一種多球殼菌素衍生物及其製備方法和應用的製作方法

2023-05-30 01:24:06 2

專利名稱：一種多球殼菌素衍生物及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種多球殼菌素衍生物，特別涉及一種氨基上引入 具有紫外特徵吸收峰基團的多球殼菌素衍生物及其製備方法，還涉 及該衍生物在定量測定含多球殼菌素的生物製品中的應用。
背景技術：
多球殼菌素具有多種藥理作用。Fujita等研究顯示，多球殼菌 素具有顯著的雙向免疫調節作用，能阻斷白介素-2受體以下的途徑， 抑制絲氨酸棕櫚醯轉移酶活性，從而特異性抑制T細胞的增殖；多 球殼菌素對同種細胞障礙性T細胞的誘導均有很強的抑制活性，在 這些方面比環孢菌素A強10 100倍；同種混合淋巴球混合反應方 面，多球殼菌素也比臨床廣泛應用的環孢菌素顯示更強的活性。另 外，Hojjati等報導多球殼菌素可抑制動脈粥樣硬化形成，利用多球 殼菌素抑制鞘脂類合成的關鍵酶——絲氨酸棕櫚醯轉移酶的機理， 連續60天對8周齡的動脈粥樣硬化的大鼠每隔一天注射濃度為0. 3 mg/kg多球殼菌素，結果顯示多球殼菌素對鞘脂類的合成有明顯的抑 製作用，該大鼠動脈硬化損傷面積明顯減少，因此，多球殼菌素抑 制絲氨酸棕櫚醯轉移酶活性可能作為治療動脈粥樣硬化的一個選 擇。肖朝華等利用高糖模擬糖尿病病人體內的高糖
3環境，探討多球殼菌素在糖尿病腎病腎臟肥大和早期腎硬化過程中所起 的作用，結果表明多球殼菌素不但可有效抑制腎小球繫膜細胞系肥大， 並能明顯較少細胞外基質分泌，因此有望將其用於治療糖尿病腎病、腎 小球硬化等腎臟疾病。基於多球殼菌素的藥理價值及臨床應用前景，建 立高靈敏度的測定方法對於開發多球殼菌素具有重要意義。
目前關於多球殼菌素含量測定方法的報導，在文獻(固相萃取結合
HPLC測定蟬花菌絲體中多球殼菌素的含量，餘佳文等，中國藥學雜誌， 43: 1191-1193， 2008年)和中國發明專利"冬蟲夏草中多球殼菌素含 量的測定方法"提供了一種固相萃取結合高效液相色譜測定蟬花和冬蟲 夏草中多球殼菌素的方法。該方法的不足之處在於多球殼菌素為不帶 發色基團的化合物，檢測波長需選擇在紫外末端，選擇紫外末端測定受 幹擾多，靈敏度不高；樣品化學成分複雜，多球殼菌素含量低，需經分 離純化後方可通過HPLC分析，操作起來比較繁瑣。

發明內容
本發明的目的是提供一種氨基上引入具有紫外特徵吸收峰基團的多
球殼菌素衍生物。
本發明的另一目的是提供該多球殼菌素衍生物的製備方法。 本發明的目的還在於提供該多球殼菌素衍生物在定量測定含多球殼
菌素的生物製品中的應用。
本發明所述多球殼菌素衍生物的化學式用下式(I)表示
4其製備方法如下取多球殼菌素和芴甲氧羰醯氯，分別溶於吡啶和 四氫呋喃，再將這兩種溶液按體積比為1 2 : 1 100進行混合，反應溫
度10 60"C，反應時間0.01 120min，得到含化學式(I)的反應物； 蒸乾該反應物的溶劑，剩餘物以矽膠為色譜介質純化，用體積比是8:2 的氯仿、甲醇混合溶液進行洗脫，分部收集餾分，蒸乾溶劑，用乙醇結 晶，乾燥得化學式(I)化合物。
化學反應式是:
0
(I)在該化學反應中，在多球殼菌素的氨基上引入了具有紫外特徵吸收峰的 基團，同時使分子內酯化。由於化學式(I)化合物具有紫外特徵吸收峰 基團及分子內酯化，穩定性增加，通過紫外檢測器測定靈敏度顯著提高。
