肌萎縮性側索硬化的治療方法

2023-05-29 15:31:41

專利名稱：肌萎縮性側索硬化的治療方法
技術領域：
本發明涉及一種治療運動神經疾病特別是肌萎縮性側索硬化的新方法。還涉及能長時間表達治療因子並可用於治療ALS的載體和藥物組合物。更準確地講，本發明涉及系統性給予治療基因治療ALS的方法。
肌萎縮性側索硬化(ALS)，也稱為Charcot病和Lou Gehrig病，由Charcot在1865年第一次報導。ALS是一種由運動神經元和皮層背髓束的退化造成的致死性疾病。ALS現今的新增病例發生率為2.5/100000並在持續增長，新舊病例總發生率為6-10/100000，在發達國家在大部分仍年輕的成人(50-60歲之間)中有90000人患ALS。該病伴有進展性麻痺，導致運動和呼吸功能的完全喪失，然後導致死亡，這在症狀第一次出現後的2-8年期間(平均3年)發生。
5％的ALS病例是家族源性的，而95％的病例是偶發的。偶髮型ALS的病理生理學起因仍然未知，但提出過多種假設。神經元退化可能造成穀氨酸代謝的改變，導致運動皮層和脊髓中這種興奮性胺基酸的濃度增加(「興奮毒性」假說，見Rothstein,1995中的綜述)。基於在某些病人中存在抗電壓敏感性鈣通道的自身抗體，還提出了自身免疫的可能性(見Appel等，1995中的綜述)。環境因素的參與也是可能的，如某些病毒的感染(見Gastant,1995的綜述)或與鋁的接觸(Yase,1984)。
對遺傳性ALS的研究已顯示銅和鋅超氧化物歧化酶基因(位於染色體21q 22-1上)中的一些點突變對20％家族性ALS的病因負責(Rosen等，1993，綜述見Rowland,1995)。這些突變並不引起超氧化物歧化酶(SOD)活性的減弱(綜述見Rowland,1995)。這些突變的酶產生潛在細胞毒性的羥基自由基，而野生型SOD並不產生這種自由基(Yim等，1996)。對於突變對SOD酶活性和細胞存活的功能效應的深入研究可能最終使人理解家族型ALS的病生學，進而明了各種形式ALS的病生學。
對於可能影響運動神經元存活的因子的研究顯示許多神經營養因子有潛在神經保護作用(Windebank,1995的綜述；Henderson,1995)。例如，已在體外觀察到BDNF(Oppenheim等，1992,Yan等，1992,Sendtner等，1992,Henderson等，1993,Vejsada等，1995)、NT-3(Henderson等，1993)、GDNF(Henderson等，1994,Oppenheim等，1995)、三種細胞因子CNTF、LIF(Henderson,1995的綜述)和心臟營養素-1(cardiotrophine-1,Pennica等，1996)、及IGF-1(Lewis等，1993)和FGF家族的成員(Hughes等，1993)的運動神經元保護作用。這些資料總體上提示，所述神經營養因子在不同的實驗條件下增強運動神經元的存活力。但神經營養因子在ALS動物模型中的應用或在人的臨床應用中迄今還沒有給出有說服力的結果。這種應用從未顯示過治療效果，而且總伴隨著不希望的付作用，如體重減少、炎症、發熱等，這都限制了營養因子在ALS治療中的意義，並導致了由Regeneron進行的第一批ALS-CNTF臨床試驗(系統給藥)半途中止(Barinaga等，1994)。因而迄今仍不能證實神經營養因子對ALS治療的意義，也不能探索其作為一種可能治療途經的特點。
鑑於此，現今還不存在任何治癒ALS的方法，具有療效的藥物也很少。Rilutek是現有的唯一治療途徑。給予riluzole(Rilutek)能延緩疾病的述展，但它沒有顯示出對運動功能的治療效果。另外，給予CNTF的臨床試驗也由於沒有結果而半途中止(Barinaga等，1994)。因而現今確實而且迫切地需要一種治療運動神經元疾病特別是ALS的方法。
本發明的目的特別在於提供一種治療運動神經元疾病如ALS的基於基因治療的新途徑。更具體地講，本發明描述了通過有效持久表達某些營養因子能直接改善這種疾病中涉及的運動神經元存活力的載體系統。
本發明第一方面涉及一種ALS的治療方法，包括系統性給予編碼神經營養因子的核酸。本發明的另一方面涉及編碼神經營養因子的核酸在製備用於治療ALS的藥物組合物中的應用。本發明的另一方面在於特別載體的構建，該載體能表達對ALS治療有效量的營養因子。本發明的另一方面涉及能產生一種或多種營養因子的表達系統在治療中的施用，以及含有這些表達系統的藥物組合物。本發明還涉及能在體內共同表達幾種營養因子的幾種新載體的構建。
因而本發明更準確地講涉及一種基於營養因子的體內持續表達的ALS的新治療方法。
