流感血凝素和神經氨酸酶變體的製作方法

2023-05-29 20:16:06

專利名稱：流感血凝素和神經氨酸酶變體的製作方法
流感血凝素和神經氨酸酶變體
背景技術：
每年眾多個體感染不通品系和類型的流感病毒，因此對抗多種和不斷演化的流感 病毒株的疫苗不僅對於公共衛生很重要，同時具有商業重要性。嬰兒、老年人、缺乏醫療條 件的人群以及免疫削弱的人群對於此類感染具有很高的致死風險。此類流感感染的複雜性 在於新的流感病毒株容易演化並在不同物種間傳播，因此迫使新的疫苗不斷產生。近50年生產了數種能夠對此類不同流感病毒/病毒株產生特異性保護性免疫應 答的疫苗，包括完全病毒疫苗、分裂病毒疫苗、表面抗原疫苗和減毒病毒疫苗。然而，儘管任 一這些疫苗類型的合適劑型都可產生系統的免疫應答，但減毒病毒疫苗的優勢在於還可在 呼吸道內刺激局部黏膜免疫。本發明人和同事為生產疫苗在產生流感病毒及其片段方面進 行了大量工作；參見例如，2002年10月23日提交的美國申請號60/420，708 ；2004年5月 24日提交的60/574，117 ;2003年4月25日提交的10/423，828 ;2004年6月12日提交的 60/578,962 ；以及2004年6月16日提交的10/870，690，其公開內容納入文本作參考。因為不同流感病毒株的持續出現(或再現)，因此持續需要新的流感疫苗。通常利 用新出現病毒株的抗原部分創造此類疫苗，因此，急需新的、新出現的或新重現的病毒株的 多肽和多核苷酸(尤其是抗原性基因序列)。本發明提供了可用於數種類型疫苗的生產及研究、診斷等的新的和/或新分離的 流感血凝素和神經氨酸酶變體。瀏覽下述內容後還可明了其它多種益處。發明概述在本發明的一些方面，本發明包括分離或重組多肽，其選自SEQ IDNO=I-SEQ ID N0:10或SEQ ID NO 21-SEQ ID N0:26或SEQ ID NO :33_SEQ ID NO :38編碼的任一種多肽； SEQ ID NO Il-SEQ ID N0:20 或 SEQ IDNO :27_SEQ ID N0:32 或 SEQ ID NO :39_SEQ ID NO: 44 編碼的任一種多肽；僅僅是編碼 SEQ ID NO =Il-SEQ ID N0:20 或 SEQ ID NO :27_SEQ ID NO 32 或 SEQ ID NO :39_SEQ ID NO 44 的多肽的開放閱讀框；SEQ ID NO 11-20 或 SEQ ID N0:27-32或SEQ ID NO :39_44多肽的任何可選(如，無信號肽的成熟形式，或開放閱讀框 外無5』和3』序列，或表達於病毒(如流感)表面的序列)形式；多核苷酸序列編碼的任何 多肽，該多核苷酸序列在高度嚴謹條件下與SEQID NO :1至SEQ ID N0:10或SEQ ID NO 21 至SEQ ID NO 26,SEQ ID N0:33_38或SEQ ID NO :45的多核苷酸序列基本上全長雜交；以 及，上述包含血凝素或神經氨酸酶多肽序列的任何片段，或血凝素或神經氨酸酶多肽片段， 優選產生特異性結合本發明全長多肽的抗體的片段。在各種實施方式中，本發明的分離或 重組多肽與任何上述多肽的約300個毗連胺基酸殘基基本相同。在另一個實施方式中，本 發明所包括的分離或重組多肽中包含與任何上述多肽中相互毗連的至少約350個胺基酸； 至少約400個胺基酸；至少約450個胺基酸；至少約500個胺基酸；至少約520個胺基酸； 至少約550個胺基酸；至少約559個胺基酸；至少約565個胺基酸；或至少約566個胺基酸 基本相同的胺基酸序列。在一些實施方式中，多肽序列(如本文「序列」所列舉的)包含少 於565、559等等個胺基酸。在此類實施方式中，較短的列舉多肽任選含有少於565、559等 等個胺基酸。在另一實施方式中，本發明多肽任選包括融合蛋白、有前導序列的蛋白、前體多肽、有分泌信號或定位信號的蛋白、或有表位標籤如E-標籤或His表位標籤的蛋白。在 其它實施方式中，本發明包括的多肽含有與至少一條上述多肽具有至少85%，至少90%， 至少93%，至少95%，至少98%，至少98. 5%，至少99%，至少99. 2%，至少99. 4%，至少 99. 6%，至少99. 8%，或至少99. 9%序列相同性的序列。本發明血凝素序列能同時含有具 有未修飾或修飾的多鹼基切割位點(從而使病毒在雞蛋中生長)的序列。血凝素多肽序列 SEQ IDNOS :11、13、15、17、19、27、29、31、39、41或43含有內源性氨基端信號肽序列，然而， 本發明血凝素多肽序列也含有血凝素多肽的成熟(氨基端信號肽已切割)形式。利用本領 域任何數種方法可常規測定並預測任何流感病毒株的任何血凝素多肽序列的切割位點。在其它方面，本發明包括具有上文所列舉的一種或多種多肽或其片段的組合物。 本發明也包括與多克隆抗血清特異性結合的多肽，所述多克隆抗血清抗含有至少一種上文 所述胺基酸序列或其片段的抗原。此類對上述多肽具有特異性的抗體也是本發明的特點。 本發明的多肽任選具有免疫原性。本發明也包括免疫原性組合物，該免疫原性組合物含有一種或多種上文所述免疫 有效量多肽，以及對個體給予生理上可接受載體中的任何上述免疫有效量多肽以產生對抗 流感病毒的保護性免疫應答的方法。此外，除了含有此類免疫有效量的重組流感病毒的免疫原性組合物之外，本發明 還包括含有上述一種或多種多肽或多核苷酸的重組流感病毒。通過給予生理上可接受載體 中的此類重組免疫病毒以刺激個體免疫系統產生抗流感病毒的保護性免疫應答的方法也 是本文的一部分。在另一方面，本發明包括分離或重組核酸，所述分離和重組核酸選自多核苷酸序 列 SEQ ID NO :1 至 SEQ ID NO 10 或 SEQ ID NO 21 至 SEQ ID NO 26 或 SEQ ID NO 33 至 SEQ ID NO: 38，或 SEQ ID NO 45 (或其互補序列)，編碼多肽 SEQ ID NO: 11 至 SEQ ID NO: 20 或 SEQ ID NO 27 至 SEQ ID NO 32 或 SEQID NO 39 至 SEQ ID NO :44(或其互補多核苷 酸序列)的任何多核苷酸序列，在高度嚴謹條件下與上述任何多核苷酸序列全長基本雜交 的多核苷酸序列，和包含此類多核苷酸序列的全部或片段的多核苷酸序列，其中優選編碼 血凝素或神經氨酸酶多肽或血凝素或神經氨酸酶多肽片段的序列。本發明也包括分離或重 組核酸，所述分離或重組核酸編碼的胺基酸序列與上述核酸編碼的任何多肽至少約300個 胺基酸基本相同，或與上述核酸編碼的多肽至少約350個胺基酸；至少約400個胺基酸；至 少約450個胺基酸；至少約500個胺基酸；至少約502個胺基酸；至少約550個胺基酸；至 少約559個胺基酸；至少約565個胺基酸；至少約566個胺基酸基本相同。此外，在胺基酸 長度少於如566、565、559等的情況下(參見例如，「序列」)，應理解的是長度任選小於566、 565,559等。本發明也包括上述任何編碼血凝素或神經氨酸酶多肽、或一種或多種血凝素 或神經氨酸酶多肽的一個或多個片段的核酸。本發明的其它方面包括編碼多肽(任選血凝 素或神經氨酸酶多肽)的分離或重組核酸，其序列與上述至少一種多核苷酸具有至少98% 相同性，至少98. 5 %相同性，至少99 %相同性，至少99. 2 %相同性，至少99. 4 %相同性，至 少99. 6%相同性，至少99. 8%相同性，或至少99. 9%相同性。本發明還包括通過突變或重 組一種或多種上述多核苷酸序列而產生的編碼血凝素或神經氨酸酶多肽的分離或重組核 酸。本發明的多核苷酸序列能優選包括，如前導序列、前體序列或表位標籤序列或類似物中 的一種或多種，並可任選編碼融合蛋白(如，具有一種或多種其它序列)。
在另一些實施方式中，本發明包括含有上述兩種或多種核酸的組合物(如，包含 至少約2、5、10、50或更多種核酸的文庫)。可任選通過切割(如，機械切割、化學切割或利 用限制性核酸內切酶/RNA酶/DNA酶酶解等)一種或多種上述核酸生產此類組合物。本發 明的其它組合物包括，如在三磷酸脫氧核糖核苷酸和熱穩定性核酸聚合酶的存在下將一種 或多種上述核酸孵育產生的組合物。本發明還包括含有至少一種上述核酸或其切割或擴增片段或其產物的細胞。此 類細胞可任選表達此核酸編碼的多肽。本發明的其它實施方式包括含有任何上述核酸的 載體(如質粒、粘粒、噬菌體、病毒、病毒片段等)。此類載體任選包括表達載體。本發明 優選的表達載體包括但不限於含有pol I啟動子和終止子序列的載體或使用pol I和 pol II 啟動子「poll/polll 啟動子系統」的載體(如 Zobel 等，Nucl. Acids Res. 1993,21 3607 ；US20020164770 ；Neumann 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999,96 9345 ；Fodor 等， J.Virol. 1999，73 9679 ；和US20030035814)。被此類載體轉化的細胞也在當前發明的範圍 內。在一些實施方式中，本發明包括含有一種或多種上述核酸(如編碼血凝素和/或 神經氨酸酶的核酸)或其一種或多種片段的病毒(如流感病毒)。包含此類病毒的免疫原 性組合物也是本發明的一部分。此類病毒能包含重配病毒，如6:2重配病毒(如，含有來 自一種或多種供體病毒的6個基因編碼區和來自一種或多種任選含有血凝素和/或神經 氨酸酶的上述核苷酸序列(或其一種或多種片段)的2個基因編碼區)。本發明的重配病 毒(任選活病毒)可包含一種或多種如冷敏感、冷適應性或減毒的供體病毒。例如，重配 病毒可包含如A/Ann Arbor/6/60，PR8等。本發明的重配病毒可排除A/Ann Arbor/6/60。 本發明的一個優選實施方式是重配流感病毒，其中病毒為6:2重配流感病毒並包含來自A/ AnnArbor/6/60的6個基因編碼區以及編碼選自SEQ ID NO 11-20、SEQ IDNOS :27_32和 SEQ ID N0S:39-44的多肽的2個基因編碼區。在一個備選實施方式中，本發明的重配流感 病毒包括6 2重配流感病毒，其中所述病毒含有來自除A/Arm Arbor/6/60外的一種或多種 供體病毒的6個基因編碼區以及編碼選自SEQ ID NOS 11-20,SEQ ID NOS :27_32和SEQ ID NOS 39-44的多肽的2個基因編碼區。在另一備選實施方式中，本發明的重配流感病毒包 含6 2重配流感病毒，其中所述病毒含有來自除A/Arm Arbor/6/60外的一種或多種供體病 毒的6個基因編碼區以及來自任何大流行流感病毒株的HA或NA多肽的2個基因編碼區。 在允許核酸表達的條件下在合適的培養基中培養含有流感病毒的宿主細胞製造重組流感 病毒並從一種或多種宿主細胞或培養基中分離重組流感病毒的方法也是本發明的一部分。在本文其它實施方式中，本發明包括免疫有效量的含有上述任何重組流感病毒的 免疫原性組合物。其它實施方式包括通過給予免疫有效量的任何上述重組流感病毒(任選 在生理上有效的載體中)刺激免疫個體免疫系統產生對抗流感病毒的保護性免疫應答的 方法。本發明的其它方面包括在允許核酸表達的條件下在合適的培養基中培養上述任 何宿主細胞從而產生分離或重組多肽以及從一種或多種宿主細胞或細胞生長培養基中分 離多肽的方法。免疫原性組合物也是本發明特徵。例如，包含任何一種或多種上述多肽和/或核 酸以及任選賦形劑(如藥學上可接受的賦形劑)或一種或多種藥學上可接受給藥組分的免疫原性組合物。本發明的免疫原性組合物也能包含任何一種或多種上述病毒(如，與一種 或多種藥學上可接受的給藥組分一起)。通過對個體給予有效量的任何上述病毒(或免疫原性組合物)在個體中產生免疫 原性反應的方法也在本發明範圍內。此外，通過給予一定量的一種或多種上述病毒(或免 疫原性組合物)以有效產生對抗病毒感染的免疫原性反應，從而在個體中預防或治療病毒 感染(如病毒性流感)也在本發明範圍內。此類治療的個體包括哺乳動物(如人)。此類 方法也包括對個體體內給藥以及對個體的一種或多種細胞體外或離體給藥。此外，此類方 法還包括給予含有病毒和藥學上可接受的賦形劑的組合物，以一定量給予個體從而有效預 防或治療病毒感染。在其它方面，本發明包括含有編碼一種或多種大流行流感病毒株血凝素和/或神 經氨酸酶多肽的核酸序列以及編碼一種或多種A/Arm Arbor/6/60多肽的核酸序列的組合 物。此外，本發明包括含有編碼一種或多種大流行流感病毒株血凝素和/或神經氨酸酶多 肽的核酸序列以及編碼一種或多種PR8或A/ArmArbor/6/60多肽的核酸序列的組合物。此 類序列能包括本文「序列」所列舉的那些。此外，本發明的優選實施方式包括含有編碼一種 或多種大流行流感病毒株血凝素和/或神經氨酸酶多肽的核酸序列以及在6 2重配株中編 碼所選主體(backbone)病毒株的核酸序列的組合物。此類組合物優選包括選自本文「序 列」中編碼血凝素和神經氨酸酶的序列以及主體病毒株，其中主體病毒株為PR8或A/Arm Arbor/6/60。本發明也包括如上所述的此類組合物，其中血凝素包含修飾的多鹼基切割位 點。本發明也包括含有上述組合物的減毒的活流感疫苗。參照附圖和附錄閱讀以下詳述後，將完全明白本發明的這些和其它目的和特徵。附圖簡要說明

圖1 顯示對VN/1203/2004的HA基因進行工程改造修飾，以移除多鹼基切割位
點ο圖2 顯示鼻內給予H5W ca重配病毒在雞內不複製的結果。圖3 顯示H5m/AA ca候選疫苗對小鼠不致死。圖4 顯示1997和2004 H5N1 ca重配病毒在小鼠體內複製受限。圖5 顯示重配的H5m/AA ca流感病毒在小鼠肺部複製受限。圖6 顯示小鼠單次鼻內疫苗給藥後得到血清HAI Ab滴度。圖7 顯示小鼠單次鼻內疫苗給藥後得到血清中和Ab滴度。圖8 顯示H5m ca重配病毒在用50、500或5000LD5(1野生型H5W病毒的致死性 刺激中保護小鼠。圖9 顯示對同源和異源H5W刺激病毒在小鼠肺部複製的保護功效。圖10 顯示對同源和異源H5W刺激病毒在小鼠上呼吸道複製的保護功效。圖11 顯示在小鼠中2004 H5N1 ca疫苗對抗高劑量(IO5TCID5ci)同源或異源H5W wt病毒刺激的保護功效。圖12 顯示在小鼠中1997和2003 H5N1 ca疫苗對抗高劑量(IO5TCID5ci)同源或異 源H5m野生型病毒刺激的保護功效。圖13 顯示在小鼠中2004 H5N1 ca疫苗對抗低或高劑量(IO5TCID5ci)同源H5W野 生型病毒刺激的保護功效。
圖14 顯示對A/Nether land/219/03HA的HA基因進行工程改造修飾，以移除多鹼 基切割位點。圖15:H5N1 ca疫苗在小鼠中引發血清中和抗體的滴度。在每一劑量疫苗給藥前 (放血前(prebleed))和28天後收集血清；未檢測到的滴度指定值為10。圖16 :H6 ca病毒在雪貂中減毒。*肺EID50/g ；鼻甲PFU/g。鼻內接種IO7TCID50, 感染後第3天收集組織。圖17 :H6 ca疫苗在雪貂中的免疫原性。圖18(a)和18(b) :H6 ca疫苗在雪貂中的功效。在肺部(a)和鼻甲(b)內檢測病 毒滴度。疫苗單次給藥71og1(1PFU。刺激71og1(1PFU ；刺激後三天。圖19 :H7N3 BC 04 ca病毒在雪貂中減毒。接種物0. 5mL IO7TCID5tl鼻內接種。在 感染後第3天收集組織。圖20:H7N3 BC 2004 ca在小鼠中具有免疫原性。a 抗ck/BC/CN_6/04wt的血清中 和抗體滴度的倒數幾何均值。b :p < 0. 05 (曼恩-惠特尼U檢驗)(Marm-Whitney U-test)， 與感染28天後的中和滴度相比。。圖21(a)_21(i)小鼠體內H7N3 BC 04 ca有效對抗H7病毒的致死刺激。對抗 50LD5(1A/ck/BC/CN-7/04致死刺激的功效單次免疫四周後(a)，單次免疫八周後(b)，或兩 次免疫八周後(2次給藥相隔四周)(c)。對抗50LD5(1A/NL/219/03致死刺激的功效單次 免疫四周後(d)，單次免疫八周後(e)，或兩次免疫八周後(2次給藥相隔四周)(f)。對抗 50LD5QA/tk/Eng/63致死刺激的功效單次免疫四周後(g)，單次免疫八周後(h)，或兩次免 疫八周後(2次給藥相隔四周)(i)。圖22(a)和(b) :H7N3 BC 04ca疫苗在小鼠中有效。8周時在(a)鼻甲和(b)肺
部測定病毒滴度。圖23(a)和(b) :H9N2 G9/AA ca在雪貂中減毒。在(a)鼻甲和(b)肺部測定病毒滴度。
