與轉基因植物外源Bt蛋白相互作用的人類蛋白NDUFA10的製作方法
2023-05-29 21:05:31
專利名稱：與轉基因植物外源Bt蛋白相互作用的人類蛋白NDUFA10的製作方法
技術領域：
本發明涉及轉基因生物食品安全和基因工程領域，具體地說，涉及一種與轉基因植物外源Bt蛋白相互作用的人類蛋白NDUFA10。
背景技術：
按照聯合國糧農組織(FAO)的定義，生物安全是指「避免由於對具有感染能力的有機體或者遺傳修飾有機體的研究和商品化生產而對人類的健康和安全以及環境的保護帶來的風險」，可歸納為生態風險、食品安全和非預期效應三個方面。轉基因生物中由於外源蛋白的引入在受體生物中表達而引起的生物安全問題引起了科學和民眾的普遍關注。在轉基因生物安全性評價的諸多項目中，食品的安全性問題是目前全球公眾爭論的熱點之一， 其原因在於轉基因生物食用安全性評價具有顯著的難以預測性和特異性。轉基因食品可能產生的安全性問題主要包括1)轉基因食品中的外源基因及其表達產物對人體產生毒性； 2)導入受體中的外源基因序列或其表達的蛋白質的胺基酸序列與已知的致敏原具有同源性、甚至產生出新的致敏原，使轉基因食品具有過敏性；3)由於目前在遺傳操作過程中選用的載體大多數具有抗生素抗性標記，因此抗生素抗性基因可能被轉移到人和動物體內外的微生物中，從而產生耐藥性的微生物；4)轉基因食品的營養質量下降。由於外源基因的來源不同和導入位點的隨機性，極有可能產生基因缺失、錯碼等突變，使所表達的蛋白質產物的性狀、數量及在生物中的表達部位與期望值不符，導致轉基因食品的營養質量下降或無法被人體有效地吸收利用。人類是轉基因食品的直接或間接的消費者，而且是最終的消費者，因此公眾必然會對轉基因食品的安全性問題十分關注。因此，加強轉基因植物的安全評價，特別是食用安全評價具有十分重要的意義。
在轉基因生物食品安全評價中，目前採用的傳統方法都是將轉基因植物及其產品用於飼餵實 驗動物，來觀察實驗動物各項生理指標的改變，以此評估轉基因生物的安全性。 但是，由於轉基因生物在經過實驗動物消化道時面臨消化與吸收的問題，並不一定會進入實驗動物體內，因此很難得到明確的結論，這也是公眾對轉基因生物安全評價質疑較多的地方。因此，如何評價轉基因生物的潛在風險成為亟待解決的問題。發明內容
本發明的目的是提供一種與轉基因植物外源Bt蛋白相互作用的人類蛋白 NDUFA10。
為了實現本發明目的，本發明提供一種與轉基因植物外源Bt蛋白相互作用的人類蛋白NDUFA10，所述人類蛋白NDUFA10的胺基酸序列如SEQ ID No.1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個胺基酸形成的具有同等功能的胺基酸序列。
所述人類蛋白NDUFA10為人類NADH脫氫酶(輔酶)I α亞複合體蛋白，是由核基因編碼的線粒體蛋白。哺乳類中複合體I是線粒體電子傳遞鏈上的第一個酶，由45個不同的亞蛋白單位組成。NDUFA10片段是該蛋白疏水部的片段並且具有NADH脫氫酶和氧化還原酶的活性，它將NADH上的電子傳遞給呼吸鏈。
應當理解，本領域技術人員可根據本發明公開的胺基酸序列，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或添加一個或幾個胺基酸，得到所述蛋白NDUFA10的突變序列。
其是利用酵母雙雜交的方法通過轉基因植物中外源蛋白對人的cDNA文庫進行篩選，獲得與外源蛋白相互作用的人體蛋白，並通過免疫共沉澱的方法對互作進行陽性驗證， 從而篩選得到與轉基因植物中外源蛋白發生相互作用的人體蛋白。
本發明還提供編碼上述蛋白NDUFA10的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
本發明還提供含有編碼上述蛋白NDUFA10的基因的載體。
本發明還提供含有編碼上述蛋白NDUFA10的基因的轉基因細胞系。