通過優化製備式(I)化合物的反應條件，Fmoc-Cl和多球殼菌素可定量 的形成式(I)化合物，因而通過測定式(I)化合物可定量表徵多球殼 菌素。值得注意的是加入的Fmoc-Cl必須足量，否則多球殼菌素不能被 完全反應完，導致定量分析結果不準確。
採用高效液相色譜-質譜聯用技術定性分析反應物中化學式(I)化 合物
取含式(I)化合物的反應物進行高效液相色譜-質譜聯用定性分析， 採用色譜柱C8色譜柱；流動相乙腈與水體積比20 80 : 80 20;流 速0.7 1.2 mL/min;柱溫20 45°C，檢測採用質譜儀。
取含式(I)化合物的反應物注入高效液相色譜-電噴霧電離-質譜儀 (HPLC-ESI-MS)進行分析。在ESI正離子全掃描方式下，得總離子流圖 (圖l)，取保留時間約29 min進行質譜分析，可得[M + H]+為606. 4的 準分子離子峰(圖2)，式(I)化合物分子量為605，與式(I)化合物 一致。選擇m/z為606. 4的準分子離子進行二級質譜分析，得其二級質譜 (圖2)，可觀察到m/z為384. 3和410. 3的碎片峰，式(工)化合物在質譜 條件下也可裂解得m/z為384和410的碎片峰(圖3)。而在空白反應物(反 應時未加多球殼菌素)中未出現相應峰及碎片峰。上述分析表明反應物
6中含有式(I)化合物，所分析的物質為式(I)化合物。
另取上述在製備式(I)化合物的過程中用乙醇結晶、乾燥後的物質
溶於甲醇，然後取5叱注入質譜儀進行分析，可得[M + H]+為606.4的 準分子離子峰，其二級質譜也可觀察到m/z為384. 3和410. 3的碎片峰。結 果與用高效液相色譜-質譜聯用技術分析化學式(I)化合物的一級質譜 和二級質譜結果一致。表明所分析物質為式(I)化合物。
採用高效液相色譜定量分析式(I)化合物，從而可以定量測定多球 殼菌素的含量。該多球殼菌素衍生物可用於定量測定蟬花、冬蟲夏草等 中藥材中多球殼菌素含量及測定含蟬花或冬蟲夏草及其提取物的製劑， 也可用於定量測定生物樣品中的多球殼菌素含量。
高效液相色譜定量分析式(I)化合物的步驟包括(1)製備化學 式(I)化合物如前所述方法製備得到含有式(I)化合物的反應物， 所取多球殼菌素和FM0C-C1，兩者摩爾比是1 : 300 1 : 3，分別溶於吡 啶和四氫呋喃，再將這兩種溶液按體積比為1 2 : 1 100進行混合，反 應溫度10 60 °C，反應時間0.01 120 min，得到含化學式(I)的反 應物。(2)高效液相色譜定量分析式(I)化合物定量移取含有式(I)
化合物的反應物進行高效液相色譜分析，採用色譜柱C8色譜柱；流動
相乙腈與水體積比20 80 : 80 20;流速0. 7 1. 2 mL/min;柱溫20 45 °C，檢測採用二極體陣列檢測器(DAD)，選取波長250 270 nm; 測定峰面積。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，可繪製式(I)化合物的標準曲線。所繪標準曲線線性關係良好，該方法可定量分析式(I) 化合物。
無論待測樣品是蟬花還是冬蟲夏草還是其他的生物樣品，只要其內 含有多球殼菌素就可以通過加入芴甲氧羰醯氯的方法發生化學反應生成 式(I)化合物，再通過高效液相色譜定量分析(I)化合物從而測定樣 品中多球殼菌素的含量。具體來說樣品中多球殼菌素的含量測定包括以 下步驟(1)待測樣品中多球殼菌素的提取；(2)利用步驟(1)所得 的多球殼菌素提取液通過加入芴甲氧羰醯氯的方法製得含有式(I)化合 物的反應物；(3)高效液相色譜定量分析反應物中式(I)化合物從而測 定多球殼菌素的含量。
