增乳鐵蛋白mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO44所設計的擴增乳鐵蛋白mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO45所設計的擴增RIP140 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO46所設計的擴增RIP140 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO47所設計的擴增TIF2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO48所設計的擴增TIF2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO49所設計的擴增JNK2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO50所設計的擴增JNK2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO51所設計的擴增BaxδmRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO52所設計的擴增BaxδmRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO53所設計的擴增BMK-1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO54所設計的擴增BMK-1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO55所設計的擴增BMK-2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO56所設計的擴增BMK-2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO57所設計的擴增Src-1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO58所設計的擴增Src-1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO59所設計的擴增P300/CBP mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO60所設計的擴增P300/CBP mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO61所設計的擴增β肌動蛋白mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO62所設計的擴增β肌動蛋白mRNA的寡聚核苷酸引物。
序列表110Takara Shuzo co..Ltd.120檢測受環境內分泌影響之基因的方法130661516150.JP 10-3102851511998-10-3016062210121119212DNA213人工序列220223為擴增Smad3 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。4001caggtgtccc atcggaagg 19210221122212DNA213人工序列220223為擴增Smad3 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。4002ctctctggta gtggtaggga tt 22210321120212DNA213人工序列220223為擴增VEGF受體mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。4003tacaagatcg acgttagctc 20210421120212DNA213人工序列220223為擴增VEGF受體mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。4004cagccaaatt cacagttaaa 20210521124212DNA213人工序列220223為擴增ACTR mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。4005gctttgaaga tataatccga aggt24210621125212DNA213人工序列220223為擴增ACTR mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。4006ggcctggtga tgacagagta gataa 25210721124212DNA213人工序列220223為擴增N-CoR/SMRT mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。4007tatggaggac cctatgaaag tgta24210821125212DNA213人工序列220223為擴增N-CoR/SMRT mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。4008ttacgaccat gttctactag acctt 25210921120212DNA213人工序列220223為擴增efp mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。4009cgccgtgaag acgtgcttgg 202101021125212DNA213人工序列220223為擴增efp mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40010tcttggtcag gctctgttca atctc 252101121116212DNA213人工序列220223為擴增c-Myc-1 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40011cgccaagctc gtctca 162101221120212DNA213人工序列220223為擴增c-Myc-1 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40012tcaactgttc tcgtcgtttc 202101321121212DNA213人工序列220223為擴增vit D受體mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40013caaacgctgt gtggacatcg g 212101421123212DNA213人工序列220223為擴增vit D受體mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40014ttctggatca tcttggcata gag 232101521120212DNA213人工序列220223為擴增c-Myc-2 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40015gtagtaattc cagcgagagg 202101621119212DNA213人工序列220223為擴增c-Myc-2 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40016ctatgggcaa agtttcgtg 192101721120212DNA213人工序列220223為擴增Bax mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40017tgttttctga cggcaacttc 202101821117212DNA213人工序列220223為擴增Bax mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40018gagcactccc