本發明還提供含有編碼上述蛋白NDUFA10的基因的工程菌。
本發明還提供上述蛋白NDUFA10在轉基因生物安全評價領域中Bt蛋白對人體潛在風險的預測中的應用，即如果外源Bt蛋白通過某種途徑進入人體內部，則會影響 NDUFAIO正常的生理功能，在研究轉基因植物安全時，可以將蛋白NDUFA10及其信號通路的下遊蛋白作為監測指標。
本發明進一步提供篩選與轉基因植物外源Bt蛋白相互作用的人類蛋白NDUFA10 的方法利用酵母雙雜交的方法通過轉基因植物中外源Bt蛋白對人的cDNA文庫進行篩選，獲得與外源蛋白相互作用的人類蛋白，並通過免疫共沉澱的方法對互作進行陽性驗證，從而篩選得到與轉基因植物外源Bt蛋白相互作用的人類蛋白NDUFA10，所述人類蛋白 NDUFA10的胺基酸序列如SEQ ID No.1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個胺基酸形成的具有同等功能的胺基酸序列。
具體包括以下步驟
I)編碼外源蛋白Bt的基因的克隆與鑑定從轉基因植物中通過PCR或基因分離的方法獲得外源蛋白Bt的基因序列，轉化至宿主菌中克隆擴增，再通過PCR、瓊脂糖凝膠電泳及序列測定分析鑑定目的片段；
2)含有外源目的片段的誘餌質粒載體的構建回收目的片段，酶切後與載體 PGBKT7連接，並轉化入大腸桿菌中，篩選陽性克隆，即構建得到可表達BD-Bait融合蛋白的質粒;
3)人cDNA文庫的構建；
4)可表達AD-Library/prey融合蛋白的質粒構建於pGADT7載體上的人cDNA文庫，購自Clontech公司；
5)用酵母雙雜交的方法篩選人的cDNA文庫中與外源蛋白相互作用的候選蛋白；
6)用免疫共沉澱的方法進一步驗證陽性互作蛋白，從而篩得與轉基因植物外源Bt 蛋白相互作用的人類蛋白 NDUFA10。
其中，步驟6)具體為將步驟5)中獲得的候選蛋白與外源蛋白Bt分別構建到載體pRK-HA和pRK-Flag上,與不同tag標籤形成融合蛋白，然後用磷酸I丐介導法共轉染人胚胎腎細胞HEK293，20-24h後裂解細胞，與proteinA偶聯的S^herose孵育沉澱，最後通過 Western blot檢測分析陽性互作的結果。
具體地，本發明的一種篩選與轉基因植物外源Bt蛋白相互作用的人類蛋白 NDUFAIO的方法，包括以下步驟
1、外源蛋白基因的克隆與鑑定
所述外源目的蛋白是指轉基因植物中插入的目標性狀。從轉基因植物或外源目的蛋白的原始來源處通過PCR或基因分離的方法獲得目標蛋白的基因序列，轉化大腸桿菌克隆擴增，再通過PCR、瓊脂糖凝膠電泳、序列測定、序列比對分析等鑑定目的片段。
2、外源目的蛋白構建誘餌融合蛋白
將上述PCR產物瓊脂糖凝膠電泳分離回收，雙酶切消化目的基因片段和質粒載體，並回收純化線性酶切產物。將載體和目的基因按照1:3的摩爾比進行連接反應，16°C過夜。連接產物轉化入大腸桿菌DH5 α感受態細胞，於抗性培養基上鑑定陽性克隆。搖菌提取重組質粒，經過PCR、雙酶切和測序鑑定後，確定為外源目的基因構建的BD-Bait融合蛋白質粒，最後轉化酵母鑑定外源蛋白重組子的自激活活性和毒性，即可用於後續分子操作。
3、從Clontech公司購買人的cDNA文庫,構建於pGADT7載體上。
4、用共轉化的方法通過酵母雙雜交進行文庫篩選
共轉系統轉化使用的酵母菌株為Y2H Gold yeast strain,報告基因系統為-His、-Ade、AURl-C 和 MELl。
(I)製備酵母感受態細胞
a.復甦酵母菌株，將凍存的菌液用接種環蘸取少許在YPDA固體培養板上劃線培養，30°C倒置培養3天；
b.挑取直徑為2-3mm的新鮮(I 3周)單菌落，接種於3mL的YPDA液體培養基中；
c.於 30°C 以 250rpm 轉速培養 8_12h ；
d.在250mL的三角瓶中加入50mL的YPDA，轉移5 μ L的上述培養液於其中，過夜培養 16-20h 至 OD600 達 O. 15-0. 3 ；