24(a)和(b) :H9N2 ca疫苗在小鼠中的功效。圖25 健康成人中H9N2 G9/AA ca的複製高度受限。圖26 健康成人中對107 °TCID5QH9N2 G9/AA ca的HI抗體應答。圖27 健康成人中H5m VN2004 A/AA ca的複製高度受限。圖28 健康成人中對106_7TCID5QVN2004 A/AA ca的HI抗體應答。發明詳述本發明包括流感血凝素和神經氨酸酶多肽和多核苷酸序列，以及包含此類序列的 載體、組合物等和其使用方法。本發明的其它特點在此詳述。定義除非另有說明，本文所用的一切技術和科學術語與本發明所屬技術領域一般技術 人員通常理解的含義相同。下列定義作為對本領域定義的補充，並指導本發明，並不需要歸 因於任何相關或不相關的場合，如任何共有的專利或申請。儘管任何與本發明所述類似或 等同的方法和材料可用於實踐測試本發明，但本文描述了優選的材料和方法。因此，本文所 用術語僅出於描述特定實施方式的目的，而不是限制本發明。除非另有清楚指示，本說明和附加權利要求所使用的單數形式「一種」、「一個」和「那」包括其複數形式。因此，例如，提及「一個病毒」包括多數病毒；提及「一種宿主細胞」 包括宿主細胞的混合物。依照上下文，「胺基酸序列」是胺基酸殘基的聚合物(蛋白質、多肽等)或代表氨基 酸聚合物的字符串。依照上下文，術語「核酸」、「多核苷酸」、「多核苷酸序列」和「核酸序列」指單鏈或 雙鏈脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物、嵌合體或其類似物。如本文所用術語任選包括 天然產生核苷酸的類似物的聚合物，其具有天然核苷酸的本質屬性，能夠與單鏈核酸以與 天然產生核苷酸(如肽核酸)類似的方式雜交。除非另有指示，本發明特定的核酸序列不 僅包括明確指示的序列，還任選包括互補序列。可從任何指定多核苷酸序列確定給定核酸 或互補多核苷酸序列(如，互補核酸)。術語「核酸」或「多核苷酸」也包含任何單體單位的物理字符串，能與核苷酸串對 應，包括核苷酸聚合物(如，典型的DNA或RNA聚合物)、PNA、修飾的寡核苷酸(如，含有溶 液中非典型生物學RNA或DNA的寡核苷酸，如2』 -0-甲基寡核苷酸)等。核酸可以是單鏈 或雙鏈。「亞序列」是整條序列的任何部分，直至並包含完整序列。通常，亞序列短於全長序 列。「獨特亞序列」指未在先前測定的任何流感多核苷酸或多肽序列中發現的亞序列。關於多肽的術語「變體」指與參考序列比較改換了一個或多個胺基酸的胺基酸序 列。變體能具有「保守」變換，其中替換的胺基酸具有相似結構或化學性質，如用異亮氨酸 替換亮氨酸。或者，變體能具有「非保守」變換，如，用色氨酸替換甘氨酸。相似的小變化也 可包括胺基酸缺失或插入或兩者均有。利用本領域熟知電腦程式可指導測定哪些胺基酸 殘基可被替換、插入或缺失而不破壞生物學或免疫學活性，例如，DNASTAR軟體。保守取代 的例子也在本文有所描述。術語「基因」廣泛用於指任何具有生物學功能的核酸。因此，基因包括編碼序列和 /或其表達所需的調節序列。術語「基因」應用於特定的基因組序列，以及該基因組序列編 碼的cDNA或mRNA。基因也包括非表達核酸區段，例如，形成其它蛋白的識別序列的區段。非表達調節 序列包括「啟動子」和「增強子」，調節蛋白如轉錄因子與其結合，導致毗鄰或相近序列的轉 錄。「組織特異性」啟動子或增強子是在特定組織類型或細胞類型中調節轉錄的啟動子或增 強子。如上下文所指示，「基因表達」或「核酸表達」指將DNA轉錄為RNA (任選包括RNA 的修飾，如剪接)、將RNA翻譯為多肽(可能包括後續多肽修飾，如，翻譯後修飾)，或同時轉 錄和翻譯。「開放閱讀框」或「0RF」是DNA或RNA (如基因)的可能翻譯閱讀框架，它可被翻譯 成為多肽。即，開放框架不被終止密碼子打斷。然而，值得注意的是術語ORF未必表示該多 核苷酸實際翻譯為多肽。術語「載體」指在生物體、細胞或細胞組件間增殖和/或轉移核酸所採用的方法。 載體包括質粒、病毒、噬菌體、前病毒(pro-virus)、噬菌粒、轉座子、人工染色體等，它們自 我複製並能整合進入宿主細胞的染色體。載體也可為裸露RNA多核苷酸、裸露DNA多核苷 酸、在同一鏈內含有DNA和RNA的多核苷酸、多聚賴氨酸偶聯的DNA或RNA、肽偶聯的DNA或RNA、脂質體偶聯的DNA或類似物質，它們不進行自主複製。在許多但非全部的一般實施方 式中，本發明的載體是質粒。「表達載體」是能夠促進摻入其中的核酸表達及複製的載體，如質粒。通常，要表達 的核酸「可操作性的連接於」啟動子和/或增強子，並受啟動子和/或增強子的轉錄調節控 制。「雙向表達載體」特徵在於兩個供選啟動子從位於兩個啟動子之間的核酸的相反 方向出發，因此可從兩個方向起始表達，導致如正⑴或有義鏈和負㈠或反義鏈RNA的轉錄。「多肽」是含有兩個或多個胺基酸殘基(如肽或蛋白)的聚合物。聚合物任選包含 修飾如糖基化等。多肽的胺基酸殘基可為天然或非天然的，並且可為未取代、未修飾、取代 或修飾的。在本發明的上下文中，術語「分離的」指生物學材料，如病毒、核酸或蛋白，基本脫 離通常伴隨的或天然產生的環境相互作用的組分。分離的生物學材料任選包含在天然環境 中未發現與該生物學材料伴隨的其它材料，如細胞或野生型病毒。例如，若材料在其自然環 境中，如細胞，可將材料置於細胞內未發現此材料的環境位置(如基因組或遺傳元件)。例 如，如果通過非天然產生的方法將其引入基因組(如載體，如質粒或病毒載體，或擴增子) 中非該核酸本來的座位時，該天然產生的核酸(如編碼序列、啟動子、增強子等)就成為分 離的。此類核酸也稱作「異源」核酸。例如，分離的病毒是所處環境(如，細胞培養體系或 純化自細胞培養物)並非野生型病毒的本來環境(如感染個體的鼻咽腔)的病毒。當術語「嵌合」或「嵌合物」涉及病毒時，表明該病毒包括源自一種以上親本病毒 株或來源的遺傳和/或多肽組分。同樣，術語「嵌合」或「嵌合物」涉及病毒蛋白時，表明該 蛋白包括源自一種以上親本病毒株或來源的多肽組分(即胺基酸亞序列)。術語「重組體」指該材料(如核酸或蛋白)由人幹涉被人工地或合成地(非天然) 改變。可在該材料的天然環境或狀態，或將材料從中移出，進行改變。詳細說，例如，當通過 重組核酸的表達產生流感病毒時，該流感病毒是重組的。例如，「重組核酸」是通過將核酸重 組產生的，例如，通過克隆、DNA重排或其它步驟，或通過化學或其它誘變產生的；「重組多 肽」或「重組蛋白質」是通過重組核酸的表達產生的；「重組病毒」，如，重組流感病毒是通過 重組核酸的表達產生。當術語「重配」涉及病毒時，表明該病毒包含源自一種以上親本病毒株或來源的遺 傳和/或多肽組分。例如，7:1重配株包含源於第一個親本病毒的7個病毒基因組區段(或 基因區段)以及一個補充性病毒基因組區段，如，編碼本發明血凝素或神經氨酸酶的區段。 6 2重配株包含6個基因組區段，最常見的來自第一親本病毒的6個內部基因以及兩個補充 區段，如，來自不同親本病毒的血凝素和神經氨酸酶。當術語「引入」涉及異源或分離的核酸時，指將核酸摻入真核或原核細胞中，其中 核酸可被摻入到細胞的基因組中(如染色體、質粒、質體或線粒體DNA)轉化為自主複製子， 或者瞬時表達(如轉染mRNA)。該術語包含此類方法如「感染」、「轉染」、「轉化」和「轉導」。 在本發明的上下文中，可使用多種方法將核酸引入細胞中，包括電穿孔、磷酸鈣沉澱、脂質 介導的轉染(脂轉染)(lipofection)等。術語「宿主細胞」指含有異源核酸如載體，並支持核酸的複製和/或表達的細胞。宿主細胞可以是原核細胞如大腸桿菌(E. coli)，或真核細胞如酵母、昆蟲、兩棲類、鳥類或 哺乳動物細胞，包括人細胞。示範性宿主細胞可包括例如Vero (非洲綠猴腎)細胞、BHK (幼 倉鼠腎)細胞、原代雞腎(PCK)細胞、Madin-Darby狗腎(MDCK)細胞、Madin-Darby牛腎 (MDBK)細胞、293細胞(如293T細胞)和COS細胞(如C0S1、C0S7細胞)等。流感病毒的「免疫有效量」是足以提高個體(如人)自身對隨後接觸流感病毒產 生免疫應答的用量。可檢測誘導免疫水平，如通過檢測中和分泌和/或血清抗體的量，如通 過空斑中和、補體固定、酶聯免疫吸附或微中和實驗來檢測。對抗病毒的「保護性免疫應答」指經過疾病防護的個體後續暴露於和/或被此類 流感病毒感染時，個體(如人)展示的免疫應答。在一些例子中，流感病毒(如天然循環) 仍能引起感染，但不能引起嚴重感染。通常，保護性免疫應答使得宿主產生血清和分泌抗體 水平可檢測到，所述宿主產生血清和分泌抗體能體外和體內中和同一病毒株和/或亞組的 病毒(也可能為不同的、非疫苗株和/或亞組)。本文所用「抗體」為包含一個或多個完全或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白 基因片段編碼的多肽的蛋白。認可的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε和μ恆 定區基因，以及無數免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分為κ或λ。重鏈分為Υ、μ、α、δ 或ε，進而分別定義了免疫球蛋白類型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(抗 體)結構單位包含四聚體。每一四聚體由兩對同樣的多肽鏈對組成，每對具有一條「輕」鏈 (約25kD)和一條「重」鏈(約50-70kD)。每一條鏈的N末端定義了約100-110個或更多 胺基酸的可變區，它們主要負責抗原識別。術語輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)分別 指這些輕鏈和重鏈。抗體以免疫球蛋白的形式或以不同肽酶消化產生的明確的數個片段的 形式存在。因此，例如，胃蛋白酶在絞鏈區二硫連接以下消化抗體產生F(ab)' 2,F(ab)' 2 是Fab 二聚體，本身是通過二硫鍵與VH-CHl連接的輕鏈。在緩和條件下還原F (ab) 『 2打 斷絞鏈區的二硫連接從而將(Fab' )2 二聚體轉化成為Fab'單體。Fab'單體實質上是具 有部分絞鏈區的Fab (參見《基礎免疫學》(FundamentalImmunology)，W. Ε. Paul編，紐約瑞 文出版社(Raven Press) (1999)，其中有關於其它抗體片段更詳細的描述)。既然通過消化 完整抗體定義不同的抗體片段，熟練技術人員意識到可通過化學或重組DNA方法全新合成 此Fab'片段。因此，本文所用術語抗體包含抗體或通過完整抗體修飾的或使用重組DNA方 法全新合成的片段。抗體包括，如，多克隆抗體、單克隆抗體、多鏈或單鏈抗體，單鏈抗體包 括單鏈Fv(sFv或scFv)抗體，其中可變的重鏈和可變的輕鏈連接在一起(直接或通過肽接 頭)，形成連續多肽，以及人源化或嵌合抗體。流感病毒本發明的多肽和多核苷酸，如SEQ ID NO :1_45，為流感HA和NA序列的變體。通 常，流感病毒由含區段化單鏈RNA基因組的內部核蛋白核心以及由基質蛋白排列成的外部 脂蛋白包膜組成。流感病毒基因組由8段線性㈠鏈核糖核酸(RNA)和6個內部核心多肽 組成，所述核糖核酸編碼免疫原性血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)蛋白，所述內部核心多肽 是核衣殼核蛋白(NP)；基質蛋白(M)；非結構蛋白(NS)；和3個RNA聚合酶(PA、PB1、PB2) 蛋白。複製過程中，基因組RNA在宿主細胞核中轉錄成為(+)鏈信使RNA和(-)鏈基因組 cRNA。8個基因組區段中的每一個都包裝成為核糖核蛋白複合物，其中除了 RNA外還含有 NP和聚合酶複合物(PB1、PB2和PA)。
流感通常分為甲型流感和乙型流感。每一甲型流感和乙型流感病毒均含有8段具 負極性的單鏈RNA。甲型流感基因組編碼11個多肽。區段1-3編碼3個多肽，組成RNA-依 賴性RNA聚合酶。區段1編碼聚合酶複合物蛋白PB2。剩下的聚合酶蛋白PBl和PA分別由 區段2和區段3編碼。此外，某些流感株的區段1編碼小蛋白PB1-F2，由PBl編碼區內的另 一閱讀框產生。區段4編碼在感染過程中參與細胞粘附和進入的血凝素(HA)表面糖蛋白。 區段5編碼與病毒RNA關聯的主要結構組分，核衣殼核蛋白(NP)多肽。區段6編碼神經氨 酸酶(NA)包膜糖蛋白。區段7編碼兩個基質蛋白Ml和M2，它們由差異剪接的mRNA翻譯。 區段8編碼兩個非結構蛋白NSl和NS2，它們由另路剪接的mRNA變體翻譯。乙型流感的8 個基因組區段編碼11個蛋白。三個最大的基因編碼RNA聚合酶的組分PB1、PB2和PA。區 段4編碼HA蛋白。區段5編碼NP。區段6編碼NA蛋白和NB蛋白。蛋白質NB和NA均由 順反子mRNA的交疊閱讀框翻譯而來。乙型流感的區段7也編碼兩個蛋白M1和BM2。最小 區段編碼兩個產物NS1翻譯自全長RNA，而NS2翻譯自剪接mRNA變體。流感病毒疫苗本文的序列、組合物和方法主要但非只關於產生流感病毒疫苗。歷史上，首先使用 選擇或基於經驗預測的相關株的病毒株在含胚雞蛋中產生流感病毒疫苗。最近，在一種批 準的減毒溫度敏感型主株中合併所選血凝素和/或神經氨酸酶抗原產生重配病毒。在雞蛋 中將病毒培養物傳代數次後，回收病毒並任選滅活病毒，如使用甲醛和/或β _丙內酯滅活 (或用於減毒的活疫苗)。因此，將認識到HA和NA序列(如，SEQ ID NO :1_45)在構建流 感疫苗時尤其有用。本發明包括含有大流行流感株HA和/或NA序列的病毒/疫苗(包括 其中HA序列含有修飾的多鹼性切割位點，如本文所述修飾)；並包括其中病毒/疫苗含有 ca主體如Α/ΑΑ/6/60或PR8主體。在細胞培養物中生產重組和重配疫苗的嘗試受阻的原因是一些批准用於疫苗生 產的病毒株無法在標準細胞培養條件下有效生長。然而，發明人和同事先前的工作提供了 一種在培養物中產生重組和重配病毒的載體系統及方法，因此，使快速生產對應一種或多 種所選抗原性病毒株的疫苗成為可能，如，A或B株，不同亞型或亞株等，如，含有本文HA 和/或NA序列。參見，用於生產流感病毒的多質粒系統(Multi-Plasmid System for the production of Influenzavirus)，2002 年 10 月 23 日提交的美國申請號 60/420，708，2003 年4月25日提交的美國申請號10/423,828，以及2004年5月24日提交的美國申請號 60/574，117。通常，將培養物維持於恆溫器控制的恆溫(使溫度不超過35°C)、溼度和0)2控 制系統中，如細胞培養箱。通過將對應主流感病毒的基因組區段的載體子集與源於感興趣 病毒株的補充區段(如，本文HA和/或NA抗原性變體)聯合引入，易於獲得重配流感病毒。 通常，基於需給藥疫苗相關所需特性選擇主病毒株。例如，用於疫苗生產，如，用於減毒的活 疫苗生產，主供體病毒株可選自減毒表型、冷適應和/或溫度敏感型。如本文其它部分及美 國專利申請號10/423，828等所釋，本發明的不同實施方式使用A/Arm Arbor (AA)/6/60流 感株作為「主體」，在其基礎之上加上HA和/或NA基因(如本文所列的那些序列等)來創造 所需重配病毒。因此，例如，在6:2重配株中，2個基因(即NA和HA)來自於期望對之產生 免疫原性反應的流感株，而其它6個基因來自於Arm Arbor株，或其它主體病毒株，等。Arm Arbor病毒的冷適應性、減毒和溫度敏感屬性很有用。當然，應當被意識到的是本文中的HA 和NA序列能夠與數種其它病毒基因或病毒類型發生重配(如數種不同「主體」，如PR8等，其包含出現於重配株的其它流感基因，即非HA和非NA基因)。本文中的不同實施方式可包含用於大流行流感的具有本文HA和/或NA序列的減 毒活疫苗。此類疫苗通常包含如SEQ ID NO: 11-20、27-32或39-44的HA和/或NA序列， 或SEQ ID N0:l-10、21-26、33-38或45的對應編碼核苷酸序列。疫苗病毒株(如重配株) 在雞蛋中生長造成的一個問題是禽類病毒株(它可能涉及大流行)能殺死生產疫苗的雞 蛋，因此通過使用傳統(非質粒拯救)重配株生產難以操作、製造等。因為此類禽病毒株能 引起人類流感及可能大流行因此對其很感興趣。因此，使用質粒拯救系統產生/操作流感 重配株及大流行病毒株，如不同的禽類序列(如本文HA和NA序列)，是急需的，也是本發明 的特色。然而，應當意識到的是當前序列也可能用於非質粒或傳統的系統。水禽(以及其它種類)能被15個血凝素(HA)和9個神經氨酸酶(NA)亞型的甲型 流感病毒感染。這種鳥類作為存儲庫可將新流感亞型引入人群並造成大流行。2003年荷蘭 禽類H7N7甲型流感病毒感染人以及早些時候香港和中國禽類H5W和H9N2病毒感染人的 發現引發了對這些(以及其它)亞型有引起大流行可能的關注。因此，需要疫苗保護人受 到甲型禽流感病毒的感染。對抗人流感病毒的減毒甲型流感病毒活疫苗最近在美國得到許 可。參見如上。此類疫苗為重配的Hmi和H3N2病毒，其中A/Ann Arbor (AA) /6/60 (H2N2) 冷適應性(ca)病毒的內部蛋白基因使重配病毒具有AA ca病毒冷適應、減毒和溫度敏感的 表型(即從非Arm Arbor病毒株得到血凝素和神經氨酸酶基因的那些)。將經典遺傳重配 和基於質粒的反向遺傳學技術應用於產生含有來自甲型流感病毒(H4-H14亞型)的禽類血 凝素和神經氨酸酶基因以及來自AA ca病毒的6個內部基因區段的重配病毒。此類重配病 毒是本發明的特色。參見下列HA和NA基因序列。因為AA ca病毒相關表型出現在重配病 毒中，因此這些病毒具有在候選疫苗中需要的生物學性質。產生並評價這些作為疫苗種病 毒的重配病毒是大流行準備的重要步驟。預計臨床試驗能確定此類減毒活的大流行疫苗的 安全性、感染性以及免疫原性。本發明的其它實施方式包括含有來自禽類和豬的大流行抗 原性基因HA和/或NA的重配病毒(如疫苗中使用的那些)、除本文列舉外的大流行病毒 株，以通過質粒拯救重配(如，重配A/Ann Arbor 6/60 (即，A/AA/6/60)和PR8等)生產大 流行疫苗。也包括構建和使用此類病毒和疫苗的方法。本文所用「大流行病毒株」定義為 不在人群中流動的流感毒株A病毒亞型，由疾病控制中心(Centers for Disease Control) 或世界衛生組織(World HealthOrganization)宣布或通常為科學領域所承認為大流行菌 株。在本文的不同實施方式中，抗原性序列(如HA序列)以及病毒和來自此類病毒的 疫苗含有修飾的多鹼性切割位點。一些高致病性禽大流行流感病毒株在血凝素序列內包 含多個鹼性胺基酸切割位點。參見例如，Li等，J. of InfectiousDiseases, 179 =1132-8, 1999。