gccacaa 172101921119212DNA213人工序列220223為擴增JNK1 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40019gagcagaagc aagcgtgac 192102021120212DNA213人工序列220223為擴增JNK1 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40020gacattgatg tacgggtgtt 202102121117212DNA213人工序列220223為擴增p38 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40021gtgcccgagc gttacca 172102221120212DNA213人工序列220223為擴增p38 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40022aaagttcatc ttcggcatct 202102321120212DNA213人工序列220223為擴增TRIP1 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40023aaatgctaaa gttcgcctat 202102421118212DNA213人工序列220223為擴增TRIP 1 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40024acatggactc gccgttct182102521118212DNA213人工序列220223為擴增ARA 70 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40025agttgcataa gccgtcac 182102621120212DNA213人工序列220223為擴增ARA 70 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40026actagccaat ctgataggtc 202102721120212DNA213人工序列220223為擴增胰島素受體mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40027gctgccacca atacgtcatt 202102821119212DNA213人工序列220223為擴增胰島素受體mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40028gcatcctgcc catcgaact 192102921125212DNA213人工序列220223為擴增PDGF受體mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40029tcaccattcc atgccgagta acaga 252103021122212DNA213人工序列220223為擴增PDGF受體mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40030aggacagtgg gcggtgggta gg 222103121120212DNA213人工序列220223為擴增CSF1受體-2 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40031ccaccctgaa tgaagtcaac202103221120212DNA213人工序列220223為擴增CSF1受體-2 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40032ggtggatgga ttaagactga 202103321120212DNA213人工序列220223為擴增FGF受體mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40033cagactccgg cctctatgct 202103421120212DNA213人工序列220223為擴增FGF受體mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40034gggcttccag aacggtcaac 202103521123212DNA213人工序列220223為擴增p38γmRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40035tgatcgggct gctggacgta ttc 232103621125212DNA213人工序列220223為擴增p38γmRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40036agagggcttg cattggtcag gatag 252103721122212DNA213人工序列220223為擴增Bcl-X mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40037ccgggagctg gtggttgact tt 222103821121212DNA213人工序列220223為擴增Bcl-X mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40038ttcttaccca gccgccgttc t 212103921120212DNA213人工序列220223為擴增c-Myc-3 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40039gtagtaattc cagcgagagg202104021119212DNA213人工序列220223為擴增c-Myc-3 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40040ctatgggcaa agtttcgtg 192104121120212DNA213人工序列220223為擴增pS2蛋白質mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40041ggcccagaca gagacgtgta 202104221122212DNA213人工序列220223為擴增pS2蛋白質mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40042gctcgatggt attaggatag aa 222104321119212DNA213人工序列220223為擴增乳鐵蛋白mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40043ggagctgcgc aagtgtaac 192104421120212DNA213人工序列220223為擴增乳鐵蛋白mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40044attagtaatg cctgcgacat 202104521120212DNA213人工序列220223為擴增RIP 140 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40045gcctctttgc ttcagtcatt 202104621120212DNA213人工序列220223為擴增RIP140 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40046ttggcttagg tatagtctgg 202104721120212DNA213人工序列220223為擴增TIF2 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40047tccaaggcaa gatcacgtct 202104821120212DNA213人工序列220223為擴增TIF2 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40048aagccaacga tgaccctaat 202104921125212DNA213人工序列220223為擴增JNK2 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。