如果待測樣品是蟬花時，其多球殼菌素的提取方法如下精密稱定過60 目篩的蟬花菌絲體粉末l g，置50 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇10 mL， 超聲提取2次，每次30 40 min，或者加熱回流法提取2次，每次1 3 小吋；提取液過濾，濾液在60 °C真空下揮幹，殘渣精密加入吡啶lmL， 溶解，離心10min，取上清液即得蟬花提取液。按所述體積比將該蟬花 提取液與溶解有芴甲氧羰醯氯的四氫呋喃溶液進行混合，製得含有式(I) 化合物的反應物，再通過高效液相色譜定量分析反應物中化學式(I)化 合物。典型高效液相色譜圖見圖4: (a):空白(b):式(I)化合物 (c)蟬花樣品峰l為式(I)化合物。
如果待測樣品是冬蟲夏草時，其多球殼菌素的提取方法如下精密 稱定過60目篩的冬蟲夏草菌絲體粉末5 g，置250 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇50mL，超聲提取2次，每次30 40min，或者加熱回流法提 取2次，每次1 3小時；提取液過濾，濾液在60'C真空下或空氣流下 揮幹，殘渣精密加入吡啶0. 5 mL，溶解，離心10 min，取上清液即得 冬蟲夏草提取液。同前述方法按所述體積比將該冬蟲夏草提取液與溶解 有芴甲氧羰醯氯的四氫呋喃溶液進行混合，製得含有式(I)化合物的反 應物。
如果待測樣品是血漿時，其多球殼菌素的提取方法如下精密量取 血漿樣品2mL，置lOmL具塞離心試管中，加入甲醇6mL，混旋10min， 離心(3000 r/min)10 min。取上清液置50 60 。C水浴上通空氣流揮幹。 殘渣用100 uL吡啶溶解，混旋10 min，離心(3000 r/min) 10 min， 得上清液即為待測樣品。同前述方法按所述體積比將該待測樣品與溶解 有芴甲氧羰醯氯的四氫呋喃溶液進行混合，製得含有式(I)化合物的反 應物。
本發明的有益效果是在多球殼菌素的氨基上引入具有紫外特徵吸 收峰的基團，能定量獲得多球殼菌素衍生物，該多球殼菌素衍生物可用 於測定蟬花、冬蟲夏草等中藥材中多球殼菌素含量及測定含蟬花或冬蟲 夏草及其提取物的製劑，也可用於測定生物樣品中的多球殼菌素含量。 測定結果可靠、精確。


圖1 反應物總離子流2 化學式(I)化合物的一級質譜和二級質譜
圖3化學式(I)化合物的可能裂解方式
圖4化學式(I)化合物典型高效液相色譜圖 具體實施例(共6例) 實施例l式(I)化合物的製備
配製芴甲氧羰醯氯(Fmoc-Cl)溶液精密稱取Fmoc-Cl約5.0 mg， 溶解於50 mL四氫呋喃溶液中，製成每1 mL含Fmoc-Cl為0. 1 mg的 衍生劑溶液，4 °C冰箱保存備用。
配製多球殼菌素溶液精密稱取多球殼菌素約2. 5 mg，置於50 mL 量瓶中，用吡啶溶解並稀釋至刻度，搖勻，製成每1 mL含多球殼菌素 0.05 mg的溶液，4 °C冰箱保存備用。
分別量取上述Fmoc-Cl溶液100.0 W和多球殼菌素溶液50.0 W 置1.5 mL Eppendorf管中，混勻，反應溫度40 。C，反應時間10 min， 得含有式(I)化合物的反應物，蒸乾反應物中溶劑，剩餘物以矽膠為色 譜介質純化，用體積比是8 : 2的氯仿、甲醇混合溶液進行洗脫，分部收 集餾分，蒸乾溶劑，用乙醇結晶，乾燥得化學式(I)化合物。 實施例2式(I)化合物的製備