e.室溫700g離心5min，棄上清，用IOOmL的YPDA液體培養基重懸細胞沉澱；
f. 30°C下 230-270rpm 繼續培養 3_5h，直至 OD6tltl 達到 O. 4-0. 5 ；
g.將酵母菌液轉移到50mL離心管中，室溫下700g離心5min,棄上清,沉澱用30mL無菌去離子水重懸；
h.室溫下700g再離心5min,棄上清,每管沉澱用1. 5mL新鮮製備的無菌1.1 XTE/ LiAc重懸；
1.將重懸液全部轉移至1. 5mLEP管中，最高轉速離心15s ；
j.棄上清，沉澱用600 μ L1.1X TE/LiAc重懸，即為酵母感受態細胞；
(2)共轉化bait和prey於感受態細胞
k.在 15mL 的離心管中加入 5 μ g DNA-BD/Bait, 10 μ g AD/prey (AD-Library), 20 μ g Yeastmaker Carrier DNA, 600 μ L剛製備的酵母感受態細胞,輕輕的充分混勻後再加入2. 5mL新製備的無菌PEG/LiAc，用槍頭反覆吹打充分混勻；
1.於30°C下培養45min,每IOmin輕彈離心管混勻一下；
m.加入160 μ L DMSO,並輕輕顛倒混勻；
n. 42°C水浴中熱激20min，每隔5min輕輕搖晃混勻一下；
ο.熱激結束後700g離心5min ；
p.棄上清，並用3mL的YPD Plus Medium重懸，在30°C搖床上振蕩培養90min;
q. 700g離心5min,用15mL0. 9%的NaCl溶液重懸並塗板。
(3)陽性克隆的篩選
實驗所用酵母雙雜系統共有四個報告基因，即-His、-Ade, AUJRl-C和MEL1，因此篩選結果最終確定的陽性克隆應該可以同時將這四個報告基因的表達激活。文庫篩選過程首先是將共轉化Bait和Prey菌液在加有α半乳糖苷酶(a -galactosidase)顯色底物X-a-Gal和抗真菌素金擔子素Aba的雙缺培養基上初篩，這一步篩選所得到的克隆既可以生長且變藍的菌落，理論上認為是由於蛋白質之間的相互作用而激活了兩個報告基因 AURl-C和MELl的表達。經過第一輪篩選得到的陽性克隆繼續劃線培養在含Χ_ a -Gal和 Aba的四缺培養基上。在四缺培養基上仍能很好的生長的菌落被認為激活了 -His，-Ade基因的表達，這些菌落被認為是初步篩選得到的陽性結果。
(4)陽性克隆插入片段的測序分析
提取所有陽性克隆酵母菌株的質粒，電擊法轉化大腸桿菌DH5CI感受態細胞，轉化後菌液塗布LB+Amp的平板，以篩選文庫AD質粒。由於表達誘餌蛋白的質粒是Kana抗性， 而表達獵物蛋白的質粒是Amp抗性，就可以篩除誘餌質粒，而只保留獵物質粒。每個板上至少隨機挑取10個單克隆，菌落PCR去除重複後提取質粒，測序並對序列進行分析。
(5)陽性克隆結果的驗證
將上述序列分析得到的陽性蛋白分別與外源蛋白一對一共轉化Y2H Gold strain 和AH109酵母菌株，進行酵母雙雜交以確認其相互作用。
(6)陽性互作蛋白通過免疫共沉澱實驗的進一步驗證
將獲得的陽性蛋白與外源蛋白分別構建到載體pRK-HA和pRK-Flag上，與不同 tag標籤形成融合蛋白，磷酸鈣介導法共轉染人胚胎腎細胞HEK293，20_24h後裂解細胞，與 protein A偶聯的Sepherose孵育沉澱。Western blot檢測分析陽性互作的結果。
本發明提供一種與轉基因植物外源Bt蛋白相互作用的人體蛋白，為轉基因生物安全評價領域中預測Bt蛋白對人體潛在風險的研究提供了一個新的研究方法和監測指標，對目前的實質等同性原則基礎下的各種方法具有很好的改進和補充作用。本發明具有以下優點
(一)確定性針對傳統研究轉基因生物安全的各種方法中存在的最大問題，即由因果之間各通路鏈條的「黑盒子」而導致的不確定性，本發明直接從效應產生的根本原因入手，獲得明確的結論。
