可被O-糖基化修飾的多肽的製作方法
2023-06-08 22:20:16 1
本發明涉及生物醫學領域中可被O-糖基化修飾的多肽。
背景技術：
在很長一段時間內，人們一直認為蛋白糖基化只存在於真核生物中。自從1974年Mescher首次發現細菌中存在糖蛋白以及糖基化修飾以來，人們已經在原核、真核、古生菌等所有生命領域均發現蛋白糖基化的存在。
蛋白糖基化包括O-糖基化和N-糖基化，細菌中大多為O-糖基化。腦膜炎奈瑟球菌糖基轉移酶PglL為O-寡糖轉移酶，單獨存在即可催化腦膜炎奈瑟球菌Ⅳ型菌毛蛋白PilE發生O-糖基化。同時由於糖基化過程和細菌脂多糖LPS的合成具有很大的相似性，因此可以利用細菌的糖基化生產多糖結合疫苗。目前只有三套糖基化系統(PglB、PglL、PilO)成功地在大腸桿菌中表達，使外源細菌多糖轉移至底物蛋白中。同PglB相比，PglL一個優勢即具有更加寬鬆的底物特異性，可以轉移更多的聚糖。從而為生物法生產多糖結合疫苗提供了更廣泛的空間。
目前生物法生產多糖結合疫苗利用細菌中PglB的蛋白N-糖基化修飾，其中一個原因是其糖基化位點已經明確，不同於真核中的保守三肽結構N-X-S/T，原核細菌N糖基化修飾位點是D/E-Y-N-X-S/T的五肽結構，因此可以將這個短的位點插入不同的底物蛋白中使其糖基化。目前已有相關N-糖基化的多糖結合疫苗進入一期臨床試驗。儘管PglL比PglB識別更多的糖，然而蛋白O-糖基化位點並不明確，已發現的PglL的天然底物蛋白在糖基化位點周圍序列並無特殊的結構或規律，使得在利用O-糖基化生產多糖結合疫苗時必須截取天然底物蛋白糖基化位點周圍較長的一段區域(20個左右胺基酸)作為糖基化位點，而在免疫識別過程中，MHC-II識別肽段長度約為15-30個胺基酸。由於糖基化位點序列過長使得最終被識別的的糖-肽中肽的序列單一，不利於抗原的遞呈及識別等免疫過程。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題是如何製備多糖結合疫苗。
為解決上述技術問題，本發明首先提供了a1)或a2)的多肽：
a1)序列為W-P-Xn-S-Ym的多肽；a2)含有a1)所述序列的多肽；
其中，Xn為1或2或3或4個胺基酸，Ym為1或2或3個胺基酸。
上述多肽中，所述胺基酸為20種天然胺基酸中的任一種。
上述多肽中，所述Xn的序列是下述A1)-A12)中的任一種：A1)A-A-A；A2)A-A；A3)A；A4)G-N-N-T；A5)A-N-N-T；A6)G-A-N-T；A7)G-N-A-T；A8)G-N-N-A；A9)G-A-T；A10)G-T；A11)G-N-T；A12)G-A-A；
所述Ym的序列是下述B1)-B25)中的任一種：B1)A-G-V；B2)A-P；B3)A-G；B4)G-P；B5)M-P；B6)S-P；B7)Q-P；B8)F-P；B9)V-P；B10)L-P；B11)I-P；B12)P-P；B13)N-P；B14)T-P；B15)C-P；B16)A-A-V；B17)A-G-A；B18)A；B19)W-P；B20)Y-P；B21)D-P；B22)E-P；B23)K-P；B24)R-P；B25)H-P。
上述多肽中，a1)所述多肽的胺基酸序列是C1)-C36)中的任一種：
C1)序列表中SEQ ID No.2的第32-41位胺基酸；
C2)序列表中SEQ ID No.5的第11-19位胺基酸；
C3)序列表中SEQ ID No.6的第11-18位胺基酸；
C4)序列表中SEQ ID No.7的第11-17位胺基酸；
C5)序列表中SEQ ID No.8的第11-20位胺基酸；
C6)序列表中SEQ ID No.9的第11-20位胺基酸；
C7)序列表中SEQ ID No.10的第11-20位胺基酸；
C8)序列表中SEQ ID No.11的第11-20位胺基酸；
C9)序列表中SEQ ID No.12的第11-19位胺基酸；
C10)序列表中SEQ ID No.13的第11-18位胺基酸；
C11)序列表中SEQ ID No.14的第11-19位胺基酸；
C12)序列表中SEQ ID No.15的第11-19位胺基酸；
C13)序列表中SEQ ID No.16的第11-18位胺基酸；
C14)序列表中SEQ ID No.17的第11-18位胺基酸；
C15)序列表中SEQ ID No.18的第11-18位胺基酸；
C16)序列表中SEQ ID No.19的第11-18位胺基酸；
C17)序列表中SEQ ID No.20的第11-18位胺基酸；
C18)序列表中SEQ ID No.21的第11-18位胺基酸；
C19)序列表中SEQ ID No.22的第11-18位胺基酸；
C20)序列表中SEQ ID No.23的第11-18位胺基酸；
C21)序列表中SEQ ID No.24的第11-18位胺基酸；
C22)序列表中SEQ ID No.25的第11-18位胺基酸；
C23)序列表中SEQ ID No.26的第11-18位胺基酸；
C24)序列表中SEQ ID No.27的第11-18位胺基酸；
C25)序列表中SEQ ID No.28的第11-18位胺基酸；
C26)序列表中SEQ ID No.29的第11-18位胺基酸；
C27)序列表中SEQ ID No.30的第11-20位胺基酸；
C28)序列表中SEQ ID No.31的第11-20位胺基酸；
C29)序列表中SEQ ID No.32的第11-17位胺基酸；
C30)序列表中SEQ ID No.33的第11-18位胺基酸；
C31)序列表中SEQ ID No.34的第11-18位胺基酸；
C32)序列表中SEQ ID No.35的第11-18位胺基酸；
C33)序列表中SEQ ID No.36的第11-18位胺基酸；
C34)序列表中SEQ ID No.37的第11-18位胺基酸；
C35)序列表中SEQ ID No.38的第11-18位胺基酸；
C36)序列表中SEQ ID No.39的第11-18位胺基酸。
上述多肽中，a2)所述多肽還含有下述b1)或b2)或b3)：
b1)1個或多個胺基酸；
b2)1個親水胺基酸或親水肽段；
b3)將所述b1)與所述b2)連接得到的肽段；
所述b1)或所述b2)或所述b3)位於所述多肽的N端或/和C端。
上述多肽中，所述肽段為由兩個或兩個以上胺基酸連接得到的多肽。
上述多肽中，所述親水胺基酸為可溶於水的胺基酸，如絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、半胱氨酸、穀氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸和/或甘氨酸。
上述多肽中，a2)所述多肽的胺基酸序列為下述D1)或D2)：
D1)序列表中SEQ ID No.3的第11-21位胺基酸；
D2)序列表中SEQ ID No.4的第11-22位胺基酸；
和/或，
所述親水肽段的胺基酸序列為下述E1)或E2)：
E1)序列表中SEQ ID No.2的第22-31位胺基酸；
E2)序列表中SEQ ID No.2的第42-48位胺基酸。
上述多肽中，a2)所述多肽的胺基酸序列為下述F1)-F38)：
F1)序列表中SEQ ID No.2的第22-48位胺基酸；F2)序列表中SEQ ID No.3；F3)序列表中SEQ ID No.4；F4)序列表中SEQ ID No.5；F5)序列表中SEQ ID No.6；F6)序列表中SEQ ID No.7；F7)序列表中SEQ ID No.8；F8)序列表中SEQ ID No.9；F9)序列表中SEQ ID No.10；F10)序列表中SEQ ID No.11；F11)序列表中SEQ ID No.12；F12)序列表中SEQ ID No.13；F13)序列表中SEQ ID No.14；F14)序列表中SEQ ID No.15；F15)序列表中SEQ ID No.16；F16)序列表中SEQ ID No.17；F17)序列表中SEQ ID No.18；F18)序列表中SEQ ID No.19；F19)序列表中SEQ ID No.20；F20)序列表中SEQ ID No.21；F21)序列表中SEQ ID No.22；F22)序列表中SEQ ID No.23；F23)序列表中SEQ ID No.24；F24)序列表中SEQ ID No.25；F25)序列表中SEQ ID No.26；F26)序列表中SEQ ID No.27；F27)序列表中SEQ ID No.28；F28)序列表中SEQ ID No.29；F29)序列表中SEQ ID No.30；F30)序列表中SEQ ID No.31；F31)序列表中SEQ ID No.32；F32)序列表中SEQ ID No.33；F33)序列表中SEQ ID No.34；F34)序列表中SEQ ID No.35；F35)序列表中SEQ ID No.36；F36)序列表中SEQ ID No.37；F37)序列表中SEQ ID No.38；F38)序列表中SEQ ID No.39。
為解決上述技術問題，本發明還提供了與所述多肽相關的生物材料。
本發明所提供的與所述多肽相關的生物材料，為M或N：
M、下述M1)至M8)中的任一種：
M1)編碼所述多肽的核酸分子；
M2)含有M1)所述核酸分子的表達盒；
M3)含有M1)所述核酸分子的重組載體；
M4)含有M2)所述表達盒的重組載體；
M5)含有M1)所述核酸分子的重組微生物；
M6)含有M2)所述表達盒的重組微生物；
M7)含有M3)所述重組載體的重組微生物；
M8)含有M4)所述重組載體的重組微生物；
N、下述N1)至N12)中的任一種：
N1)由編碼所述多肽的核酸分子和編碼寡糖轉移酶的核酸分子組成的組合物；
N2)含有N1)所述組合物的表達盒；
N3)表達盒組合物，由N3a)的表達盒和N3b)的表達盒組成：
N3a)含有編碼所述多肽的核酸分子但不含有編碼所述寡糖轉移酶的核酸分子的表達盒；
N3b)含有編碼所述寡糖轉移酶的核酸分子但不含有編碼所述多肽的核酸分子的表達盒；
N4)含有N1)所述組合物的重組載體；
N5)重組載體組合物，由N5a)的重組載體和N5b)的重組載體組成：
N5a)含有編碼所述多肽的核酸分子但不含有編碼所述寡糖轉移酶的核酸分子的重組載體；
N5b)含有編碼所述寡糖轉移酶的核酸分子但不含有編碼所述多肽的核酸分子的重組載體；
N6)重組載體組合物，由N6a)的重組載體和N6b)的重組載體組成：
N6a)含有N3a)所述表達盒的重組載體；
N6b)含有N3b)所述表達盒的重組載體；
N7)含有N1)所述組合物的重組微生物；
N8)含有N2)所述表達盒的重組微生物；
N9)含有N3)所述表達盒組合物的重組微生物；
N10)含有N4)所述重組載體的重組微生物；
N11)含有N5)所述重組載體組合物的重組微生物；
N12)含有N6)所述重組載體組合物的重組微生物。
本領域普通技術人員可以很容易地採用已知的方法，例如定向進化和點突變的方法，對本發明的編碼所述多肽的核苷酸序列進行突變。那些經過人工修飾的，具有與本發明分離得到的多肽的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼所述多肽且具有所述多肽的功能，均是衍生於本發明的核苷酸序列並且等同於本發明的序列。
這裡使用的術語「同一性」指與天然核酸序列的序列相似性。「同一性」包括與本發明的編碼所述多肽的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟體進行評價。使用計算機軟體，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關序列之間的同一性。
上述生物材料中，所述載體可為質粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。所述質粒具體可為pET28a(+)。
上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細菌、藻或真菌。所述細菌具體可為福氏志賀氏菌2a 301野生株(S.flexneri 2a 301)或S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI。所述S.flexneri2a 301ΔpCPΔwaaI為將所述福氏志賀氏菌2a 301野生株(S.flexneri 2a 301)的編碼毒力因子的大質粒pCP去除及將O抗原連接酶基因waaI缺陷得到的菌株。
在本發明的實施例中，所述多肽的編碼基因通過含有所述多肽的編碼基因的表達盒的重組載體導入所述S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI中。所述重組載體的製備方法如下：將pET28a(+)的XbaI和XhoI識別序列間的DNA片段替換為SEQ ID No.41所示的XbaI和XhoI間的DNA片段，得到表達SEQ ID No.40所示的腦膜炎奈瑟球菌糖基轉移酶PglL的重組載體pET28tacpglL；將pET28tacpglL的SacI和PstI識別序列間的DNA片段替換為所述含有所述多肽的融合蛋白的編碼基因，得到重組載體，將該重組載體命名為重組載體1。重組載體1中，所述腦膜炎奈瑟球菌糖基轉移酶的編碼基因和所述融合蛋白的編碼基因位於兩個獨立的表達盒中，所述腦膜炎奈瑟球菌糖基轉移酶的編碼基因和所述融合蛋白的編碼基因的表達由兩個獨立的啟動子啟動，重組載體1表達所述腦膜炎奈瑟球菌糖基轉移酶和含有所述多肽的融合蛋白；所述融合蛋白從N端至C端依次為DsbA信號肽、所述多肽、載體蛋白細菌毒素蛋白的無毒突變體rEPA和His tag。
在本發明的實施例中，所述重組載體1為如下重組載體：pET28tacpglL-tacrEPA4573、pET28tacpglL-tacrEPA5766aa、pET28tacpglL-tacrEPA5666aa、pET28tacpglL-tacrEPA5566aa、pET28tacpglL-tacrEPA5866aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766W57A aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766P58A aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766G59A aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766N60A aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766N61A aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766T62A aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766G65A aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766V66A aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766AAA aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766AA aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766A aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766WPS aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766GAT aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766GT aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766GNT aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766GAA aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SAP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SAG aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SA aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SGP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SMP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SSP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SQP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SFP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SVP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SLP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SIP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SPP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SNP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA STP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SCP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SWP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SYP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SDP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SEP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SKP AA、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SRP aa和pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SHP aa。