配製芴甲氧羰醯氯(Fmoc-Cl)溶液精密稱取Fmoc-Cl約20. 0 mg， 溶解於100 mL四氫呋喃溶液中，製成每1 mL含Fmoc-Cl為0. 2 mg的 衍生劑溶液，4 °C冰箱保存備用。
10配製多球殼菌素溶液精密稱取多球殼菌素約2. 0 mg，置於10 mL量 瓶中，用吡啶溶解並稀釋至刻度，搖勻，製成每lmL含多球殼菌素0.2 mg的溶液，4 °C冰箱保存備用。
分別量取上述Fmoc-Cl溶液100.0 ml和多球殼菌素溶液10.0 ml 置500 mL圓底燒瓶中，混勻，反應溫度50 °C，反應時間20 min，得 含有式(I)化合物的反應物，蒸乾反應物中溶劑，剩餘物以矽膠為色譜 介質純化，用體積比是8 : 2的氯仿、甲醇混合溶液進行洗脫，分部收集 餾分，蒸乾溶劑，用乙醇結晶，乾燥得化學式(I)化合物。 實施例3高效液相色譜-質譜聯用定性分析式(I)化合物
取10化實施例i所製得的反應物注入高效液相色譜-電噴霧電離-質
譜儀(HPLC-ESI-MS)分析。採用色譜柱C8色譜柱；流動相乙腈與水 體積比70 : 30;流速1.0 mL/min;柱溫35°C，檢測採用質譜儀。
在ESI正離子全掃描方式下，可得[M + H]+為606. 4的準分子離子峰， 式(I)化合物分子量為605，推測[M + H]+為606.4的準分子離子峰為 式(I)化合物的準分子離子峰。選擇m/z 606. 4進行二級質譜分析，得 其二級質譜，可觀察到m/z為384. 3和410. 3的碎片峰，式(I)化合物質 譜條件下也可裂解得m/z為384和410的碎片峰，進一步證實[M + H]+為 606.4的準分子離子峰為式(I)化合物的準分子離子峰。在空白反應物 (反應時未加多球殼菌素)中未出現相應峰及碎片峰。結果表明，反應 物中有式(I)化合物。
ii實施例4 式(I)化合物的用途測定不同發酵批次蟬花菌絲體中多 球殼菌素含量
所用儀器Agilent 1100型高效液相色譜儀(G1379A脫氣機、G1311A 四元泵、G1313A自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315B DAD檢測器， Chemstations工作站)。
分析條件色譜柱C8色譜柱；流動相乙腈與水體積比60 : 40;
流速1.0mL/min;柱溫35 °C，檢測採用DAD，選取波長262 nm。
測定步驟如下(用不同發酵批次的蟬花菌絲體分別做以下試驗)
(1) 待測樣品中多球殼菌素的提取
分別精密稱定過60目篩的蟬花菌絲體粉末0.5 g，置50 mL具塞 錐形瓶中，加入甲醇10 mL，超聲提取2次，每次30 40min，提取液 過濾，濾液在60 °C真空下揮幹，剩餘物精密加入吡啶1 mL，溶解， 離心10 min，取上清液即得蟬花提取液。
(2) 利用步驟(1)所得的蟬花提取液製備含有式(I)化合物的反
應物
取蟬花提取液IO叱，置1.5 mL Eppendorf管中，然後加入實施例l 所配製的Fmoc-Cl溶液50叱，密塞，旋渦混勻，離心，反應溫度40'C， 反應時間IO min，放冷至室溫，得含有式(I)化合物的反應物。
(3) 高效液相色譜定量分析反應物中式(I)化合物從而測定多球 殼菌素的含量。通過上述步驟取不同發酵批次蟬花菌絲體，按步驟(1)方法配製供試品溶 液，衍生化反應後按上述色譜條件進行測定，以外標法按峰面積計算含 量，結果見表l。
