一種直接的免疫傳感器和測定方法

2023-05-29 21:44:46 2

專利名稱：一種直接的免疫傳感器和測定方法
技術領域：
本發明涉及一種進行免疫測定的器件和方法。該器件由一次性使用的免疫傳感器構成。
背景技術：
生物醫學上的傳感器用來報告各種被分析物的存在和/或其濃度。如果被分析物是一種蛋白質，那麼所使用的傳感元件通常是一種抗體，因為抗體與蛋白質(抗原)的相互作用非常特異。這種免疫測定技術通常分成兩類一類是可通過簡單的目視檢測進行的得到是或否的答案，另一類是通過定量方法來確定抗原的濃度。大多數定量方法需要使用昂貴的設備，如閃爍計數器(用來監測放射性)、分光光度計、螢光分光計(可見美國專利U.S.5,156,972)、表面細胞質基因諧振儀(可見美國專利U.S.5,965,456)等儀器。因此需要研製出一種既便宜又簡單適合於在家庭或現場使用的定量的免疫測定技術。這種免疫傳感器不需要進行離心、稀釋、移液、衝洗或定時等操作步驟，而且產生最少的廢物。
傳統的免疫測定技術分為兩類競爭測定和夾層測定。在競爭測定中，試樣中的抗原與抗原-探針複合物(通常稱作報導複合物)進行混合，然後，混合物中的抗原通過競爭與抗體結合。探針可以是放射性同位素、酶、螢光團或發色團。在夾層免疫測定技術中，試樣中的抗原與抗體結合，然後第二抗體-探針複合物與抗原結合。在這些現有技術的測定方法中，通常需要有一個或多個衝洗步驟。衝洗步驟使測定過程複雜化並會產生對生物有害的廢液。因此需要研製出一種無需任何衝洗步驟即可進行免疫測定的器件，而且還應適合於作為用後即棄的一次性器件。

發明內容
本發明提供了一種便宜的可作定量分析的一次性的免疫傳感器，不需要進行洗滌步驟，因此不會產生廢液。對於某些實施例的免疫傳感器，使用者無需進行定時操作，而且這種傳感器可以很容易地應用於廣泛的動力學範圍的抗原-抗體相互作用。優選實施例中的傳感器具有許多潛在的優點。這種傳感器很簡單便於製造，因為可以在單個步驟中沉積試劑，和/或試劑只沉積在反應腔的一部分上，或沉積在反應腔中的支持上。
這種傳感器可以使用假抗原-探針複合物、修飾抗原-探針複合物、或抗原-探針複合物。在此使用的術語「假抗原」是廣義的術語，應按照其原本的意義來使用，其包括但不限於，除了要檢測的抗原以外的所有能與固定抗體結合的抗原，但這種結合不如要檢測的抗原與固定抗體的結合牢固。在此使用的術語「修飾抗原」是廣義的術語，並按照其原本的意義來使用，它包括但不限於，已經用化學方法或其它方法修飾的抗原，因此這種修飾抗原可與固定抗體結合，但其結合不如要檢測的抗原與固定抗體的結合牢固。抗原-探針複合物中的抗原可與要檢測的的抗原相同或不同，這種抗原藉助與探針結合而可以與固定抗體結合，但卻不如處於未結合狀態的要檢測的的抗原與固定抗體將進行的結合那麼牢固。雖然優選實施例中主要討論假抗原，但是應當知道可以用抗原-探針複合物或修飾抗原代替假抗原。
與現有技術的方法一般通過控制試劑的沉積速率和表面密度來獲得正確的比率相比，本發明比較容易確保反應腔中抗體與抗原-探針、修飾抗原-探針或假抗原-探針的比率正確，因為這在傳感器工作過程中抗原-探針、修飾抗原-探針或假抗原-探針於和抗體結合時基本上可以自動實現。優選實施例中的傳感器還非常適用於較慢的免疫反應動力學，其中的結合過程可能很慢。在製造傳感器時使用非人類的假抗原可以減少當傳感器接觸病人手指上血滴時傳染免疫疾病的可能性。
在第一實施例中，提供了一種用來檢測液體試樣中目標抗原的一次性使用的器件，該器件包括具有第一高度的反應腔，固定在反應腔中的固定抗體，包含探針和報導複合抗原的報導複合物，其中探針與報導複合抗原聯接，報導複合抗原可與固定抗體結合，而且報導複合抗原與固定抗體的結合不如目標抗原與固定抗體的結合牢固；檢測腔，具有比反應腔的第一高度小的第二高度並且包括通氣孔；反應腔的試樣入口，和反應腔與檢測腔之間的試樣通道，其中當通氣孔打開時，所述器件適於通過毛細管作用使試樣在所述反應腔和所述檢測腔之間移動。
在第一實施例的一個特徵中，報導複合抗原可以是目標抗原、假抗原或修飾抗原。探針可以包括放射性同位素、發色團或螢光團。
在第一實施例的一個特徵中，探針可以包括酶，如葡糖脫氫酶。當探針是一種酶時，檢測腔中還可以包括一種酶作用物，例如氧化酶作用物，如葡萄糖。檢測腔中還可以包括一種介質，如二氯酚靛酚、或過渡金屬與含氮雜原子物組分的絡合物、或鐵氰化物。該器件中還可以包含用來調節試樣pH值的緩衝劑，如磷酸鹽或苯六甲酸鹽。該器件中還可以包含穩定劑，用來穩定目標抗原、報導複合抗原、酶、固定抗體中的一種或多種。酶作用物可以支持於檢測腔內表面上。
在第一實施例的一個特徵中，固定抗體可以支持於反應腔內表面上。
在第一實施例的一個特徵中，該器件中還包含一種支持材料。支持材料可以包含在檢測腔中，而且支持材料可以包含第一物質，如酶作用物、介質或緩衝劑，其中第一物質可以支持在支持材料上或包含在支持材料中。支持材料可以包含在反應腔中，而且支持材料可以包含第二物質，如固定抗體、報導複合物或能夠防止蛋白質與反應腔內表面非特定結合的試劑，其中第二物質可以支持於支持材料上或包含在支持材料中。支持材料可以包括網狀材料，例如聚合物如聚烯烴、聚酯、尼龍、纖維素、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚碸或其混合物的網狀材料。支持材料可以包括纖維填充材料，例如聚合物如聚烯烴、聚酯、尼龍、纖維素、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚碸或其混合物的纖維填充材料。支持材料可以包括多孔材料，如粉末燒結，或大孔隙薄膜，比如聚合物材料如聚碸、聚乙二烯二氟化物、尼龍、醋酸纖維素，、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯或其混合物的大孔隙薄膜。支持材料可以包括珠粒。
在第一實施例的一個特徵中，檢測腔中包含第一電極和第二電極。第一電極和第二電極中至少一個包括鋁、銅、鎳、鉻、鋼、不鏽鋼、鈀、鉑、金、銥、石墨、粘結劑混合石墨、氧化銦、氧化錫、導電聚合物或其混合物等材料。
在第一實施例的一個特徵中，檢測腔壁對於探針發出或吸收的輻射線是可穿透的，且輻射線表示檢測腔中是否有報導複合物存在。
在第一實施例的一個特徵中，該器件包括可探測到反應腔是否基本上處於充滿狀態的探測器。