在本發明的實施例中，所述重組菌為如下的重組菌：301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA4573、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5666aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5566aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5866aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766W57A aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766P58A aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766G59Aaa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766N60A aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766N61A aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766T62Aaa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766G65A aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766V66A aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766AAAaa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766AA aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766A aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766WPS aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766GAT aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766GT aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766GNT aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766GAA aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SAP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASAG aa、301ΔpCPΔ waaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SA aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASGP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SMP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SSP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASQP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SFP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SVP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASLP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SIP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SPP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASNP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA STP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SCP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASWP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SYP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SDP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASEP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SKP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SRP aa和301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SHP aa。
為解決上述技術問題，本發明還提供了下述c1)-c6)中的任一種產品：
c1)將所述多肽和載體蛋白進行融合得到的融合蛋白；
c2)利用所述生物材料製備的含有所述多肽的融合蛋白；
c3)對c1)或c2)所述融合蛋白進行糖基化修飾得到的糖蛋白；
c4)由所述多肽與所述寡糖轉移酶組成的成套試劑；
c5)由M所述生物材料與所述寡糖轉移酶組成的成套試劑；
c6)由c1)或c2)所述融合蛋白與所述寡糖轉移酶組成的成套試劑。
上述產品中，所述糖基化為O-糖基化；所述寡糖轉移酶可為O-寡糖轉移酶。所述O-寡糖轉移酶具體可為所述腦膜炎奈瑟球菌糖基轉移酶。所述腦膜炎奈瑟球菌糖基轉移酶的胺基酸序列為序列表中SEQ ID No.40。
所述融合蛋白可含有信號肽和/或標籤。所述載體蛋白可為細菌毒素蛋白的無毒突變體或細菌毒素蛋白的部分片段。
在本發明的一個實施例中，所述信號肽為DsbA信號肽，所述DsbA信號肽的胺基酸序列為序列表中SEQ ID No.1的第1-21位胺基酸；所述標籤為His-tag；所述載體蛋白為綠膿桿菌毒素A的無毒突變體，所述綠膿桿菌毒素A無毒突變體的胺基酸序列為序列表中SEQ ID No.1的第53-662位胺基酸。所述融合蛋白從N端至C端依次為所述DsbA信號肽、所述多肽、所述綠膿桿菌重組去毒外毒素和His-tag。
為解決上述技術問題，本發明還提供了下述任一應用：
H1、所述多肽或所述生物材料在製備c1)或c2)所述融合蛋白中的應用；
H2、所述多肽或所述生物材料在製備c3)所述糖蛋白中的應用；
H3、所述多肽或所述生物材料在製備多糖結合疫苗中的應用；
H4、所述多肽或所述生物材料在製備抗體中的應用；
H5、所述產品在製備多糖結合疫苗中的應用；
H6、所述產品在製備抗體中的應用。
為解決上述技術問題，本發明還提供了預防和/或治療細菌引起的疾病的藥物。
本發明所提供的預防和/或治療細菌引起的疾病的藥物，它的活性成分是c3)所述糖蛋 白。
上述藥物中，所述預防和/或治療細菌引起的疾病的藥物可為多糖結合疫苗。
上文中，所述胺基酸可為胺基酸或其殘基。A表示丙氨酸(或其殘基)，R表示精氨酸(或其殘基)，N表示天冬醯胺(或其殘基)，D表示天冬氨酸(或其殘基)，C表示半胱氨酸(或其殘基)，Q表示穀氨醯胺(或其殘基)，E表示穀氨酸(或其殘基)，G表示甘氨酸(或其殘基)，H表示組氨酸(或其殘基)，I表示異亮氨酸(或其殘基)，L表示亮氨酸(或其殘基)，K表示賴氨酸(或其殘基)，M表示甲硫氨酸(或其殘基)，F表示苯丙氨酸(或其殘基)，P表示脯氨酸(或其殘基)，S表示絲氨酸(或其殘基)，T表示蘇氨酸(或其殘基)，W表示色氨酸(或其殘基)，Y表示酪氨酸(或其殘基)，V表示纈氨酸(或其殘基)。
實驗證明，本發明所提供的可被O-糖基化的多肽可僅包括W-P-Xn-S-Ym的多肽(即核心肽段)，序列達到了最短，可插入蛋白表面較強免疫原性的部位，利於抗原的遞呈及被MHC-II識別等免疫過程，本發明所提供的可被O-糖基化的多肽可用於生物法生產多糖結合疫苗。
附圖說明
圖1為S.flexneri 2a 301ΔpCP的PCR鑑定。
圖2為S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI的PCR鑑定。其中，301ΔpCPΔwaaI代表S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI，野生株301代表野生株S.flexneri 2a 301；泳道1和5為引物為waaI內部引物時的PCR產物；泳道2和6為引物為waaI外部引物時的PCR產物；泳道3和7為引物為waaIw5和kanf3時的PCR產物；泳道4和8為引物為Kan基因引物時的PCR產物。
圖3為重組菌301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA4573和301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglLmut-tacrEPA4573表達蛋白的O-糖基化情況。其中，泳道1表示S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI，泳道2表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglLmut-tacrEPA4573，泳道3表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA4573；Coomassie表示考馬斯亮藍染色結果，Anti-His表示HRP標記的Anti-His抗體的檢測結果，Anti-S.flexneri 2a serum表示一抗為兔源福氏I I型血清的檢測結果。
圖4為4573截短片段的O-糖基化檢測結果。其中，Control表示宿主菌S.flexneri2a 301ΔpCPΔwaaI，EPA4573pglLmut表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglLmut-tacrEPA4573，EPA4573表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA4573，EPA5573表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5573，EPA5569表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5569，EPA5566表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5566，EPA5866表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5866。
圖5為含有親水肽段的多肽的O-糖基化檢測結果。其中，Control表示S.flexneri 2a301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglLmut-tacrEPA4573，EPA5766+AA表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766aa，EPA5666+AA表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5666aa，EPA5566+AA表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5566aa，EPA5866+AA表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5866aa；Coomassie表示考馬斯亮藍染色結果，Anti-EPA表示一抗為兔源Anti-EPA抗體的檢測結果，Anti-S.flexneri 2a serum表示一抗為兔源福氏II型血清的檢測結果。
圖6為將5766中胺基酸突變後得到的多肽的O-糖基化檢測結果。其中，W57A表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766W57A aa，P58A表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766P58A aa，G59A表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766G59A aa，N60A表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766N60A aa，N61A表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766N61A aa，T62A表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766T62A aa，G65A表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766G65A aa，V66A表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766V66A aa；Coomassie表示考馬斯亮藍染色結果，Anti-EPA表示一抗為兔源Anti-EPA抗體的檢測結果，Anti-S.flexneri 2a serum表示一抗為兔源福氏I I型血清的檢測結果。
圖7為將5766中WP與S間的G-N-N-T突變後得到的多肽的O-糖基化檢測。其中，GNT表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766GNT aa，GT表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766GT aa，GAT表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766GAT aa，GAA表示pET28tacpglL-tacrEPA5766GAA aa，AAA表示pET28tacpglL-tacrEPA5766AAA aa，WPAAAS表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766AAA aa，WPAAS表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766AA aa，WPAS表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766A aa，WPS表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766WPS aa；Coomassie表示考馬斯亮藍染色結果，Anti-EPA表示一抗為兔源Anti-EPA抗體的檢測結果，Anti-S.flexneri 2a serum表示一抗為兔源福氏II型血清的檢測結果。
圖8為將5766AAA aa中S位點後的AGV突變後得到的多肽的O-糖基化定性檢測結果。其中，Control表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacrEPA5763AAA SAP aa，SAGV表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766AAA aa，SAG表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASAG aa，SA表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SA aa，SAP表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SAP aa，SP表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SP aa，SGP表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SGP aa，SMP表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SMP aa，SSP表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SSP aa，SQP表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SQP aa，SFP表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SFP aa，SVP表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SVP aa，SLP表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SLP aa，SIP表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SIP aa，SPP表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SPP aa，SNP表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SNP aa，STP表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA STP aa，SCP表示301ΔpCPΔ waaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SCP aa，SWP表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SWP aa，SYP表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SYP aa，SDP表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SDP aa，SEP表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SEP aa，SKP表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SKP aa，SRP表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SRP aa，SHP表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SHP aa；Coomassie表示考馬斯亮藍染色結果，Anti-EPA表示一抗為兔源Anti-EPA抗體的檢測結果，Anti-S.flexneri 2a serum表示一抗為兔源福氏I I型血清的檢測結果。