本發明現證明通過神經營養因子的體內產生可能獲得特別顯著的體內療效。本申請人特別證實體內系統性注射神經營養因子表達系統，能夠獲得治療因子的持續產生，並且治療劑的產生足以在神經元疾病特別是ALS中取得療效。例如，申請人證實施用這些表達系統可導致存活期的非常顯著的提高，伴隨著運動肌回應的改善，後者如可用肌電描記術測得。所述的這些結果證明這種給藥途徑能獲得神經營養因子的適當生物利用度，而無毒性作用。因而這種治療途徑能夠產生治療活性量的分子，而保持在這些分子的毒性閾之下。因而，神經營養因子類蛋白系統給藥時由於存在血腦屏障只能低效穿至神經系統中，而本發明的方法卻意外地能獲得顯著療效。另外，本發明的方法還能使用低於毒性閾值的治療因子劑量，不會引起付作用。
本發明的目的之一是一種ALS的治療方法，包括系統性給予一種神經營養因子的表達系統。本發明的另一目的是一種神經營養因子的表達系統在製備用於系統性給藥治療ALS的藥物組合物中的應用。本發明還涉及一種延長患ALS之哺乳動物壽命的方法，包括系統性給予一種神經營養因子的表達系統。
在本發明中，術語「表達系統」指能在體內表達編碼神經營養因子之核酸的任何構建物。該表達系統最好包括處於一種轉錄啟動子控制下的編碼神經營養因子的核酸(表達盒)。這種核酸可以是DNA或RNA。對於DNA，可以使用cDNA、gDNA或雜合DNA，即含有gDNA一個或多個(但不是全部)內含子的DNA。DNA還可以是合成的或半合成的，特別是用於優化密碼子或構建截短形式核酸的人工合成DNA。
轉錄啟動子可以是在一種哺乳動物細胞(優選人細胞)中有功能的任何啟動子。當在相關細胞或機體中可能有功能時，可以是負責所用神經營養因子表達的天然啟動子區。也可以是不同來源的啟動子區(負責其他蛋白的表達，或甚至是合成的)。特別是真核基因或病毒基因的啟動子區。例如，可以用來自靶細胞基因組的啟動子區。在真核啟動子中可以使用刺激或抑制基因轉錄的任何啟動子或衍生序列，這種刺激或抑制可以是特異性或非特異性的，可誘導或不可誘導的，強的或弱的。特別可以使用遍在性啟動子(HPRT、PGK、α-肌動蛋白、微管蛋白等基因的啟動子)，中間絲蛋白的啟動子(GFAP、結蛋白、波形蛋白、神經絲、角蛋白等基因的啟動子)，治療基因的啟動子(如MDR、CFTR、Ⅷ因子、ApoA I等基因的啟動子)，組織特異性啟動子(丙酮酸激酶、絨毛蛋白、脂肪酸結合腸蛋白、平滑肌α-肌動蛋白等基因的啟動子)或對刺激物應答的啟動子(類固醇激素受體、視黃酸受體等)。同樣，可以使用來自病毒基因組的啟動子序列，例如腺病毒E1A和MLP基因的啟動子，CMV早期啟動子，或RSV的LTR啟動子等。另外，這些啟動子區可被修飾，如加入活化序列、調節序列或使得能組織特異性(或主要)表達的序列。
在本發明中最好使用真核或病毒的組成型啟動子，特別是選自如下的啟動子HPRT、PGK、α-肌動蛋白、微管蛋白基因的啟動子，或腺病毒E1A和MLP基因的啟動子，CMV的早期啟動子，或RSV的LTR啟動子。
另外，表達盒中最好帶有指導合成產物至靶細胞分泌途徑中的信號序列。這種信號序列可以是合成產物的天然信號序列，但也可以是任何其他功能性信號序列，或是一種人工信號序列。
最後，表達盒一般含有位於3′端的一個區，它編碼轉錄終止信號和多聚腺苷酸化位點。
可用於本發明的營養因子基本分為三個家族神經營養因子家族、神經因子家族和TGFβ家族(綜述見Henderson Adv.Neurol.68(1995)235)。
在神經營養因子家族中本發明更優選使用BDNF、NT-3或NT-4/5。
由Thoenen(神經科學趨勢(Trends in Neurosci),14 (1991)165)報導的大腦衍生的神經營養因子(BDNF)是一種118個胺基酸的蛋白，分子量為13.5kD。在體外，BDNF刺激軸突的形成和視網膜節神經元、中隔膽鹼能神經元及中腦多巴胺神經元的培養存活期(綜述見Lindsay在《神經營養因子》(Neurotrophic Factors),(1993)257,Academic Press中的文章)。編碼人BDNF和大鼠BDNF的DNA序列(Maisonpierre等，基因組(Genomics)10(1991)558)、特別是編碼豬BDNF的序列(Leibrock等，自然(Nature)341(1989)149)已被克隆和測序。儘管這些營養因子的特性可能令人感興趣，但BDNF的治療應用遇到了許多障礙。特別是BDNF缺乏生物可利用性，限制了其任何治療應用。本發明中產生的大腦衍生神經營養因子(BDNF)可以是人BDNF或動物BDNF。
神經營養因子3(NT3)是一種119個胺基酸的分泌蛋白，其在體外甚至在很低濃度下也能改善神經元的生存(Henderson等，自然363,266-270(1993))。已報導了編碼人NT3的cDNA的序列(Holn等，自然344(1990)339)。
TGF-β家族特別包括神經膠質細胞衍生的神經營養因子。神經膠質細胞衍生的神經營養因子GDNF(L.-F.Lin等，科學(Science),260,1130-1132(1993))是一種134個胺基酸的蛋白質，分子量為16kD。它具有體外促進多巴胺能神經元和運動神經元存活的重要特性(綜述見Henderson,1995)。本發明中產生的GDNF可以是人GDNF或動物GDNF。編碼人GDNF和大鼠GDNF的cDNA序列已被克隆並測序(C.-F.Lin,D.Doherty,J.Lile,S.Besktesh,F.Collins，科學，260,1130-1132(1993))。