在第一實施例的一個特徵中，該器件包括可在檢測腔的遠端形成檢測腔氣孔的穿刺件。該器件還可以在反應腔的遠端形成反應腔氣孔。
在第一實施例的一個特徵中，目標抗原包括人類丙種反應蛋白。報導複合抗原可以包括單體丙種反應蛋白。或者，報導複合抗原可以包括從非人類物種得到的丙種反應蛋白或經化學修飾的丙種反應蛋白，其中經化學修飾的丙種反應蛋白與抗體的親合力小於人類丙種反應蛋白與抗體的親合力。
在第一實施例的一個特徵中，檢測腔壁或反應腔壁可具有聚酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚烯烴、聚對苯二甲酸乙二醇酯或其混合物等材料。檢測腔壁或反應腔壁還可以包括填充劑如二氧化鈦、石墨、矽石、玻璃及其混合物。
在第一實施例的一個特徵中，探針包括酶輔因子，如黃素單核甙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、煙醯胺腺嘌呤二核苷酸或吡咯並喹啉苯醌。酶輔因子可以通過撓性間隔層與報導複合抗原聯接。檢測腔中還可以包含酶作用物，或主酶。
在第一實施例的一個特徵中，探針中包含酶活性調節劑如激酶，或磷酸化酶。檢測腔中還可以包括酶作用物，或酶。
在第一實施例的一個特徵中，探針中包含屬於多亞基酶的蛋白質亞基。
在第二實施例中，提供了一種用來測定液體試樣中目標抗原數量的方法，該方法包括以下步驟將液體試樣放置到含有固定抗體和報導複合物的反應腔中，其中報導複合物包含與報導複合抗原聯接的探針，抗體固定在反應腔中，報導複合抗原與固定抗體結合，而且報導複合抗原與固定抗體的結合不如目標抗原與固定抗體的結合牢固；將報導複合抗原的一部分從固定抗體上分離到液體試樣中；使目標抗原的一部分與固定抗體結合；將液體試樣輸送到檢測腔中，有電極定位檢測腔內；然後以電化反應來確定液體試樣中的報導複合物數量，其中報導複合物的數量表示最初在液體試樣中的目標抗原數量。
在第二實施例的一個特徵中，將液體試樣輸送到檢測腔中的步驟包括將液體試樣輸送到帶有第一電極和第二電極的電化學電池中。確定液體試樣中報導複合物數量的步驟還可以包括在電化學電池中的第一電極和第二電極之間施加電壓；然後測量電流，電流表示在液體試樣中存在的報導複合物數量，而報導複合物的數量表示目標抗原的數量。
在第二實施例的一個特徵中，將液體試樣輸送到檢測腔的步驟包括將液體試樣輸送到帶有電磁輻射透射部分的檢測腔中。確定液體試樣中報導複合物數量的步驟還可以包括將電磁輻射透射部分暴露於電磁輻射線中，電磁輻射線穿過液體試樣或從液體試樣上反射；然後在電磁輻射線穿過液體試樣或從液體試樣上反射後監測電磁輻射線的特性，該特性表示在液體試樣中存在的報導複合物數量，而報導複合物的數量表示目標抗原的數量。


圖1顯示採用了電化學電池的第一優選實施例的免疫傳感器的頂視圖(不按比例)；圖2顯示沿圖1中免疫傳感器實施例A-A′剖面的橫斷面視圖(不按比例)；圖3顯示採用了電化學電池的另一個優選實施例的免疫傳感器的頂視圖(不按比例)；圖4顯示沿圖3中免疫傳感器實施例B-B′剖面的橫斷面視圖(不按比例)。
具體實施例方式
以下說明和實例詳細介紹了本發明的優選實施例。所屬領域的技術人員應當認識到在本發明的範圍之內可以作出很多修改和變化。因此，對於優選實施例的說明不應該被認為是用來限制本發明範圍。
本發明提供的傳感器條包含兩個腔室反應腔和檢測腔。試樣容納到反應腔中，試樣成分在其中進行免疫反應。在檢測腔中檢測免疫反應的一種或多種生成物以測定試樣中存在的抗原數量。反應腔和檢測腔設置成可使試樣從反應腔流入檢測腔。
當反應腔進行免疫反應之後，至少一些已反應的試樣被輸送到檢測腔，在那裡對探針的存在進行檢測和分析以得到最後結果。最好輸足夠的試樣，使得檢測腔充分裝滿，即，有足夠的試樣輸送到檢測腔，使得能夠通過所用的檢測方法對探針的存在進行檢測和分析。
反應腔中包含要檢測的抗原的抗體，抗體在反應腔中固定不動。抗體可以固定在腔室壁上。或者抗體可以固定在反應腔中的支持上。適當的支持包括但並不限於，纖維狀材料、大孔隙材料、粉末材料，或者在更為優選的實施例中，可以用本技術領域中眾所周知的珠粒材料來支持抗體。
在優選實施例中，固定抗體與被稱作「假抗原」的抗原結合在一起，其中「假抗原」與探針聯接。假抗原-探針與固定的抗體結合起來，但不如要檢測的抗原結合的那麼牢固。舉例來說，如果要檢測的抗原是一種人體蛋白，那麼適當的假抗原-探針可以包括相同的動物蛋白質，比如與探針聯接的狗蛋白質或豬蛋白質。在這一實例中，人體蛋白質的抗體固定在反應腔中，而與適當探針聯接的動物蛋白質則與固定抗體結合，形成抗體-假抗原-探針複合物。
當試樣充滿反應腔時，假抗原-探針的一小部分分離到溶液中，因為其與抗體的結合相對較弱。在結合的假抗原-探針與自由的假抗原-探針之間將存在一種動態平衡，而留下一些自由的抗體結合位置。如果溶液中有抗原，其將優先於假抗原-探針牢固地結合到自由的抗體結合位置，因而使假抗原-探針留在溶液中。這一過程將持續進行，直至試樣中的抗原基本上全部與抗體結合，而在溶液中有等量的自由假抗原-探針。因此與固定抗體結合的每個抗原都將一個假抗原-探針置換到溶液中。
當試樣中所有或預定的一部分抗原與固定抗體結合時，溶液中假抗原-探針的濃度反映了試樣中抗原的初始濃度。在優選實施例中，自由的和已結合的假抗原-探針之間必須達到平衡以確保溶液中的抗原可以優先於假抗原-探針與抗體結合。因此，要使用與抗體的結合力比目標抗原更弱的假抗原-探針，但是不必像某些現有技術的方法那樣在引入試樣之前用物理方法使假抗原-探針與抗體分離。
當進行完免疫反應之後，包含任何從抗體上釋放的假抗原-探針的液體試樣輸送到檢測腔中。在檢測腔中，對試樣中存在的假抗原-探針的濃度進行測量並得到結果。
即使在試樣中沒有抗原的情況下，少量的假抗原-探針也會由於結合的和自由的假抗原-探針在溶液中達到平衡而分離到溶液中。如果是這樣，那麼在檢測腔中因這些自由假抗原-探針而產生的信號被當作本底信號，應作為分析過程的一部分從抗原濃度結果中減去。