圖9為將5766AAA aa中S位點後的AGV突變後得到的多肽的O-糖基化定量檢測結果。其中，A表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SAP aa，G表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SGP aa，M表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SMP aa，S表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SSP aa，Q表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SQP aa，F表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SFP aa，V表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SVP aa，L表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SLP aa，I表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SIP aa，P表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SPP aa，N表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SNP aa，T表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA STP aa，C表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SCP aa，W表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SWP aa，Y表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SYP aa，D表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SDP aa，E表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SEP aa，K表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SKP aa，R表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SRP aa，H表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SHP aa，Control表示301ΔpCPΔwaaI/pET28tacrEPA5763AAA SAP aa；EPA表示一抗為兔源Anti-EPA抗體的檢測結果，Anti-S.flexneri 2a serum表示一抗為兔源福氏II型血清的檢測結果。
具體實施方式
下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的範圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
下述實施例中的福氏志賀氏菌2a 301野生株(S.flexneri 2a 301)(Genome sequence of Shigella flexneri 2a:insights into pathogenicity through comparison with genomes of Escherichia coli K12and O157,Nucl.Acids Res 2002,30(20):4432-4441)公眾可從 中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所獲得，該生物材料只為重複本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。
下述實施例中的pKDinc重組質粒(Global Analysis of a Plasmid-Curred Shigella flexneri Strain:New Instghts into the Interaction between the Chromosome and a Virulence Plasmid,Journal of Proteome Research,2010,9(2):843-854)公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所獲得，該生物材料只為重複本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。pKDinc重組質粒為溫度敏感型質粒，氨苄青黴素抗性。
下述實施例中的pCP20質粒(Datsenko,K.A.and B.L.Wanner.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products[J].Proc.natl.Acad.Sci.U.S.A,2000,97(12):6640-6645)公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所獲得，該生物材料只為重複本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。pCP20質粒為氯黴素抗性。
下述實施例中的pET28a(+)購自Novagen。
下述實施例中的pKOBEG質粒(A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans[J].Nucleic Acids Res.2000Nov15；28(22):E97)公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所獲得，該生物材料只為重複本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。pKOBEG質粒為溫度敏感型質粒，氯黴素抗性。
下述實施例中的HRP標記的Anti-His抗體為Abmart產品，貨號為M20020。
下述實施例中的兔源福氏I I型血清為日本生研株式會社產品，編號為210227。
下述實施例中的HRP標記的山羊抗兔為TransGen公司產品，編號為HS-101-01。
下述實施例中的兔源Anti-EPA抗體為Sigma產品，貨號為P2318。
下述實施例的序列中，A表示丙氨酸，R表示精氨酸，N表示天冬醯胺，D表示天冬氨酸，C表示半胱氨酸，Q表示穀氨醯胺，E表示穀氨酸，G表示甘氨酸，H表示組氨酸，I表示異亮氨酸，L表示亮氨酸，K表示賴氨酸，M表示甲硫氨酸，F表示苯丙氨酸，P表示脯氨酸，S表示絲氨酸，T表示蘇氨酸，W表示色氨酸，Y表示酪氨酸，V表示纈氨酸。
實施例1、多肽的O-糖基化
本實施例提供的多肽為a1)和a2)的多肽：a1)序列為W-P-Xn-S-Ym的多肽(即核心肽段)；a2)含有a1)所述序列的多肽；其中，Xn為1或2或3或4個胺基酸，Ym為1或2或3個胺基酸，a1)和a2)的多肽均可被O-糖基化。Xn的胺基酸序列是下述A1)-A12)中的任一種：A1)A-A-A；A2)A-A；A3)A；A4)G-N-N-T；A5)A-N-N-T；A6)G-A-N-T；A7)G-N-A-T；A8)G-N-N-A；A9)G-A-T；A10)G-T；A11)G-N-T；A12)G-A-A；Ym的胺基酸序列是下述B1)-B25)中的任一種：B1)A-G-V；B2)A-P；B3)A-G；B4)G-P；B5)M-P；B6)S-P；B7)Q-P；B8)F-P；B9)V-P；B10)L-P；B11)I-P；B12)P-P；B13)N-P；B14)T-P；B15)C-P；B16)A-A-V；B17)A-G-A；B18)A；B19)W-P；B20)Y-P；B21)D-P；B22)E-P；B23)K-P；B24)R-P；B25)H-P。
a1)的多肽具體為胺基酸序列是C1)-C36)中任一種的多肽：C1)序列表中SEQ ID No.2的第32-41位胺基酸；C2)序列表中SEQ ID No.5的第11-19位胺基酸；C3)序列表中SEQ ID No.6的第11-18位胺基酸；C4)序列表中SEQ ID No.7的第11-17位胺基酸；C5)序列表中SEQ ID No.8的第11-20位胺基酸；C6)序列表中SEQ ID No.9的第11-20位胺基酸；C7) 序列表中SEQ ID No.10的第11-20位胺基酸；C8)序列表中SEQ ID No.11的第11-20位胺基酸；C9)序列表中SEQ ID No.12的第11-19位胺基酸；C10)序列表中SEQ ID No.13的第11-18位胺基酸；C11)序列表中SEQ ID No.14的第11-19位胺基酸；C12)序列表中SEQ ID No.15的第11-19位胺基酸；C13)序列表中SEQ ID No.16的第11-18位胺基酸；C14)序列表中SEQ ID No.17的第11-18位胺基酸；C15)序列表中SEQ ID No.18的第11-18位胺基酸；C16)序列表中SEQ ID No.19的第11-18位胺基酸；C17)序列表中SEQ ID No.20的第11-18位胺基酸；C18)序列表中SEQ ID No.21的第11-18位胺基酸；C19)序列表中SEQ ID No.22的第11-18位胺基酸；C20)序列表中SEQ ID No.23的第11-18位胺基酸；C21)序列表中SEQ ID No.24的第11-18位胺基酸；C22)序列表中SEQ ID No.25的第11-18位胺基酸；C23)序列表中SEQ ID No.26的第11-18位胺基酸；C24)序列表中SEQ ID No.27的第11-18位胺基酸；C25)序列表中SEQ ID No.28的第11-18位胺基酸；C26)序列表中SEQ ID No.29的第11-18位胺基酸；C27)序列表中SEQ ID No.30的第11-20位胺基酸；C28)序列表中SEQ ID No.31的第11-20位胺基酸；C29)序列表中SEQ ID No.32的第11-17位胺基酸；C30)序列表中SEQ ID No.33的第11-18位胺基酸；C31)序列表中SEQ ID No.34的第11-18位胺基酸；C32)序列表中SEQ ID No.35的第11-18位胺基酸；C33)序列表中SEQ ID No.36的第11-18位胺基酸；C34)序列表中SEQ ID No.37的第11-18位胺基酸；C35)序列表中SEQ ID No.38的第11-18位胺基酸；C36)序列表中SEQ ID No.39的第11-18位胺基酸。
a2)的多肽為在a2)多肽的兩端分別連接序列表中SEQ ID No.2的第22-31位胺基酸所示的親水肽段1和SEQ ID No.2的第44-50位胺基酸所示的親水肽段2得到的多肽，具體如下：
序列表中SEQ ID No.2的第22-48位胺基酸所示的肽段，將其命名為5766aa，5766aa的編碼序列為序列表中SEQ ID No.43的第64-144位核苷酸；
SEQ ID No.5所示的肽段，將其命名為5766AAA aa，5766AAA aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTGCCGGCGTG CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.6所示的肽段，將其命名為5766AA aa，5766AA aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccGCTTCTGCCGGCGTG CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.7所示的肽段，將其命名為5766A aa，5766A aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccGCTTCTGCCGGCGTG CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.8所示的肽段，將其命名為5766G59A aa，5766G59A aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGCCCgccAACAACACTTCTGCCGGCGTGCAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.9所示的肽段，將其命名為5766N60A aa，5766N60A aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGCCCGGCgccAACACTTCTGCCGGCGTGCAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.10所示的肽段，將其命名為5766N61A aa，5766N61A aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGCCCGGCAACgccACTTCTGCCGGCGTGCAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.11所示的肽段，將其命名為5766T62A aa，5766T62A aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGCCCGGCAACAACgctTCTGCCGGCGTGCAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.12所示的肽段，將其命名為5766GAT aa，5766GAT aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccggcgcCACTTCTGCCGGCGTG CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.13所示的肽段，將其命名為5766GT aa，5766GT aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccggcACTTCTGCCGGCGTG CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.14所示的肽段，將其命名為5766GNT aa，5766GNT aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccggcAACACTTCTGCCGGCGTG CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.15所示的肽段，將其命名為5766GAA aa，5766GAA aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccggcgccGCTTCTGCCGGCGTG CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.16所示的肽段，將其命名為5763AAA SAP aa，5763AAA SAP aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTGCCccc CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.17所示的肽段，將其命名為5763AAASAG aa，5763AAASAG aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTGCCGGC CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.18所示的肽段，將其命名為5763AAA SGP aa，5763AAA SGP aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTGCCccc CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.19所示的肽段，將其命名為5763AAA SMP aa，5763AAA SMP aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTATGCCC CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.20所示的肽段，將其命名為5763AAA SSP aa，5763AAA SSP aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTAGTCCC CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.21所示的肽段，將其命名為5763AAA SQP aa，5763AAA SQP aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTCAACCC CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.22所示的肽段，將其命名為5763AAA SFP aa，5763AAA SFP aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTTTTCCC CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.23所示的肽段，將其命名為5763AAA SVP