可用於本發明的另一神經營養因子是CNTF(「CiliaryNeuroTrophic Factor」睫狀神經營養因子)。CNTF是一種可能阻止神經元死亡的神經因子。如前文所提到的，臨床試驗由於沒有結果而半途中止。本發明現能單獨或與其他營養因子一起在體內持久連續地產生CNTF，用於治療ALS。人和鼠CNTF的cDNA和基因已被克隆和測序(EP385060；WO91/04316)。
可用於本發明的其他神經營養因子例如有IGF-1(Lewis等，1993)和成纖細胞生長因子(FGFa,FGFb)。特別是IGF-1和FGFa，它們是特別有意義的侯選物。FGFa基因的序列以及其體內表達載體在文獻中已有報導(WO95/25803)。
編碼BDNF、GDNF、CNTF及NT3的基因對實施本發明特別有意義。
根據第一種實施方案，本發明的表達系統在體內只產生一種神經營養因子。這時，該表達系統只含有一種表達盒。優選本發明的表達系統可在體內產生一種選自神經營養因子、神經因子和TGF的神經營養因子。更優選為選自BDNF、GDNF、CNTF、NT3、FGFa和IGF-I的一種因子。
根據本發明的另一實施方案，本發明的表達系統能在體內產生兩種神經營養因子。在此實施方案中，該表達系統要麼含有兩種表達盒，要麼含有能同時表達兩種核酸的一種表達盒(雙順反子單元)。對於含兩種表達盒的系統，兩種表達盒可以使用相同或不同的啟動子。
優選本發明的表達系統可在體內產生如下的神經營養因子組合BDNF+GDNF；BDNF+NT3；GDNF+NT3；CNTF+BDNF；CNTF+NT3；CNTF+GDNF。
有利的是，申請人已證明施用兩種神經營養因子的表達系統可產生強治療效果。在兩種神經營養因子的表達系統中，使用相同或相似效力的啟動子，相同或相似的核酸拷貝數。一般體內產生的兩種因子的量相當接近。但在某些情形下優選產生不同量的每種因子。此時可使用不同效力的啟動子、或對不同基因存在不同拷貝數的系統、或變化施用劑量。
在本發明的表達系統中，所述一種或多種表達盒最好是載體的一部分，特別是病毒載體或質粒載體。在含多個表達盒的表達系統中，這些表達盒載於分立的載體中或同一個載體中。
所用的載體可以是標準的質粒載體，除本發明的表達盒外，其含有複製起點和標誌基因。另外已報導了不同類型的改進載體，它們不含標誌基因和複製起點(PCT/FR96/00274)或含有例如條件性複製起點(FR9510825)。這些載體可有利地用於本發明中。
所用的載體還可以是一種病毒載體。已從病毒構建了許多載體，其具有轉移較大基因的特性。可特別舉出腺病毒、逆轉錄病毒、腺相關病毒(AAV)和皰疹病毒。為了用作轉移基因的載體，修飾這些病毒使其不能在靶細胞中自主複製。這些病毒被稱為複製缺陷型。一般用一個或多個表達盒取代病毒複製所必需的區域來修飾基因組。
本發明中優選使用衍生自腺病毒的病毒載體。腺病毒是一些約36kb(千鹼基)長的線性雙鏈DNA病毒。它們的基因組特別含有每一末端的反向重複序列(ITR)、衣殼化序列(Psi)、早期基因和晚期基因。主要早期基因含於E1、E2、E3和E4區中，其中含於E1區中的基因是病毒繁殖必需的。主要晚期基因含於L1至L5區中。腺病毒Ad5的基因組已被完全測序，並可從資料庫中得到(特別是Genebank M73260)。同樣，其他腺病毒基因組(Ad2、Ad7、Ad12等)的部分甚至全部也已被測序。
為了用作基因轉移載體，已通過引入不同的治療基因製備了衍生自腺病毒的不同構建物。更具體地講，現有技術中描述的構建物是缺失病毒複製必需的E1區並在其位置插入了外源DNA序列的腺病毒(Levrero等，基因(Gene)101(1991)195；Gosh-Choudhury等，基因50(1986)161)。另外，為了改善這種載體的特性，已有人提出在腺病毒基因組中製造其他的缺失或修飾。例如已在突變體ts125中引入了一種熱敏感性點突變，使72kDa的DNA結合蛋白(DBP)失活(Van der Vliet等，1975)。其他載體包括對病毒複製和/或增殖必需的另一區域E4區的缺失。實際上E4區參與晚期基因表達的調節、晚期核RNA的穩定性、宿主細胞蛋白表達的消除和病毒DNA複製的效率。因而缺失了E1和E4區的腺病毒載體中病毒基因轉錄和表達的背景噪音很低。這種載體已在例如專利申請WO94/28152、WO95/02697、WO96/22378中描述。另外還在WO96/10088中描述了在基因IVa2處有修飾的載體。