在2000年7月14日中提交的共同未決申請No.09/616,433中介紹了一種帶有相連的免疫反應和檢測腔的免疫測定條，本文引用參考其內容。與本文介紹的具有起初就與固定在反應腔內表面上的抗體複合的假抗原-探針的傳感器不同的是，在申請No.09/616,433的傳感器中，在將試樣引入反應腔之前，抗體固定在反應腔的一個表面上，而抗原-探針固定在反應腔的另一個表面上。當試樣進入反應腔時，抗原-探針溶解到溶液中並與試樣中的抗原競爭與抗體結合的位置。申請No.09/616,433中傳感器的使用方法主要依靠動力學因素以確保抗原優先於抗原-探針與抗體結合(通過先到達)。因此，需要在空間上將抗原-探針與反應腔中的抗體分離，而且這種傳感器在抗原和抗原-探針與抗體的結合強度相等時可以工作。
在優選實施例中的傳感器是一種單步驟無衝洗的免疫傳感器。這種傳感器是一種用後即棄的一次性器件，帶有反應腔和檢測腔。任何適當的檢測方法都可以利用。適當的檢測方法包括如目視檢測或光譜檢測，其中目視檢測可觀察顏色的變化，而在光譜檢測中反射或透射光線被用來測量吸光率的變化。在優選實施例中的檢測方法是電化學方法，其中測量與免疫反應生成物有關的電流或電壓。
2000年7月14日提交的共同未決美國專利申請No.09/616,556中還介紹了對液體試樣進行電化學測量的方法和器件，在本文中引用參考其內容。
各試驗階段即反應階段和檢測階段的定時可手動進行。或者，可根據反應腔和/或檢測腔被充滿時所產生的觸發信號來自動定時。
適用於電化學檢測的傳感器實施例在圖1、2以及圖3和4中顯示。圖1是傳感器條第一實施例的頂視圖；而圖2是橫斷面視圖，示出了反應腔和檢測腔的細節。圖3是傳感器條第二實施例的頂視圖；而圖4是橫斷面視圖，顯示了反應腔和檢測腔的細節。
傳感器本發明的免疫傳感器可以用已知的薄層器件製造技術來製造，如製造電化學葡萄糖傳感器所採用的技術(參見美國專利5,942,102，本文引用參考其內容)。這種技術經過某些改進之後還可以用來製造使用非電化學檢測方法的免疫傳感器。
在圖1、2以及圖3和4所示的免疫傳感器優選實施例中，檢測腔中包含電化學電池。按照本技術領域中已知的薄層傳感器製造方法，通過將各種適當形狀的薄層材料裝配起來就可以製成免疫傳感器。一般來說，製造過程包括將一個或多個間隔層夾在頂層和底層中間。
在優選實施例中，傳感器20是一種將酶，如葡糖氧化酶或葡糖脫氫酶，用作探針的電化學電池28，在圖1所示的這種傳感器20的頂視圖，在圖2中示出了這種傳感器沿A-A′剖面的橫斷面視圖。反應腔22和檢測腔28是通過使一小孔從電阻材料片36中穿過而形成的。小孔的形狀設計成可構成反應腔22和檢測腔28的側壁以及兩個腔22和28之間的試樣通道38。通過將小孔從反應腔22的近端24延伸到薄片37的邊緣還可以形成試樣入口24。在一個實施例中，薄片36的厚度構成反應腔22和檢測腔28的整個高度，其中反應腔22和檢測腔28的高度相同。在另一個實施例中，反應腔22的高度大於檢測腔28的高度。反應腔22的高度大於檢測腔28的高度是通過將多個薄片32、34和36層疊而形成的。如上面所介紹的那樣，中間薄片層36帶有構成反應腔22和檢測腔28的側壁74和76的小孔。該中間層36夾在兩個或更多個其他層32和34中間，其他層32和34中的小孔只構成反應腔22的側壁74，因此層32和34構成檢測腔28的端壁60和62。在本實施例中，檢測腔的端壁60和62包括電極52和54，它們可以按下述方法製成。
如圖2所示，抗體44被固定在反應腔22的底部40上。假抗原-探針50與抗體44複合。抗體可以固定在反應腔中任何適當的表面上，比如固定在反應腔22的壁上或是固定在反應腔22中支持的表面上。
第一薄層電極52固定或設置在電阻材料片36的一側70上，並在構成檢測腔28的小孔中延伸而形成端壁60。層52比如可以用粘合劑粘接到薄片36上。適當的粘合劑包括，如熱激活粘合劑、壓敏粘合劑、熱固性粘合劑、化學固化粘合劑、熱熔性粘合劑、熱流動粘合劑等類似的粘合劑。
電極層52可以採用適當的材料，如鋁、銅、鎳、鉻、鋼、不鏽鋼、鉑、鈀、石墨、粘結劑混合的石墨、氧化銦、氧化錫、混合氧化銦/錫、金、銀、銥及其混合物、導電聚合物、如聚吡咯或聚乙炔等(用WO97/18464中所披露的濺射鍍膜方法、用絲網印刷方法或用其它任何適當的方法)對電阻材料片32進行塗復而製成。如果電極52在電化學電池中用作陰極，那麼適當的材料包括，如鋁、銅、鎳、鉻、鋼、不鏽鋼、鉑、鈀、石墨、粘結劑混合的石墨、氧化銦、氧化錫、混合氧化銦/錫、金、銀、銥、及其混合物、聚吡咯或聚乙炔等導電聚合物，和類似材料。如果電極52在電化學電池中用作陽極或是在傳感器的製造或貯存過程中要與氧化物質接觸，那麼適當的材料包括，比如鉑、鈀、石墨、用粘結劑混合的石墨、氧化銦、氧化錫、混合氧化銦/錫、金、銀、銥、及其混合物、如聚吡咯或聚乙炔等導電聚合物、和類似材料。適合於用作電極52和54的材料要與傳感器20存在的試劑相容，即，在所選擇的電壓下或在傳感器的製造和貯存過程中不與試劑起化學反應。
第二薄層電極54固定在電阻材料36的另一側72上，也在構成檢測腔28的小孔中延伸而形成第二端壁62。在本實施例中，惰性的電絕緣層36將電極承載基片32和34隔開。絕緣層36最好使層32和34保持預定的間距。如果這一間距足夠小，比如小於或等於大約500微米，那麼在相對所用檢測時間適當短的時間之後，在電極52和54之間流動的電流將與還原介質的濃度成正比。在本實施例中，電流上升的速率直接與酶反應的速率有關，因此與酶的數量有關。
在某些實施例中，電極布置形式除了相對形式以外還可以優先選用並列的形式或平行但有偏移的形式。兩個電極的大小可以是相同的或基本上相似，或者也可以是大小不同和/或形狀不同。兩個電極可以由相同的導電材料或不同的材料構成。所屬領域的技術人員應當知道可以對電極布置形式、間距、以及結構或製造方法作出其它改進。
在優選實施例中，電極層52和54以平行的相對關係布置，其間距小於或等於500、450、400、350、300、250或200微米，而且最好是從大約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50微米至大約75、100、125、150或175微米。然而，在某些實施例中，也許最好使電極間距大於500微米如600、700、800、900或1000微米，乃至大於1、2、3、4或5毫米。
檢測腔或反應腔的體積通常為大約0.3微升或以下至大約100微升或以上，最好大約為0.5、0.6、0.7、0.8或0.9微升至大約20、30、40、50、60、70、80或90微升，在大約1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5微升至大約6、7、8、9、10、12、14、16或18微升就更好。然而，在某些實施例中，對於反應腔和檢測腔或其中之一可以選用更大或更小的體積。