在本發明的典型實施方式中，與產生目前序列的野生型序列相比，此類切割位點的序 列經過修飾或更改(如，使其不能切割或減少了切割等)。因為野生型序列切割位點的不 同序列，在不同病毒株中此類修飾/更改是不同的。例如，通常，本文序列中移除(與wt相 比)成熟H5的位置326-329上的4個多鹼性殘基(RRKK)。參見「序列」。在各種實施方式 中，可通過多種方式修飾多鹼性切割位點(這些均包含於本發明範圍內)。例如，一次可移 除多鹼性切割位點的一個胺基酸(如，移除一個R，移除兩個R，移除RRK，或移除RRKK)。此 外，切割位點直接上遊的胺基酸殘基也可被移除或更改(如，R變為T等)；切割位點直接下遊的胺基酸編碼核苷酸也同樣可被修飾。參見例如，圖1所示切割位點的修飾。此外，流感 病毒血凝素多肽序列含有氨末端信號肽序列，因此，本發明的血凝素多肽序列包含血凝素 多肽的成熟(氨基末端信號肽切割)形式以及血凝素的預切割形式。利用本領域任何數種 方法可常規檢測任何流感株的任何血凝素多肽序列的切割位點。應用於任選包含當前序列的病毒(通常用於疫苗或疫苗生產)的術語「溫度敏感 型」、「冷適應性」和「減毒的」為本領域所熟知。例如，對甲型流感株而言，術語「溫度敏感 型」(ts)表明與33°C相比病毒在39°C時表現出100倍甚至更多的減弱，或者對乙型流感株 而言，與33°C相比，在37°C時表現出100倍甚至更多的減弱。術語「冷適應性」(ca)表明病 毒在25°C時生長為其在33°C的100倍之內，而術語「減毒」(att)表明病毒在雪貂的上呼吸 道內複製但未在其肺組織中檢測到，並且不在動物中引起流感樣疾病。應理解，病毒具有中 間表型，即病毒在39°C (對A株病毒)或37°C (對B株病毒)展現的減弱小於100倍，或在 25°C時生長為33°C生長的100倍以上(如200倍內、500倍內、1000倍、少於10，000倍)， 和/或與上氣道相比，在雪貂肺中生長減弱(即部分減毒)和/或在動物中減弱的流感樣 疾病，也是有用的病毒並可與本文的HA和NA序列聯用。再次，任選將本發明的HA和NA序列用於生產重配病毒或用於重配病毒(和/或 在其它ts、cs、ca和/或att病毒和疫苗)。然而，值得注意的是本發明中的HA和NA序列 等不限於特定疫苗組合物或生產方法，因此基本能用於使用病毒株特異性HA和NA抗原的 任何疫苗類型或疫苗生產方法(如SEQ ID NO 11-20、27-32或39-44或編碼特定HA和NA 抗原的對應核苷酸，如SEQ ID NO :1-10、21-26、33-38或45中的任何)。FluMi st 如前文所提到的，存在數種流感疫苗類型的例子。示範性流感疫苗是FluMist ， 它是保護兒童和成人免受流感疾病侵襲的活減毒疫苗(Belshe等(1998)減毒、冷適應 性、三價、鼻內流感病毒活疫苗在兒童中的功效(Theefficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virusvaccine in children)N Engl J Med 338 1405-12 ；Nichol等(1999)減毒、鼻內流感病毒活疫苗在健康的有工作成年人 中的*雙 生隨式 1 (Effectivenessof live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy,working adults :arandomized controlled trial)JAMA 282 137-44)。典型的優選實施方式中，本發明的方法和組合物優選適應/用於FluMist 疫苗 生產。然而，應當被本領域熟練技術人員了解的是本文的序列、方法、組合物等也可用於生 產相似或者甚至不同的病毒疫苗。FluMist 疫苗病毒株包含起源於病毒株(如野生型病毒株)的HA和NA基 因區段，疫苗還包含六個來自共有主供體病毒(MDV)的基因區段，即PB1、PB2、PA、NP、 M和NS。因此本文的HA序列是不同的FluMist 製劑的一部分。FluMist 的甲型流 感毒株的MDV(MDV-A)是在持續低溫下在原代雞腎組織培養物中連續傳代野生型A/Arm Arbor/6/60 (A/AA/6/60)病毒株所得(Maassab (1967)流感病毒在25攝氏度下的適應和生 長特性(Adaptation andgrowth characteristics of influenza virus at 25 degrees ONature 213 :612_4)。MDV-A在25°C下有效複製(ca，冷適應性)，但在38°C和39°C下生 長受限(ts，溫度敏感)。此外，該病毒在感染雪貂的肺部不複製(att，減毒)。ts表型被 認為通過限制除呼吸道最冷區域外病毒的複製使疫苗具有減毒性。該性質的穩定性已在動物模型及臨床試驗中展現。與化學誘變產生的流感株ts表型相反，MDV-A的ts特性不隨 在感染倉鼠中傳代而回復也不在兒童的流出分離物中回復(近期的一篇綜述，參見Murphy 和Coelingh (2002)開發和使用減毒的冷適應性甲型流感和乙型流感病毒活疫苗的原理 (Principles underlying thedevelopment and use of live attenuatedcold-adapted influenza A and B virusvaccine)Virus Immunol 15 :295_323)。在超過20，000個成人和兒童中進行關於12種分離6:2重配株的臨床研究表明 這些疫苗是減毒、安全有效的(Belshe等(1998)減毒、冷適應性、三價、鼻內流感病毒活 ^δ ^JLmlzIzl Witl^ (The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intrenasal influenza vaccine in children)N Engl J Med338 1405~12 ；Boyce 等 (2000)通過鼻內途徑給予健康成年人的含佐劑和不含佐劑的亞基流感疫苗的安全性和 ；^ 貞 M t生(Safety and immunogenicity ofadjuvanted and unadjuvanted subunit influenza vaccine administered intranasalIyto healthy adults)Vaccine 19 217-26 ；Edwards等(1994)用於預防甲型流感的冷適應性和滅活疫苗的隨機對照試 驗(A randomized controlled trial ofcold-adapted and inactivated vaccine for the prevention of influenza A disease),!Infect Dis 169 :68_76 ；Nichol 等 (1999)減毒、鼻內流感病毒活疫苗在健康的有工作成年人中的有效性隨機對照試驗 (Effectiveness of live, attenuatedintranasal influenza vaccine in healthy, working adults :a randomized controlledtrial) TAMA 282:137—44)。 MDV—A Af 內部基因和野生型病毒兩個HA和NA基因區段的重配病毒(即，6:2重配株)一向保持ca、 ts和att表型(Maassab等(1982)在雪貂中評價冷適應性流感疫苗(Evaluation of a cold-recombinantinfluenza vaccine in ferrets)J. Infect. Pis. 146 780-900)。使用乙型流感病毒株生產此類重配病毒要困難一些，然而，近期工作(參見例如， 生產流感病毒的多質粒系統，2002年10月23日提交的美國申請號60/420，708，2003年4月 25日提交的美國申請號10/423，828以及2004年5月24日提交的美國申請號60/574，117) 展示了一個完全來自克隆cDNA的用於產生乙型流感病毒的八質粒系統。用於產生減毒甲 型和乙型流感活病毒的方法適用於疫苗製劑，如為人熟知的用於鼻內給藥的活病毒疫苗制 劑。前述系統和方法可用於在細胞培養物中快速生產重組和重配的甲型和乙型流感 病毒，包括適合用作疫苗的病毒，包括減毒的活疫苗，如合適鼻內給藥的疫苗。本發明中的 序列(如，核苷酸序列SEQ ID N0:l-10、21-26、33-38或45及核苷酸序列編碼的對應氨基 酸SEQ ID NO 11-20，27-32或39-44)、方法等任選與先前工作涉及的，例如用於疫苗生產 的重配流感病毒一起或聯合使用，以生產疫苗用病毒。用於預防性疫苗給藥的方法和組合物如上所述或除了用於生產FluMist 疫苗外，本發明還可用於其它疫苗製劑。通 常，本發明重組和重配病毒(如，包含多核苷酸SEQ ID N0:l-10、21、23-26、33-38或45或 多肽SEQ ID N0:ll-20、27-32或39-44，或其片段的病毒)可以免疫有效量並在合適載體賦 形劑中預防性給藥以刺激對於一種或多種流感病毒株的特異性免疫應答，這些流感病毒株 由HA和/或NA序列決定。通常，載體或賦形劑為藥學上可接受的載體或賦形劑，如滅菌水、 鹽水溶液、緩衝鹽水溶液、右旋糖水溶液、甘油水溶液、乙醇或其組合。根據本領域確定的實驗方法能夠有效製備此類溶液並確保無菌、PH、等滲和穩定性。通常，選擇載體或賦形劑以 儘量減少過敏和其它不需要的反應，並適合於特定的給藥途徑，如皮下、肌肉內、鼻內等。本發明的一個相關方面提供了刺激個體免疫系統產生對抗流感病毒的保護性免 疫應答的方法。在方法中，用在生理上可接受載體中的重組流感病毒(如，含有本發明HA 和/或NA分子)的免疫有效量、本發明多肽的免疫有效量和/或本發明核酸的免疫有效量 進行給藥。通常，以足以刺激對一種或多種流感病毒株(即，本發明的HA和/或NA病毒株) 應答的量給予本發明的流感病毒。優選給予流感病毒引起對此類病毒株的保護性免疫應 答。本領域熟練技術人員了解引起對於一種或多種流感病毒株的保護性免疫應答的劑量和 方法。參見例如，USPN 5，922，326 ；Wright 等，Infect. Immun. 37 397-400 (1982) ；Kim 等， Pediatrics 52:56-63(1973)和 Wright 等，Τ. Pediatr. 88 931~936 (1976)。例如，每劑量 提供約I-IOOOHID5q(人有效劑量)，即約105-108pfu(空斑形成單位)流感病毒進行給藥。 通常，根據如年齡、身體條件、體重、性別、飲食、給藥時間和其它臨床因素在範圍內調整劑 量。全身給予預防性疫苗製劑，如利用針和注射器或無針裝置進行皮下或肌肉內注射。或 者鼻內給予疫苗製劑，通過滴劑、大顆粒氣溶膠(大於約10微米)，或噴入上呼吸道。儘管 上述任何途徑均引起保護性系統免疫應答，但鼻內給藥的另一益處是引起流感病毒進入位 置的黏膜免疫。對於鼻內給藥，經常優選減毒活病毒疫苗，如，減毒、冷適應性和/或溫度敏 感型重組或重配流感病毒。參見上文。儘管優選單次給藥刺激保護性免疫應答，但也可通 過相同或不同途徑給予額外劑量，以達到所需預防效果。通常，在疫苗中的本發明減毒重組流感(病毒)充分減毒，因此感染症狀，至少嚴 重感染症狀不會在大多數減毒流感病毒免疫的(或由於另外因素感染的)個體中發生。在 一些例子中，減毒流感病毒仍能夠產生輕度疾病症狀(如輕度上呼吸疾病)和/或傳染未 接種疫苗的個體。然而，其毒性充分消減，因此並不會在接種或隨機宿主體內發生嚴重的下 呼吸道感染。或者，利用含有本文序列的流感病毒離體或體內靶向樹突細胞刺激免疫應答。例 如，使樹突細胞暴露於足夠量的病毒足夠長的時間以使樹突細胞捕獲流感抗原。然後利用 標準靜脈內移植方法將該細胞轉移到要接種的個體中。儘管優選單次給藥刺激保護性免疫應答，但也可通過相同或不同途徑給予額外劑 量，以達到所需預防效果。例如在嬰幼兒中，也許需要多次給藥引發足夠水平的免疫。為了 維持足夠水平對抗野生型流感感染的防護，可在整個兒童期持續間隔給藥。同樣，對重複或 嚴重流感感染尤其易感的成人，例如，健康工作者、護工、幼年兒童的家庭成員、老年人以及 心肺功能受損的個體也許需要多次免疫以建立和/或維持保護性免疫應答。可監測誘導免 疫的水平，如通過測定分泌和血清抗體的量，並且根據需要調整劑量和重複接種以引發並 維持所需水平的保護。任選地，預防性給予流感病毒的製劑也含有一種或多種佐劑，以提高對流感抗原 的免疫應答。合適的佐劑包括完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、皂苷、礦物凝膠如氫氧化 鋁、表面活性物質如溶血卵磷脂、複合多元醇、聚陰離子、肽、油或烴乳劑、卡介苗(BCG)，短 小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)和合成佐劑QS-21。根據需要，流感病毒的預防性疫苗給藥可與一種或多種免疫刺激分子偶聯操作。免疫刺激分子包括具有免疫刺激、免疫增效和預刺激活性的各種細胞因子、淋巴因子和趨 化因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生長因子(如粒細胞-巨噬 細胞(GM)-集落刺激因子(CSF))；和其它免疫刺激分子，如巨噬細胞炎症因子、Flt3配體、 B7. 1、B7.2等。免疫刺激分子可在與流感病毒同樣的製劑中給藥，或者獨立給藥。可用蛋 白(如本發明的HA和/或NA多肽，如SEQ ID NO :11-20、27_32或39-44中任何一個)或 含有編碼蛋白的核酸的表達載體(如SEQ ID NO :1-10、21-26、33-38或45任何一個)給藥 以產生免疫刺激效應。上述方法可用於通過體外、離體或體內將含有編碼治療或預防有效的HA和/或NA 多肽(或肽)或HA和/或NA RNA(如反義RNA或核酶)的異源多核苷酸的本發明載體引 入靶細胞群，以便治療性和/或預防性治療疾病或失調，通常是流感。通常，編碼感興趣多 肽(或肽)或RNA的多核苷酸可操作性連接於合適的調節序列，如上文名為「表達載體」和 「附加表達原件」部分所述。任選地，可將一種以上異源編碼序列插入單一載體或病毒。例 如，除了編碼治療或預防有效的活性HA和/或NA多肽或HA和/或RNA的多核苷酸外，該 載體還可包含其它治療性或預防性多肽，如抗原、共刺激分子、細胞因子、抗體等和/或標 記物等。儘管利用特定亞組的特定病毒株的減毒流感病毒接種個體能誘導對於不同病毒 株和/或亞組的交叉防護，如果需要可利用來自至少兩個病毒株的減毒流感病毒(如各自 代表不同的亞組)接種個體。此外，疫苗組合可任選包括大流行疫苗(如對抗大流行株如 各種禽類病毒株(參見例如，本文序列)或其它大流行病毒株的疫苗)和非大流行病毒株 的混合物。疫苗混合物(多重疫苗)能包含來自人病毒株和/或非人(如禽類和人類等) 流感株的組分。同樣，本發明的減毒流感病毒疫苗能任選與誘導對抗其它感染劑的保護性 免疫應答的疫苗組合。本發明的多核苷酸本領域眾所周知流感病毒HA和NA多核苷酸區段包含編碼區(編碼0RF)和非編 碼區(NCR)，以及HA和NA編碼序列的5，和3，。這些NCR的一個例子是SEQ ID NO :1_9所 示NCR(0RF外部)。同樣知道的是可製造這些NCR的引物以利於擴增流感病毒整個HA和NA 區段。(參見例如，Hoffmann 等，ArchVirol. 2001 年 12 月；146(12) :2275_89)。此外，還知 道流感的HA和NA的NCR可增加所得重配株的效率。因此，這些NCR的多核苷酸序列(包 括片段及其變體(如至少約60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少約91% 或至少約92 %、或至少約93 %、或至少約94%、或至少約95 %、或至少約96 %、或至少約 97%、或至少約98%、或至少約98. 5%、或至少約98. 7%、或至少約99%、或至少約99. 1%, 或至少約99. 2%、或至少約99. 3%、或至少約99. 4%、或至少約99. 5%、或至少約99. 6%或 至少約99.7%、或至少約99.8%、或至少約99. 9%相同))在本發明的範圍之內。當擴增 任何大流行病毒株HA和NA區段時，可製造並使用多核苷酸引物與HA和NA NCR的保守區 (在相關病毒株中保守)結合，以便擴增(如通過RT-PCR)。在一個實施方式中，本發明的 HA和NA多核苷酸包含大流行病毒株HA和NA序列的NCR和ORF (包括片段及其變體(如 至少約60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少約91%或至少約92%、或至 少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、 或至少約98. 5%、或至少約98. 7%、或至少約99%、或至少約99. 1%、或至少約99. 2%、或至少約99. 3%、或至少約99. 4%、或至少約99. 5%、或至少約99. 6%或至少約99. 7%、或 至少約99. 8%、或至少約99. 9%相同))。在另一個實施方式中，本發明的HA和NA多核苷 酸不包含NCR，但包含大流行病毒株HA和NA序列(如SEQ ID NO 1-9)的ORF (包括片段 及其變體(如至少約60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少約91%或至少 約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或 至少約98%、或至少約98. 