aa，5763AAA SVP aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTGTCCCC CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.24所示的肽段，將其命名為5763AAA SLP aa，5763AAA SLP aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTCTCCCC CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.25所示的肽段，將其命名為5763AAA SIP aa，5763AAA SIP aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTATCCCC CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.26所示的肽段，將其命名為5763AAA SPP aa，5763AAA SPP aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTCCACCC CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.27所示的肽段，將其命名為5763AAA SNP aa，5763AAA SNP aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTAATCCC CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.28所示的肽段，將其命名為5763AAA STP aa，5763AAA STP aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTACTCCC CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.29所示的肽段，將其命名為5763AAA SCP aa，5763AAA SCP aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTTGTCCC CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.30所示的肽段，將其命名為5766G65A aa，5766G65A aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGCCCGGCAACAACACTTCTGCCgccGTGCAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.31所示的肽段，將其命名為5766V66A aa，5766V66A aa的編碼序列為 GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGCCCGGCAACAACACTTCTGCCGGCgcgCAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.32所示的肽段，將其命名為5763AAA SA aa，5763AAA SA aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTGCC CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.33所示的肽段，將其命名為5763AAA SWP aa，5763AAA SWP aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTTGGCCC CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.34所示的肽段，將其命名為5763AAA SYP aa，5763AAA SYP aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTTATCCC CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.35所示的肽段，將其命名為5763AAA SDP aa，5763AAA SDP aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTGATCCC CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.36所示的肽段，將其命名為5763AAA SEP aa，5763AAA SEP aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTGAACCC CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.37所示的肽段，將其命名為5763AAA SKP aa，5763AAA SKP aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTAAGCCC CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.38所示的肽段，將其命名為5763AAA SRP aa，5763AAA SRP aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTCGTCCC CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
SEQ ID No.39所示的肽段，將其命名為5763AAA SHP aa，5763AAA SHP aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTCATCCC CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC。
本實施例所提供的多肽還可以是在親水肽段和核心肽段間插入其他胺基酸(G和E)得到的多肽，具體為：SEQ ID No.3所示的肽段和SEQ ID No.4所示的肽段。將SEQ ID No.3所示的肽段命名為5666aa，5666aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACGAATGGCCCGGCAACAACACTTCTGCCGGCGTGCAGCCCGGCAAACCGCCGCGC；
將SEQ ID No.4所示的肽段命名為5566aa，5566aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACGGCGAATGGCCCGGCAACAACACTTCTGCCGGCGTGCAGCCCGGCAAACCGCCGCGC。
一、宿主菌S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI的構建
志賀氏菌(S.flexneri)俗稱痢疾桿菌，作為一種具有高度傳染性的革蘭氏陰性腸道致病菌，主要通過侵入人結腸上皮細胞最終定位於大腸，而引起典型細菌性痢疾(發熱、腹痛、裡急後重、大便膿血)，而毒力大質粒則是其致病性的最主要的因素，毒力大質粒包含有大概32個與毒力有關的基因，主要包括與III型分泌系統有關的mxi-spa基因、與細菌侵入上皮細胞密切相關的ipaBCD以及ipgC等毒力基因。為了將其開發為安全的宿主菌，必須先將其編碼毒力因子的大質粒pCP去除，在此基礎上再將O抗原連接酶基因waaI缺陷，從而開發成適於本發明的宿主菌。S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI的構建方法如下：
(一)毒力大質粒缺失株S.flexneri 2a 301ΔpCP的構建
1、福氏志賀氏菌2a 301野生株感受態細胞的製備
1)將福氏志賀氏菌2a 301野生株(S.flexneri 2a 301)接種於LB液體培養基中，30℃過夜培養後，將1ml培養液轉接到100mL低鹽LB液體培養基中，30℃培養至OD600達到0.6。
2)離心收集菌體，用滅菌的體積百分含量為10％甘油的水溶液洗滌四次，最後用400uL滅菌的體積百分含量為10％甘油的水溶液重懸細菌，即可獲得電擊轉化用的S.flexneri 2a 301感受態細胞，分裝待用。
2、毒力大質粒的缺失
1)inc是志賀氏菌毒力大質粒pCP上與其複製相關的一段序列片段，將帶有inc片段的pKDinc重組質粒導入步驟1製備的S.flexneri 2a 301感受態細胞中，得到中間重組菌，將其命名為S.flexneri 2a 301/pKDinc。
2)將S.flexneri 2a 301/pKDinc在含有濃度為50μg/mL的氨苄青黴素的LB液體培養基中連續傳代3次以上，以保證毒力大質粒的丟失，得到待測菌株菌液，之後將待測菌株菌液塗布在氨苄青黴素抗性的LB固體培養基上，待長出單菌落之後，提取待測菌株單菌落的基因組DNA，以其為模板，分別以ipaA、ipgB、mxiD、virG的引物為引物，進行PCR擴增，通過驗證毒力基因ipaA、ipgB、mxiD、virG檢測毒力大質粒pCP是否丟失,同時以S.flexneri2a 301的基因組DNA為對照，進行上述PCR擴增。
ipaA的引物如下：ipaAp1:5』-AAGATTCTGCCTTTGGACC-3』；ipaAp2:5』-GTGGTTGAAGAGTTCTGTATG-3』。
ipgB的引物如下：ipgB1U:5』-TGCTTTGACGGTATACAGC-3』；ipgB1L:5』-ACTTCCACAGGTTGAATTCG-3』。mxiD的引物如下：mxiDU:5』-AAGCAGGTTTCTTCTATTGG-3』；mxiDL:5』-GAACACATTACCGATTACAGG-3』。
virG的引物如下：VirGp1:5』-CATCAATCCGTTACTCACT-3』；VirGp2:5』-ACTACCAGCAACAATACG-3』。
結果如圖1中A所示。圖1中A中，301代表福氏志賀氏菌2a 301野生株S.flexneri 2a301；301ΔpCP代表步驟2)得到的待測菌株。結果表明，在福氏志賀氏菌2a 301野生株S.flexneri 2a 301中，ipaA、ipgB、mxiD、virG基因都出現了目的擴增片段，分別為888bp的ipaA目的片段、595bp的ipgB目的片段、986bp的mxiD目的片段、777bp的virG目的片段。而步驟2)的待測菌株中，ipaA、ipgB、mxiD、virG基因均無擴增片段，說明毒力大質粒成功丟失，將待測菌株(利用質粒不相容原理將毒力大質粒驅除而只保留有pKDinc質粒的重組菌)命名為S.flexneri 2a 301ΔpCP/pKDinc。
3)再利用pKDinc質粒的溫度敏感特性，將S.flexneri 2a 301ΔpCP/pKDinc在無抗生素的液體LB培養基中42℃連續培養2代，得到在無抗生素的LB固體培養基上可以生長，但在含有氨苄青黴素抗性的LB固體培養基上不長的菌株，該菌株為在S.flexneri 2a301ΔpCP/pKDinc的基礎上丟失pKDinc重組質粒得到的重組菌，將該重組菌命名為S.flexneri 2a 301ΔpCP。
提取S.flexneri 2a 301ΔpCP的基因組DNA，按照步驟2)的方法檢測毒力基因ipaA、ipgB、mxiD、virG，同時以福氏志賀氏菌2a 301野生株S.flexneri 2a 301的基因組DNA為對照，進行上述PCR擴增，結果與圖1中A的結果一致，在福氏志賀氏菌2a 301野生株S.flexneri 2a 301中，ipaA、ipgB、mxiD、virG基因都出現了目的擴增片段，而S.flexneri2a 301ΔpCP中，ipaA、ipgB、mxiD、virG基因均無擴增片段，說明毒力大質粒不存在。
提取S.flexneri 2a 301ΔpCP的基因組DNA，以inc的引物為引物進行PCR擴增，通過驗證pKDinc質粒上的inc片段檢測pKDinc質粒是否成功丟失,同時以福氏志賀氏菌2a 301野生株S.flexneri 2a 301的基因組DNA為對照，進行上述PCR擴增。
inc的引物如下：incF:5』-TGCGAGAGAGAGGGGATAAC-3』；incR:5』-CGCCTTTTCCATCAGTTTC-3』。
結果如圖1中B所示。圖1B中，301代表福氏志賀氏菌2a 301野生株S.flexneri 2a 301；301ΔpCP代表S.flexneri 2a 301ΔpCP。結果表明，在福氏志賀氏菌2a 301野生株S.flexneri 2a 301中，具有488bp的inc基因目的片段，而S.flexneri 2a 301ΔpCP中無目的擴增片段，說明pKDinc質粒成功丟失。
上述結果表明，S.flexneri 2a 301ΔpCP已經丟失了毒力大質粒pCP，同時也丟失了外源的pKDinc質粒，毒力大質粒缺失株S.flexneri 2a 301ΔpCP構建成功。
(二)O-抗原連接酶基因waaI缺陷的無毒福氏志賀氏菌S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI的製備
1、線性打靶DNA片段的製備
1)PCR引物的設計和合成
在福氏志賀氏菌2a 301waaI基因的上遊(5』端)和下遊(3』端)各設計一對引物，即301waaIu5/301waaIu3和301waaId5/301waaId3。其中301waaIu5具有限制性酶切位點BamHⅠ，301waaIu3具有限制性酶切位點SalⅠ，301waaId5具有限制性酶切位點HindⅢ，301waaId3具有限制性酶切位點XhoⅠ。
同時，為了驗證突變體是否夠構建成功，設計了基因組上waaI基因上下遊同源臂以外的一對引物(301waaIw5/301waaIw3)，內部檢測引物(301waaIn5/301waaIn3)，kan基因引物(Kan5/Kan3)及kan基因內部引物(Kanf5/Kanf3)(表1)，進行PCR驗證，同時進行測序驗證。
表1、引物列表1
表1中的下劃線所示的序列為酶切識別位點。
2)線性打靶DNA片段的構建
(1)pETKan的構建
以S.flexneri 2a 301ΔpCP基因組DNA為模板，以5』-GCGTCGACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3』和5』-CCAAGCTTATGGGAATTAGCCATGGTCC-3』為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；
Sal Ⅰ和HindⅢ雙酶切PCR擴增產物，得到基因片段，該基因片段為在SEQ ID No.44的 5』末端起第641-2136位核苷酸所示的DNA分子的兩端分別連接Sal Ⅰ和HindⅢ的識別序列及其保護鹼基得到的DNA片段；SalⅠ和HindⅢ雙酶切pET-22b質粒，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質粒，將其命名為pETKan，將pETKan送測序，結果正確。
(2)中間載體的構建
以S.flexneri 2a 301ΔpCP基因組DNA為模板，用301waaIu5/301waaIu3和301waaId5/301waaId3分別擴增出waaI的上、下遊同源臂up和down。
PCR程序如下：94℃10min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，30個循環；72℃10min。
PCR擴增得到的up片段為在SEQ ID No.44的的第7-634位核苷酸所示的DNA分子兩端分別連接BamHⅠ和Sal Ⅰ的識別序列及其保護鹼基得到的DNA片段。BamHⅠ和Sal Ⅰ雙酶切up片段，得到基因片段1；BamH Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切質粒pETKan，得到載體大片段1；將基因片段1與載體大片段1連接，得到中間載體1。
PCR擴增得到的down片段為在SEQ ID No.44的第2143-2822位核苷酸所示的DNA分子兩端分別連接HindⅢ和Xho Ⅰ的識別序列及其保護鹼基得到的DNA片段。HindⅢ和Xho Ⅰ雙酶切down片段,得到基因片段2；HindⅢ和Xho Ⅰ雙酶切中間載體1，得到載體大片段2；將基因片段2與載體大片段2連接，得到中間載體2。
(3)BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切中間載體2，得到打靶片段，該片段為在SEQ ID No.44所示的DNA分子兩端分別連接BamH Ⅰ和Xho Ⅰ的部分識別序列得到的DNA片段。該打靶片段兩側為同源臂，中間含kan基因。SEQ ID No.44中自5』末端起第7-634位核苷酸為up片段，第641-2136位核苷酸為kan基因，自5』末端第2143-2822位核苷酸為down片段。
2、S.flexneri 2a 301ΔpCP/pKOBEG的構建
由於pKOBEG質粒含有編碼λ-Red重組系統所需各種酶，將pKOBEG質粒電擊轉化至S.flexneri 2a 301ΔpCP中，塗於含有濃度為50μg/mL的氯黴素的LB平板上，30℃培養過夜，得到的陽性克隆，將其命名為S.flexneri 2a 301ΔpCP/pKOBEG菌株。
3、線性打靶DNA片段電擊轉化S.flexneri 2a 301ΔpCP/pKOBEG
1)將S.flexneri 2a 301ΔpCP/pKOBEG接種於含終濃度為30μg/mL氯黴素低鹽LB液體培養基30℃培養過夜，並按照體積比1:100將其傳代於低鹽LB液體培養基，進行培養。
2)在步驟1)的培養液OD600值達到0.2時，加入終濃度為1mmol/L的L-阿拉伯糖誘導Red重組系統的表達。
3)待步驟2)的培養液OD600值為0.6時，取步驟1製備的濃度為300ng/μL的打靶片段電轉S.flexneri 2a 301ΔpCP/pKOBEG，得到轉化後的細胞。
4)在轉化後的細胞中快速加入提前預冷的1mL低鹽LB液體培養基，30℃復甦2.5h左右，然後塗布於含有50ug/mL濃度的卡那黴素的LB平板，放於30℃培養箱培養過夜，篩選出陽性克隆。
5)將陽性克隆接種於含有50μg/mL的卡那黴素的LB液體培養基中，42℃培養傳代兩次(每次培養12h時間)，即可除去pKOBEG質粒，最終獲得含卡那黴素抗性、waaI缺失突變株，將其命名為S.flexneri 2a 301ΔpCP waaI::kan。
4、將編碼FRT位點特異性重組酶的質粒pCP20電擊轉入S.flexneri 2a 301ΔpCP waaI::kan中，在含50μg/mL濃度的氯黴素及不含卡那黴素的LB平板上30℃培養，篩選CmrKms(氯黴素抗性、卡那黴素敏感)的陽性克隆S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI pCP20。