(二)高效性通過酵母雙雜交進行的文庫篩選和驗證即可以獲得一些陽性互作蛋白，結果明確且易於分析。
(三)實用性酵母雙雜交的方法對比於比較分析法和組學技術更為成熟和簡單， 更易於操作。
(四)廣泛適應性本發明方法可以用於任何轉基因植物外源目標蛋白潛在風險的研究。
圖1為本發明較佳實施例中通過酵母雙雜交驗證文庫篩選的陽性蛋白，圖示表明外源蛋白與人的NDUFA10蛋白有相互作用；其中，A為pGADT7空載體分別與pGBKT7空載體及pGBKT7-BT共轉化酵母的結果；B為pGADT7融合蛋白載體分別與pGBKT7空載體及PGBKT7-BT共轉化酵母的結果。
圖2為本發明較佳實施例中通過免疫共沉澱實驗驗證外源蛋白與人的NDUFA10蛋白的體內相互作用；其中，A為免疫共沉澱的結果，B為正對照和NDUFA10蛋白全細胞水平表達的檢測。
具體實施方式
以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
實施例Bt蛋白對人體潛在風險的預測研究
1.1外源蛋白Bt基因的克隆鑑定
分析目的基因片段序列和連接載體多克隆位點信息，設計引物
5』 端引物5' -CCCATATGATGGATAACAATCCGAACATC-3'，下劃線部分為 NdeI 酶切位點；
3』端引物5' -GCGTCGACATCATATTCTGCCTCAAAGG-3'，下劃線部分為 SalI 酶切位佔.
對蘇雲金桿菌HD-1菌株PCR獲得Bt基因片段。50 μ L PCR體系5』端引物I μ L， 3』 端引物 I μ L，10XK0D 緩衝液 5 μ L，MgSO4 緩衝液 2 μ L，dNTP5 μ L, KOD plus 酶 I μ L， ddH2035 μ L ；PCR 條件94°C預變性 5min, 39 個循環94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 2min,最終延伸72°C IOmin0將PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑑定片段大小並送Invitrogen公司測序， NCBI上Blast比對鑑定序列 η息。
1. 2誘餌質粒載體的構建
將上述PCR產物瓊脂糖凝膠電泳跑膠回收，用NdeI和SalI雙酶切同時分別消化目的基因片段Bt和質粒載體pGB KT7，並回收純化線性酶切產物。將載體和目的基因按照 1:3的摩爾比進行連接反應，16°C過夜。連接產物轉化入大腸桿菌DH5 α感受態細胞，於抗性培養基上鑑定陽性克隆。搖菌提取重組質粒，經過PCR、雙酶切和測序鑑定後，轉化酵母感受態細胞鑑定其沒有自激活活性和毒性，可用於後續分子操作。
1. 3文庫篩選
用酵母雙雜交的方法篩選人的cDNA文庫中與蘇雲金桿菌殺蟲蛋白(CryIAb/Bt) 相互作用的候選蛋白。本發明中以Bt作為Bait連接到載體pGBKT7上構成BD-Bait，而文庫蛋白則作為prey構建成AD-Library/prey。共轉化所用酵母菌株為Y2H Gold yeast strain,報告基因系統為_His、-Ade, AURl-C 和 MELl。
①製備酵母感受態細胞
a.復甦酵母菌株，將凍存的菌液用接種環蘸取少許在YPDA固體培養板上劃線培養，30°C倒置培養3天；
b.挑取直徑為2-3mm的新鮮(I 3周)單菌落，接種於3mL的YPDA液體培養基中；
c.於 30°C 以 250rpm 轉速培養 8_12h ；
d.在250mL的三角瓶中加入50mL的YPDA，轉移5 μ L的上述培養液於其中，過夜培養 16-20h 至 OD600 達 O. 15-0. 3 ；
e.室溫下700g離心5min，棄上清，用IOOmL的YPDA液體培養基重懸細胞沉澱；