表1蟬花菌絲體中多球殼菌素含量測定結果(n = 3)
批號菌絲體(g)多球殼菌素(mg/g)RSD (/ %)
1200705015. 26780. 19161. 7
1200705023. 19830. 07531.6
1200806014. 93470. 37821.4
為了證實該測定方法的精確性，做了如下試驗:
(A) 線性關係試驗
多球殼菌素儲備液的配製精密稱取多球殼菌素對照品適量，置於
50mL量瓶中，用吡啶溶解並稀釋至刻度，搖勻，製成每lmL含多球 殼菌素0.5 mg的對照品儲備液，4°C冰箱保存備用。
分別精密量取多球殼菌素儲備液O. 1， 0.4, 1.0， 2.0， 3.0， 4.0， 5.0mL，置10mL量瓶中，用吡啶定容，分別經衍生化反應後按上述高效 液相色譜條件進行測定，衍生化反應條件同本實施例的步驟(2)。以化 學式(I)化合物峰面積(Y)對多球殼菌素濃度(X)進行線性回歸，結果表 明多球殼菌素濃度在5.0 250.0 ug/mL範圍內與(式(I)化合物) 的峰面積呈良好的線性關係，回歸方程為Y = 35471.88 X - 9. 34 (r =0.9972)。
(B) 檢出限和定量限取多球殼菌素儲備液適量，用吡啶稀釋成
1350 500 ng/mL的一系列溶液，衍生化反應後，分別進樣5叱，記錄 色譜圖。按信噪比(S/N)為3: 1，測得化學式(I)化合物的檢出限為60 ng/mL;按信噪比(S/N)為10: 1，測得化學式(I)化合物的定量限為200 ng/mL。
(C) 精密度試驗精密吸取100化多球殼菌素溶液(500 ng/mL)， 衍生化反應後，連續進樣5次，測定峰面積。結果化學式(I)化合物峰 面積的RSD(n = 5)為1.45%。試驗結果表明，本法精密度良好。
(D) 穩定性試驗取本實施例步驟(1)所得的待測樣品蟬花提取 液，衍生化反應後室溫下放置，分別於0， 1， 2， 4， 8， 12h測定，化 學式(I)化合物峰面積的RSD為2.0X。結果表明，化學式(I)化合物 在室溫下放置12 h穩定。
(E) 重現性試驗精密稱取同一批號的菌絲體樣品6份，按本實施 例步驟(1)項下方法配製供試品溶液，衍生化反應後進樣分析，多球殼 菌素含量的RSD為2.2X。試驗結果表明，本法重現性良好。
(F) 回收率試驗精密稱取已知含量的蟬花菌絲體(批號 120080601,含量0.3782 ug/g)細粉9份，每份約0. 5 g，分成3組， 每組3份，分別精密添加濃度為0.063 u g/mL的多球殼菌素對照品溶液 2、 3、 4mL，照實施例步驟(1)項下方法製備供試品溶液，分別衍生化 反應後按上述色譜條件測定，測得低、中、高3組濃度下的平均加樣回收 率分別為98.2% ， 99.7%， 98.8%; RSD分別為2. 1%， 1.2%， 1.9%(n
14=3)。總平均加樣回收率為98.9%， RSD為1.7X(n二9)。試驗結果表明， 本法具有良好的回收率。
實施例5式(I)化合物的用途測定冬蟲夏草中多球殼菌素含量
(1) 精密稱定過60目篩的冬蟲夏草菌絲體粉末5g，置250 mL具 塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，加熱回流法提取2次，每次1 3小時； 提取液過濾，濾液在60'C真空下揮幹，殘渣精密加入吡啶0.5mL，溶 解，離心10 min，取上清液即得冬蟲夏草提取液。