5、將步驟4篩選到的陽性克隆S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI pCP20，轉入液體LB中42℃培養12小時，即可獲得O-抗原連接酶基因waaI缺陷的無毒福氏志賀氏菌2a 301，將其命名為S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI。
(pCP20的複製子對溫度敏感，42℃培養時丟失，此質粒含有編碼FLP重組酶的DNA，由溫敏啟動子控制，42℃培養時誘導FLP重組酶表達，同時該質粒丟失。)
(三)S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI的分子鑑定
以S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI的基因組DNA為模板，分別用一對waaI內部引物(301waaIn5/301waaIn3)，一對waaI外部引物(301waaIw5/301waaIw3)，一對交叉引物(301waaIw5和kanf3)和kan基因引物(kan5/kan3)進行PCR擴增，同時以野生株S.flexneri2a 301基因組DNA進行上述PCR擴增，作為對照。
結果如圖2所示。圖2中，301ΔpCPΔwaaI代表S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI，野生株301代表野生株S.flexneri 2a 301；1,5:引物為waaI內部引物時的PCR產物；2,6:引物為waaI外部引物時的PCR產物；3,7:引物為waaIw5和kanf3時的PCR產物；4,8:引物為Kan基因引物時的PCR產物。
圖2表明，以S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI的基因組DNA為模板，以waaI內部引物為引物進行PCR擴增，沒有目的條帶，以waaI外部引物為引物進行PCR擴增得到的條帶比以野生株的基因組DNA為模板得到的PCR擴增條帶小，以交叉引物和kan基因引物為引物也沒有擴增條帶。而以野生株的基因組DNA為模板，以waaI內部引物為引物進行PCR擴增，有目的條帶，以交叉引物和kan基因引物為引物同樣沒有目的擴增條帶。
上述結果證明S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI是waaI基因缺失、毒力大質粒pCP缺失、並且無抗生素基因的福氏志賀氏菌2a 301。
二、多肽的O-糖基化檢測
1、0-糖基化系統的建立
1.1重組載體及重組菌的構建
腦膜炎奈瑟球菌糖基轉移酶PglL表達載體的構建：腦膜炎奈瑟球菌糖基轉移酶PglL(GeneBank：JN200826.1)的胺基酸序列如SEQ ID No.40所示，其編碼序列如SEQ ID No.41的第180-1994位核苷酸所示。SEQ ID No.41的第1-6位核苷酸為XbaI識別位點，第2475-2480位核苷酸為SacI識別序列，第2487-2492位核苷酸為PstI識別位點，第2510-2515位核苷酸為XhoI識別位點。SEQ ID No.41的第105-2240位核苷酸為PglL表達盒的序列，PglL表達盒中，PglL的表達由tac啟動子啟動，將該表達盒命名為tacpglL。其中，SEQ ID No.41的第105-133位核苷酸為tac啟動子的序列，SEQ ID No.41的第180-1994位核苷酸為腦膜炎奈瑟球菌糖基轉移酶PglL的編碼序列。
用XbaI和XhoI酶切SEQ ID No.41所示的DNA分子，得到基因片段；用XbaI和XhoI酶切pET28a(+)，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到含有SEQ ID No.41所示的DNA分子的重組載體，將該重組載體命名為pET28tacpglL。
以綠膿桿菌重組去毒外毒素rEPA(rEPA為SEQ ID No.1的第53-662位胺基酸所示的蛋白質)為載體蛋白，將SEQ ID No.1的第22-50位胺基酸所示的肽段(將該肽段命名為4573)融合於rEPA的N端，並在4573的N端融合DsbA信號肽(DsbA信號肽為SEQ ID No.1的第1-21位胺基酸所示的肽段)、在rEPA的C端融合His tag(His tag為SEQ ID No.1的第666-671位胺基酸所示的多肽)，得到融合蛋白，將該融合蛋白命名為rEPA4573， rEPA4573中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、4573、rEPA和His tag。rEPA4573的編碼序列為序列表中SEQ ID No.42的第178-2193位核苷酸。含有這兩個表達盒的重組載體的具體構建方法如下：
將上述pET28tacpglL的SacI和PstI識別序列間的DNA片段替換為SEQ ID No.42的SacI和PstI識別序列間的DNA片段，得到重組載體，將該重組載體命名為pET28tacpglL-tacrEPA4573，pET28tacpglL-tacrEPA4573中，rEPA4573的表達由tac啟動子啟動，tac啟動子與rEPA4573的編碼基因組成的表達盒(即tacrEPA4573)位於pglL表達盒(tacpglL)下遊。
在pET28tacpglL-tacrEPA4573的基礎上利用北京全式金生物技術有限公司的Fast Mutagenesis System試劑盒(貨號為FM111-01)構建pglL提前表達終止載體pET28tacpglLmut-tacrEPA4573作為對照，pET28tacpglLmut-tacrEPA4573與pET28tacpglL-tacrEPA4573的差別僅在於：pET28tacpglLmut-tacrEPA4573為將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的SEQ ID No.41的第105-2240位核苷酸所示的PglL表達盒替換為SEQ ID No.45所示的DNA分子得到的重組載體，SEQ ID No.45的第130-132位核苷酸為TAA，使蛋白表達中止。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573和pET28tacpglLmut-tacrEPA4573分別導入步驟一得到的宿主菌S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI中，分別得到含有相應目的載體的重組菌，即301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA4573和301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglLmut-tacrEPA4573。
1.2、0-糖基化系統的建立
將步驟1.1得到的重組菌301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA4573和301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglLmut-tacrEPA4573分別按照下述方法檢測重組菌表達蛋白的O-糖基化情況，實驗重複三次：
挑取重組菌的單克隆並接於液體培養基(該液體培養基為向LB液體培養基中加入氨苄青黴素得到的氨苄青黴素含量為50μg/mL液體培養基)中，於225r/min 37℃下培養至OD600為0.6，得到重組菌培養液，向重組菌培養液中加入IPTG，使IPTG的濃度為1mM，得到重組菌誘導前培養液，重組菌誘導前培養液於30℃225r/min下培養10小時，得到重組菌誘導液。
將1mL重組菌誘導液離心，棄上清，得到菌體，將菌體重懸於1×SDS上樣Buffer(1×SDS上樣Buffer由水和溶質組成，溶質及其濃度分別為50mM Tris-HCl(pH 6.8)，1.6％(質量百分比濃度)SDS，0.02％(質量百分比濃度)溴酚藍，8％(體積百分比濃度)甘油，20mM DTT)中在沸水中孵育10分鐘後，進行離心，得到蛋白上清液。
取10μL蛋白上清液進行SDA-PAGE電泳，共三個重複。其中一個重複用考馬斯亮藍染色觀察蛋白的電泳情況，第二個重複用HRP標記的Anti-His抗體檢測多肽的O-糖基化情況，第三個重複用兔源福氏II型血清和作為二抗的HRP標記的山羊抗兔檢測多肽的O-糖基化情況，用宿主菌S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI作為陰性對照，結果如圖3所示。
結果顯示，宿主菌S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI中無融合蛋白的產生，重組菌301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglLmut-tacrEPA4573和301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA4573中均有融合蛋白的產生；宿主菌S.flexneri 2a301ΔpCPΔwaaI和重組菌301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglLmut-tacrEPA4573中沒有O-糖基化 蛋白的產生，301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA4573中產生了O-糖基化蛋白，表明該系統可用來檢測蛋白的O-糖基化。
2、4573截短片段的O-糖基化檢測
2.1重組載體及重組菌的構建
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為SEQ ID No.42的第271-327位核苷酸所示的DNA分子(該DNA分子編碼SEQ ID No.1的第32-50位胺基酸所示的肽段，將該肽段命名為5573)，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5573，pET28tacpglL-tacrEPA5573表達融合蛋白rEPA5573，rEPA5573中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5573(SEQ ID No.1的第32-50位胺基酸)、rEPA和His tag。5573和4573相比，N端缺少SEQ ID No.1的第22-31位胺基酸。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為SEQ ID No.42的第271-315位核苷酸所示的DNA分子(該DNA分子編碼SEQ ID No.1的第32-46位胺基酸所示的肽段，將該肽段命名為5569)，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5569，pET28tacpglL-tacrEPA5569表達融合蛋白rEPA5569，rEPA5569中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5569(SEQ ID No.1的第32-46位胺基酸)、rEPA和His tag。5569和4573相比，N端缺少SEQ ID No.1的第22-31位胺基酸，C端缺少SEQ ID No.1的第47-50位胺基酸。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為SEQ ID No.42的第271-306位核苷酸所示的DNA分子(該DNA分子編碼SEQ ID No.1的第32-43位胺基酸所示的肽段，將該肽段命名為5566)，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5566，pET28tacpglL-tacrEPA5566表達融合蛋白rEPA5566，rEPA5566中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5566(SEQ ID No.1的第32-43位胺基酸)、rEPA和His tag。5566和4573相比，N端缺少SEQ ID No.1的第22-31位胺基酸，C端缺少SEQ ID No.1的第44-50位胺基酸。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為SEQ ID No.42的第280-306位核苷酸所示的DNA分子(該DNA分子編碼SEQ ID No.1的第35-43位胺基酸所示的肽段，將該肽段命名為5866)，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5866，pET28tacpglL-tacrEPA5866表達融合蛋白rEPA5866，rEPA5866中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5866(SEQ ID No.1的第35-43位胺基酸)、rEPA和His tag。5866和4573相比，N端缺少SEQ ID No.1的第22-34位胺基酸，C端缺少SEQ ID No.1的第44-50位胺基酸。
將pET28tacpglL-tacrEPA5573、pET28tacpglL-tacrEPA5569、pET28tacpglL-tacrEPA5566和pET28tacpglL-tacrEPA5866分別導入步驟一得到的宿主菌S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI中，分別得到含有相應目的載體的重組菌，即301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5573、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5569、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5566和301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5866。
2.24573截短片段的O-糖基化檢測
將步驟2.1得到的重組菌301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5573、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5569、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5566和301Δ pCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5866分別按照步驟1.2的方法檢測重組菌表達蛋白的O-糖基化情況，用宿主菌S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI和重組菌301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglLmut-tacrEPA4573作為陰性對照，用重組菌301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA4573作為陽性對照，實驗重複三次，利用HRP標記的Anti-His抗體檢測蛋白的O-糖基化的結果如圖4所示。
結果顯示，重組菌301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5573、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5569和301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5566中均有O-糖基化蛋白的產生，301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5866中無O-糖基化蛋白的產生，表明多肽5573、5569和5566均可被O-糖基化，而5866不可被糖基化，表明SEQ ID No.1的第32-34位胺基酸或其部分胺基酸在O-糖基化過程中不可或缺。
3、含有親水肽段的多肽的O-糖基化檢測
3.1重組載體及重組菌的構建
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5766aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5766aa，pET28tacpglL-tacrEPA5766aa表達融合蛋白rEPA5766aa，rEPA5766aa的胺基酸序列為SEQ ID No.2，rEPA5766aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5766aa(SEQ ID No.2的第22-48位胺基酸)、rEPA和His tag；編碼rEPA5766aa的核苷酸序列為SEQ ID No.43。其中，5766aa與5766的差別僅在於5766aa為將5766的N端添加親水肽段1、C端添加親水肽段2得到的肽段。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5666aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5666aa，pET28tacpglL-tacrEPA5666aa表達融合蛋白rEPA5666aa，rEPA5666aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5666aa(SEQ ID No.3)、rEPA和His tag。其中，5666aa與5666的差別僅在於5666aa為將5666的N端添加親水肽段1、C端添加親水肽段2得到的肽段。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5566aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5566aa，pET28tacpglL-tacrEPA5566aa表達融合蛋白rEPA5566aa，rEPA5566aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5566aa(SEQ ID No.4)、rEPA和His tag。其中，5566aa與5566的差別僅在於5566aa為將5566的N端添加親水肽段1、C端添加親水肽段2得到的肽段。