f. 30°C下 230-270rpm 繼續培養 3_5h，直至 OD6tltl 達到 O. 4-0. 5 ；
g.將酵母菌液轉移到50mL離心管中，室溫下700g離心5min,棄上清,沉澱用30mL 無菌的去離子水重懸；
h.室溫下700g再離心5min,棄上清,每管沉澱用1. 5mL新鮮製備的無菌1.1 XTE/ LiAc重懸；
1.將重懸液全部轉移至1. 5mLEP管中，最高轉速離心15s ；
j.棄上清，沉澱用600 μ L1.1X TE/LiAc重懸，即為酵母感受態細胞；
②共轉化bait和prey於感受態細胞
k.接著進行文庫共轉化實驗；在15mL的離心管中加入5 μ gDNA-BD/Bait (pGBKT7_Bt)，10 μ g AD/prey (pGADT7-Library),20 μ gYeastmaker Carrier DNA,600 μ L 剛製備的酵母感受態細胞，輕輕的充分混勻後再加入2. 5mL新製備的無菌PEG/LiAc，用槍頭反覆吹打充分混勻；
1.於30°C下培養45min,每IOmin輕彈離心管混勻一下；
m.加入160 μ L DMSO,並輕輕顛倒混勻；
n. 42°C水浴中熱激20min，每隔5min輕輕搖晃混勻一下；
ο.熱激結束後700g離心5min ；
p.棄上清，並用3mL的YPD Plus Medium重懸，在30°C搖床上振蕩培養90min;
q. 700g離心5min,用15mL0. 9%的NaCl溶液重懸並塗板。
③陽性克隆的篩選
實驗所用酵母雙雜系統共有四個報告基因，即-His、-Ade、AURl_C和MEL1，因此篩選結果最終確定的陽性克隆應該可以同時將這四個報告基因的表達激活。文庫篩選過程首先是將共轉化DNA-BD/Bait (pGBKT7_BT)和人的cDNA文庫(購自Clontech公司)構建的 AD/prey (pGADT7_Library)的酵母菌液塗布在加有α半乳糖苷酶(a-galactosidase)顯色底物X- a -Gal和抗真菌素金擔子素Aba的雙缺培養基上初篩，這一步篩選所得到的克隆既可以生長且變藍的菌落，理論上認為是由於蛋白質之間的相互作用而激活了兩個報告基因AURl-C和MELl的表達。經過第一輪篩選得到的陽性克隆繼續劃線培養在含Χ_ a -Gal和 Aba的四缺培養基上進行更嚴謹的陽性篩選。在四缺培養基上仍能很好的生長的菌落被認為又激活了 -His、-Ade基因的表達，這些菌落被初步認為是篩選得到的陽性結果。四缺板上篩選的陽性結果見圖1，A為pGADT7空載體分別與pGBKT7空載體及pGBKT7_BT共轉化酵母，即使用AD+BD和AD+BD-BT共轉體系作為實驗組的對照實驗；B圖中第一行也為對照組實驗，為AD-NDUFA10+BD的系統對照組；對照實驗結果表明，共轉的雙空載體以及單空載體 +單融合蛋白共轉組可以在二缺的培養基上生長，說明兩個載體都已轉入菌體中，但是不能在四缺和四缺加X-a -Gal和抗真菌素金擔子素Aba的培養基上生長，說明空載體本身，或空載體+單一的融合蛋白均不能激活報告基因系統的表達，單一融合蛋白不具有自激活活性，進一步說明實驗組結果的發生是由於NDUFA10和BT相互作用的結果。
B圖中第二行的3個結果為實驗組結果，AD-NDUFA10+BD-BT兩個融合蛋白載體共轉化酵母菌後在雙缺培養基和四缺培養基上都能生長，且在加了 X-a -Gal和抗真菌素金擔子素Aba的四缺培養基上仍可以生長而且菌斑變藍。
酵母雙雜交結果表明NDUFA10蛋白和BT蛋白具有相互作用，並通過這一相互作用能夠結合在一起，從而引起後續的一些效應。
以上結果表明蛋白NDUFA10可與Bt蛋白產生相互作用。
④陽性克隆插入片段的測序分析
提取所有陽性克隆酵母菌株的質粒，電擊法轉化大腸桿菌DH5CI感受態細胞，轉化後菌液塗布LB+Amp的平板，以篩選文庫AD質粒。由於表達誘餌蛋白的質粒是Kana抗性， 而表達獵物蛋白的質粒是Amp抗性，就可以篩除誘餌質粒，而只保留獵物質粒。每個板上至少隨機挑取10個單克隆，菌落PCR去除重複後提取質粒，測序並對序列進行分析。