5%、或至少約98. 7%、或至少約99%、或至少約99. 1%、或至少 約99. 2%、或至少約99. 3%、或至少約99. 4%、或至少約99. 5%、或至少約99. 6%或至少約 99. 7%、或至少約99. 8%、或至少約99. 9%相同))。本發明的HA 和 NA 多核苷酸，如 SEQ ID NO :1 至 SEQ ID NO 10、SEQ IDNO :21 至 SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 33 至 SEQ ID NO 38、SEQ ID NO :45 及其片段，可任意用於產生 數種不同能力(capacity)，作為用於上述疫苗的備選或補充。本文所述其它示範性用途僅 出於說明目的而非為了限制實際使用範圍。本文也描述構建、純化和鑑定核苷酸序列的不 同方法。在一些實施方式中，含有本發明一種或多種多核苷酸序列的核酸易於用作監測不 同環境中對應或相關核酸的探針，這些環境包括例如，核酸雜交實驗，如為了尋找和/或鑑 定感染其它種屬或在不同流感爆發中(等)的同源流感變體(如，與本文序列同源等)。探 針可為DNA或RNA分子，如基因組的限制性片段或克隆DNA、cDNA、PCR擴增產物、轉錄子和 寡核苷酸，並且長度可從短至約10個核苷酸的寡核苷酸到長至超過Ikb甚至更長的全長序 列或cDNA。例如，在一些實施方式中，本發明的探針包括所選的多核苷酸序列或亞序列，如 選自 SEQ ID NO :1 至 SEQID NO 10,SEQ ID NO :21 至 SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 33 至 SEQ ID N0:38、SEQ ID NO :45或其互補序列。或者，使用上述指定序列之一變體的多核苷酸序 列作為探針。最通常的，此類變體包含一個或數個保守核苷酸變化。例如，選擇數對(或數 套)寡核苷酸，其中兩個(或更多)多核苷酸序列彼此保守性變異，其中一個多核苷酸序列 完全對應第一個變體或，且其它多核苷酸序列完全對應剩餘變體。此類寡核苷酸探針對尤 其有用，如，用於特異性雜交實驗以探測多態性核苷酸或探測同源性流感HA和NA變體，如 與當前HA和NA序列同源的變體，感染其它種屬或在不同流感爆發(時間和/或地理上不 同)中出現的變體。在其它應用中，選擇更離散的探針即選擇至少約91% (或約92%、約 93%、約 94%、約 95%、約 96%、約 97%、約 98%、約 98. 5%、約 98. 7%、約 99%、約 99. 1%, 約 99. 2 %、約 99. 3 %、約 99. 4 %、約 99. 5 % 或約 99. 6 % 或多於約 99. 7 %、約 99. 8 %、約 99. 9%或更多)相同的探針。本發明的探針，例如衍生自本文序列的序列，根據本領域常規步驟也可用於識別 其它有用的多核苷酸序列。在一套實施方式中，如上所述，用一個或多個探針篩選產物表達 文庫或染色體區段文庫(如表達文庫或基因組文庫)以鑑別包含與本文序列的一個或多個 探針序列相同或序列顯著相似的克隆，即變體、同源物等。應被理解的是除了如文庫篩選的 物理方法外，計算機輔助的生物信息學手段，如BLAST和其它序列同源性搜索算法等，也能 用於鑑定相關多核苷酸序列。以此方式鑑定的多核苷酸序列也是本發明特徵。任選通過本領域熟練技術人員熟知的數種方法生產寡核苷酸探針。最典型的 是，利用熟知的合成方法，如 Beaucage 禾口 Caruthers (1981) Tetrahedron Letts22 (20) 1859-1862所述固相亞磷醯胺三酯方法，如使用自動合成儀或如Needham-Van Devanter等 (1984) Nucl Acids Res, 12 :6159_6168所述製造。也可定製寡核苷酸或從本領域技術人員熟知的商品來源訂購。當需要純化寡核苷酸時，一般進行非變性(nature)丙烯醯胺凝膠電 泳或通過陰離子交換 HPLCjn Pearson 和 Regnier (1983) T Chrom 255 137-149 所述。可 根據Maxam和Gilbert (1980)在Grossman和Moldave (編)紐約科學出版社，《酶學方法》 (Methods in Enzymology) 65 :499_560所述化學降解方法來驗證合成寡核苷酸的序列。也 可方便從多個熟練技術人員所知的商業來源訂購定製的寡核苷酸。在其它情況下，如關於表達本發明多核苷酸和多肽的細胞或生物體(如，帶有包 含本發明序列病毒的那些)，方便使用多肽、肽或抗體探針。例如，源於本發明任何胺基酸序 列(如 SEQ ID NO 11-20,SEQ ID NO =27-32,SEQ IDNO 39-44)的分離或重組多肽、多肽片 段和肽和/或由本發明多核苷酸序列，如選自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO :10、SEQ ID NO 21 至 SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 33 至 SEQ ID NO 38 以及 SEQ ID NO 45 編碼的多肽或多 肽片段易於用於鑑定和分離噬菌體展示文庫、組合文庫、多克隆血清等中的抗體。本發明的 多肽片段包含肽或多肽，其胺基酸序列包含本發明HA或NA多肽的胺基酸序列(如SEQ ID NO 11-20, SEQ ID NO :27_32和SEQ ID NOS 39-44)的至少5個毗連胺基酸殘基，或至少 10個毗連胺基酸殘基，或至少15個毗連胺基酸殘基，或至少20個毗連胺基酸殘基，或至少 25個毗連胺基酸殘基，或至少40個毗連胺基酸殘基，或至少50個毗連胺基酸殘基，或至少 60個毗連胺基酸殘基，或至少70個毗連胺基酸殘基，或至少80個毗連胺基酸殘基，或至少 90個毗連胺基酸殘基，或至少100個毗連胺基酸殘基，或至少125個毗連胺基酸殘基，或至 少150個毗連胺基酸殘基，或至少175個毗連胺基酸殘基，或至少200個毗連胺基酸殘基， 或至少250個毗連胺基酸殘基，或至少350個，或至少400個，或至少450個或至少500個， 或至少550個毗連胺基酸殘基。本發明的實施方式中優選編碼特異性與所述多肽結合的所 述多肽片段和抗體的多核苷酸。對任何多肽序列或亞序列，如SEQ ID N0:11至SEQ ID NO 20、SEQ IDNO 27至 SEQ ID N0:32和/或SEQ ID N0:39至SEQ ID NO :44，和/或本發明多核苷酸序列，如SEQ ID NO :1 至 SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 21 至 SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 33 至 SEQ ID NO 38和SEQ ID NO :45編碼的多肽序列或亞序列特異的抗體同樣具有作為評價細胞或組織中 表達產物的探針的價值。此外，抗體尤其適用於在組織陣列，細胞、組織或生物體中，如被未 知流感病毒或類似感染的生物體中，原位評價含有胺基酸亞序列的蛋白質(如本文給出的 那些)或由本發明多核苷酸序列(如選自本文所示的那些)編碼的蛋白質的表達。可用檢 測試劑直接標記抗體，或用特定抗體的重鏈恆定區(即同種型)特異性第二抗體進行標記 以便間接檢測。下文提供了關於產生特異性抗體的另外的細節。診斷實驗可在診斷實驗中使用本發明的核酸序列檢測樣品中的流感病毒(和/或血凝素和 /或神經氨酸酶)、檢測血凝素樣和/或神經氨酸酶樣序列、利用如選自本文序列的化學合 成或重組的多核苷酸片段檢測流感臨床分離物中病毒株差異。例如，可將含有至少10-20 個核苷酸的血凝素和/或神經氨酸酶序列片段用作引物以使用本領域熟知聚合酶鏈反應 (PCR)(如逆轉錄PCR)方法擴增核酸，或者用作核酸雜交實驗中的探針以檢測臨床標本中 的靶遺傳物質，如流感RNA。本發明的探針，如本文給定的那些獨特亞序列，根據本領域常規步驟也能用於鑑 定其它有用的多核苷酸序列(如鑑定其它流感株)。在一套優選實施方式中，使用如上所述的一個或多個探針篩選表達產物文庫和克隆病毒核酸文庫(即，表達文庫或基因組文庫) 以鑑定包含與本文序列相同或具有顯著相同性的序列的克隆。然後這些鑑定的序列各自可 用於製造探針，包括如上所述的成對或成套的變體探針。應被理解的是除了如文庫篩選的 物理方法外，計算機輔助的生物信息學手段，如BLAST和其它序列同源性搜索算法等，也能 用於鑑定相關多核苷酸序列。本發明的探針在用於檢測細胞、組織或其它生物樣品(如鼻腔洗液或支氣管灌洗 液)中流感病毒的存在或測定其相同性中尤其有用。例如，本發明的探針有助於測定生物 樣品，如個體(如人個體)或模型系統(如培養細胞樣品)是否暴露於或已經被流感或特 定流感株感染。檢測所選探針與源於(或分離自)生物樣品或模型系統的核酸的雜交情況 可指示是否暴露於或受到探針多核苷酸選自的病毒(或相關病毒)的感染。應當被理解的是探針設計受到目的應用的影響。例如，在單一實驗，如單一 DNA芯 片中，檢測數個等位基因特異性探針靶點相互作用時，需要所有的探針具有相近的解鏈溫 度。因此，調整探針的長度使陣列上所有探針的解鏈溫度接近相同(應當被理解的是當不 同探針的GC含量不同時，需要使不同探針長度不同以達到特定的Tm)。儘管解鏈溫度是探 針設計中首先考慮的因素，但可任選使用其它因素進一步調整探針構建，如選擇抗引物自 身互補等。載體，啟動子和表達系統本發明包括整合本文一個或多個核酸序列的重組構建物。此類構建物任選包括載 體，例如質粒、粘粒、噬菌體、病毒、細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)等，其中 正向或反向插入本發明一個或多個多核苷酸序列，如包含SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :10、 SEQ ID NO 21 至 SEQ ID NO :26、SEQID NO 33 至 SEQ ID NO :38、SEQ ID NO 45 中任何一 個或其亞序列等的多核苷酸序列。例如，插入的核酸能包含含有至少一個本發明多核苷酸 序列的全部或一部分的病毒染色體序列或cDNA。在一個實施方式中，構建物還包括與序列 操作性連接的調節序列，包括例如啟動子。本領域技術人員知道大量合適的載體和啟動子， 並可商業購得。本發明的多核苷酸可包含於數種適合產生正義或反義RNA，以及任選地產生多肽 (或肽)表達產物(如，本發明血凝素和/或神經氨酸酶分子或其片段)的載體中。此類 載體包括染色體、非染色體和合成DNA序列，如SV40衍生物；細菌質粒；噬菌體DNA ；杆狀病 毒；酵母質粒；衍生自質粒和噬菌體DNA的組合，病毒DNA如牛痘、腺病毒、禽痘病毒、狂犬 病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉錄病毒等(如pCDL)。可使用任何能夠將遺傳物質引入細胞 並且能夠在相關宿主中複製(如果需要的話)的載體。在表達載體中，感興趣的HA和/或NA多核苷酸序列物理排布接近並朝向合適的 轉錄控制序列(如啟動子，任選地，一個或多個增強子)以指導mRNA合成。也就是說，感興 趣的多核苷酸序列可操作性連接於合適的轉錄控制序列。此類啟動子的例子包括LTR或 SV40啟動子、大腸桿菌Iac或trp啟動子、噬菌體λ Pl啟動子及其它知道可控制原核或真 核細胞或其它病毒中基因表達的啟動子。數種啟動子可用於表達載體中，以調節流感病毒基因組區段轉錄。在某些實施方 式中，使用巨細胞病毒(CMV) DNA依賴性RNA聚合酶II (Pol II)啟動子。如果需要如條件控 制表達，可替換使用其它可在特定條件下、或特定組織和細胞中，誘導DNA轉錄的啟動子。可用數種病毒和哺乳動物，如人的啟動子，或者根據預期特定應用分離。例如，獲自動物和 人病毒基因組的候選啟動子包括此類啟動子，如腺病毒(如腺病毒2)、乳頭瘤病毒、B肝病 毒、多瘤病毒以及猿病毒40 (SV40)和不同逆轉錄病毒的啟動子。哺乳動物啟動子包括肌動 蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、熱休克啟動子等。任選地，可通過包含增強子序列增強轉錄。增強子通常較短，如，10-500bp,它是 與啟動子配合作用以增加轉錄的順式作用DNA原件。從哺乳動物基因(血紅蛋白、彈性蛋 白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰島素)和真核細胞病毒中分離了許多增強子序列。可將增強 子序列剪接到載體中異源編碼序列的5'或3'位置，但通常插入啟動子的5'位點。通 常，選擇啟動子和其它轉錄增強序列(若需要)以優化異源DNA在引入宿主細胞中的表達 (Scharf■等(1994)熱應力啟動子禾口轉錄因子(Heat stress prompter and transcription factors)Results Probl CellDiffer 20 :125-62 ;Kriegler 等(1990)組裝增強子、啟動 子和剪接信號以控制轉移基因的表達(Assembly of enhancers, promoter, and splice signals to controlexpression of transferred Rene)Methods in Enzymol 185 512-27)。任選地，為了啟動轉錄，擴增子也可包含核糖體結合位點或內部核糖體進入位點 (IRES)。本發明的載體也包含終止轉錄和穩定mRNA所需的序列，如聚腺苷酸化位點或終 止序列。此類序列一般位於真核或病毒DNA或cDNA非翻譯區的5'末端，偶爾位於3'末 端。在一個實施方式中，SV40聚腺苷酸化信號序列能提供雙向聚腺苷酸化位點，它從啟動 (-)鏈病毒基因組複製的Poll啟動子隔離了(+)鏈mRNA分子的轉錄。此外，如上所述，表達載體任選包含一個或多個選擇性標記物基因以提供用於篩 選轉化宿主細胞的表型特徵，除了以前列出的基因，諸如二氫葉酸還原酶或新黴素抗性等 標記物可用於真核細胞培養物的選擇。含有如上所述的合適核酸序列以及合適的啟動子或控制序列的載體，可用於轉化 允許蛋白表達的宿主細胞。雖然本發明的載體可在細菌細胞中複製，但最經常需要將其引 入哺乳動物細胞，如Vero細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞、COS細胞等用於表達。如其它地方所述，在各種實施方式中，本文HA和NA序列可包含於參與質粒拯救重 配的質粒之中。參見例如，2002年10月23日提交的美國申請號60/420，708 ;2004年5月 24日提交的60/574，117 ；2003年4月25日提交的10/423，828 ；2004年6月12日提交的 60/578，962 ；和2004年6月24日提交的10/870，690以及US20020164770，納入本文作為 參考。例如，本發明優選的表達載體包括但不限於含有pol I啟動子和終止子序列的載 體或使用pol I和polll啟動子「poll/polll啟動子系統」的載體(如，Zobel等，Nucl. Acids Res. 1993，21 3607 ；US20020164770 ；Neumann 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999， 96 9345 ；Fodor 等，J. Virol. 1999，73 9679 ；和 US20030035814)。產生的重配株可包含 HA 和NA基因與排列在一起的來自A/Arm Arbor/6/60供體病毒株(和/或其衍生物及修飾形 式)、PR8供體病毒株主體、A/Leningrad/17供體病毒株主體的6個其它流感基因。其它主 體病毒株在如20040137013和20030147916中有描述，納入本文作為參考。其它表達元件最常見的，編碼流感病毒HA和/或NA蛋白的基因組區段包含其表達、包括翻譯為 功能性病毒蛋白質所必需的任何其它序列。在其它情況下，可使用編碼病毒蛋白如HA和/或NA蛋白的小基因或其它人工構建物。再次，在此類情況下，常常需要包括有助於異源編 碼序列有效翻譯的特定起始信號。這些信號能包括如，ATG起始密碼子和相鄰序列。為了 保證整個插入子的翻譯，將起始密碼子插入到病毒蛋白正確的閱讀框中。外源性轉錄原件 和起始密碼子可為不同來源，天然和合成均可。在所用細胞系統中包含合適的增強子可增 強表達效率。如果需要，可將編碼其它表達原件如信號序列、分泌或定位序列等的多核苷酸序 列摻入載體中，通常與感興趣的多核苷酸序列在同一閱讀框內，以便(例如)使多肽靶向表 達於所需細胞隔室、膜或細胞器中，或指導多肽分泌至周質空間或細胞培養基中。本領域技 術人員了解此類序列，包括分泌前導肽、細胞器靶向序列(如核定位序列、ER駐留信號、線 粒體轉運序列序列)，膜定位/錨定序列(如終止轉運序列、GPI錨定序列)等。當需要翻譯本發明核酸序列編碼多肽時，其它翻譯特異性起始信號可提高翻譯效 率。這些信號能包括，如，ATG起始密碼子和相鄰序列、IRES區等。在一些情況下，例如，含 有摻入本發明多核苷酸序列(如在本文序列中)、翻譯起始密碼子和相關序列元件的編碼 序列的全長cDNA分子或染色體區段與感興趣多核苷酸序列同時插入合適的表達載體。在 這些情況下，通常無需其它翻譯控制信號。