文獻中描述的重組腺病毒從不同血清型的腺病毒製得。實際上存在不同的腺病毒血清型，其結構和特性有所區別，但具有相似的基因結構。更具體地講，這些重組腺病毒可源自人或動物。對於人源的腺病毒，可優選舉出劃歸C組的那些，特別是2型(Ad2)、5型(Ad5)、7型(Ad7)或12型(Ad12)腺病毒。對於源自動物的不同腺病毒，可優選舉出源自狗的腺病毒，特別是腺病毒CAV2的任何毒株[例如manhattan株或A26/61(ATCCVR-800)]。源自動物的其他腺病毒特別在專利申請WO94/26914(引入本文作為參考)中述及。
在本發明的另一優選實施方案中，重組腺病毒是C組的人腺病毒，更優選腺病毒Ad2或Ad5。
這些重組腺病毒是在衣殼化細胞系中產生的，即反式補充重組腺病毒基因組中一種或多種缺陷功能的細胞系。這些細胞系之一例如為293細胞系，其中已整合了腺病毒基因組的一部分。更準確地講，293細胞系是一種人胚腎細胞系，含有血清型5腺病毒(Ad5)基因組的左端(約11-12％)，包括左側ITR、衣殼化區、E1區(包括Ela和Elb)、編碼蛋白pIX的區域和編碼蛋白pIVa2的區域。該細胞系能夠反式補充E1區缺陷的重組腺病毒(即不含E1區全部或部分)，能夠產生高滴度的病毒原液。該細胞系還能夠在一定溫度(32℃)下產生另外含有熱敏感性E2突變的病毒原液。已報導了能夠補充E1區的其他細胞系，特別是基於人肺癌細胞A549(WO94/28152)或人成視網膜細胞(人類基因治療(Hum.Gen.Ther.)(1996)215)的細胞系。另外，還報導了能反式補充腺病毒多種功能的細胞系。特別可舉出補充E1和E4區的細胞系(Yeh等，病毒學雜誌(J.Virol.)70(1996)559；癌症基因治療(Cancer Gen.Ther.)2(1995)322；Krougliak等，人類基因治療，6(1995)1575)和補充E1和E2區的細胞系(WO94/28152,WO95/02697,WO95/27071)。一般通過在衣殼化細胞系中引入病毒DNA，然後在約2或3天後裂解細胞(腺病毒循環的動力學為24-36小時)。裂解細胞後，在氯化銫梯度中離心分離重組腺病毒顆粒。其他替代方法已在專利申請RF9608164(引入本文作為參考)中描述。
治療基因的表達盒可按現有技術中描述的技術插入在重組腺病毒基因組的不同位點。首先可插入在E1缺失部位。還可以插入在E3區部位，序列插入或替代均可。表達盒還可以位於缺失的E4區部位。為了構建帶兩種表達盒的載體，可將一種插入在E1區部位，另一種插入在E3或E4區部位。兩種表達盒也可以插入在同一區域。
如同前文提到的，對於帶多個表達盒的表達系統，這些表達盒可載於分立的多個載體中，或載於同一個載體中。本發明更具體地涉及對治療活性量GDNF、BDNF、NT3和CNTF的體內投送特別有效或可定位投送的載體的製備。更準確地講，本發明涉及系統性注射含兩種基因轉移載體的表達系統，每種載體含有編碼一種神經營養因子的基因。本發明還涉及系統性注射能使兩種基因共表達的含雙順反子載體的表達系統。優選地，本發明涉及系統性注射含兩種載體的表達系統，一種帶有編碼CNTF的基因，另一種帶有編碼NT3的基因，或一種帶有編碼CNTF的基因，另一種帶有編碼BDNF的基因，或一種帶有編碼GDNF的基因，另一種帶有編碼NT3的基因。
更優選所用的基因轉移載體是腺病毒載體。實際上，申請人在處理不同的ALS動物模型時證明了靜脈注射使用編碼神經營養因子的腺病毒的有效性。特別是，在實施例中給出的結果第一次在家族性ALS動物模型(FALSG93A小鼠)上顯示出壽命的顯著延長，並伴有肌電圖的改善。現今提出的對ALS患者的唯一治療是riluzole(Rilutek)，它能提高病人預期壽命達幾個月。還證明了給FALSG93A小鼠施用riluzole可提高其平均壽命13天(Gurney等，1996)。因而可以預言提高FALSG93A小鼠壽命大於13天的治療可能對病人帶來優於riluzole的療效。實施例中顯示的結果表明本發明的治療途徑可提高FALSG93A小鼠平均壽命達30天左右。這構成了對存活期的非常顯著的改善，代表著在ALS模型上顯示重要療效。
pmn小鼠是ALS的另一模型，其特徵是運動神經元較早較快的退化，和平均壽命約40天。實施例中給出的結果證明本發明的治療方法可將pmn小鼠的壽命從40天延長至53天，這構成大於30％的顯著改善。被治療pmn小鼠的壽命延長伴隨著運動神經元退化的顯著降弱。
這種新療法所得總體結果第一次在兩種不同的ALS模型上證明了臨床、肌電圖和組織學不同參數的重要改善。
根據本發明，營養因子的體內產生是通過系統給藥獲得的。在實施例中給出的結果證明這種給藥方法可通過患者自身的機體規律地、連續地產生營養因子，且這種產生足以造成顯著的療效。這種系統性給藥優選為靜脈內或動脈內注射，特別優選靜脈內注射。這種注射方法就耐受性和易接近性而言也是有利的。另外靜脈注射可以比肌肉注射注入更大的量，也可以重複注射。