可以使檢測腔28中的電極54和52通過連接端66與儀表(未示出)電連接。連接件(未示出)通過導電線路(未示出)與檢測腔28中的電極54和56電連接。在圖1所示的優選實施例中，導電跡線由覆蓋在層32和34內表面上的薄膜導體52和54的延伸部分構成。與連接區66相連的儀表能夠在檢測腔28中的電極52和54之間施加電壓，分析所產生的電信號，顯示響應值，還可以將響應值存儲在存儲器中，或者可以將所存儲的響應值發送給外部設備如印表機或電腦。
在使用電化學檢測的其它實施例中，一般要用到檢測腔一個或兩個內表面上的導電材料條，其中至少有兩個電極，即傳感電極和平衡/參考電極。作為一種選擇，還可以設置用作獨立參考電極的第三電極。
當使用電位測量的檢測方法時，儀表可以測量傳感電極和參考電極之間的電位差，但不需要能夠在電極之間施加電壓。
在使用目視檢測或反射光譜法作為檢測方法的實施例中，層32和46及/或層34和42對於所要觀察的輻射波長是可穿透的。在目視檢測的情況下，在檢測腔28中可觀察到簡單的顏色變化。在使用反射光譜法的情況下，使檢測輻射線透過層32和46及/或層34和42，然後分析從檢測腔28溶液反射的輻射線。在使用透射光譜法作為檢測方法的情況下，層32、46、34和42對於所選擇波長的輻射線是可穿透的。使輻射線透過檢測腔28中的試樣並測量射束的衰減。
在優選實施例中，層36包括基片，基片的上表面70和下表面72上塗有一層粘合劑(未示出)。適於用作層36基片的材料包括聚酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚烯烴，最好是聚對苯二甲酸乙二醇酯。這些材料可以是原始的或加有適當的填充劑以提供所需要的光學或機械性能。適合於用作填充劑的材料包括但並不限於，二氧化鈦、石墨、矽石和玻璃。適當的粘合劑包括壓敏粘合劑、熱固性粘合劑、化學固化粘合劑、熱熔性粘合劑和熱流動粘合劑。或者，間隔層本身可以由適當的粘合劑構成。
如果在製造過程早期尚未製成試樣入口24，那麼可以在與反應腔22相交的器件20邊緣37中形成切口(未示出)來製成。
圖1中的虛線圓表示穿透了層32、34和36但未穿透層42和46的小孔30，層34中的小孔通到檢測腔28中。由於層42和46起初未被穿透，所以檢測腔28與大氣相通的唯一出口是通到反應腔22中的試樣通道38。因此，當反應腔22中充滿試樣時，至檢測腔28的試樣通道38被阻塞。這樣便將空氣封閉在檢測腔28中並可基本上防止試樣進入檢測腔28內。在試樣最初接觸通向檢測腔28的開口38和試樣接觸到開口38遠側的期間，少量的試樣將會進入檢測腔28中。不過，一旦試樣已經完全沾溼通向檢測腔28的開口38之後，就不會再有試樣填充到檢測腔28中。反應腔22的體積通常選為至少等於且最好大於檢測腔28的體積。通過使孔口30與大氣相通，可以將試樣輸送到檢測腔28中。孔口可以利用與儀表中螺線管相連的針狀物來打開。
如圖3所示的另一個實施例中的免疫傳感器100可按以下方法製造。第一成形間隔層112和具有類似厚度的第二成形間隔層114分別設置在底層116的上面。第一間隔層112是矩形的，並位於底層116的近邊118處。第二間隔層114也是矩形的，並位於底層116上離開第一間隔層112一定距離的位置。第一間隔層112的遠邊120和第二間隔層114的近邊122構成反應腔124的側壁部分120、122。底層116構成反應腔124的底壁126。抗體164固定在反應腔124的底部126。抗原-探針或假抗原-探針162與固定的抗體164結合。
形狀與第一成形間隔層112類似的第三成形間隔層128位於第一成形間隔層112的上面。第四間隔層130帶有狹縫132，狹縫132朝著間隔層130的中心方向從間隔層130的近端134中穿過延伸。第四間隔層130位於第二成形間隔層114的上面，近端122、134相互對齊。第四間隔層中的狹縫132構成檢測腔132的側壁(未示出)。第二間隔層被第四間隔層130中狹縫132暴露出來的部分138構成檢測腔132的底部138。狹縫132的近端140構成反應腔124與檢測腔132之間的通道140。第四間隔層130的近端134構成反應腔124的側壁部分134。
形狀與第一成形間隔層112及第三成形間隔層128類似的第五成形間隔層142位於第三間隔層128的上面。形狀與第二成形間隔層114類似的第六成形間隔層144位於第四成形間隔層130的上面，近端146、122相互對齊。第六間隔層被第四間隔層130的狹縫132暴露出來的部分170構成檢測腔的頂部170。小孔148從第六成形間隔層144中穿過延伸。小孔148的遠端150與狹縫132的遠端152對齊。小孔148構成孔口154的側壁部分150，使得檢測腔132中充滿試樣時能夠將空氣排出。頂層156設置在第五間隔層142和第六間隔層144上。頂層156中也帶有大小和形狀與第六成形間隔層144中小孔148類似並相互對準的小孔158。
在某些實施例中，最好將檢測腔132中充填試樣推遲到反應腔124中已裝入試樣後一段時間，使得反應腔124中能夠有時間進行免疫反應。在這些實施例中，這是通過在免疫反應完成之後在層116和/或156中形成通氣孔158來實現的。當反應腔124裝滿試樣時，空氣被封閉在檢測腔132中，這樣可以防止試樣進入檢測腔132中。在試樣已經裝入反應腔124之後的適當時間，可以用合適的器具如針狀物或刀片在通氣孔148上面或在通氣孔154下面刺穿頂層156和底層116中至少一個。當這麼做時，檢測腔132中的空氣可以通過小孔148或154從層116和/或156中形成的孔148或孔154中排出，因此能夠通過毛細管作用使試樣從反應腔124被吸入檢測腔132中，而取代的空氣則排出。
檢測腔132的高度一般選擇為小於反應腔124的高度，這樣在腔室132和124表面的表面能作用下，檢測腔132中的毛細管作用力將大於反應腔124中的毛細管作用力。檢測腔132中較強的毛細管作用力用來將試樣抽入檢測腔132中並清空反應腔124。這種利用毛細管作用力的差別來填充腔室的方法在2000年3月27日提交的共同未決申請No.09/536,234中作了詳細介紹。