將pET28tacpglL-tacrEPA5766aa中的5766aa編碼序列中編碼核心肽段的W的三個核苷酸tgg刪除，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5866aa，pET28tacpglL-tacrEPA5866aa表達融合蛋白rEPA5866aa，rEPA5866aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5866aa、rEPA和His tag。5866aa的胺基酸序列為DPRNVGGDLDPGNNTSAGVQPGKPPR，下劃線分別為親水肽段1和親水肽段2的胺基酸序列。其中，5866aa與5866的差別僅在於5866aa為將5866的N端添加親水肽段1、C端添加親水肽段2得到的肽段。
將pET28tacpglL-tacrEPA5766aa、pET28tacpglL-tacrEPA5666aa、pET28tacpglL-tacrEPA5566aa和pET28tacpglL-tacrEPA5866aa分別分別導入步驟一得到的宿主菌S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI中，分別得到含有相應目的載體的重組菌，即301 ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5666aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5566aa和301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5866aa。
3.2含有親水肽段的多肽的O-糖基化檢測
將步驟3.1得到的重組菌301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5666aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5566aa和301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5866aa分別按照步驟1.2的方法，將「用HRP標記的Anti-His抗體檢測多肽的O-糖基化情況」替換為「用兔源Anti-EPA抗體和作為二抗的HRP標記的山羊抗兔檢測多肽的O-糖基化情況」，其他步驟均不變，檢測重組菌表達蛋白的O-糖基化情況，用步驟1的S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglLmut-tacrEPA4573作為陰性對照，實驗重複三次，結果如圖5所示。
結果顯示，重組菌301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5566aa中有O-糖基化蛋白的產生，表明親水肽段1和親水肽段2不影響多肽的糖基化，多肽5566aa可被O-糖基化；301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5666aa和301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766aa中均有O-糖基化蛋白的產生，301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5866aa中無O-糖基化蛋白的產生，表明多肽5666aa和5766aa均可被O-糖基化，而5866aa不可被糖基化，表明SEQ ID No.1的第32-33位胺基酸不影響多肽的糖基化，而SEQ ID No.1的第34位的色氨酸(W)在O-糖基化過程中不可或缺。
4、將5766中胺基酸突變後得到的多肽的O-糖基化檢測
4.1重組載體及重組菌的構建
將pET28tacpglL-tacrEPA5766aa中的5766aa編碼序列中編碼核心肽段的色氨酸(W)的三個核苷酸tgg替換為編碼丙氨酸(A)的三個核苷酸gcg，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5766W57A aa，pET28tacpglL-tacrEPA5766W57A aa表達融合蛋白rEPA5766W57A aa，rEPA5766W57A aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5766W57A aa、rEPA和His tag。5766W57A aa的胺基酸序列為DPRNVGGDLDAPGNNTSAGVQPGKPPR，下劃線分別為親水肽段1和親水肽段2的胺基酸序列。5766W57A aa與5766aa的差別僅在於5766W57A aa為將5766aa(SEQ ID No.2的第22-48位胺基酸所示的多肽)的SEQ ID No.2的第32位的色氨酸(W)替換為丙氨酸(A)得到的多肽。
將pET28tacpglL-tacrEPA5766aa中的5766aa編碼序列中編碼核心肽段的脯氨酸(P)的三個核苷酸ccc替換為編碼丙氨酸(A)的三個核苷酸gcc，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5766P58A aa，pET28tacpglL-tacrEPA5766P58A aa表達融合蛋白rEPA5766P58A aa，rEPA5766P58A aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5766P58A aa、rEPA和His tag。5766P58A aa的胺基酸序列為DPRNVGGDLDWAGNNTSAGVQPGKPPR，下劃線分別為親水肽段1和親水肽段2的胺基酸序列。5766P58A aa與5766aa的差別僅在於5766P58A aa為將5766aa(SEQ ID No.2的第22-48位胺基酸所示的多肽)的SEQ ID No.2的第33位的脯氨酸(P)替換為丙氨酸(A)得到的多肽。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為5766G59A aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5766G59A aa，pET28tacpglL-tacrEPA5766G59A aa表達融合蛋白rEPA5766G59A aa，rEPA5766G59A aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5766G59A aa(SEQ ID No.8)、rEPA和His tag。5766G59A aa與5766aa的差別僅在於5766G59A aa為將5766aa(SEQ ID No.2的第22-48位胺基酸所示的多肽)的SEQ ID No.2的第34位的甘氨酸(G)替換為丙氨酸(A)得到的多肽(即SEQ ID No.8所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5766N60A aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5766N60A aa，pET28tacpglL-tacrEPA5766N60A aa表達融合蛋白rEPA5766N60A aa，rEPA5766N60A aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5766N60A aa(SEQ ID No.9)、rEPA和His tag。5766N60A aa與5766aa的差別僅在於5766N60A aa為將5766aa(SEQ ID No.2的第22-48位胺基酸所示的多肽)的SEQ ID No.2的第35位的天冬醯胺(N)替換為丙氨酸(A)得到的多肽(即SEQ ID No.9所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5766N61A aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5766N61A aa，pET28tacpglL-tacrEPA5766N61A aa表達融合蛋白rEPA5766N61A aa，rEPA5766N61A aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5766N61A aa(SEQ ID No.10)、rEPA和His tag。5766N61A aa與5766aa的差別僅在於5766N61A aa為將5766aa(SEQ ID No.2的第22-48位胺基酸所示的多肽)的SEQ ID No.2的第36位的天冬醯胺(N)替換為丙氨酸(A)得到的多肽(即SEQ ID No.10所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5766T62A aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5766T62A aa，pET28tacpglL-tacrEPA5766T62A aa表達融合蛋白rEPA5766T62A aa，rEPA5766T62A aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5766T62A aa(SEQ ID No.11)、rEPA和His tag。5766T62A aa與5766aa的差別僅在於5766T62A aa為將5766aa(SEQ ID No.2的第22-48位胺基酸所示的多肽)的SEQ ID No.2的第37位的蘇氨酸(T)替換為丙氨酸(A)得到的多肽(即SEQ ID No.11所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5766G65A aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5766G65A aa，pET28tacpglL-tacrEPA5766G65A aa表達融合蛋白rEPA5766G65A aa，rEPA5766G65A aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5766G65A aa(SEQ ID No.30)、rEPA和His tag。5766G65A aa與5766aa的差別僅在於5766G65A aa為將5766aa(SEQ ID No.2的第22-48位胺基酸所示的多肽)的SEQ ID No.2的第40位的甘氨酸(G)替換為丙氨酸(A)得到的多肽(即SEQ ID No.30所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5766V66A aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5766V66A aa，pET28tacpglL-tacrEPA5766V66A aa表達融合蛋白rEPA5766V66A aa，rEPA5766V66A aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5766V66A aa(SEQ ID No.31)、rEPA和His tag。5766V66A aa與5766aa的差別僅在於5766V66A aa為將5766aa(SEQ ID No.2的第22-48位胺基酸所示的多肽)的SEQ ID No.2的第41位的纈氨酸(V)替換為丙氨酸(A)得到的多肽(即SEQ ID No.31所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA5766W57A aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766P58A aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766G59A aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766N60A aa、 pET28tacpglL-tacrEPA5766N61A aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766T62A aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766G65A aa和pET28tacpglL-tacrEPA5766V66A aa分別分別導入步驟一得到的宿主菌S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI中，分別得到含有相應目的載體的重組菌，即301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766W57A aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766P58A aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766G59Aaa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766N60A aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766N61A aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766T62Aaa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766G65A aa和301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766V66A aa。
4.2將5766中胺基酸突變後得到的多肽的O-糖基化檢測
將步驟4.1得到的重組菌301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766W57A aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766P58A aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766G59A aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766N60Aaa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766N61A aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766T62A aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766G65A aa和301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766V66A aa分別按照步驟1.2的方法，將「用HRP標記的Anti-His抗體檢測多肽的O-糖基化情況」替換為「用兔源Anti-EPA抗體和作為二抗的HRP標記的山羊抗兔檢測多肽的O-糖基化情況」，其他步驟均不變，檢測重組菌表達蛋白的O-糖基化情況，實驗重複三次，結果如圖6所示。
結果顯示，重組菌301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766G59A aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766N60A aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766N61Aaa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766T62A aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766G65A aa和301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766V66Aaa中有O-糖基化蛋白的產生，多肽5766G59A aa、5766N60A aa、5766N61A aa、5766T62A aa、5766G65Aaa和5766V66A aa可被O-糖基化；301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766W57A aa中無O-糖基化蛋白的產生，301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766P58A aa中糖蛋白的量明顯減弱，表明多肽5766W57A aa不可被O-糖基化，多肽5766P58A aa會降低糖基化效率。結果表明SEQ ID No.2的第34位的甘氨酸(G)、第35位的天冬醯胺(N)、第36位的天冬醯胺(N)、第37位的蘇氨酸(T)、第40位的甘氨酸(G)和第41位的纈氨酸(V)殘基不影響多肽的糖基化，而SEQ ID No.2的第32位的色氨酸(W)和第33位的脯氨酸(P)在O-糖基化過程中不可或缺。
5、將5766中WP與S間的G-N-N-T突變後得到的多肽的O-糖基化檢測
5.1重組載體及重組菌的構建