tatagtgtcc aagtggcaga ctcaa 252105021123212DNA213人工序列220223為擴增JNK2 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物．40050atgtatgggt gacgcagagc ttc 232105121124212DNA213人工序列220223為擴增BoxδmRNA所設計的寡聚核苷酸引物．40051gatgattgcc gccgtggaca caga242105221125212DNA213人工序列220223為擴增BoxδmRNA所設計的寡聚核苷酸引物．40052ggtgagcact cccgccacaa agatg 252105321125212DNA213人工序列220223為擴增BMK-1 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物．40053ttaaagcccg ctccttcgat gtgac252105421123212DNA213人工序列220223為擴增BMK-1 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物．40054ggcggtcggc acctgggtac act232105521125212DNA213人工序列220223為擴增BMK-2 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40055ggtggccatc aagaagatcc ctaat 252105621124212DNA213人工序列220223為擴增BMK-2 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40056cctcacgcct tgcatggaag tcct242105721125212DNA213人工序列220223為擴增Src-1 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40057gtatgaatga aggacccaat aactc 252105821121212DNA213人工序列220223為擴增Src-1 mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40058ctggcaggat ctccgatttg a 212105921125212DNA213人工序列220223為擴增p300/CBP mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40059ttcagtcacc aacgtgccaa atatg252106021123212DNA213人工序列220223為擴增p300/CBP mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40060ttagagctgc gggatcaggt gtt 232106121121212DNA213人工序列220223為擴增β-肌動蛋白mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40061caagagatgg ccacggctgc t 212106221121212DNA213人工序列220223為擴增β-肌動蛋白mRNA所設計的寡聚核苷酸引物。40062tccttctgca tcctgtcggc a 2權利要求
1.檢測受內分泌擾亂子影響之基因的方法，其特徵在於該方法包括製備取自細胞、組織或生物、含有mRNA或其cDNA的核酸樣本，該細胞、組織或生物已經與含一種內分泌擾亂子的樣本相接觸；使該核酸樣本與一種DNA陣列雜交，該陣列上固定有可能受該內分泌擾亂子影響的基因或來自受該內分泌擾亂子影響之基因的DNA片段；和通過比較該結果與用對照樣本製備的核酸樣本所得結果，選擇受該內分泌擾亂子影響的基因；
2.根據權利要求1的方法，其中應用的基因選自如下(1)核受體基因或與核受體轉錄偶聯有關的基因；(2)與激酶類信號傳導有關的基因；(3)與性腺分化有關的基因；(4)受體類激酶基因或與之有關的基因；(5)中間纖維標誌基因或與之有關的基因；(6)與細胞周期或生長調節有關的基因；(7)癌基因、與癌基因有關的基因或與腫瘤抑制有關的基因；(8)與凋亡有關的基因；(9)與DNA損傷應答、修復或重組有關的基因；(10)受體基因與受體有關的基因；(11)與細胞死亡或分化調節有關的基因；(12)與細胞黏附、遷移或侵襲有關的基因；(13)與促血管生成有關的基因；(14)與細胞侵襲有關的基因；(15)與細胞-細胞間的作用有關的基因；(16)Rho家族、GTP酶或其調節因子的基因或與之有關的基因；和(17)生長因子或細胞因子的基因或與之有關的基因，或來自該基因的DNA片段。
3.檢測內分泌擾亂子的方法，其特徵在於該方法包括通過權利要求1或2的方法對所檢測基因的表達進行測量；
4.根據權利要求3的方法，其中內分泌擾亂子選自以下類別(1)二氧芑；(2)有機氯化合物；(3)酚類；(4)鄰苯二甲酸酯；(5)芳香族烴；(6)殺蟲劑；(7)有機錫化合物；(8)雌激素；或(9)全氯五環癸烷、毒殺芬、丁醛肟威或開蓬。
5.可能干擾內分泌的物質的檢測方法，其特徵在於該方法包括製備取自細胞、組織或生物、含有mRNA或其cDNA的核酸樣本，該細胞、組織或生物已經與懷疑含有可能干擾內分泌之物質的樣本相接觸；使該核酸樣本與DNA陣列雜交，該陣列上固定有受內分泌擾亂子影響的基因或來自受該內分泌擾亂子影響之基因的DNA片段；和通過比較該結果與用對照樣本製備的核酸樣本所得結果，檢測可能干擾內分泌的物質；
6.根據權利要求5的方法，其中將可能干擾內分泌的物質劃分為(1)二氧芑；(2)有機氯化合物；(3)酚類；(4)鄰苯二甲酸酯；(5)芳香族碳氫化合物；(6)殺蟲劑；(7)有機錫化合物；(8)雌激素；或(9)全氯五環癸烷、毒殺芬、丁醛肟威或開蓬。
7.檢測受內分泌擾亂子影響之基因的DNA陣列，其上固定有受內分泌擾亂子影響的基因或可能受內分泌擾亂子影響的基因，或該基因的DNA片段。
8.根據權利要求7的DNA陣列，其上固定的基因選自如下(1)核受體基因或與核受體轉錄偶聯有關的基因；(2)與激酶類信號傳導有關的基因；(3)與性腺分化有關的基因；(4)受體類激酶的基因或與之有關的基因；(5)中間纖維標誌基因或與之有關的基因；(6)與細胞周期或生長調節有關的基因；(7)癌基因、與癌基因有關的基因或與腫瘤抑制有關的基因；(8)與凋亡有關的基因；(9)與DNA損傷應答、修復或重組有關的基因；(10)受體基因與受體有關的基因；(11)與細胞死亡或分化調節有關的基因；(12)與細胞黏附、遷移或侵襲有關的基因；(13)與促血管生成有關的基因；(14)與細胞侵襲有關的基因；(15)與細胞-細胞間的作用有關的基因；(16)Rho家族、GTP酶或其調節因子的基因或與之有關的基因；和(17)生長因子或細胞因子的基因或與之有關的基因，或來自該基因的DNA片段。
9.根據權利要求7或8的DNA陣列，其中該基因或來自該基因的DNA片段固定在承物玻璃片上。
全文摘要
檢測受內分泌擾亂子影響之基因的方法,其特徵在於(該方法)包括製備源自細胞、組織或有機體、含mRNA的核酸樣本或其cDNA,該細胞、組織或有機體已接觸了含該內分泌擾亂子的樣本;使該核酸樣本與已固定有可能受該內分泌擾亂子影響的基因或其DNA片段的DNA陣列雜交;然後比較所得結果與用其他源自對照樣本的核酸樣本所得結果,從而選擇受該內分泌擾亂子影響的基因。
文檔編號C12N15/12GK1331754SQ99814877
公開日2002年1月16日 申請日期1999年10月28日 優先權日1998年10月30日
發明者近藤昭宏, 佐川裕章, 峰野純一, 君塚房夫, 加藤鬱之進 申請人:寶酒造株式會社