在優選實施例中，反應腔的高度通常大於檢測腔的高度。檢測腔的高度通常為大約500微米或以下，最好為大約450、400、350、300、250微米或以下，在大約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50微米至大約75、100、125、150、175或200微米就更好。這些檢測腔高度尤其非常適合於檢測腔的頂壁和底壁包括電極層的情況。然而，在採用電化學檢測的某些實施例中，可以優先選用大於約500微米的腔室高度。這些檢測腔高度也適用當採用除電化學檢測以外的檢測方法時。當採用另一種檢測方法如光學檢測方法時，優先選用不同的腔室高度。在這種實施例中，可以優先選用的腔室高度為大約600、700、800或900微米或以上，乃至大約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5毫米或以上。反應腔的高度通常大於檢測腔的高度。然而，在某些實施例中最好使用與檢測腔具有相同或類似高度的反應腔，甚至使用高度比檢測腔小的反應腔。檢測腔高度通常是從大約5微米或以下至大約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5毫米或以上，更好是大約900、800、700、600、500微米或以下，大約450、400、350、300、250微米或以下就更好，而最好是從大約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50微米至大約75、100、125、150、175、200或250微米。
當免疫傳感器100是電化學傳感器100時，通過第四間隔層130中的狹縫132暴露出來的第二間隔層138的頂面和第六間隔層144的底面160可以局部或完全由導電材料覆蓋。或者，層114和144本身可以用導電材料製成。兩個導電層之間的電連接(未示出)和儀表(未示出)使得能夠在檢測腔中進行電化學測量。
製造方法為了便於說明，將參考圖3和4中所示的傳感器來詳細介紹優選實施例中傳感器的製造方法。傳感器條100通常是由層壓在一起的各層材料構成的。一個或多個間隔層128、130將層112和114與層142和144隔開。間隔層帶有粘合面使得層112、128和142以及層114、130和144能夠結合在一起。另一種方法是，間隔層本身可以由粘合劑構成，或是包括可通過層壓方法中的加熱和/或加壓而粘接到相鄰層上的材料。
檢測腔132是毛細管空間，其中層114和144構成該空間的端壁，且層128、130的厚度則形成了該空間的高度。層114和144還可以充當構成電化學電池電極的電極塗層(未示出)的基片，或者通過用導電材料製成而充當電極本身。在製造時，檢測腔132一般是通過衝壓或其它可將層130的一部分除去的方法形成。層130中除去的部分還可以用來形成電化學電池的電極區。
反應腔124可以用衝壓或其它可將間隔層的一部分除去的方法來形成，通過將這一區域除去可使反應腔與檢測腔132交迭，從而使檢測腔132連通反應腔124。然後可以將層116和156分別層壓到層112、114和層142、144的外表面上以形成反應腔124的端壁126、174。在將層116和156分別層壓到層112、114和層142、144上之前或之後，可以將免疫化學物質164和162塗敷到層116和/或156的內表面126和/或174上。通過位於層112、114和層142、144外表面上的粘合層，或者通過位於層116和156內表面上的粘合層，可以分別將層112、114和層142、144粘接到層116和156上。
通氣孔148和/或154最好通過衝壓穿過層114、130和144的孔來形成。為了簡化傳感器條的製造過程，最好在進行切去反應腔124和/或檢測腔132一部分的同時形成通氣孔148和/或154，因為這樣更容易實現腔室和通氣孔之間具有重複性的空間關係，而且還可以減少工序步驟。
在另一個實施例中，通氣孔148、154、158可以通過在層114、116、130、144和156上衝孔而形成，然後將另外的帶層(未示出)層壓在這樣形成的孔兩端。這樣做的優點在於，使得能夠分別對層116和156以及通氣孔覆蓋帶層(未示出)的性能進行優化。或者，在層壓層116或156之前，通氣孔148、154、158分別可以通過在層114、130、144和116或156上衝孔而形成。這樣使得只在傳感器條100的一個表面上有開口158，因而只需要使用一個覆蓋帶。
在另一個實施例中，可以先形成層116和156然後層壓到層114和144上，這樣層116和156不會延伸覆蓋通氣孔158的區域。只是需穿過層114、130和144以形成通氣孔148、154、158，然後將另外的帶層(未示出)層壓在這樣形成的孔兩端。
可以用任何適當的方法，如壓敏粘合劑、可固化粘合劑、熱熔性粘合劑，將各層相互粘接在一起。通過加熱和/或加壓、機械緊固件等類似的方法進行層壓。
所屬領域的技術人員應當認識到，上述用於免疫傳感器的結構形式只是許多種可能結構形式中的兩種。比如，通氣孔可以設在傳感器條的頂部、底部、同時在頂部和底部、或者設在傳感器條的一個或多個側面。通氣孔可以具有任何適當的結構形式，並且可以直接延伸到檢測腔的一部分，或者可以沿曲折路徑延伸到檢測腔中。檢測腔可以有任何適當的形狀，如矩形、方形、圓形或不規則形。檢測腔可以緊靠反應腔，或者可以在反應腔和檢測腔之間設置一個獨立的試樣通道。可以使試樣從傳感器條的每一側進入反應腔，如圖4和3中的傳感器，或者使試樣只從傳感器條的一側進入，而另一側用間隔層封閉，如圖1和2中的傳感器。檢測腔可以是任何適當的形狀，如矩形、方形、圓形或不規則形。檢測腔可以被包容在傳感器條的主體中，而到達檢測腔的通路可以由設在傳感器條頂部、底部或側面的一個或多個試樣入口來提供。一般來說，應選擇一種具體的結構形式使製造方法得到簡化，比如可以通過進行較少的工序或使用較少的部件。
電化學檢測當所述傳感器是電化學電池時，電極層，如圖1和2中傳感器的層52和54，中設有電接頭，使得傳感器20能夠被安置在測量電路中。電池28的電極52或54中至少一個是傳感電極，即至少有一個電極對試樣中被分析物的氧化或還原形式的數量敏感。在傳感電極52或54的電位表示被分析物水平的電位測量傳感器20的情況下，還設有有充當參考電極的第二電極54或52來提供參考電位。在傳感電極電流表示試樣中被分析物水平的電流測量傳感器20的情況下，至少還設置另一個電極54或52起到平衡電極的作用以形成電路。該第二電極54或52還可以起到參考電極的作用。或者，設置獨立的電極(未示出)來執行參考電極的功能。