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5766AAA aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5766AAA aa，pET28tacpglL-tacrEPA5766AAA aa表達融合蛋白rEPA5766AAA aa，rEPA5766AAA aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5766AAA aa(SEQ ID No.5)、rEPA和His tag。5766AAA aa與5766aa的差別僅在於5766AAA aa為將5766aa(SEQ ID No.2的第22-48位胺基酸所示的多肽)的SEQ ID No.2的第34-37位胺基酸(即G-N-N-T)替換為A-A-A得到的多肽(即SEQ ID No.5所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5766AA aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5766AA aa，pET28tacpglL-tacrEPA5766AA aa表達融合蛋白rEPA5766AAaa，rEPA5766AA aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5766AA aa(SEQ ID No.6)、rEPA和His tag。5766AA aa與5766aa的差別僅在於5766AA aa為將5766aa(SEQ ID No.2的第22-48位胺基酸所示的多肽)的SEQ ID No.2的第34-37位胺基酸(即G-N-N-T)替換為A-A得到的多肽(即SEQ ID No.6所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5766A aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5766A aa，pET28tacpglL-tacrEPA5766A aa表達融合蛋白rEPA5766Aaa，rEPA5766A aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5766A aa(SEQ ID No.7)、rEPA和His tag。5766A aa與5766aa的差別僅在於5766A aa為將5766aa(SEQ ID No.2的第22-48位胺基酸所示的多肽)的SEQ ID No.2的第34-37位胺基酸(即G-N-N-T)替換為A得到的多肽(即SEQ ID No.7所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為5766WPS aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5766WPS aa，pET28tacpglL-tacrEPA5766WPS aa表達融合蛋白rEPA5766WPS aa，rEPA5766WPS aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5766WPS aa、rEPA和His tag。5766WPS aa與5766aa的差別僅在於5766WPS aa為將5766aa(SEQ ID No.2的第22-48位胺基酸所示的多肽)的SEQ ID No.2的第34-37位胺基酸(即G-N-N-T)刪除得到的多肽，5766WPS aa的胺基酸序列為DPRNVGGDLDWPSAGVQPGKPPR，下劃線分別為親水肽段1和親水肽段2的胺基酸序列，5766WPS aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccTCTGCCGGCGTG CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5766GAT aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5766GAT aa，pET28tacpglL-tacrEPA5766GAT aa表達融合蛋白rEPA5766GAT aa，rEPA5766GAT aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5766GAT aa(SEQ ID No.12)、rEPA和His tag。5766GAT aa與5766aa的差別僅在於5766GAT aa為將5766aa(SEQ ID No.2的第22-48位胺基酸所示的多肽)的SEQ ID No.2的第34-37位胺基酸(即G-N-N-T)替換為G-A-T得到的多肽(即SEQ ID No.12所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5766GT aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5766GT aa，pET28tacpglL-tacrEPA5766GT aa表達融合蛋白rEPA5766GTaa，rEPA5766GT aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5766GT aa(SEQ ID No.13)、rEPA和His tag。5766GT aa與5766aa的差別僅在於5766GT aa為將5766aa(SEQ ID No.2的第22-48位胺基酸所示的多肽)的SEQ ID No.2的第34-37位胺基酸(即G-N-N-T)替換為G-T得到的多肽(即SEQ ID No.13所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5766GNT aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5766GNT aa，pET28tacpglL-tacrEPA5766GNT aa表達融合蛋白 rEPA5766GNT aa，rEPA5766GNT aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5766GNT aa(SEQ ID No.14)、rEPA和His tag。5766GNT aa與5766aa的差別僅在於5766GNT aa為將5766aa(SEQ ID No.2的第22-48位胺基酸所示的多肽)的SEQ ID No.2的第34-37位胺基酸(即G-N-N-T)替換為G-N-T得到的多肽(即SEQ ID No.14所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5766GAA aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5766GAA aa，pET28tacpglL-tacrEPA5766GAA aa表達融合蛋白rEPA5766GAA aa，rEPA5766GAA aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5766GAA aa(SEQ ID No.15)、rEPA和His tag。5766GAA aa與5766aa的差別僅在於5766GAA aa為將5766aa(SEQ ID No.2的第22-48位胺基酸所示的多肽)的SEQ ID No.2的第34-37位胺基酸(即G-N-N-T)替換為G-A-A得到的多肽(即SEQ ID No.15所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA5766AAA aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766AA aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766A aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766WPS aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766GAT aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766GT aa、pET28tacpglL-tacrEPA5766GNT aa和pET28tacpglL-tacrEPA5766GAA aa分別分別導入步驟一得到的宿主菌S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI中，分別得到含有相應目的載體的重組菌，即301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766AAA aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766AA aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766A aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766WPS aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766GAT aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766GT aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766GNT aa和301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766GAA aa。
5.2將5766中WP與S間的G-N-N-T突變後得到的多肽的O-糖基化檢測
將步驟5.1得到的重組菌301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766AAA aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766AA aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766Aaa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766WPS aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766GAT aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766GT aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766GNT aa和301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766GAA aa分別按照步驟1.2的方法，將「用HRP標記的Anti-His抗體檢測多肽的O-糖基化情況」替換為「用兔源Anti-EPA抗體和作為二抗的HRP標記的山羊抗兔檢測多肽的O-糖基化情況」，其他步驟均不變，檢測重組菌表達蛋白的O-糖基化情況，實驗重複三次，用步驟的3的301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766aa作為陽性對照，結果如圖7所示。
結果顯示，重組菌301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766GAT aa的糖基化水平高於301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766GT aa和301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766GNT aa的O-糖基化水平，表明，5766GAT aa的可被O-糖基化的能力高於5766GT aa和5766GNT aa；301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766AAA aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766AA aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766A aa和301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5766WPS aa的O-糖基化水平依次降低，表明，5766AAA aa、5766AA aa、5766A aa和5766WPS aa的可被O- 糖基化的能力依次下降。結果表明，5766中WP與S間的G-N-N-T突變為1-3個丙氨酸(A)時，完全排出了殘基對其結構的影響，多肽可被O-糖基化的能力增強，其中，突變為3個丙氨酸時，多肽可被O-糖基化的能力增強，突變為2個丙氨酸時，多肽可被O-糖基化的能力次之。
6、將步驟5的5766AAA aa中S位點後的AGV突變後得到的多肽的O-糖基化檢測
6.1重組載體及重組菌的構建
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5763AAA SAP aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SAP aa，pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SAP aa表達融合蛋白rEPA5763AAA SAP aa，rEPA5763AAA SAP aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAA SAP aa(SEQ ID No.16)、rEPA和His tag。5763AAA SAP aa與步驟5的5766AAA aa的差別僅在於5763AAA SAP aa為將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)替換為S-A-P得到的多肽(即SEQ ID No.16所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為5763AAA SP aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SP aa，pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SP aa表達融合蛋白rEPA5763AAA SP aa，rEPA5763AAA SP aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAA SP aa、rEPA和His tag。5763AAA SP aa與步驟5的5766AAA aa的差別僅在於5763AAA SAP aa為將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)替換為S-A得到的多肽，5766AAA aa的胺基酸序列為DPRNVGGDLDWPAAASAPQPGKPPR，下劃線分別為親水肽段1和親水肽段2的胺基酸序列，5763AAA SP aa的編碼序列為GACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTGCC CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5763AAASAG aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASAG aa，pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASAG aa表達融合蛋白rEPA5763AAASAG aa，rEPA5763AAASAG aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAASAG aa(SEQ ID No.17)、rEPA和His tag。5763AAASAG aa與步驟5的5766AAA aa的差別僅在於5763AAASAG aa為將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)替換為S-A-G得到的多肽(即SEQ ID No.17所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5763AAA SA aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SA aa，pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SA aa表達融合蛋白rEPA5763AAA SA aa，rEPA5763AAA SA aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAA SA aa(SEQ ID No.32)、rEPA和His tag。5763AAASA aa與步驟5的5766AAA aa的差別僅在於5763AAASA aa為將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)替換為S-A得到的多肽(即SEQ ID No.32所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5763AAA SGP aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SGP aa，pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SGP aa表達融合蛋白rEPA5763AAA SGP aa，rEPA5763AAA SGP aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAA SGP aa(SEQ ID No.18)、rEPA和His tag。5763AAA SGP aa與步驟5的5766AAA aa的差別僅在於5763AAA SGP aa為將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)替換為S-G-P得到的多肽(即SEQ ID No.18所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5763AAA SMP aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SMP aa，pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SMP aa表達融合蛋白rEPA5763AAA SMP aa，rEPA5763AAA SMP aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAA SMP aa(SEQ ID No.19)、rEPA和His tag。5763AAA SMP aa與步驟5的5766AAA aa的差別僅在於5763AAA SMP aa為將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)替換為S-M-P得到的多肽(即SEQ ID No.19所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5763AAA SSP aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SSP aa，pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SSP aa表達融合蛋白rEPA5763AAA SSP aa，rEPA5763AAA SSP aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAA SSP aa(SEQ ID No.20)、rEPA和His tag。