本發明還涉及包含兩種神經因子的表達系統的任何藥物組合物。本發明的藥物組合物有利地含有注射製劑用的藥物可接受的載體。特別是無菌等滲鹽水溶液(磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等，或這些鹽的混合物)，或幹組合物特別是凍幹品，通過根據情況加入無菌水或生理血清可產生可注射溶液。也可以使用其他賦形劑，如穩定性蛋白質(特別是血清白蛋白RF9603074)或水凝膠。這種水凝膠可從任何生物相容的無毒聚合物(均聚或共聚)製得。一些這樣的聚合物已在例如專利申請WO93/08845中描述過。其中的一些已商業化，如從環氧乙烷和/或環氧丙烷獲得的那些。另外，當表達系統由質粒載體組成時，在本發明藥物組合物中最好加入有利於基因轉移的化學或生物化學試劑。對此，特別可提及如WO95/21931中所描述的聚賴氨酸、(LKLK)n、(LKKC)n型陽離子聚合物、聚乙烯亞胺(WO96/02655)和DEAE葡聚糖或陽離子脂類或脂轉染試劑。這些試劑具有凝聚DNA並促進其與細胞膜結合的特性。其中也以舉出脂聚胺(如WO95/18863或WO96/17823中所描述的lipofectamine,transfectam)、不同的陽離子或中性脂類(DOTMA、DOGS、DOPE等)，以及核源肽(WO96/25508)，它們可以是為了靶向某些組織而官能化的。使用這種化學載體的本發明組合物的製備按本領域技術人員已知的任何技術進行，一般是將各種成分簡單地接觸。
表達系統的給藥劑量取決於多種因素，特別是所用的載體、涉及的營養因子、所用的啟動子類型、病程或尋求治療的持續時間。一般而言，表達系統以含0.1-500mg DNA/kg，優選1-100mg DNA/kg的劑量給藥。一般使用約10mg DNA/kg的劑量。
對於重組腺病毒，最好將其配製並以104至1014pfu、優選106至1010pfu的劑量給藥。術語pfu(空斑形成單位)相應於腺病毒溶液的感染能力，通過適當的細胞培養物的感染來測定，並一般在15天後測定被感染細胞的空斑數目。對病毒溶液pfu滴度的測定技術在文獻中有充分的描述。
可通過不同的裝置進行注射，特別是注射器或通過灌注法。優選藉助於注射器注射。另外可進行重複注射以進一步提高療效。
根據本發明的一種變化方案，這種治療還可以與riluzole聯合應用。因而本發明涉及一種藥物組合物，其含有本發明的一種表達系統和藥理有效量的riluzole，以在時間上同時或分開給藥。
下文給出的結果只是說明本發明而不限制其範圍。這些結果證明本發明方法的特別有利的特性，據我們所知，這是第一次在動物模型上證明了對ALS的治療意義。


圖1給予或不給予CNTF-GDNF聯合表達系統的FALSG93A小鼠的肌電圖行為比較。
圖2給予或不給予NT3表達系統的FALSG93A小鼠的肌電圖行為比較。
圖3給予或不給予CNTF表達系統的pmn小鼠存活的比較。pmn小鼠的存活(天)用所分析動物的百分數表示。用CNTF表達系統給藥處理的pmn小鼠100％,n=7(粗線)；未處理的pmn小鼠100％,n=14(正常線)。
圖4給或不給予CNTF表達系統的pmn小鼠中運動神經元退化的比較。在25天齡時檢查小鼠膈神經中有髓神經纖維的數目。結果用CNTF表達系統處理的pmn小鼠(145,n=10)；無CNTF表達系統處理的pmn小鼠(122,n=8)；用AdlacZ處理的pmn小鼠(111,n=8)；「正常」Xt小鼠(263,n=4)。豎線代表平均標準誤(SEM)。
實施例1．材料和方法以下描述的全部實驗(腺病毒構建、給小鼠的注射、功能測定)都是在L3封閉實驗室中進行的。1-動物已建立了多種品系的表達SOD突變形式(致家族型ALS)的轉基因小鼠，試圖獲得ALS的鼠模型。超量表達93位甘氨酸被丙氨酸取代的突變人SOD的轉基因小鼠具有進行性運動神經元退化，表現為四肢麻痺，在4-6個月齡時死亡(Gurney等，1994)。最早的臨床症狀是大約90天時四肢顫抖，隨後在125天時步長減小(Chiu等，1995)。組織學方面，從大約37天可以在運動神經元中觀察到來自線粒體的液泡，從90天開始可能觀察到運動神經元的丟失(Chiu等，1995)。有髓神經軸突的感染主要在腹面骨髓中，在背面區很少。在運動板處觀察到代償性側突重支配象現(Chiu等，1995)。對實施例2-10，我們選擇使用FALSG93A小鼠。FALSG93A小鼠是研究ALS病生機制及開發其治療策略的很好的動物模型。它與家族型ALS具有共同的病生來源(SOD突變)、大量的組織病理學和肌電圖特徵。
因而，我們在實驗室鑑定了FALSG93A小鼠的肌電圖行為並證明FALSG93A小鼠可滿足ALS的Lambert標準(Kennel等，1996)(1)運動單元數目減少，同時側突重支配；(2)在前肢和後肢中存在失支配的自發活動(纖維性顫動)和自發性收縮；(3)與運動回應降低有關的運動傳導速度的改變；(4)無感覺器官損害。另外我們已證明面部神經的損害很少見，甚至在年老的FALSG93A小鼠中也是如此，在病人中也是這樣。