如果免疫傳感器20是作為電化學電池28來工作的，那麼帶有構成反應腔22和/或檢測腔28的小孔的薄片36是用電阻材料製成。在優選實施例中，薄片32和34也是由電阻材料構成。適當的電阻材料包括如聚酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚烯烴及其混合物等材料。優先選用的聚酯是聚對苯二甲酸乙二醇酯。在圖1和2所示的傳感器中，層32和34是覆蓋著導電材料52和54的基片。導電材料52或54覆蓋在面對檢測腔28的表面60或62上，而粘合劑層(未示出)覆蓋在面對層42或46的表面33或35上。
在圖3和4所示的實施例中，檢測腔132在層138和170的內表面上帶有導電塗層(未示出)，該導電塗層適合於用作電化學傳感器電池中的電極。檢測腔132中還包括由探針酶作用物組成的幹試劑層172，如果必要的話還可以包括一種能使酶在其氧化和還原形式之間循環的氧化還原物質，這種氧化還原物質能夠在電池電極上被氧化或還原。還可以有緩衝劑以控制檢測腔132中的pH值。當使用免疫傳感器時，電極通過外部連接件(未示出)，如本技術領域中所共知的舌片狀插頭，連接到外部儀表裝置(未示出)上。在1999年9月20日提交的共同未決申請No.09/399,512和2002年1月4日提交的共同未決申請No.60/345,743中公開了適當的連接件。
如果免疫傳感器20、100是用除電化學檢測方法外的檢測方法來工作的，那麼構成傳感器的材料不必是電阻性的。然而，上述聚合物材料在製作優選實施例中的免疫傳感器時應被優先選用，因為其易加工、成本低、且與試劑和試樣沒有反應。
光學檢測在另一個可供選擇的實施例中，使用的是光學檢測系統而不是電化學檢測系統。根據這一可供選擇的實施例，不需要有電極，而是使用外部光源和光電管來分析檢測腔中溶液透射或反射的光線。在一個實施例中，最好使光線從傳感器的頂面射入然後穿過試樣，光線在傳感器底層反射回來並穿過試樣和頂層，並在頂層處檢測。在另一個實施例中，光線通過檢測腔的側面進來並在檢測腔的端面之間完全內部反射直至光線通過檢測腔的另一個側面離去，並在那裡進行檢測。在這些實施例中，檢測腔上面的、側面的和/或下面的層對於這些層的分析光線來說基本上都是可穿透的。在1999年9月23日提交的共同未決的申請No.09/404,119中介紹的技術可以用於採用光學檢測系統的免疫傳感器優選實施例。或者，在某些實施例中最好採用電化學檢測與光學檢測的組合方法，這也在申請No.09/404,119中作了介紹。
免疫傳感器中的試劑和其它材料在反應腔中使用的試劑如固定抗體、假抗原-探針、緩衝劑、介質等類似的物質可以支持在反應腔壁或檢測腔壁上、支持在腔室中的獨立支持上、保持在基體中、或者可以是自支持的。當試劑支持在腔壁或電極上時，可以利用所屬技術領域中眾所周知的印刷技術如噴墨印刷、絲網印刷、空隙塗復、平版印刷等類似的方法來塗復化學物質。在一優選實施例中，將含有試劑的溶液塗復到腔室內表面上並進行乾燥。
除了使試劑或其它化學物質在反應腔或檢測腔的表面上固定或乾燥之外，更好的方法是使試劑支持在一個或多個獨立支持上或者包括在一個或多個獨立支持中，然後將支持放入腔室中。適當的獨立支持包括但並不限於，網狀材料、無紡薄片材料、纖維充填材料、大孔隙薄膜、粉末燒結、膠凝體、或珠粒。獨立支持的優點包括可提高表面面積，因此如果需要的話可以使更多的抗體和假抗原-探針包括在反應腔中。在這樣的一個實施例中，與假抗原-探針結合的抗體在多孔材料上乾燥，然後放入反應腔中。而且在製造過程中，將未結合的蛋白質從獨立支持上洗去也比從反應腔表面上洗去更加容易。
在更為優選的實施例中，與假抗原-探針結合的抗體支持在珠粒上。這種珠粒可以由聚合物材料如乳膠或瓊脂糖構成，還可以選擇包住磁性材料(如γ相三氧化二鐵和四氧化三鐵)。可挑選珠粒材料以提供對抗體的適當支持。適用的珠粒可以包括市場銷售的如挪威奧斯陸Dynal Biotech公司所生產DYNABEADS牌。作為選擇，在儀表中可以包括磁鐵以使磁性珠粒保持在反應腔中並阻止其移動到檢測腔。
在還有一個實施例中，反應腔壁是多孔的，與這些孔隙結合的假抗原-探針與抗體固定。在此實施例中，液體試樣通過毛細作用能被吸入多孔壁中，但不會滲到限定區域的外面。這是通過使用大孔隙薄膜來形成反應腔壁並將薄膜壓緊到反應腔周圍以防止試樣從所要求的區域滲出來，如授予Hodges等人的美國專利No.5,980,709中所介紹的。
適用的獨立支持如珠粒、網狀材料、無紡薄片材料和纖維填充材料使用了聚烯烴、聚酯、尼龍、纖維素、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚碸及其混合物等類似的材料。適用的大孔隙薄膜可以用聚合物材料來製造，這些聚合物材料包括聚碸、聚乙二烯二氟化物、尼龍、纖維素醋酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、及其混合物等材料。
與假抗原-探針結合的抗體可以包括在如聚醋酸乙烯酯基體中。通過改變試樣中基體的溶解度特性，可以實現將蛋白質或抗體可控制地釋放到試樣中。
如圖2所示，乾燥的試劑64可以選擇性地布置在檢測腔28中。這些試劑可以包括酶作用物(用作探針)和介質，它們可與假抗原-酶探針50中的酶部分起反應以產生可檢測信號。酶作用物和介質如果存在的話，應該有足夠的數量，使得任何與酶作用物64放在一起的酶的反應速度是由酶的數量來決定的。舉例來說，如果酶是葡糖氧化酶或葡糖脫氫酶，就應將適當的酶介質64和葡萄糖(如果在試樣中不存在)放置到檢測腔28中。
在使用電化學檢測系統的實施例中，鐵氰化物是一種適當的介質。其它適當的介質包括二氯酚靛酚和過渡金屬與含氮雜原子組分的絡合物。如果必要的話，還可以含有緩衝劑以調整檢測腔28中試樣的pH值。葡萄糖、介質和緩衝試劑64應該有足夠的數量，使得酶與酶作用物64的反應速度是由酶的濃度來決定的。