(2) 製備式(I)化合物稱取Fmoc-Cl溶於四氫呋喃溶液，配成 Fmoc-Cl濃度為0. 15 mg/mL，分別取冬蟲夏草提取液20 u L和Fmoc-Cl 溶液100 pL，混合反應，反應溫度40 °C，反應時間10 min，得含式
(I)化合物的反應物。
(3) 高效液相色譜定量分析式(I)化合物取10 UL反應物進行
高效液相色譜分析，採用色譜柱C8色譜柱；流動相乙腈與水體積比
70 : 30;流速0.8 mL/min;柱溫30 °C，檢測採用DAD，選取波長262; 測定峰面積。根據式(I)化合物的標準曲線可計算冬蟲夏草中多球殼菌 素含量。測得冬蟲夏草菌絲體樣品中多球殼菌素含量為0.012mg/g。 實施例6式(I)化合物的用途測定生物樣品(血漿)中多球殼菌 素的含量
(1)血漿中多球殼菌素提取精密量取血漿樣品2 mL，置10 mL 具塞離心試管中，加入甲醇6mL，混旋10min，離心(30Q0 r/min)10min。
15取上清液置75 80 "C水浴上通空氣流揮幹。殘渣用200 uL吡啶溶解， 混旋IO min，離心(3000 r/min) 10 min，得上清液。
(2) 製備式(I)化合物稱取Fmoc-Cl溶於四氫呋喃溶液，配成 Fmoc-Cl濃度為0. 15 mg/mL，分別取步驟(1)的上清液2 u L和Fmoc-Cl 溶液10yL，混合反應，反應溫度40'C，反應時間10min，得含式(I) 化合物的反應物。
(3) 高效液相色譜定量分析式(I)化合物定量取反應物進行高
效液相色譜分析，採用色譜柱C8色譜柱；流動相乙腈與水體積比70 :
30;流速1.0 mL/min;柱溫35 。C，檢測採用DAD，選取波長262 nm; 測定峰面積。根據式(I)化合物的標準曲線可計算血漿中多球殼菌素含 量。測得所取血漿樣品中多球殼菌素含量為0.0032 mg/mL。本方法可用
於測定多球殼菌素及其類似物的藥代動力學。
權利要求
1、一種多球殼菌素衍生物，化學式是(I)
2、 如權利要求1所述的多球殼菌素衍生物，其製備方法如下 取多球殼菌素和芴甲氧羰醯氯，分別溶於吡啶和四氫呋喃，再將這 兩種溶液按體積比為1 2 : 1 100進行混合，反應溫度10 60 °C， 反應時間0.01 120 min，得到含化學式(I)的反應物；蒸乾該反 應物的溶劑，剩餘物以矽膠為色譜介質純化，用體積比是8 : 2的氯 仿、甲醇混合溶液進行洗脫，分部收集餾分，蒸乾溶劑，用乙醇結 晶，乾燥得化學式(I)化合物。
3、 如權利要求1所述的多球殼菌素衍生物在定量測定含多球殼 菌素的生物製品中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種多球殼菌素衍生物及其製備方法，是在吡啶和四氫呋喃溶液提供反應環境的條件下，向多球殼菌素中加入芴甲氧羰醯氯，兩者反應後生成多球殼菌素衍生物，該衍生物在多球殼菌素的氨基上引入具有紫外特徵吸收峰的基團，再通過高效液相色譜可以進行定量分析，從而進一步定量表徵多球殼菌素。該方法測定結果可靠精確，可用於測定蟬花、冬蟲夏草等中藥材中多球殼菌素含量及測定含蟬花或冬蟲夏草及其提取物的製劑，也可用於測定生物樣品中的多球殼菌素含量。
文檔編號C07D307/00GK101508686SQ20091010303
公開日2009年8月19日 申請日期2009年1月8日 優先權日2009年1月8日
發明者餘佳文, 徐紅娟, 朱華李, 毛先兵, 鍾國躍, 陳仕江, 馬開森 申請人:重慶市中藥研究院