FALSG93A小鼠來自Transgenic Alliance(L′Arbresle，法國)。妊娠雌鼠每周發放，並在室驗室動物中心產仔。患病雜合幼鼠通過取一段尾巴並提取DNA進行PCR來鑑定。
還有其他具有運動神經元退化的動物模型(Sillevis-Smilt De Jong,1989；Price等，1994)，這是由急性神經毒性損害造成的(用IDPN、興奮毒素處理)，或由於遺傳錯誤造成(Wobbler、pmn、Mnd小鼠、HCSMA狗)。在遺傳性動物模型中，pmn小鼠在臨床、組織學(Schmalbruch 1991)和肌電圖(Kennel,1996)方面已有特別好的表徵。pmn突變以隱性常染色體方式傳遞，並已定位在第13號染色體上。純合pmn小鼠在2-3周齡開始患肌肉萎縮和麻痺並表現在後肢上，然後擴展至全身。所有未處理的pmn小鼠都在6-7周齡前死亡。其神經元的退化開始於神經末稍並導致運動神經中有髓神經纖維的大量喪失，特別是保證橫隔神經支配的隔神經中(Schmalbruch 1991)。與FALSG93A小鼠不同，這種肌肉的失神經支配是很快的，基本不伴有由軸突旁側重新生長引起的重支配現象。在肌電圖方面，肌肉失神經支配過程的特徵是纖維性顫動的出現和超強電刺激神經後肌肉反應幅度的大大降低(Kennel等，1996)。
轉基因小鼠品系Xt/pmn也用作ALS的另一鼠模型。這些小鼠按如下獲得C57/B156或DBA2雌性小鼠與Xt pmn+/Xt+pmn雄性小鼠(129系)第一次雜交，然後是雜合的Xt pmn+/Xt+pmn+雌性子代(N1)與原雄性之間第二次交雜。在小鼠子代(N2)中，選擇了帶有等位基因Xt(由贅指表型顯示)和等位基因pmn(PCR測定)的雙雜合子Xt pmn+/Xt+pmn(稱為「Xt pmm」小鼠)用於進一步雜交。2．表達系統2.1．質粒載體可使用能表達一種或兩種神經營養因子的不同質粒載體。例如可舉出質粒pCRⅡ-BDNF和pSh-Ad-BDNF，它們含有一個表達和分泌BDNF的盒子(WO95/25804)。還可以提及在LTR啟動子控制下含有編碼GDNF的核酸的質粒p-LTR-IX-GDNF(WO95/26408)，以及質粒p-LTR-IX-preNGF/CNTF，其在βNGF信號序列之後含有CNTF基因的序列，還含有腺病毒基因組的反向重複序列(ITR)、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子的LTR序列、衣殼化序列及同源重組所必需的腺病毒序列。應理解，任何含有一個複製起點和標誌基因的質粒都可用於通過插入神經營養因子的一個或多個表達盒來構建本發明的表達系統。可在真核細胞或原核細胞宿主中製備這些質粒。2.2．腺病毒如前文所提及的，病毒載體、特別是腺病毒構成本發明一個特別優選的實施方案。
以下所用的重組腺病毒是按現有技術中描述的方法通過同源重組獲得的。簡言之，是在293細胞中通過如下重組構建的，線性化病毒基因組(dl324)和含有左側ITR、衣殼化序列、轉基因及其啟動子和重組所需病毒序列的質粒之間的重組。病毒在293細胞中擴增。在我們的P3實驗室中定期對其再純化。病毒基因組還可以在原核細胞中按WO96/25506中描述的技術製備。更具體地使用了下列病毒-Ad-CNTF:Ad5血清型重組腺病毒，在其基因組中被缺失的E1區處含有一個CNTF基因的表述盒，該表達盒由轉錄啟動子(特別是RSV的LTR)控制下的編碼CNTF的cDNA組成。在WO94/08026中給出了構建的詳情。其他構建物包括在E4區中的互補性缺失(如WO96/22378中所述)或在E3區中的互補性缺失。-Ad-GDNF:Ad5血清型重組腺病毒，在其基因組中被缺失的E1區處含有一個GDNF基因的表達盒，該表達盒由轉錄啟動子(特別是RSV的LTR)控制下的編碼GDNF的cDNA組成。在WO95/26408中給出了構建的詳情。另一構建物包括在E4區中的互補性缺失(如WO96/22378中所述)。-Ad-NT3:Ad5血清型重組腺病毒，在其基因組中被缺失的E1區處含有一個NT3基因的表達盒，該表達盒由轉錄啟動子(特別是RSV的LTR)控制下的編碼NT3的cDNA組成。另一構建物包括在E4區中的互補性缺失(如WO96/22378中所述)。-Ad-BDNF:Ad5血清型重組腺病毒，在其基因組中被缺失的E1區處含有一個BDNF基因的表達盒，該表達盒由轉錄啟動子(特別是RSV的LTR)控制下的編碼BDNF的cDNA組成。在WO95/25804中給出了構建的詳情。另一構建物包括在E4區中的互補性缺失(如WO96/22378中所述)。-Ad-FGFa:Ad5血清型重組腺病毒，在其基因組中被缺失的E1區處含有一個FGFa基因的表達盒，該表達盒由轉錄啟動子(特別是RSV的LTR)控制下的編碼FGFa的cDNA組成。在WO95/25803中給出了構建的詳情。另一構建物包括在E4區中的互補性缺失(如WO96/22378中所述)。