構成反應腔22底部的基片42內表面40上塗有與抗體44結合的假抗原-探針50，其中抗體44可與試樣中要檢測的抗原起反應。抗體44吸附在或者用其它方法固定在基片42的表面40上，使得抗體44在試驗過程中不會從基片42上移動。作為選擇，在將抗體44塗敷到基片42內表面40上的時候或在此之後，可塗敷用來防止蛋白質與該表面非特定結合的試劑(未示出)。本技術領域中眾所周知的這種試劑是牛血清白蛋白(BSA)。非離子表面活性劑也可以用作這種試劑，比如由賓夕法尼亞州費城的Rohm和Haas公司製造的TRITONX100表面活性劑，或者由德拉瓦州威爾明頓市的卜內門化學工業美洲(ICI Americas)公司製造的TWEEN表面活性劑。所選擇的非離子表面活性劑應該不會使蛋白質變性。當準備好用於試驗中時，基片42內表面40上的塗層44處於乾燥狀態。
在使用電化學檢測的優選實施例中，酶可以被用作探針。適當的酶實例包括但並不限於，辣根過氧化酶、葡糖氧化酶和葡糖脫氫酶如PQQ非獨立葡糖脫氫酶或NAD非獨立葡糖脫氫酶。
探針還可以是一種酶輔因子。適當的酶輔因子包括但並不限於，黃素單核甙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、煙醯胺腺嘌呤二核苷酸和吡咯並喹啉苯醌。酶輔因子最好通過撓性間隔層與抗原聯接，使得酶輔因子能夠與主酶結合。當探針是一種酶輔因子時，主酶可以選擇性地與反應腔中的酶作用物及介質一起乾燥。
探針還可以是一種酶活性的調節劑。適當的酶調節劑包括，但並不限於，激酶或磷酸化酶。通過改變酶的磷酸化、甲基化、腺苷酸化、尿苷酸化或二磷酸腺苷核糖基化狀態，酶調節劑可以改變酶的活性。酶調節劑還可以通過將縮氨酸從酶中分解出來改變酶的活性。當探針是一種酶調節劑時，酶可以與反應腔中的酶作用物及介質一起乾燥。
探針可以是屬於多亞基複合體的一種蛋白質亞基。這種蛋白質亞基的一個實例是多亞基酶細胞色素氧化酶中的一種亞基。
抗體和假抗原-探針在反應腔中被乾燥之前可以複合在一起。應選擇複合條件使自由(未複合的)假抗原-探針的數量減到最小，因為這種物質會增大測定時的本底信號。還應當使自由抗體的數量減到最小，因為這種物質會固定抗原並阻止抗原取代假抗原-探針，從而降低測定靈敏度。例如，通過用惰性高分子如聚乙二醇「佔據」溶液可以優化假抗原-探針與抗體的複合作用，因為這樣能排除蛋白質周圍的體積，從而提高蛋白質的熱力學活性並增強它們相互結合的親合力。參見Minton的《生物高聚物》第20卷，1981年，2093至2120頁。
抗體在與假抗原-探針複合之前最好固定到珠粒上。這樣可以通過暴露於高濃度假抗原-探針使所有抗體位置都被佔據。於是通過離心作用和衝洗珠粒很容易將過量的假抗原-探針除去。
免疫傳感器對大約1nM(納摩爾)至大約10μm(微摩爾)的抗原濃度最敏感。對於相對摩爾量為100,000的抗原來說，該濃度對應於大約0.1μg/mL(微克/毫升)至大約1000μg/mL(微克/毫升)。不過，可以改進傳感器(比如通過改變電極之間的距離或通過施加不同形式的電壓脈衝)以測定濃度在0.1nM或以下至0.1mM或以上範圍內的抗原。
這種測定方法的檢測極限是由反應腔中假抗原-探針/抗體的濃度決定的。因此將這摩爾濃度設置到對應於所關心試樣中一般會遇到的抗原摩爾濃度的預期範圍內。例如，在一般的病理實驗室中所遇到的丙種反應蛋白的濃度是從大約10nM(納摩爾)至大約10μm(微摩爾)。
可以測定的抗原實例包括，但並不限於，甲胎蛋白、癌胚抗原、丙種反應蛋白、心肌鈣蛋白I、心肌鈣蛋白T、地高辛、鐵蛋白、γ-穀氨醯轉移酶、Glycated血色素、glycated蛋白質、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、絨毛膜促性腺激素、人類免疫缺陷性病毒、胰島素、血清澱粉狀蛋白A、thromblastin、前列腺特殊抗原、凝血素、甲狀腺素、腫瘤抗原CA125、腫瘤抗原CA15-3、腫瘤抗原CA27/29、腫瘤抗原CA19-9和腫瘤抗原NMP22。
優選實施例中的傳感器並不限於測定人體抗原，而是還可以應用於獸醫行業和畜牧業中。而且，如果抗原太小而不能產生免疫性，那麼可以將其附加到作為半抗原的載體上，而抗體也可以用這種方法提升到抗原處。因此本發明並不限於蛋白質抗原或大分子的測定，而是同樣也可應用於小的抗原。
適用於優選實施例中傳感器的抗體包括，但並不限於，天然抗體如免疫球蛋白G、免疫球蛋白M和免疫球蛋白A。適當的抗體還可以由天然抗體的片段如F(ab)2或Fab構成。抗體可以由天然抗體的遺傳工程片段或人造片段如scFv(單鏈可變片段)物質製成。
抗體可以與天然抗原探針或「假抗原」探針複合。假抗原的實例包括來自其它物種的抗原。例如，如果要測定人的丙種反應蛋白，那麼假抗原可以包括狗、貓、馬、牛、羊、豬或鳥的丙種反應蛋白。假抗原還可以通過對天然抗原的修飾來製造。例如，如果要測定人的丙種反應蛋白，那麼假抗原可以包括天然五聚物的單體形式或丙種反應蛋白，其胺基、羧基、羥基、硫醇基或二硫基已作了化學修飾。
用傳感器來確定抗原是否存在可以按以下方法用傳感器來確定抗原是否存在。參見圖3和4，傳感器條100中包括反應腔124和檢測腔132。試樣通過入口166或168進入反應腔124中。層116和156之間的間距以及其內表面的表面能使得試樣可以通過毛細管作用吸入到反應腔124中。反應腔124中包括固定到反應腔124內表面126上抗體164。假抗原-探針複合物162與抗體164結合起來，使得基本上所有對抗原的抗體識別部位都被假抗原-探針162擋住。在本實施例中，探針是一種酶。
在圖4中示出抗體只是覆蓋在反應腔124的一個表面126上，但是抗體最好覆蓋在反應腔124中多於一個表面126上或是覆蓋在包括於反應腔124中的獨立支持(未示出)上。不過，為了便於製造，一般來說建議抗體164隻是覆蓋在反應腔124的一部分上或是覆蓋在單個支持材料上。當使用獨立支持來固定抗體164時，應使支持在試驗時不會進入檢測腔132中。這可以通過以下方法來實現，比如使支持粘附到反應腔124的至少一個表面126上，或是通過選擇支持的大小或形狀使得支持不能通過試樣通道134進入檢測腔132中，或是通過選擇具有足夠密度的支持使得當試樣被輸送到檢測腔132中時支持還保持在反應腔124的底面126上。