然而，當僅插入多肽編碼序列或其部分的情況 下，常常提供外源性翻譯控制信號，包括如ATG起始密碼子用於相關序列的表達。將起始密 碼子置於合適的閱讀框中以保證感興趣多核苷酸序列的轉錄。外源性轉錄原件和起始密碼 子的來源可以不同，天然和合成均可。通過包含對所用細胞體系合適的增強子可增強表達 效率(參見例如，Scharf D.等(1994) Results Probl CellDiffer 20 125-62 ；Bittner 等 (1987)Methods in Enzymol 153:516-544)。生產重組病毒利用重組反向遺傳學手段可遺傳工程改造並回收負鏈RNA病毒(參見例如， Palese等的USPN 5，166，057)。起初此類方法用於工程改造病毒基因組(Luytjes等(1989) Cell 59 1107-1113 ；Enami 等(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA92 :11563_11567)並被成 功應用於各種區段化和非區段化負鏈RNA病毒，如狂犬病病毒(Schnell等(1994)EMBO J. 13 4195-4203) ；VSV (Lawson 等(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4477-4481)；麻 疹病毒(Radecke 等(1995)EMBO J. 14 5773~5784)；牛癌病毒(Baron 和 Barrett (1997) J. Virol. 71 1265-1271)；人副流感病毒(Hoffman 禾Π Baner iee (1997).Τ. Virol. 71 3272-3277 ；Dubin 等(1997)ViroloRY 235:323-332) ；SV5 (He 等(1997)ViroloRY 237 249-260)；犬瘟病毒(Gassen 等(2000) J. Virol. 74 10737-44)；和仙臺(Sendai)病 毒(Park 等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 5537-5541 ；Kato 等(1996)Genes to Cellsl 569-579)。本領域技術人員將熟悉這些製造含本發明HA和NA序列流感病毒的方 法及類似方法。根據此類方法製造的重組流感病毒就像含有本發明的一種或多種核酸和/ 或多肽的重組流感病毒一樣，也是本發明的特點。細胞培養和表達宿主本發明也涉及引入(轉導、轉化和轉染)本發明載體的宿主細胞，和利用重組技 術產生本發明的多肽。利用本發明載體，如表達載體遺傳學工程改造宿主細胞(即轉導、 轉化或轉染)。如上所述，載體可為質粒、病毒顆粒、噬菌體等的形式。合適的表達宿主的 例子包括細菌細胞，如大腸桿菌(E. coli)、鏈黴菌(Str印tomyces)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)；真菌細胞，如酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),巴其Jf 德畢赤酵母(Pichia pastoris)和粗糙鏈孢黴(Neurospora crassa)；或昆蟲細胞如果蠅 (Drosophila)禾口草地I夜娥(Spodopterafrugiperda)。最常見的，使用哺乳動物細胞培養本發明的HA和NA分子。流感病毒複製的合適 宿主細胞包括，如Vero細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞和COS細胞，包括293T細胞、 C0S7細胞或類似細胞。通常，使用一定比例如1 1的兩種上述細胞系的共培養物，如MDCK 細胞和293T或COS細胞，以提高複製效率。通常，在標準商品化培養基中培養細胞，如在添 加血清(如10%胎牛血清)的杜氏改良的易購氏培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium)，或在無血清培養基中，在保持中性緩衝pH(如pH在7. 0-7. 2)的受控溼度和CO2濃 度下培養。任選地，培養基包含阻止細菌生長的抗生素，如青黴素、鏈黴素等，和/或補充營 養物，如L-谷胺醯胺、丙酮酸鈉、非必需胺基酸等，以及利於促進生長特性的其它補充劑， 如胰蛋白酶、β-巰基乙醇等。工程改造的宿主細胞可在根據激活啟動子、選擇轉化子或擴增插入多核苷酸序列 的需要改良的營養培養基中培養。如溫度、PH等培養條件通常為所選用於表達的特定宿 主細胞先前培養所使用的條件，並為本領域熟練技術人員所熟悉並在本文引用的參考文獻 中，包括如，Freshney (1994)《動物細胞培養，基本技術手冊》(Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Techniaue),第3版，紐約韋利-李斯出版社(Wiley-Liss)及其引用 文獻。其它有用的參考文獻包括，如，Paul (1975)《細胞和組織培養》(Cell and Tissue Culture),第5版，愛丁堡利文斯頓出版社；Adams (1980)《生物化學與分子生物學實驗室 技術-生化學家細胞培養》(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular BioloRY-CellCulture for Biochemists), Work 和 Burdon 編，阿姆斯特丹埃斯威爾出版 社。關於體外產生流感病毒尤感興趣的組織培養步驟的其它細節包括，如Merten等(1996) 在細胞培養物中生產流感病毒用於疫苗製備(Production of Influenza virusin cell cultures for vaccine pr印aration) Cohen禾口 Shafferman編《設計禾口生產疫苗的新策略》 (Novel StrateRies in DesiRn and Production of Vaccine),出於所有目的將其整體納 入本文。此外，易於通過常規實驗確定並且本領域技術人員熟知此類步驟適合本發明的改 變。用於生產流感病毒(如具有本發明HA和/或NA序列)的細胞能在含血清或無血 清培養基中培養。在一些情況下，如用於製備純化病毒時，尤其需要細胞在無血清條件下生 長。可小規模培養細胞，如，少於25ml培養基，培養管或瓶中或在大瓶中震蕩培養，在滾瓶 中培養，或在培養瓶、瓶或反應器培養物中的微載體珠上(如，DEAE-右旋糖苷微載體珠，如 灰鶴和朗更公司的多瑪薩爾(Dormacell,Pfeifer and Langen)；弗洛實驗室公司的超級珠 (Superbead, FlowLaboratories)；苯乙烯共聚三甲胺珠，如希爾萊克斯、所咯希爾、安阿伯 (Hillex, SoloHill, Ann Arbor))上培養。微載體珠是為每體積貼壁細胞培養物提供更大 表面積的小球(直徑範圍為100-200微米)。例如一升培養基能包含2千萬個微載體珠， 這些珠提供了超過8000平方釐米的生長表面。商業病毒生產，如為了生產疫苗，經常需要 在生物反應器或發酵罐裡培養細胞。生物反應器容積從1升至超過100升，如，Cyto3生物 反應器(奧斯莫裡卡公司，明尼蘇達州明內通卡市(Osmonics，MirmetonkhMN)) ； NBS生物 反應器(新不倫瑞克科學公司，新澤西州埃迪遜市(New Brunswick Scientific, Edison,NJ))；來自布朗生物技術國際公司(布朗生物技術公司，德國邁爾蘇金(B. Braim Biotech, Melsungen, Germany))的實驗室和商業規模的生物反應器。不考慮培養體積，在本發明的許多所需方面，重要的是保持培養物合適溫度以保 證利用溫度依賴的多質粒系統(參見例如，用於生產流感病毒的多質粒系統，2002年10月 23日提交的美國申請號60/420，708，2003年4月25日提交的美國申請號10/423,828以及 2004年5月24日提交的美國申請號60/574,117)有效回收重組和/或重配流感病毒並加 熱病毒溶液進行過濾等。通常使用調節器，如自動調溫裝置或其它感受並維持細胞培養體 系和/或其它溶液溫度的設備以確保合適時期(如病毒複製等)溫度處於正確水平。在本文的一些實施方式中(如其中從載體區段製造重配病毒)，根據本領域熟知 的將異源核酸引入細胞的方法將含有流感基因組區段的載體引入(如轉染)宿主細胞，這 些包括例如，磷酸鈣共沉澱、電穿孔、顯微注射、脂轉染和使用聚胺轉染試劑的轉染。例如， 可將載體，如質粒轉染入宿主細胞，如COS細胞、293T細胞或COS或293T細胞和MDCK細胞 的混合物，根據製造商指導手冊利用聚胺轉染試劑TransIT-LTl (密如斯公司(Mirus))生 產重配病毒等。因此，在一個實施例中，用160μ 1培養基(優選無血清培養基)稀釋的約 2 μ ITransIT-LTl將每一載體各約1 μ g引入一群宿主細胞中，總體積是200 μ 1。在室溫下 將DNA 轉染試劑混合物孵育45分鐘然後加入800 μ 1培養液。將轉染混合物加入宿主細 胞，通過本領域熟練技術人員所熟知的其它方法培養細胞。因此，為了在細胞培養物中生產 重組或重配病毒，將各自摻入8個基因組區段(如本發明ΡΒ2、PBl、PA、NP、M、NS、HA和NA) 的載體與約20μ1 TransIT-LTl混合併轉染進入宿主細胞。任選地，在轉染前用無血清培 養基如Opti-MEM I替換含血清的培養基，並孵育4-6小時。或者，可使用電穿孔將此類摻入流感基因組區段的載體引入宿主細胞。例如，根據 下述步驟利用電穿孔將摻入甲型流感或乙型流感病毒的質粒載體引入Vero細胞。簡要說， 如生長於含10%胎牛血清(FBS)的改良易購氏培養基(Modified Eagle，s Medium(MEM)) 的約5X IO6Vero細胞重懸於0.4ml OptiMEM中並置於電穿孔杯中。將體積多至25μ1的 20微克DNA加入杯中的細胞，輕拍以溫和混勻。根據廠商指導手冊進行電穿孔(如，連接電 容延長器(CapacitanceExtender Plus)的伯樂基因脈衝儀II)，300伏，950微法拉，恆定 時間28-33毫秒。輕拍細胞混勻並在電穿孔後約1-2分鐘直接在杯中加入含10% FBS的 0. 7mlMEM。將細胞轉移至標準6孔組織培養板的兩個含2ml MEM，10% FBS的孔中。洗滌電 擊杯回收任何剩餘細胞並將洗滌懸液在兩孔間平分。終體積約為3.5mL。然後在允許病毒 生長的條件下，如對於冷適應性病毒株在33°C，孵育細胞。在哺乳動物宿主細胞中，可使用數種表達系統，如基於病毒的系統。當使用腺病毒 作為表達載體時，任意將編碼序列連接到含晚期啟動子和三重前導序列的腺病毒轉錄/翻 譯複合物中。插入病毒基因組非必需El和E3區將得到在感染宿主細胞中能表達感興趣多 肽的活病毒(LoSan 和 Shenk(1984)Proc NatlAcad Sci 81:3655-3659)。此外，可使用轉 錄增強子，如勞氏肉瘤病毒(RSV)增強子增加在哺乳動物宿主細胞中的表達。可任選能調節插入序列的表達或以所需方式加工表達蛋白的宿主細胞株。此類蛋 白修飾包括但不限於乙醯化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化和醯基化。將前體形式切割為 成熟形式的蛋白翻譯後加工對於正確的插入、摺疊和/或功能有時重要。此外，在宿主細胞 中的位置(如在細胞表面)也很重要。不同的宿主細胞，如C0S、CH0、BHK、MDCK、293、293T、C0S7等，對於此類轉錄後活動具有特定的細胞機器和特有機制，可對細胞進行選擇以保證 當前引入外來蛋白的正確修飾和加工。對於本發明多核苷酸或其亞序列編碼的重組蛋白的長期高產率生產而言，任選使 用穩定表達系統。例如，利用含病毒來源的複製或內源性表達原件和選擇性標記物基因的 表達載體轉化穩定表達本發明多肽的細胞系。例如，在引入載體之後，在富集培養基中培養 細胞1-2天後轉移至選擇性培養基中。選擇性標記物的目的是產生選擇抗性，它的存在允 許成功表達引入序列的細胞生長和恢復。因此，如源於單一細胞類型的穩定轉化抗性細胞 團可利用適合細胞類型的合適組織培養技術擴增。可在適合表達和從細胞培養物中回收編碼蛋白的條件下任意培養被編碼本發明 多肽的核苷酸序列轉化的宿主細胞。對表達所述蛋白的細胞進行分選、分離和/或純化。根 據序列(如取決於編碼膜滯留信號或其它的融合蛋白)和/或使用的載體，重組細胞產生 的蛋白或其片段可為分泌的、膜結合的或胞內滯留的。本發明核酸對應的表達產物也能在非動物細胞，如植物、酵母、真菌、細菌等中產 生。除了 Sambrook，Berger和Ausubel (參見下文)以外，關於細胞培養的細節可參見 Payne等(1992)《在液體系統中的棺物細胞和組織培養》(PlantCell and Tissue Culture in Liquid Systems)約翰韋利森出版公司(John Wiley &Sons，Inc.)，紐約；Gamborg 和 Phillips編(1995)《植物細胞、組織和器官培養；施普林格實驗室基本方法手冊》(Plant Cell, Tissue and OrRan Culture -Fundamental Methods Springer Lab Manual),施普林 格弗萊格公司(Springer-Verlag)(紐約柏林海德爾堡)和Atlas和Parks編《微生物培養 基手冊》(The Handbook of Microbiological Media) (1993)CRC 出版社，佛羅裡達州伯克 萊屯(Boca Raton, FL)。在細菌系統中，根據表達產物的用途目的可選擇數種表達載體。例如，當生產抗體 需要大量多肽或其片段時，優先使用指導易於大量表達純化蛋白的載體。此類載體包括但 不限於多功能大腸桿菌克隆和表達載體，如BLUESCRIPT(司查塔基公司(Stratagene))， 其中感興趣的編碼序列，如含有本文那些序列等的編碼序列，可連接入載體並與半乳 糖苷酶的氨基端翻譯起始甲硫氨酸和後續7個殘基的序列在同一讀框內，產生有催化活性 的 β 半乳糖苷酶融合蛋白；ρΙΝ 載體(Van Heeke 和 Schuster (1989) J Biol Chem 264 5503-5509) ；pET載體(威斯康星麥迪遜的諾華基公司(Novagen，Madison WI))等。同樣，在 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可使用數種含有組成型或誘導型啟動子如α 因子、醇氧化酶和PGH的載體產生所需表達產物。參見Ausubel，同上，和Grant等，(1987)； 《酶學方法》(Methods in EnzymoloRy) 153 :516_544 的綜述。核酸雜交可使用比較性雜交鑑定本發明的核酸(如SEQ ID N0:1_10、SEQ ID NO :21_26、 SEQ ID NO =33-38, SEQ ID NO :45)，包括本發明核酸的保守性變異。比較性雜交法是區別 本發明核酸的優選方法。此外，在高、超高和超超高嚴謹性條件下與如本文所示代表的核酸 雜交的靶核酸是本發明的特色。此類核酸的例子包括與給定核酸序列相比包含一個或數個 沉默或保守性核酸取代的核酸。當測試靶核酸與探針雜交程度至少相當於完全配合互補靶點的一半時，稱此測試 靶核酸與探針核酸特異性雜交，即，靶點與探針雜交的信噪比至少為與完全配合互補序列的一半，後者的信噪比至少為觀察到任何不配合靶核酸的雜交信噪比的約5倍-10倍。通常在溶液中，當核酸結合時發生「雜交，，。數種已知明了的物理化學力，如氫鍵、 溶劑斥力、鹼基堆積等引起核酸雜交。核酸雜交的數種實驗方案為本領域所熟知。核酸 雜交的詳盡指南參見Tijssen(1993)《生物化學和分子生物學實驗室技術_核酸探針雜 交〉〉(Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes)第一部分第二章，「雜交原則概述與核酸探針實驗策 略，，(「Overview of principles of hybridization andthe strategy of nucleic acid probe assays，」(埃斯威爾出版社，紐約)，以及下述Ausubel，Sambrook和Berger和 Kimmel。Hames和Higgins (1995)《基因探針1》(Gene Probes 1)牛津大學出版社IRL出 版社，牛津，英格蘭(Hames和Higginsl)以及Hames和Higgins (1995)《基因探針2》(Gene Probes 2)牛津大學出版社IRL出版社，牛津,英格蘭(Hames和Higgins 2)提供了合成、標 記、檢測和定量測定DNA和RNA包括寡核苷酸的詳細內容。在Southern或Northern印跡中濾紙上有多於100個互補殘基的互補核酸雜交的 嚴謹性雜交條件的一個例子是42°C，含Img肝素的50%福馬林雜交過夜。嚴謹性洗滌條 件的例子包含0. 2x SSC在65°C洗滌15分鐘(參見Sambrook下文中SSC緩衝液和其它核 酸雜交參數的描述)。通常在高嚴謹性洗滌之前進行低嚴謹性洗滌以去除探針信號背景。 低嚴謹性洗滌的例子是2x SSC在40°C洗滌15分鐘。通常，在特定雜交實驗中觀察到信噪 比比無關探針信噪比高5倍(甚至更高)表明檢測到了特異性雜交。雜交以後，通過一系列的洗滌去除未雜交核酸，其嚴謹性根據需要結果可進行調 整。低嚴謹性條件(如使用高鹽和低溫)增加靈敏度，但會造成非特異性雜交信號和高背景 信號。高嚴謹性條件(如使用低鹽和接近Tm的高溫)降低背景信號，通常主要是留下特異性 信號。參見Rapley，R.和Walker，J. Μ.編，《分子生物學方法手冊》(Molecular Biomethods Handbook) (Humana 出版公司，1998)。核酸雜交實驗如Southern和northern雜交上下文中的「嚴謹雜交洗滌條件」取 決於序列，並在不同的環境參數下「嚴謹雜交洗滌條件」也不同。核酸雜交的詳盡指南參見 Tijssen(1993)，同上以及Hames和Higgins，1和2。對於任何測試核酸的嚴謹雜交和洗滌 條件可憑經驗測定。例如，在確定高嚴謹雜交和洗滌條件時，逐漸增加雜交和洗滌條件(如 通過增加雜交或洗滌中的溫度、降低鹽濃度、增加去汙劑濃度和/或增加有機溶劑，如福爾 馬林的濃度)直至滿足選擇的一套標準。例如，逐漸增加雜交和洗滌的條件直至探針與互 補靶點完美配合，其信噪比是觀察到的探針與不配合靶點雜交信噪比的5倍。通常，在特定雜交實驗中，信噪比是觀察到無關探針的至少2倍(或更高，如，至少 5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更高)表明檢測到特異性雜交。本發明的上下文中檢測到 兩個序列至少發生嚴謹雜交表明與本文序列表提供了本發明的核酸具有相對強的結構相 似性。所選擇的「非常嚴謹」條件等於特定探針的熱解鏈點(Tm)。Tm是50%測試序列與 完美配合探針雜交時的溫度(在確定離子強度和PH的條件下)。出於本發明的目的，在確 定離子強度和PH的條件下，通常選擇低於特定序列Tm5°C的「高度嚴謹的」雜交和洗滌條件 (如下文註明，高嚴謹度條件也是相等同的術語)。可在嚴謹或高度嚴謹條件下鑑別與感興 趣核苷酸序列相接近或相同的靶序列(如「探針」)。低嚴謹性條件適合互補性較差的序列。