所構建病毒的功能性通過感染培養中的成纖維細胞來驗證。用ELISA和/或通過顯示上清液對神經元初級培養物的營養特性分析培養上清中相應的神經營養因子的存在。3．重組腺病毒的給藥編碼神經營養因子的腺病毒經靜脈途徑給予成年或新生的動物。對於成年FALSG93A小鼠，藉助於Hamilton型微注射器將109pfu的每種腺病毒注射至尾靜脈內。對於新生的pmn小鼠(2-3天齡)(由無贅指來鑑別)，藉助於裝有30G針的胰島素型微注射器將2×109pfu(終體積20μl)的病毒懸液注射至視網膜靜脈內。新生動物用乙醚輕度麻醉並處在低體溫狀態。4．其他技術肌電圖只要其身體狀況充許，腹膜內注射2μg/g和60μg/g體重的安定(Valium, Roche，法國)和鹽酸氯胺酮(Ketalar,Parke-Davis，法國)的混合物將動物麻醉。
所用的肌電描記儀是帶有獲取和處理肌電圖信號所需要的成套軟體的最新一代儀器(Keypoint)。該儀器是從Dantec公司(法國Les Ulis)租借的。
刺激-檢測的肌電圖運動刺激反應(REM)當在神經上施加電刺激時，由該神經支配的肌肉是電反應的所在地。這種反應發生在一段時間之後(遠程潛伏期)，即相當於刺激傳導至突觸的時間加上信號在突觸內的傳遞時間。這種反應的幅度與受神經支配的肌肉纖維的量成比例。
純粹出於實踐的原因，我們選擇刺激坐骨神經並在腿肚腓腸肌處接收運動刺激反應。將5隻針式電極按如下方式植入並與肌電圖描記儀連接(a)放置兩個刺激電極，一個(主電極)在坐骨神經通道上，另一個(參考電極)在尾根部；(b)植入兩個檢測電極，一個在腓腸肌中(主電極)，另一個在相應的腱上(參考電極)；(c)最後一個電極接地並植入在動物大腿中兩個主電極之間。測量肌肉響應於對其運動神經刺激的REM的幅度和潛伏期。在相當於可獲得最大動作潛力之強度150％的所謂超強強度下，REM歷時200毫秒。在成年小鼠中，如果所研究的神經和肌肉健康，在上述條件下，刺激反應的幅度大於或等於80mV，潛伏時間一段等於0.6毫秒。組織學分析用過量的氯仿處死動物並且心內灌注戊二醛溶液。將隔神經分離、取出、用四氧化鋨後固定並放在環氧樹脂中。在近橫隔處切割隔神經，3μm厚的切片用對苯二胺染色並用光學顯微鏡分析。5．給予表達CNTF基因的表達系統注射腺病毒載體2-3天齡的純合Xt+pmn/Xt+pmn小鼠(「pmn小鼠」)(由不存在贅指來鑑別)用於注射腺病毒載體。將腺病毒原液稀釋在鹽水-磷酸鹽緩衝液(PBS)中至2×109pfu/μl製得腺病毒CNTF的懸液，按第3點描述的條件給藥。在大腸桿菌中編碼β-半乳糖苷酶的AdlacZ(Stratford-Perricaudet,1992)用作對照腺病毒載體。結果用AdCNTF染感的人成纖細胞的Northern印跡分析表明存在長度分別為1.1和1.6kb的兩種重組轉錄物。ELISA分析揭示感染不同類型細胞後的上清中存在重組蛋白。在實驗系列中所有未治療的pmn小鼠都在2個月之前死亡，其平均存活期為40.4±2.4天(n=14)。對照載體AdlacZ的施用不改變pmn小鼠的存活期。而靜脈內注射AdCNTF處理的pmn小鼠最長存活至73天(圖3)。用AdCNTF治療的pmn小鼠的平均存活期被顯著改善，為52.7±3.9天(n=7,p＜0.011)(已用Studentt檢驗分析了健康Xt/pmn小鼠、未處理的純合小鼠和處理的pmn小鼠的結果之間的差別，數值以均值±平均標準誤(SEM)給出。
為了確定用AdCNTF處理的pmn小鼠的存活期延長是否反映了隔神經纖維數目的增加，在第25天進行了光學顯微鏡檢查，結果表明在未處理的pmn小鼠中和在靜脈接受AdlacZ的pmn小鼠中，隔神經中有髓神經纖維的數目分別降至122±13(n=6)和111±11(n=8)，而健康小鼠中有髓神經纖維為263±8(n=4)。在注射AdCNTF的pmn小鼠的膈神經中有髓神經纖維的數目顯著高於對照動物的(145±11,n=10,p＜0.05)。因而用AdCNTF對pmn小鼠的處理使有髓神經纖維的喪失降低了20％(圖4)。6．給予聯合產生CNTF-GDNF的表達系統用微注射器以200μl的終體積給4隻99天齡的FALSG93A小鼠注射(尾靜脈)腺病毒Ad-CNTF和Ad-GDNF各109pfu。隨著時間跟蹤動物的肌電圖行為並與對照組相比較。還記錄了平均存活期。肌電圖所得結果示於圖1中，觀察到AdCNTF+AdGDNF處理的FALSG93A小鼠及未處理的FALSG93A小鼠的腓腸肌中運動刺激反應(REM)幅度的降低。這種降低反映了進行性失神經支配的過程，這是ALS的特徵之一。但治療小鼠的REM幅度總體上大於對照的，說明治療後功能損害的減弱。壽命動物的存活期如下表中所示。
受治療的動物

未處理的動物