當試樣填充到反應腔124中時，與抗體164結合的假抗原-酶探針162接觸到試樣，使假抗原-探針的一小部分與抗體164分離而進入試樣中。然後要有足夠的時間使已結合和未結合假抗原-酶探針162之間達到動態平衡。如果在試樣中存在抗原，那麼比假抗原-酶探針162能更牢固地與抗體164結合的抗原將最終置換出假抗原-酶探針162。因此與固定抗體164結合的每個抗原都會將一個假抗原-酶探針162置換到溶液中。
反應在試樣進入反應腔124之後的預定時間結束。該預定時間是這樣設置的，使得有足夠的時間使試樣中基本上全部抗原都能取代假抗原-酶探針162而與抗體164結合。或者，該預定時間可以這樣設置，使得抗原中的已知部分能夠取代假抗原-探針162而與抗體164結合。
試樣進入反應腔124的時間可以由用戶通過壓下與傳感器100相連的儀表(未示出)上的按鈕來表示。這一動作用來起動定時裝置(未示出)。在目視檢測的情況下，不需要有儀表。在這種實施例中，用戶對反應周期手動定時。
在使用電化學檢測來檢測免疫反應結果的情況下，可以自動發出試樣已經進入反應腔124中的指示。如上面所介紹的那樣，當試樣充滿反應腔124時，檢測腔132在其通到反應腔124的開口140處一小部分將被試樣溼潤。如果使用電化學檢測，那麼在檢測腔132中至少有兩個電極(未示出)。如果這些電極(未示出)布置在檢測腔的近端134，那麼在試樣填充到反應腔124中的時候，每個電極(未示出)至少有一部分會與試樣接觸，試樣將接通電極(未示出)而產生可用來起動定時裝置的電信號。
在定時裝置起動後的預定時間，由用戶來確定或自動確定免疫反應階段已經完成。當試驗的免疫反應階段完成時，將與大氣連通的通氣孔158打開。例如，可以用儀表中由螺線管驅動的針狀物刺穿層156和/或層116，或者再刺穿層114和144，使檢測腔132的遠端152與大氣連通。可以如上述實例中那樣由儀表自動進行穿刺，或者在不使用儀表的目視檢測情況下可由用戶手動刺穿，例如，用戶將針狀物穿過層156、116、114和/或144至檢測腔中，從而形成通氣孔158。
通氣孔158與大氣的連通使得封閉在檢測腔132中的空氣能夠逸出，從而使檢測腔132能夠被來自反應腔124的已反應試樣填充。由於檢測腔132中的毛細管作用力與反應腔124中的毛細管作用力相比增大，所以已反應的試樣會被吸入檢測腔132中。在一優選實施例中，增大的毛細管作用力是通過適當地塗覆檢測腔132的表面138和160來提供的，更好的是通過選擇檢測腔132的毛細管距離使其小於反應腔124的毛細管距離來實現。在此實施例中，毛細管距離確定為等於腔室的最小尺寸。
當檢測腔132充滿時，試劑172溶解到試樣中。試劑層172中酶組分與酶作用物及介質起反應而產生還原介質。該還原介質在檢測腔134中被充當陽極的電極(未示出)用電化學方法氧化而產生電流。在一個實施例中，電流隨時間的變化率被用作已反應試樣中有酶存在及酶數量的指示。如果電流的變化率小於預定閾值(考慮到有一些假抗原-酶探針162由於自由和結合假抗原-酶探針162之間建立的動態平衡而釋放到溶液中)，那麼這就表示已反應試樣中沒有大量的假抗原-酶探針162，也就表示原始試樣中沒有抗原。如果電流的變化速率大於閾值速率，那就表示已反應試樣中存在的假抗原-酶探針162數量大於閾值，因此最初在試樣中也有抗原存在。在一個實施例中，電流的變化速率被用來測量試樣中最初存在的抗原數量。
上述說明公開了本發明的幾種方法和材料。很容易在這些方法和材料方面對本發明作出修改，而且還可以改變本發明的製造方法和設備。通過研究在此公開的本發明說明或實施例，這些修改對於本領域的專業人員來說將變得更加明顯。因此，本發明並不限於在此公開的具體實施例，而是包括在本發明的真正範圍和精神之內的所有修改和變化，本發明的範圍和精神在所附權利要求中加以概括。在此引用的所有專利、申請書和其它參考文獻都是以其整體內容作為參考根據。
權利要求
1.一種用來測定液體試樣中目標抗原數量的方法，所述方法包括以下步驟將液體試樣放置到含有固定抗體和報導複合物的反應腔中，所述報導複合物包含與報導複合抗原聯接的探針，其中，所述抗體固定在所述反應腔中，所述報導複合抗原與所述固定抗體結合，且所述報導複合抗原與所述固定抗體的結合不如所述目標抗原與所述固定抗體的結合牢固；將所述報導複合抗原的一部分從所述固定抗體上分離到所述液體試樣中；使所述目標抗原的一部分與所述固定抗體結合；將所述液體試樣輸送到檢測腔中，有電極定位檢測腔內；和以電化反應來確定所述液體試樣中的報導複合物數量，其中，所述報導複合物的數量表示最初在所述液體試樣中的目標抗原數量。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述將液體試樣輸送到檢測腔中的步驟包括將所述液體試樣輸送到電化學電池，所述電化學電池包含第一電極和第二電極。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述確定液體試樣中報導複合物數量的步驟還包括在所述第一電極和所述第二電極之間施加電壓；和測量電流，其中，所述電流表示在所述液體試樣中存在的報導複合物數量，所述報導複合物的數量表示最初在所述液體試樣中的目標抗原數量。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述將液體試樣輸送到檢測腔中的步驟包括將所述液體試樣輸送到帶有電磁輻射透射部分的檢測腔中。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述確定液體試樣中報導複合物數量的步驟還包括將所述電磁輻射透射部分暴露於電磁輻射線中，所述電磁輻射線穿過所述液體試樣或從所述液體試樣上反射；和在所述電磁輻射線穿過所述液體試樣或從所述液體試樣上反射後監測所述電磁輻射線的特性，其中，所述特性表示在所述液體試樣中存在的報導複合物數量，且所述報導複合物的數量表示最初在所述液體試樣中的目標抗原的數量。
全文摘要
本發明公開了一種便宜的可作定量分析的一次性的免疫傳感器，不需要洗滌步驟，因此不會產生廢液。而且，在這種傳感器的優選實施例中，用戶無需進行定時操作，且這種傳感器可以很容易地應用於廣泛的動力學範圍內的抗原－抗體相互作用。
文檔編號C12Q1/68GK1975424SQ20061016289
公開日2007年6月6日 申請日期2003年3月21日 優先權日2002年3月21日
發明者A·霍奇斯, R·查特利爾 申請人:生命掃描有限公司