「超高嚴謹性」雜交和洗滌條件是提高雜交和洗滌條件的嚴謹性直至探針與互補 靶點完美配合，其信噪比是觀察到的探針與不配合靶點雜交信噪比的至少10倍。在此條件 下與探針雜交的信噪比相當於完美配合互補靶核酸一半的靶核酸被稱作在超高嚴謹條件 下與探針結合。在測定嚴謹或高度嚴謹的雜交(或甚至更嚴謹的雜交)和洗滌條件時，逐漸增加 雜交和洗滌條件(如，通過增加雜交或洗滌中的溫度、降低鹽濃度、增加去汙劑濃度和/或 增加有機溶劑如甲醯胺的濃度)，直至滿足所選一套標準。例如，逐漸增加雜交和洗滌條件， 直至含有本發明一個或多個多核苷酸序列，如選自本文給定的序列或獨特亞序列(如SEQ ID NO :1-10、21-26、33-38、SEQID NO 45)的探針和/或互補多核苷酸序列，與完美配合互 補靶點(再次，含有本發明一個或多個選自本文給定的序列或亞序列和/或其互補多核苷 酸序列的核酸)結合，根據需要，信噪比至少為觀察到的非配合靶點(如含有一個或多個選 自提交時公共資料庫(如Genbank)中的已知流感序列的序列或亞序列的多核苷酸序列，和 /或其互補多核苷酸序列)雜交的2倍(任選5倍、10倍或100倍或更多倍)。利用本發明的多核苷酸或其亞序列，可獲取新穎靶核酸；此類靶核酸也是本發明 的特點。例如，此類靶核酸包含在嚴謹條件下與對應本發明多核苷酸SEQ ID N0:l-10、 21-26、33-38、45的獨特寡核苷酸探針雜交的序列)。同樣，通過逐漸增加相關雜交實驗的雜交和/或洗滌條件可確定甚至更高水平的 嚴謹性。例如，增加雜交和洗滌的嚴謹性直至與探針與完美配合互補靶核酸結合的信噪比 至少為任何非配合靶核酸雜交的10倍、20倍、50倍、100倍或500倍甚至更高。特定信號取 決於相關實驗中使用的標記，如螢光標記、比色標記、放射性標記等。在此條件下與探針雜 交的信噪比相當於完美配合互補靶核酸一半的靶核酸被稱作在超超高嚴謹條件下與探針 結合，並且也是本發明的特點。如果核酸編碼的多肽基本相同，那麼在嚴謹條件下彼此不雜交的核酸仍有可能基 本相同，例如當使用遺傳密碼允許的最大密碼子簡併性創建核酸拷貝時。感興趣生物分子的克隆、誘變和表達描述應用於本發明的分子生物學方法技術如克隆、突變、細胞培養等的文本包 括Berger和Kimmel，《分子克隆技術指南，酶學方法》(Guide to MolecularCloninR Techniques,Methods in Enzymology)第152卷科學出版社公司，加州聖地牙哥(Berger)； Sambrook 等，《分子克隆 _ 實驗室手冊》(MolecularCloninR-A Laboratory Manual)(第三 版)，第1-3卷，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約2000 ( "Sambrook")和《新編分子生物學實驗 方案》(Current Protocols inMolecular BioIory) ,F. Μ. Ausubel 等編，格林出版聯合公司 (Greene PublishingAssociates，Inc)和約翰韋利森出版公司(John Wiley & Sons，Inc.) 合資的最新實驗方案公司(從2002年補充)(「Ausubel」))。這些文本描述了誘變、使用 載體、啟動子和其它關於如HA和/或NA分子等產生的相關話題。本發明任選使用不同類型的誘變，如生產和/或分離本發明新穎的或新分離的HA 和/或NA分子和/或進一步修飾/誘變多肽(如，HA和NA分子，如SEQID NO 11-20或 27-32或39-44)。它們包括但不限於定點誘變、隨機點突變、同源重組(DNA重排)、利用含 尿嘧啶的模板進行誘變、寡核苷酸定向誘變、硫代磷酸酯修飾的DNA誘變、利用缺口雙鏈體 DNA誘變等。其它合適的方法包括點錯配修復、利用修復缺陷宿主株進行誘變、限制性選擇和限制性純化、缺失誘變、全基因合成誘變、雙鏈打斷修復等。本發明也包括誘變，如涉及嵌 合構建物的誘變。在一個實施方式中，可由天然產生分子或改變或誘變的天然產生分子的 信息，如序列、序列對比、物理性質、晶體結構等指導誘變。 上述文本和例子以及下列公開物(及其引用文獻)都描述了這些步驟 Sieber,等，Nature Biotechnology, 19 456~460 (2001) :Ling 等，DNA 誘變方法 概 覽(Approaches to DNA Mutagenesis :an overview), Anal Biochem 254(2) 157-178 (1997) ；Dale等，利用硫代磷酸酯方法進行寡核苷酸定向隨機誘變 (OligonucIeotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method), Methods Mol Biol 57 :369_374 (1996) ；I.A. Lorimer, I.Pastan, NucleicAcids Res 23,3067-8(1995) :ff.P.C. Stemmer, Nature 370,389-91(1994) ；Arnold,非常態 環境下的蛋白質工禾呈(Protein engineering for unusual environments), Current Opinion in Biotechnology 4 :450_455 (1993) ；Bass 等，具有新 DNA 結合特異性的 突變 Trp 阻抑物(Mutant Trp repressors with newDNA-binding specificities), Science 242 =240-245(1988) ；Fritz等，突變的寡核苷酸定向構建不進行體外酶反 應的缺口 雙鏈體 DNA 方法(Oligonucleotide-directed construction of mutation a gapped duplex DNAprocedure without enzymatic reactions in vitro), Nucl Acids Res 16 :6987_6999 (1988) ；Kramer等，在缺口雙鏈體DNA方法中用於寡核苷 酸定向構建突變的改良的醇促體夕卜反應(Improved enzymatic in vitro reactions in thegapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutation)， Nucl Acids Res 16 :7207 (1988) ;Sakamar 禾口 Khorana，牛杆體夕卜 節鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(轉導蛋白)的α亞基的基因的總合成和表達(Total synthesis andexpression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guaninenucleotide-binding protein (transducin)), Nucl Acids Res 14 6361-6372(1988) ；Sayers等，基於硫代磷酸酯的寡核苷酸定向誘變中的Y_T核酸外 切 醇(Y-TExonucleases in phosphorothioate-based oligonulcleotide-directed mutagenesis), Nucl Acids Res 16:791-802(1988) ；Sayers 等，溴乙錠存在下通過限 制性核酸外切酶的反應對含硫代磷酸酯的DNA進行鏈特異性切割(Strand specific cleavageof phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases inthe presence of ethidium bromide)， (1988)Nucl Acids Res 16 803-814 ；Carter，改進的利用M13載體的寡核苷酸定向誘變(Improved oligon ucleotide-directedmutagenesis using M13 vector), Methods in Enzymol 154 382-403(1987) ；Kramer和Fritz通過缺口雙鏈體DNA進行突變的寡核苷酸定向構建 (Oligonucleotide-directed construction of mutation via gapped duplex DNA)， Methods in Enzymol 154 :350_367 (1987) ；Kunke 1,《核酸和分子生物學》(Nucleic Acids and Molecular Biology)中的《寡核苷酸定向誘變的效率》(Theefficiency of oligonucleotide directed mutagenesis) (Eckstein，F.禾口 Lilley，D.M.J·編，施普林 格弗萊格公司，柏林)(1987) ；Kimkel等，不進行表型選擇的快速有效的定點誘變(Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypicseIection), Methods in Enzymol 154，367-382 (1987) ；Zoller和Smith，寡核苷酸定向誘變利用兩種寡核苷酸引物和一種單鏈DNA模板的簡單方法(Oligonucleotide-directed mutagenesis a simple method using two oligonucleotideprimers and a single-stranded DNA template), Methods in Enzymol 154 329~350 (1987) ；Carter,(Site-directed
mutagenesis), Biochem .1237 :1_7(1986) ；Eghtedarzadeh 禾口 Henikoff,使用寡核苷 酸產生大缺失(Use ofoligonucleotides to generate large deletions), Nucl Acids Res 14:5115(1986) ；Mandecki，大腸桿菌質粒中寡核苷酸定向的雙鏈斷裂修 復定『點誘變方法(olionucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichiacoli :a method for site-specific mutagenesis), Proc Natl Acad Sci USA,83 :7177_7181 (1986) ；Nakamaye 和 Eckstein，通過硫代磷酸酯 基團抑制核酸內切酶NciI切割和它在寡核苷酸定向誘變中的應用(Inhibition of endonucIeaseNciI cleavage by phosphorothioate, groups and its application tooligonucleotide-directed mutagenesis)， Nucl Acids Res 14:9679-9698(1986)； Wells等，氫鍵形成在穩定枯草桿菌蛋白酶的過渡態中的重要性(Importence ofHydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin)， PhilTrans R Soc Lond A 317 :415_423 (1986) ；Botstein 和 Shortle，體外誘變的方 案禾口應用(Strategies and applications of in vitro mutagenesis)，Science229 1193-1201 (1985) ；Carter等，改進的利用M13載體的寡核苷酸定向誘變(Improved oligonucleotide site-specific mutagenesis using M13 Vector), NuclAcids Res 13 =4431-4443(1985) ； Grundstrijm等，通過小規模『鳥槍，基因合成進行寡核苷酸定向 誘變(oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 』 shot-gun 『 gene synthesis), Nucl Acids Res 13:3305-3316(1985) ；Kunkel，不進行表型選擇的快速有 效的定點誘變(Rapid and efficient site-specific mutagenesiswithout phenotypic selection)，Proc Natl Acad Sci USA 82:488-492(1985) ；Smith，體外誘變(In vitro mutagenesis), Ann Rev Genet 19:423-462(1985) ；Taylor 等，在限制性酶反應中使用 硫代磷酸酯修飾的 DNA 製備帶切口的 DNA(The useof phosphorothioat-modified DNA in restriction enzyme reactions to preparenicked DNA), Nucl Acids Res 13 8749-8764(1985) ；Taylor等，利用硫代磷酸酯修飾的DNA高頻快速產生寡核苷酸定向突 變(The rapid generation ofoligonucleotide-directed mutaiton at high frequency usingphosphorothioate-modified DNA)，Nucl Acids Resl3 8765~8787(1985) ；Wells 等，盒誘變在確定位點產生多個突變的有效方法(Cassette mutagenesis inefficient method for generation of multiple mutation at defined sites), Gene34 315-323(1985) ；Kramer等，進行寡核苷酸定向突變構建的缺口雙鏈體DNA方法(The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutationconstruction), Nucl Acids Res 12:9441-9456(1984) ；Kramer 等，點錯配修復(Point Mismatch Repair), Cell 38 =879-887 (1984) ；Nambiar等，核糖核酸酶S蛋白編碼基因的總合成和克隆 (Total synthesis and cloning of a gene coding for theribonuclease S protein)， Science 223 1299-1301 (1984) ；Zoller 禾Π Smith，考慮到 M13 載體中的 DNA 片段的寡 核苷酸定向誘變(oligonucleotide-directedmutagenesis of DNA fragment cloned into M13 vector)，Methods in Enzymol 100 468-500 (1983)以及 Zoller 和 Smith，禾Ij用M13衍生載體進行寡核苷酸定向誘變在任何DNA片段中產生點突變的有效的普通方 法(oligonucleotide-directed mutagenesis using M13_derived vector :an efficient andgeneral procedure for the production of point mutation in any DNA fragment)， Nucl Acids Res 10 :6487-6500 (1982)。