⑤陽性克隆結果的驗證
將上述序列分析得到的有意義的陽性蛋白分別與pGBKT7_Bt —對一共轉化Y2H Gold strain和AH109酵母菌株，以確認其相互作用。最終篩選得到與外源Bt蛋白相互作用的蛋白人類NADH脫氫酶(輔酶)Ia亞複合體蛋白(自命名為NDUFA10)，是由核基因編碼的線粒體蛋白。哺乳類中複合體I是線粒體電子傳遞鏈上的第一個酶，由45個不同的亞蛋白單位組成。NDUFA10片段是該蛋白疏水部的片段並且具有NADH脫氫酶和氧化還原酶的活性，它將NADH上的電子傳遞給呼吸鏈。
1. 4陽性互作蛋白免疫共沉澱驗證
HEK293細胞培養於含10%胎牛血清的高糖DMED培養基中，在5% 二氧化碳培養箱中37°C下培養。將細胞接種於IOcm培養皿中，18-24h後長至IX IO6後可用於轉染。Bt 和NDUFA10分別構建到載體pRK-Flag和pRK-ΗΑ上與相關tag標籤形成融合蛋白。各取 Bt-Flag和NDUFA10-HA質粒10 μ g通過磷酸鈣介導轉染293細胞，20_24h後收取細胞， 用 ImL 細胞裂解液(20mM Tris, 150mM NaCl，l%Triton，ImMEDTA，10 μ g/mL 蛋白酶抑制劑 (aprotinin), 10 μ g/mL亮抑蛋白酶肽(leupeptin), ImM苯甲基磺醯氟，pH7. 5)於4°C或冰浴裂解細胞30min，14，OOOrpm離心lOmin，上清液分2份50 μ L用來做全細胞裂解液中蛋白表達的測定，剩餘950 μ L用來做免疫共沉澱和免疫印跡分析。
免疫共沉澱將上一步收集的95(^1^上清蛋白液加入&社^1&8的抗體，與3(^1^ protein A偶聯的Sepherose4°C孵育過夜，12, OOOrpm離心IOmin,棄上清,用清洗液洗2次後加入2 X SDS上樣緩衝液後煮沸lOmin，迅速移冰上，4°C 12，OOOrpm離心lOmin，獲得共沉澱蛋白樣品。
Western Blot檢測將上一步中獲得的蛋白樣與全細胞裂解蛋白樣同時進行聚丙烯醯胺凝膠電泳，轉膜，免疫印跡用a Flag或a HA的單克隆抗體室溫孵育2小時，TTBS洗後與HRP偶聯二抗孵育I小時後顯影檢測，結果表明蛋白NDUFA10與Bt蛋白具有明顯的相互作用(圖2)。在圖2中，A和B的第一泳道為正對照實驗組，第二泳道為BT和NDUFA10實驗組；Β圖為正對照和NDUFA10蛋白全細胞水平表達的檢測，A為IP檢測結果，使用BT融合蛋白標籤Flag與S印herose A Beeds孵育，洗脫後免疫印跡，Western使用NDUFA10蛋白融合標籤HA顯影，結果表明BT-Flag可以免疫沉澱NDUFA10-HA蛋白，兩者具有相互作用。
最終篩選得到與外源Bt蛋白相互作用的蛋白人類NADH脫氫酶(輔酶)1α亞複合體蛋白(NDUFA10)，具有NADH脫氫酶和氧化還原酶的活性，它將NADH上的電子傳遞給呼吸鏈。如果轉基因植物中的外源Bt蛋白通過某種途徑進入人體內部，則會與NDUFA10發生相互作用，而影響其正常的生理功能，如影響能量代謝功能，這可視為外源Bt蛋白對人體的潛在風險，當然仍需更多的證據支持。在研究轉基因植物安全時，可以NDUFA10及其信號通路的下遊蛋白作為監測指標。
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。
序列表北京大學與轉基因植物外源Bt 白賴S作用的人類蛋白NDUFMO<130〉KHP12116926.82PatentIn version 3.5 I 355 PRT 人類(homo sapien) I
權利要求