這些結果表明，治療組的所有動物死亡時的年齡都大於或等於對照組中活得最長的動物的年齡。這些結果還表明，與對照動物相比，治療組的存活期平均提高30天。這些結果特別出人意料，與Rilutek所得的13天延長相比，表明本發明方法的治療潛力。7．給予產生NT3的表達系統7(a)．給予產生NT3的表達系統(99天齡的小鼠)用微注射器以200μl的終體積給4隻99天齡的FALSG93A小鼠注射(尾靜脈)了109pfu的腺病毒AdNT3。隨著時間跟蹤動物的肌電圖行為並與對照組比較。所得結果示於圖2中，其表明受治療的小鼠的REM幅度大於對照組的，說明由於治療減弱了功能損害。7(b)-給予產NT3的表達系統(3天齡的小鼠)用微注射器以20μl的終體積給3天齡的小鼠注射(顳靜脈)了5×108pfu的腺病毒Ad-NT3。
動物的存活期示於下表中。
受治療的動物

未處理的動物

這些結果表明用Ad-NT3靜脈途徑治療的動物的平均存活期此未處理的動物提高了16.1天。8．給予聯合產生CNTF-NT3的表達系統用微注射器以200μ1的終體積給4隻99天齡的動物注射(尾靜脈)了腺病毒Ad-CNTF和Ad-NT3各109pfu。隨著時間跟蹤記錄動物的肌電圖行為，並與對照組相比較。還記錄了平均存活期。9．給予聯合產生BDNF-NT3的表達系統用微注射器以200μl的終體積給4隻99天齡的動物注射(尾靜脈)了腺病毒Ad-BDNF和Ad-NT3各109pfu。隨著時間跟蹤記錄動物的肌電圖行為，並與對照組相比較。還記錄了平均存活期。10．給予產生BDNF的表達系統用微注射器以200μl的終體積給4隻99天齡的動物注射(尾靜脈)了109pfu的腺病毒Ad-BDNF。隨著時間跟蹤記錄動物的肌電圖行為，並與對照組相比較。還記錄了平均存活期。
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權利要求
1．神經營養因子的表達系統在製備用於系統性給藥治療ALS的藥物組合物中的應用。
2．根據權利要求1的應用，其特徵在於所述表達系統包含一種表達盒，後者由在轉錄啟動子控制下的編碼一種神經營養因子的核酸組成。
3．根據權利要求1的應用，其特徵在於所述表達系統包含兩種表達盒，每種表達盒由在轉錄啟動子控制下的編碼不同的神經營養因子的核酸組成。
4．根據權利要求1的應用，其特徵在於所述表達系統包含一種表達盒，後者由在轉錄啟動子控制下的編碼不同神經營養因子的兩種核酸組成(雙順反子單元)。
5．根據權利要求2的應用，其特徵在於所述神經營養因子選自GDNF、CNTF、BDNF和NT3。
6．根據權利要求3或4的應用，其特徵在於每種核酸編碼一種選自GDNF、CNTF、BDNF和NT3的不同的神經營養因子。
7．根據權利要求6的應用，其特徵在於所述表達系統包含編碼CNTF的核酸和編碼GDNF的核酸。
8．根據權利要求2-4之一的應用，其特徵在於這些表達盒構成載體的一部分。
9．根據權利要求8的應用，其特徵在於這些表達盒構成質粒載體的一部分。
10．根據權利要求8的應用，其特徵在於這些表達盒構成病毒載體的一部分。
11．根據權利要求10的應用，其特徵在於病毒載體為一種腺病毒載體。
12．根據上述權利要求任一項的應用，其特徵在於啟動子是一種真核或病毒的組成型啟動子。
13．根據上述權利要求任一項的應用，其特徵在於系統性給藥為靜脈給藥。
14．用於治療運動神經元退化性疾病的藥物組合物，其含有能表達兩種神經營養因子的系統。
15．根據權利要求14的組合物，其特徵在於所述系統包含兩種基因轉移載體，每種帶有編碼一種不同的神經營養因子的核酸。
16．根據權利要求14的組合物，其特徵在於所述系統包含一種基因轉移載體，其帶有能同時表達兩種不同的神經營養因子的表達盒。
17．根據權利要求15或16的組合物，其特徵在於這些載體為病毒載體。
18．根據權利要求17的組合物，其特徵在於這些載體為腺病毒。
19．根據權利要求15或16的組合物，其特徵在於這些載體為質粒載體。
20．根據權利要求14的組合物，其特徵在於神經營養因子選自GDNF、BDNF、CNTF和NT3。
21．根據權利要求20的組合物，其特徵在於它含有兩種缺陷型重組腺病毒，一種帶有編碼CNTF的核酸，另一種帶有編碼GDNF的核酸。
22．根據權利要求20的組合物，其特徵在於它含有兩種缺陷型重組腺病毒，一種帶有編碼GDNF的核酸，另一種帶有編碼NT3的核酸。
23．根據權利要求20的組合物，其特徵在於它含有兩種缺陷型重組腺病毒，一種帶有編碼BDNF的核酸，另一種帶有編碼NT3的核酸。
24．根據權利要求14的組合物，其特徵在於它經靜脈內途徑注射。
25．一種藥物組合物，其含有神經營養因子的表達系統和riluzole，用於同時或在時間上分開給藥。
全文摘要
本申請涉及一種治療運動神經疾病、特別是肌萎縮性側索硬化的新方法,特別在於神經營養因子表達系統的系統性給藥。
文檔編號A61K48/00GK1225131SQ9719641
公開日1999年8月4日 申請日期1997年9月10日 優先權日1996年9月13日
發明者G·哈斯, A·卡恩, P·肯耐爾, J·馬萊特, F·瑞瓦 申請人:羅納-布朗克羅萊爾股份有限公司, 國家健康科學研究所