上述方法的其它細節可在《酶學方法》(Methods in Enzvmol)第154卷中找到，其中也描述了有關不同誘變、基因分離、表達和其它方法的有用 問題解決控制方法。用於如本發明誘變如將本發明HA和/或NA分子文庫進行突變或更改的寡核苷酸 通常根據 Beaucage 和 Caruthers, Tetrahedron Letts 22(20) :1859_1862，(1981)所述固 相亞磷醯胺三酯方法化學合成，如利用自動合成儀，如Needham-VanDevanter等，Nucleic Acids Res, 12 :6159_6168 (1984)所述。此外，基本上任何核酸均可通過數種商業來源定製或標準訂購，如中部認證試劑 公司(The Midland Certified Reagent Company) (mcrcOoligos. com)、大美國基因公司 (The Great American Gene Company) (www. genco. com)、快速基因公司(ExpressGen Inc.) (www. expressgen. com)、歐普龍技術公司(OperonTechnologies Inc.)(力口州阿拉米達 (Alameda,CA))及其它來源。同樣，也可從任何數種資源定製肽和抗體，如(派普肽金尼克 公司)(P印tidoGenic) (pkimiccnet. com)、HTI 生物產品公司(HTI Bio-products, Inc.) (www. htibio. com)、BMA生物醫學有限公司(BMA Biomedicals Ltd.)(英國)、生物合成公 司(Bio. Synthesis, Inc.)及其它。本發明也涉及含有本發明HA和/或NA分子或其它多肽和/或核酸，如SEQID NO: 1-45的宿主細胞和生物體。利用本發明載體遺傳工程改造宿主細胞(如轉化、轉導或轉 染)，本發明載體可以是(例如)克隆載體或表達載體。載體可為，例如，質粒、細菌、病毒、裸 露多核苷酸或偶聯多核苷酸的形式。通過以下標準方法將載體引入細胞或微生物電穿孔 (參見，From等，Proc Natl Acad SciUSA 82，5824(1985)、病毒載體感染、小珠或顆粒基質 內部或表面具有核酸的顆粒高速彈道穿透(Klein等，Nature 327，70-73 (1987))。Berger， Sambrook和Ausubel提供了數種合適的轉化方法。參見上文。本發明可利用數種已知在細菌細胞中引入靶核酸的方法，它們均可用於本發明。 這些方法包括將受體細胞和含DNA的細菌原生質體融合、電穿孔、微粒轟擊、用病毒載體 感染等。可使用細菌細胞擴增含本發明DNA構建物質粒的數目。細菌生長至對數期，可利用 本領域已知數種方法分離細菌中的質粒(參見例如Sambrook)。此外，用市售的各種試劑盒 純化細菌質粒(參見例如，來自法瑪西亞生物技術公司的EasyPr印 ，FlexiPrep ；來自絲 材特基因公司的StrataClean ；以及凱傑公司的QIApMp )。進一步操作分離並純化的質 粒產生其它質粒，用於轉染細胞或摻入相關載體以感染生物體。典型的載體包含轉錄、翻譯 終止子和轉錄、翻譯起始序列，以及用於調節特定靶核酸表達的啟動子。載體任選包含普通 表達盒，表達盒含有至少一個獨立終止序列，允許表達盒在真核、原核或兩者中(如穿梭載 體)複製的序列以及原核和真核系統的選擇性標記。載體可在原核、真核或任選兩者中復 制和整合。參見，Gi 1 iman和 Smith，Gene8 81(1979) ^Roberts，等，Nature，328 731 (1987)； Schneider, B.等，Protein Expr Purif 6435 10 (1995) ；Ausubel, Sambrook, Berger (所 有同上)。用於克隆的細菌和噬菌體目錄由ATCC提供，如，《ATCC細菌和噬菌體目錄》OM ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage) (1992) Gherna 等(編)ATCC 發並亍。其它測序、克隆及分子生物學其它方面基礎步驟以及其理論探討可參見Watson等(1992)1 組 DNA(Recombinant DNA)第二版(科學美國人圖書公司)(Scientific American Books), 紐約。如上所述。在上文有關流感病毒疫苗生產的章節及其引用文獻中闡述了用於本文序 列的其它載體。多肽生產和回收在轉導合適的宿主細胞系或細胞株並使其生長至合適細胞密度後，利用合適方法 誘導所選啟動子(如，改變溫度或化學誘導)，將細胞再培養一段時間。在一些實施方式中， 可從培養基中回收分泌的多肽產物，如分泌融合蛋白形式中的HA和/或NA多肽。在其它 實施方式中，細胞產生含本發明HA和/或NA多肽的病毒顆粒。或者，可離心收集細胞，通 過物理或化學方法破碎細胞並保留所得粗提物進一步純化。可使用任何方便方法破碎表達 蛋白所使用的真核或微生物細胞，包括反覆凍融、超聲、機械破碎或使用細胞裂解試劑或其 它方法，本領域熟練技術人熟知這些方法。此外，可使用表達本發明HA和/或NA多肽產物 的細胞而不將多肽從細胞中分離。在此種情況下，本發明多肽可任選表達於細胞表面並因 此可用細胞表面結合抗體等檢測(如通過具有HA和/或NA分子或其片段的融合蛋白等形 式)。此類細胞也是本發明的特點。可通過本領域熟知的任何方法從重組細胞培養物中回收並純化表達的多肽，包括 硫酸銨或或乙醇沉澱、酸抽提、陰離子或陽離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水相互作用 色譜、親和色譜(如使用本領域熟練技術人員指導的任何標籤系統)、羥基磷灰石色譜和凝 集素色譜。根據需要可在完成成熟蛋白構型的過程中使用蛋白質重摺疊步驟。也可以在 最終純化步驟中使用高效液相色譜(HPLC)。除了本文註明的參考文獻外，本領域熟知數種 純化方法，包括如下文獻列出的那些Sandana(1997)《蛋白的生物分離》(Bioseparation of proteins),科學出版公司(Academic Press, Inc.)和 Bollag 等(1996)《蛋白方 法(第二版)》(Protein Methods, 2nd Edition)韋利李斯公司，紐約(Wiley-Liss，NY)； Walker (1996)《蛋白實驗手冊》(The Protein Protocols Handbook) Humana 出版公司，紐約， Harris 和 Angal (1990)《蛋白純化應用方法實踐》(Protein purification application A practical approach)牛津 IRL 出版公司，牛津，英格蘭(Press at Oxford, Oxford, England) ；Harris 和 Angal《蛋白純化方法方法實踐》(Protein PurificationMethods A Practical Approach)牛津 IRL 出版公司，牛津，英格蘭(Press atOxford, Oxford, England) ；Scopes (1993)《蛋白純化原理和實踐(第三版)》(Protein Purification Principles and Practice 3- Edition 施普林格佛萊格公司，紐約(Springer Verlag, NY) Janson和Ryden (1998)《蛋白純化原理、高解析度方法及其應用(第二版)》(Protein Purification :Principles,High ResolutionMethods and Applications,韋利-VCH公司， 紐約(Wiley-VCH，NY)；和Walker (1998)CD-ROM上的蛋白實驗方法(Protein Protocols on ⑶-ROM)休曼出版公司(Humana Press)，紐約。在病毒中生產本發明表達多肽時，病毒通常從感染(轉染)細胞生長的培養基中 回收。通常，在濃縮流感病毒前澄清粗培養基。一般的方法包括超濾、硫酸鋇吸附和洗脫以 及離心。例如，來自感染培養物的粗培養基首先離心澄清，如1000-2000xg離心足夠長的 時間以去除細胞碎片和其它大顆粒物質，如離心10-30分鐘。任選的，離心澄清培養基上 清使流感病毒成團，如15，OOOxg離心約3-5小時。接下來將病毒團塊重懸於合適的緩衝液，如 STE(0. OlMTris-HCl ；0. 15M NaCl ；0. 0001M EDTA)或磷酸緩衝鹽水(PBS)pH 7. 4 中， 在蔗糖(60% -12% )或酒石酸鉀(50% -10% )中密度梯度離心病毒。連續梯度或步進 梯度均可，如12% -60%的4個12%步長的蔗糖梯度。以一定速度和時間進行梯度離心， 所用時間足以使病毒濃縮於可見條帶中用於回收。或者，對於多數大規模商用，用分帶離 心轉頭以連續模式從密度梯度中淘選病毒。其它在組織培養物中製備流感病毒的足以指 導技術人員的細節參見Nicholson等(編)《流感教科書》(Textbook of Influenza)第 324-332 頁的 Furminger.《疫苗生產》(VaccineProduction) ；Cohen 禾口 Shafferman (編) 《設計和生產疫苗的新策略》(NovelStrategies in Design and Production of Vaccine) 第141-151頁Merten等(1996)《從細胞培養物中制生產用於製備疫苗的流感病毒》 (Production of influenza virusincellcultures for vaccine preparation)，以及美國 專利號5，690，937。需要的話可將回收病毒在作為穩定劑的蔗糖磷酸穀氨酸(SPG)存在下 存儲於-80°C。或者，可使用無細胞轉錄/翻譯系統產生包含本文給定序列如SEQ IDNOS 11-20 或27-32或39-44的胺基酸序列或亞序列，或由本發明多核苷酸序列如SEQ ID NOS 1-10 或21-26或33-38或45編碼的胺基酸序列或亞序列的多肽。可購得數種合適的體外轉錄 和翻譯系統。體外轉錄和翻譯實驗方案的通用指南參見Tymms (1995)《體外轉錄和翻譯實 驗方案分子生物學方法》(In vitroTranscription and Translation Protocols :Methods in Molecular Biology 第 37 卷，加蘭出版公司，紐約(Garland Publishing，NY)。此外，多肽或其亞序列，如含抗原性肽的亞序列，可通過手工或自動化系統合成， 如利用固相技術直接進行肽合成(參見，Stewart等(1969)《固相肽合成》(Solide-Phase Peptide Synthesis)，WH佛理茫公司，舊金山(WH FreemanCo, San Francisco) ；Merrifield .T(1963).T Am Chem Soc 85 =2149-2154)。示例性的自動化系統包括應用生物系統(Applied Biosystems)431A肽合成儀(珀金愛爾默公司，加州福斯特城(Perkin Elmer, Foster City, CA)。根據需要可以分別合成亞序列，並用化學方法組合提供全長多肽。修飾胺基酸本發明表達多肽能含一個或多個修飾胺基酸。修飾胺基酸存在的優勢在於，例如， (a)增加多肽血清半衰期，(b)降低/增加多肽抗原性，(c)增加多肽存儲穩定性等。例如， 在重組生產的翻譯時或翻譯後(如，在哺乳動物細胞表達時N-X-S/T基序的N連接糖基化) 或通過合成手段(如，通過PEG化)進行胺基酸修飾。修飾的胺基酸的非限制性例子包括糖基化的胺基酸、硫酸化胺基酸、異戊烯基化 (如法尼基化、櫳牛兒基櫳牛兒基化)胺基酸、乙醯化胺基酸、醯基化胺基酸、PEG化胺基酸、 生物素化胺基酸、羧化胺基酸、磷酸化胺基酸等，以及與脂部分或其它有機衍生物質偶聯的 修飾胺基酸。文獻中遍布足以指導技術人員進行胺基酸修飾的參考內容。示例性的實驗方 案參見Walker (1998)《CD-ROM上的蛋白實驗方案》(Protein Protocols on CD-ROM)休曼 出版社iHuman Pressi，新澤西州託瓦它(Towata，NJ)。融合蛋白本發明也提供融合蛋白，該融合蛋白含有本發明序列(如SEQ ID NO 11-20, 27-32和39-44示例的編碼HA和/或NA多肽的序列)或其具有如免疫球蛋白(或其部 分)、GFP(綠色螢光蛋白)編碼序列或其它類似標記物的片段。編碼此類融合蛋白的核苷酸序列是本發明另一方面。本發明的融合蛋白任選用於，如，與本發明非融合蛋白類似的應 用(包括，如，治療、預防、診斷、實驗等本文所述的應用)。除了與免疫球蛋白序列和標記序 列融合，本發明蛋白也可任選與用於分選融合蛋白和/或使融合蛋白靶向特定細胞類型、 區域等的序列融合。抗體本發明的多肽能用於生產本文給定多肽和/或本發明多核苷酸(如本文所示的那 些及其保守性變體)編碼多肽的特異性抗體。上述提及多肽的特異性抗體可用於如診斷和 治療目的，如關於靶多肽的活性、分布和表達。可通過本領域熟知方法產生本發明多肽的特異性抗體。此類抗體能包括但不限 於多克隆、單克隆、嵌合、人源化、單鏈、Fab片段和Fab表達文庫產生的片段。抗體生產所用多肽無需生物學活性(如，無需全長功能性血凝素或神經氨酸酶)。 然而，多肽或寡肽必須具有抗原性。用於誘導特異性抗體的肽通常具有至少4個胺基酸的 序列，常常至少5個或10個胺基酸。多肽的短臂可與另一蛋白，如鑰孔血藍素及抗嵌合分 子的抗體融合。本領域技術人員了解數種製造多克隆和單克隆抗體的方法，這些方法適合生產本 發明多肽和/或本發明多核苷酸序列編碼多肽的特異性抗體。參見例如，Coligan(1991) 《新編免疫學實驗方案》(Current Protocols in Immunology)紐約韋利/格林公司(Wiley/ Greene, NY) ；Paul (編)(1998)《基礎免疫學第四版》(Fundamental Immunology, Fourth Edition), Lippincott-Raven, Lippincottffilliams 禾口 Wilkins ；Harlow 禾口 Lane(1989) 《抗體實驗室手冊》(Antibody :A Laboratory Manual)，紐約冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press, NY) ；Stites等(編)《基礎和臨床免疫學(第四版)》(Basic and Clinical ImmunoloRY (4th ed.))，蘭格醫學出版公司，加州洛斯阿爾託斯(Lange Medical Publications, Los Altos, CA)及其引用文獻；Goding(1986)《單克隆抗體原理和實踐 (M —Afe ))) (Monoclonal antibody principles and Practice (2d ed·))禾鬥學出版社， 紐約(Academic Press, New York, NY) ；Kohler 禾口 Milstein (1975)Nature 256:495—497。 其它合適的抗體製備技術包括在噬菌體或類似載體中選擇重組抗體文庫。參見，Huse等 (1989) Science 246 1275-1281 ；和 Ward 等(1989) Nature 341 544-546 特異性單克隆和 多克隆抗體和抗血清結合的KD，如至少約0. 1 μ M，至少約0. 01 μ M或更好，並且，通常至少 約0. 001 μ M或更好。對於某種治療性應用，需要人源化抗體。製備嵌合(人源化)抗體的方法參見美國 專利5，482，856。人源化和其它抗體生產和工程改造技術的其它細節參見Borrebaeck (編) (1995)《抗體工程第二版》(Antibody EnRineerinR^pd Edition)佛理茫和公司，紐約 (Borrebaeck)(Freeman and Company, NY(Borrebaeck)) ；McCafferty 等(1996)〈〈抗體 工程，實踐方法》(EnRineerinR, A Practical Approach)，IRL牛津出版社，牛津，英格蘭 (McCafferty) (IRL at Oxford Press，Oxford，England (McCafferty))以及禾口 Paul (1995) 《抗體工程手冊》(EnRineerinR Protocols)休曼出版社，紐約(Paul) (Humana Press, Towata, NJ (Paul))。其它特定步驟的細節可參見 Ostberg 等(1983)，Hybridoma 2 361-367，Ostberg，美國專利號 4，634，664，和 Engelman 等，美國專利號 4，634，666。由免疫反應性定義多肽