1.與轉基因植物外源Bt蛋白相互作用的人類蛋白NDUFA10，所述人類蛋白NDUFA10的胺基酸序列如SEQ ID No.1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個胺基酸形成的具有同等功能的胺基酸序列。
2.編碼權利要求1所述蛋白NDUFA10的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特徵在於，其核苷酸序列如SEQIDNo. 2所示。
4.含有權利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權利要求2或3所述基因的轉基因細胞系。
6.含有權利要求2或3所述基因的工程菌。
7.權利要求1所述蛋白NDUFA10在轉基因生物安全評價領域中Bt蛋白對人體潛在風險的預測中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特徵在於，當外源Bt蛋白進入人體內時，通過監測蛋白NDUFA10及其信號通路的下遊蛋白，從而評價轉基因植物安全性。
9.一種篩選與轉基因植物外源Bt蛋白相互作用的人類蛋白NDUFA10的方法，利用酵母雙雜交的方法通過轉基因植物中外源Bt蛋白對人的cDNA文庫進行篩選，獲得與外源蛋白相互作用的人類蛋白，並通過免疫共沉澱的方法對互作進行陽性驗證，從而篩選得到與轉基因植物外源Bt蛋白相互作用的人類蛋白NDUFA10，所述人類蛋白NDUFA10的胺基酸序列如SEQ ID No.1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個胺基酸形成的具有同等功能的胺基酸序列，其特徵在於，包括以下步驟1)編碼外源蛋白Bt的基因的克隆與鑑定從轉基因植物中通過PCR或基因分離的方法獲得外源蛋白Bt的基因序列，轉化至宿主菌中克隆擴增，再通過PCR、瓊脂糖凝膠電泳及序列測定分析鑑定目的片段；2)含有外源目的片段的誘餌質粒載體的構建回收目的片段，酶切後與載體PGBKT7連接，並轉化入大腸桿菌中，篩選陽性克隆，即構建得到可表達BD-Bait融合蛋白的質粒；3)人cDNA文庫的構建；4)可表達AD-Library/prey融合蛋白的質粒構建於pGADT7載體上的人cDNA文庫， 購自Clontech公司；5)用酵母雙雜交的方法篩選人的cDNA文庫中與外源蛋白相互作用的候選蛋白；6)用免疫共沉澱的方法進一步驗證陽性互作蛋白，從而篩得與轉基因植物外源Bt蛋白相互作用的人類蛋白NDUFA10。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，步驟6)具體為將步驟5)中獲得的候選蛋白與外源蛋白Bt分別構建到載體pRK-HA和pRK-Flag上,與不同tag標籤形成融合蛋白，然後用磷酸鈣介導法共轉染人胚胎腎細胞HEK293，20-24h後裂解細胞，與protein A偶聯的Sepherose孵育沉澱,最後通過Western blot檢測分析陽性互作的結果。
全文摘要
本發明提供一種與轉基因植物外源Bt蛋白相互作用的人類蛋白NDUFA10，所述人類蛋白NDUFA10的胺基酸序列如SEQ ID No.1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個胺基酸形成的具有同等功能的胺基酸序列。其是利用酵母雙雜交的方法通過轉基因植物中外源蛋白對人的cDNA文庫進行篩選，獲得與外源Bt蛋白相互作用的人類蛋白，並通過免疫共沉澱的方法對互作進行陽性驗證。本發明可在轉基因生物安全評價研究領域用於預測Bt蛋白對人體的潛在風險。
文檔編號C12N1/21GK102994466SQ201210580459
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月27日 優先權日2012年12月27日
發明者王戎疆, 許崇任, 韓娟 申請人:北京大學