由於本發明多肽提供了多種新的多肽序列(如含有HA和NA分子的多肽序列)，因 此多肽也提供了可在如免疫學實驗中被識別的新結構特點。因此生產能特異性結合本發明 多肽的抗血清以及此類抗血清結合的多肽也是本發明的特點。例如，本發明包括能夠與抗體或抗血清特異性結合或者對抗體或抗血清具有特異 免疫反應性的多肽(如，HA和NA分子)，其中抗體或抗血清所抗免疫原包含選自一個或多 個本文給定序列(如，SEQ ID N0:ll-20、27-32和39-44)等的胺基酸序列。為了減少與其 它同源物的交叉反應，用提交時公共資料庫中的HA和/或NA分子如「對照」多肽對抗體或 抗血清進行消減。當其它對照序列對應核酸時，產生由核酸編碼的多肽並用於抗體/抗血 清消減目的。在一個典型形式中，免疫實驗使用的多克隆抗血清是用含一個或多個對應本文序 列(如SEQ ID N0:ll-20、27-32和39-44)等或其亞序列(即佔所提供全長序列的至少約 30%)的一種或多種多肽產生的。起源於當前序列的一套潛在多肽免疫原下文統稱為「免 疫原性多肽」。任意選擇所得抗血清使其對對照血凝素和/或神經氨酸酶同系物具有低交 叉反應性，並且在免疫實驗使用多克隆抗血清之前通過免疫吸附消除與一種或多種對照血 凝素和神經氨酸酶同系物的交叉反應性。為了生產免疫實驗中所用抗血清，按照本文所述生產一種或多種免疫原性多肽並 純化。例如，能在重組細胞中產生重組蛋白質。按照標準小鼠免疫實驗方案(參見例如， Harlow 和 Lane (1988)《抗體實驗室手冊》(Antibody, ALaboratory Manual),冷泉港出版 公司(Cold Spring Harbor Publications)，紐約)，用免疫原性蛋白和標準佐劑如弗氏佐 劑免疫純系小鼠(用於本實驗的原因是由於該小鼠遺傳背景基本相同導致結果更具重現 性)，上述文獻中包含關於可用於測定特異性免疫反應性的抗體產生、免疫實驗形式及條件 的標準描述。其它抗體參考資料和討論可在本文中找到，並可用於利用免疫反應性定義多 肽。或者，將源於本文公開序列的一種或多種合成或重組的多肽與載體蛋白偶聯，並用作免 疫原。收集多克隆血清，並在免疫實驗中測定抗免疫原性多肽的滴度，例如，使用在固體 支持物上固定一種或多種免疫原性蛋白的固相免疫實驗。選擇滴度為IO6或更高的多克隆 抗血清，匯集並用對照血凝素和/或神經氨酸酶多肽消減以產生消減、匯集的已知滴度的 多克隆抗血清。在比較性免疫實驗中檢測消減、匯集的已知滴度多克隆抗血清抗對照同系物的交 叉反應性。在此比較性實驗中，使用差異性結合條件檢測消減的已知滴度多克隆抗血清，已 知滴度抗血清與免疫原性多肽結合的信噪比至少比結合對照同系物信噪比高5-10倍。艮口， 通過加入非特異性競爭物如清蛋白或脫脂奶粉和/或調整鹽條件、溫度和或其它來調整結 合反應的嚴謹性。在接下來的實驗中使用這些結合條件，以測定測試多肽(與免疫原性多 肽和/或對照多肽對比的多肽)是否特異性與匯集的消減多克隆抗血清結合。具體說，在 差異性結合條件下，測試多肽比對照受試同源物信噪比高2-5倍，且信噪比是免疫原性多 肽的至少約1/2，與已知受體相比與免疫原性多肽具有顯著結構相似性，因此是本發明的多 肽。在另一個實施例中，用競爭結合形式的免疫實驗檢測受試多肽。例如，利用對照多 肽免疫吸附將交叉反應抗體從匯集抗血清混合物中去除。然後將免疫原性多肽固定於固體支持物上，隨後接觸消減、匯集的抗血清。將受試蛋白加入實驗，以競爭結合匯集、消減的抗 血清。與固定蛋白相比，受試蛋白競爭結合匯集、消減的抗血清的能力與加入實驗的免疫原 性多肽競爭結合的能力(免疫原性多肽與固定的免疫原性多肽有效競爭結合匯集的抗血 清)作比較。使用標準計算方法計算受試蛋白的交叉反應百分數。在平行實驗中，任選測定對照蛋白競爭結合匯集、消減的抗血清的能力，與免疫原 性多肽競爭結合抗血清的能力作比較。再次使用標準計算方法計算受試蛋白的交叉反應百 分數。當受試蛋白交叉反應百分數是對照多肽的至少5-10倍或受試多肽的結合大約在免 疫原性多肽結合範圍內，則稱受試多肽特異性結合匯集、消減的抗血清。通常，可在如本文所述比較任何多肽與免疫原性和/或對照多肽的競爭結合免疫 實驗中使用免疫吸附並匯集的抗血清。為了進行比較，免疫原性、受試和對照多肽分別進行 寬濃度範圍實驗，並用標準技術測定每一多肽抑制50%消減抗血清結合固定對照、受試或 免疫原性多肽的多肽量。如果競爭實驗中結合所需受試多肽的量小於所需免疫原性多肽量 的兩倍，則稱受試多肽特異性結合免疫原性蛋白的抗體，只要該量至少是比對照多肽的約 5-10 倍。作為特異性的另一測定，任選用免疫原性多肽(而非對照多肽)完全免疫吸附匯 集抗血清，直至檢測到所得免疫原性多肽消減、匯集的抗血清很少或沒有結合於免疫吸附 中使用的免疫原性多肽。然後測試該完全免疫吸附抗血清與受試多肽的反應性。若觀察到 很少或沒有反應(即，不超過完全免疫吸附抗血清結合免疫原性多肽信噪比的2倍)，則受 試多肽特異性結合於免疫原性蛋白產生的抗血清。核酸和多肽序列變體如本文所述，本發明提供核酸多核苷酸序列和多肽胺基酸序列，如血凝素和神經 氨酸酶序列，以及包含所述序列的組合物和方法。本文公開所述序列的例子(如SEQ ID NO 1-45)。然而，本領域技術人員將意識到本發明提供的這些序列並不限制本發明，並且本發 明也提供許多具有本文所述功能的相關和非相關的序列，如編碼HA和/或NA分子的序列。技術人員也將意識到本發明包括許多所公開序列的變體。例如，本發明包括所公 開序列通過保守性變異產生的功能相同的序列。如果核酸多核苷酸序列的變體能與至少一 條公開序列雜交，那麼該變體也應該包括在本發明中。本發明也包括通過如標準序列比對 技術確定的本文公開序列的獨特亞序列。沉默變異由於遺傳密碼的簡併性，可任選產生任何編碼本發明多肽和/或病毒的多種核酸 序列，其中一些與本文HA和NA核酸和多肽序列具有較低水平的序列相同性。下文提供了 詳細遺傳密碼的密碼子表，可在許多生物學和生化教科書中找到。^ 1密碼子表
權利要求
一種分離多肽，其中所述多肽選自a)含有SEQ ID NO21 26或33 38或45中任一項所示核苷酸序列編碼的胺基酸序列的多肽；b)含有SEQ ID NO27 32或39 44中任一項所示胺基酸序列的多肽；c)含有SEQ ID NO27 32或39 44中任一項所示胺基酸序列的多肽的成熟形式；d)含有某多核苷酸編碼的胺基酸序列的多肽，所述多核苷酸在高嚴謹條件下與含編碼(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的多核苷酸雜交；或e)含有與(b)中多肽具有至少90％序列相同性的胺基酸序列的多肽。
2.一種免疫原性組合物，其含有免疫有效量的權利要求1所述的至少一種多肽。
3.一種分離抗體，所述抗體與權利要求1所述多肽特異性結合。
4.一種刺激個體免疫系統產生對抗流感病毒的保護性免疫應答的方法，所述方法包括 給予所述個體生理上可接受載體中的免疫有效量的權利要求1所述多肽。
5.一種重組流感病毒，其包含權利要求1所述的多肽。
6.一種免疫原性組合物，其含有免疫有效量的權利要求5所述的重組流感病毒。
7.一種刺激個體免疫系統產生對抗流感病毒的保護性免疫應答的方法，所述方法包括 給予所述個體生理上可接受載體中的免疫有效量的權利要求5所述重組流感病毒。
8.一種分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸選自a)含有SEQID NO 21~26或33-38或45中任一項所示核苷酸序列的多核苷酸，或其 互補序列；b)含有核苷酸序列的多核苷酸或其互補核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼含有SEQID NO 27-32或39-44中任一項所示胺基酸序列的多肽；c)在高嚴謹條件下與多核苷酸(a)基本上全長雜交的多核苷酸；或d)含有與多核苷酸(a)具有至少98%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸。
9.一種免疫原性組合物，其包含權利要求8所述的至少一種多核苷酸。
10.一種包含權利要求8所述的至少一種多核苷酸的細胞。
11.一種包含權利要求8所述的多核苷酸的載體。
12.如權利要求11所述的載體，其特徵在於，所述載體為質粒、粘粒、噬菌體、病毒或病毒片段。
13.如權利要求12所述的載體，其特徵在於，所述載體為表達載體。
14.一種包含權利要求13所述載體的細胞。
15.一種包含權利要求8所述的一種或多種多核苷酸的流感病毒。
16.如權利要求15所述的病毒，其特徵在於，所述病毒為重配病毒。
17.一種6 2重配流感病毒，其中所述病毒包含來自A/Arm Arbor/6/60的6個內部 基因組區段和編碼HA和/或NA多肽的2個基因組區段，所述HA和/或NA多肽選自下組 多肽 SEQ ID NO 27-32 和 39-44。
18.—種製造重配流感病毒的方法，所述方法包括在允許所述多核苷酸表達的條件 下在合適培養基中培養權利要求14所述的細胞；和，從包含所述細胞的細胞群或培養基中 分離所述重配流感病毒。
19.一種免疫原性組合物，其含有免疫有效量的權利要求17所述的重配流感病毒。
20.一種刺激個體免疫系統產生對抗流感病毒的保護性免疫應答的方法，所述方法包 括給予所述個體生理上有效載體中的免疫有效量的權利要求17所述重配流感病毒。
21.—種產生分離或重組多肽的方法，所述方法包括在允許所述多核苷酸表達的條 件下在合適培養基中培養權利要求10所述的細胞；和，從所述細胞或培養基中分離所述多 肽。
22.一種預防性或治療性治療對象的病毒感染的方法，所述方法包括給予所述對象 有效量的權利要求17所述病毒，以產生對抗病毒感染的免疫原性應答。
23.如權利要求22所述的方法，其特徵在於，所述對象是人。
24.如權利要求19所述的免疫原性組合物，其特徵在於，血凝素包含修飾的多鹼性切 割位點。
25.一種減毒的活流感疫苗，其含有權利要求19所述的組合物。
26.一種分裂病毒或死病毒疫苗，其含有權利要求19所述的組合物。
27.—種減毒的活流感疫苗，其含有權利要求24所述的組合物。
28.一種分裂病毒或死病毒疫苗，其含有權利要求24所述的組合物。
29.—種在細胞培養物中產生流感病毒的方法，所述方法包括i)將許多載體引入一群宿主細胞，所述宿主細胞群能夠支持流感病毒的複製，所述載 體含有對應於至少六個A/Arm Arbor/6/60內部基因組區段和含有編碼HA和/或NA多肽的 多核苷酸的至少一個基因組區段的核苷酸序列，所述HA和/或NA多肽選自下組多肽SEQ ID NO 27-32 和 39-44， )在低於或等於35°C的溫度下培養所述宿主細胞群；和，iii)回收流感病毒。
30.如權利要求29所述的方法，其特徵在於，編碼HA和/或NA多肽的多核苷酸選自a)含有SEQID NO :21、23-26或33-38或45中任一項所示核苷酸序列的多核苷酸，或 其互補核苷酸序列；b)包含某核苷酸序列的多核苷酸或其互補核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼含有SEQ ID NO 27-32或39-44中任一項所示胺基酸序列的多肽；c)在高嚴謹條件下與多核苷酸(a)基本上全長雜交的多核苷酸；或d)含有與多核苷酸(a)具有至少98%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸。
31.一種免疫原性組合物，其含有免疫有效量的權利要求29所述方法生產的流感病
32. 一種免疫原性組合物，其含有免疫有效量的權利要求30所述方法生產的流感病
33. 一種刺激個體免疫系統產生對抗流感病毒的保護性免疫應答的方法，所述方法包 括給予所述個體生理上有效載體中的免疫有效量的權利要求29所述方法產生的流感病
34. 一種刺激個體免疫系統產生對抗流感病毒的保護性免疫應答的方法，所述方法包 括給予所述個體生理上有效載體中的免疫有效量的權利要求30所述方法產生的流感病
35. 一種刺激個體免疫系統產生對抗流感病毒的保護性免疫應答的方法，所述方法包括給予所述個體權利要求31所述的免疫原性組合物。
36.一種刺激個體免疫系統產生對抗流感病毒的保護性免疫應答的方法，所述方法包 括給予所述個體權利要求32所述的免疫原性組合物。
37.一種減毒的活流感疫苗，其含有權利要求31所述的免疫原性組合物。
38.一種分裂病毒或死病毒疫苗，其含有權利要求32所述的免疫原性組合物。
39.一種6 2重配流感病毒，其中所述病毒包含來自一種或多種不同於A/Arm Arbor/6/60的供體病毒的6個內部基因組區段和編碼HA和/或NA多肽的2個基因組區 段，所述HA和/或NA多肽選自下組多肽SEQ ID NO 27-32和39-44。
40.如權利要求39所述的6 2重配流感病毒，其特徵在於，所述供體病毒包含一種或 多種下列表型溫度敏感性、冷適應性或減毒。
41.如權利要求39所述的6 2重配流感病毒，其特徵在於，所述供體病毒是PR8。
42.如權利要求39所述的6 2重配流感病毒，其特徵在於，所述供體病毒是A/ Leningrad/17 ο
43.一種免疫原性組合物，其含有免疫有效量的權利要求39所述的重配流感病毒。
44.一種免疫原性組合物，其含有免疫有效量的權利要求40所述的重配流感病毒。
45.一種免疫原性組合物，其含有免疫有效量的權利要求41所述的重配流感病毒。
46.一種免疫原性組合物，其含有免疫有效量的權利要求42所述的重配流感病毒。
47.一種刺激個體免疫系統產生對抗流感病毒的保護性免疫應答的方法，所述方法包 括給予所述個體生理上有效載體中的免疫有效量的權利要求39所述重配流感病毒。
48.一種刺激個體免疫系統產生對抗流感病毒的保護性免疫應答的方法，所述方法包 括給予所述個體生理上有效載體中的免疫有效量的權利要求40所述重配流感病毒。
49.一種刺激個體免疫系統產生對抗流感病毒的保護性免疫應答的方法，所述方法包 括給予所述個體生理上有效載體中的免疫有效量的權利要求41所述重配流感病毒。
50.一種刺激個體免疫系統產生對抗流感病毒的保護性免疫應答的方法，所述方法包 括給予所述個體生理上有效載體中的免疫有效量的權利要求42所述重配流感病毒。
51.一種預防性或治療性治療對象的病毒感染的方法，所述方法包括給予所述對象 有效量的權利要求39所述病毒以產生對抗病毒感染的免疫原性反應。
52.一種預防性或治療性治療對象的病毒感染的方法，所述方法包括給予所述對象 有效量的權利要求41所述病毒以產生對抗病毒感染的免疫原性反應。
53.一種預防性或治療性治療對象的病毒感染的方法，所述方法包括給予所述對象 有效量的權利要求42所述病毒以產生對抗病毒感染的免疫原性反應。
54.如權利要求51所述的方法，其特徵在於，所述病毒是死的或滅活的。
55.如權利要求52所述的方法，其特徵在於，所述病毒是死的或滅活的。
56.如權利要求53所述的方法，其特徵在於，所述病毒是死的或滅活的。
57.如權利要求43所述的免疫原性組合物，其特徵在於，血凝素包含修飾的多鹼性切 割位點。
58.如權利要求44所述的免疫原性組合物，其特徵在於，血凝素包含修飾的多鹼性切 割位點。
59.如權利要求45所述的免疫原性組合物，其特徵在於，血凝素包含修飾的多鹼性切割位點。
60.如權利要求46所述的免疫原性組合物，其特徵在於，血凝素包含修飾的多鹼性切 割位點。
61.如權利要求47所述的方法，其特徵在於，所述對象是人。
62.如權利要求48所述的方法，其特徵在於，所述對象是人。
63.如權利要求49所述的方法，其特徵在於，所述對象是人。
64.一種減毒的活流感疫苗，其含有權利要求45所述的組合物。
65.一種減毒的活流感疫苗，其含有權利要求46所述的組合物。
66.一種在細胞培養物中產生流感病毒的方法，所述方法包括i)將許多載體引入一群宿主細胞，所述宿主細胞群能夠支持流感病毒的複製，所述載 體所包含核苷酸序列對應於(a)第一流感病毒株的至少六個內部基因組區段和編碼HA或NA多肽的至少一個基因 組區段，其中所述第一流感病毒株不是A/Arm Arbor/6/60 ；且所述HA或NA多肽選自下組 多肽 SEQ ID NO 27-32 和 39-44 ；或者(b)第一流感病毒株的至少六個內部基因組區段和編碼HA或NA多肽的至少一個基 因組區段，其中所述第一流感病毒株不是A/Arm Arbor/6/60,所述第一流感病毒株包含一 個或多個選自下組的表型屬性減毒、冷適應性和溫度敏感性；且所述HA或NA多肽選自下 組多肽 SEQ ID NO 27-32 和 39-44 ； )在低於或等於35°C的溫度下培養所述宿主細胞群；和， iii)回收流感病毒。
67.一種免疫原性組合物，其含有免疫有效量的通過權利要求66所述方法產生的流感病毒。
68.一種刺激個體免疫系統產生對抗流感病毒的保護性免疫應答的方法，所述方法包 括給予所述個體生理上有效載體中的免疫有效量的權利要求66所述方法產生的流感病
69.一種刺激個體免疫系統產生對抗流感病毒的保護性免疫應答的方法，所述方法包 括給予所述個體權利要求67所述的免疫原性組合物。
70.一種減毒的活流感疫苗，其含有權利要求67所述的免疫原性組合物。
71.—種分裂病毒或死病毒疫苗，其含有權利要求67所述的免疫原性組合物。
全文摘要
本發明提供了包含(禽類大流行)流感血凝素和神經氨酸酶變體的多肽、多核苷酸、方法、組合物和疫苗。
文檔編號A61P43/00GK101983069SQ200780029510
公開日2011年3月2日 申請日期2007年8月9日 優先權日2006年8月9日
發明者B·默菲, G·坎寶, K·蘇巴拉奧, 楊青芬 申請人:米迪繆尼有限公司;美國政府健康及人類服務部