5763AAA SSP aa與步驟5的5766AAA aa的差別僅在於5763AAA SSP aa為將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)替換為S-S-P得到的多肽(即SEQ ID No.20所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5763AAA SQP aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SQP aa，pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SQP aa表達融合蛋白rEPA5763AAA SQP aa，rEPA5763AAA SQP aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAA SQP aa(SEQ ID No.21)、rEPA和His tag。5763AAA SQP aa與步驟5的5766AAA aa的差別僅在於5763AAA SQP aa為將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)替換為S-Q-P得到的多肽(即SEQ ID No.21所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5763AAA SFP aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SFP aa，pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SFP aa表達融合蛋白rEPA5763AAA SFP aa，rEPA5763AAA SFP aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAA SFP aa(SEQ ID No.22)、rEPA和His tag。5763AAA SFP aa與步驟5的5766AAA aa的差別僅在於5763AAA SFP aa為將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)替換為S-F-P得到的多肽(即SEQ ID No.22所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5763AAA SVP aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SVP aa，pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SVP aa表達融合蛋白rEPA5763AAA SVP aa，rEPA5763AAA SVP aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAA SVP aa(SEQ ID No.23)、rEPA和His tag。5763AAA SVP aa與步驟5的5766AAA aa的差別僅在於5763AAA SVP aa為將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)替換為S-V-P得到的多肽(即SEQ ID No.23所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5763AAA SLP aa的編碼序列，得到重組載體 pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SLP aa，pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SLP aa表達融合蛋白rEPA5763AAA SLP aa，rEPA5763AAA SLP aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAA SLP aa(SEQ ID No.24)、rEPA和His tag。5763AAA SLP aa與步驟5的5766AAA aa的差別僅在於5763AAA SLP aa為將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)替換為S-L-P得到的多肽(即SEQ ID No.24所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5763AAA SIP aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SIP aa，pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SIP aa表達融合蛋白rEPA5763AAA SIP aa，rEPA5763AAA SIP aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAA SIP aa(SEQ ID No.25)、rEPA和His tag。5763AAA SIP aa與步驟5的5766AAA aa的差別僅在於5763AAA SIP aa為將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)替換為S-I-P得到的多肽(即SEQ ID No.25所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5763AAA SPP aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SPP aa，pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SPP aa表達融合蛋白rEPA5763AAA SPP aa，rEPA5763AAA SPP aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAA SPP aa(SEQ ID No.26)、rEPA和His tag。5763AAA SPP aa與步驟5的5766AAA aa的差別僅在於5763AAA SPP aa為將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)替換為S-P-P得到的多肽(即SEQ ID No.26所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5763AAA SNP aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SNP aa，pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SNP aa表達融合蛋白rEPA5763AAA SNP aa，rEPA5763AAA SNP aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAA SNP aa(SEQ ID No.27)、rEPA和His tag。5763AAA SNP aa與步驟5的5766AAA aa的差別僅在於5763AAA SNP aa為將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)替換為S-N-P得到的多肽(即SEQ ID No.27所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5763AAA STP aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA STP aa，pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA STP aa表達融合蛋白rEPA5763AAA STP aa，rEPA5763AAA STP aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAA STP aa(SEQ ID No.28)、rEPA和His tag。5763AAA STP aa與步驟5的5766AAA aa的差別僅在於5763AAA STP aa為將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)替換為S-T-P得到的多肽(即SEQ ID No.28所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5763AAA SCP aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SCP aa，pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SCP aa表達融合蛋白rEPA5763AAA SCP aa，rEPA5763AAA SCP aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAA SCP aa(SEQ ID No.29)、rEPA和His tag。5763AAA SCP aa與步驟5的5766AAA aa的差別僅在於5763AAA SCP aa為將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)替換為S-C-P得到的多肽(即SEQ ID No.29所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5763AAA SWP aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SWP aa，pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SWP aa表達融合蛋白rEPA5763AAA SWP aa，rEPA5763AAA SWP aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAA SWP aa(SEQ ID No.33)、rEPA和His tag。5763AAA SWP aa與步驟5的5766AAA aa的差別僅在於5763AAA SWP aa為將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)替換為S-W-P得到的多肽(即SEQ ID No.33所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5763AAA SYP aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SYP aa，pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SYP aa表達融合蛋白rEPA5763AAA SYP aa，rEPA5763AAA SYP aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAA SYP aa(SEQ ID No.34)、rEPA和His tag。5763AAA SYP aa與步驟5的5766AAA aa的差別僅在於5763AAA SYP aa為將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)替換為S-Y-P得到的多肽(即SEQ ID No.34所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5763AAA SDP aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SDP aa，pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SDP aa表達融合蛋白rEPA5763AAA SDP aa，rEPA5763AAA SDP aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAA SDP aa(SEQ ID No.35)、rEPA和His tag。5763AAA SDP aa與步驟5的5766AAA aa的差別僅在於5763AAA SDP aa為將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)替換為S-D-P得到的多肽(即SEQ ID No.35所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5763AAA SEP aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SEP aa，pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SEP aa表達融合蛋白rEPA5763AAA SEP aa，rEPA5763AAA SEP aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAA SEP aa(SEQ ID No.36)、rEPA和His tag。5763AAA SEP aa與步驟5的5766AAA aa的差別僅在於5763AAA SEP aa為將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)替換為S-E-P得到的多肽(即SEQ ID No.36所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5763AAA SKP aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SKP aa，pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SKP AA表達融合蛋白rEPA5763AAA SKP aa，rEPA5763AAA SKP aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAA SKP aa(SEQ ID No.37)、rEPA和His tag。5763AAA SKP aa與步驟5的5766AAA aa的差別僅在於5763AAA SKP aa為將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)替換為S-K-P得到的多肽(即SEQ ID No.37所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5763AAA SRP aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SRP aa，pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SRP aa表達融合蛋白rEPA5763AAA SRP aa，rEPA5763AAA SRP aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAA SRP aa(SEQ ID No.38)、rEPA和His tag。5763AAA SRP aa與步驟5的5766AAA aa的差別僅在 於5763AAA SRP aa為將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)替換為S-R-P得到的多肽(即SEQ ID No.38所示的多肽)。
將pET28tacpglL-tacrEPA4573中的4573的編碼序列(SEQ ID No.42的第241-327位核苷酸所示的DNA分子)替換為上述5763AAA SHP aa的編碼序列，得到重組載體pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SHP aa，pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SHP aa表達融合蛋白rEPA5763AAA SHP aa，rEPA5763AAA SHP aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAA SHP aa(SEQ ID No.39)、rEPA和His tag。5763AAA SHP aa與步驟5的5766AAA aa的差別僅在於5763AAA SHP aa為將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)替換為S-H-P得到的多肽(即SEQ ID No.39所示的多肽)。
將步驟1的pET28tacpglL-tacrEPA4573的XbaI和PstI識別位點間的DNA片段替換為rEPA5763AAASAP aa的編碼基因，得到重組載體，將該重組載體命名為pET28tacrEPA5763AAASAP aa，pET28tacrEPA5763AAA SAP aa不表達pglL，表達融合蛋白rEPA5763AAA SAP aa，rEPA5763AAA SAP aa中，從N端至C端依次為DsbA信號肽、5763AAA SAP aa(SEQ ID No.16)、rEPA和His tag。rEPA5763AAASAP aa的編碼基因如下：
ATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGCATCGGCGGCCGAGGACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACTGGcccgccgccGCTTCTGCCccc CAGCCCGGCAAACCGCCGCGC
actagtGAAGCCTTCGACCTCTGGAACGAATGCGCCAAAGCCTGCGTGCTCGACCTCAAGGACGGCGTGCGTTCCAGCCGCATGAGCGTCGACCCGGCCATCGCCGACACCAACGGCCAGGGCGTGCTGCACTACTCCATGGTCCTGGAGGGCGGCAACGACGCGCTCAAGCTGGCCATCGACAACGCCCTCAGCATCACCAGCGACGGCCTGACCATCCGCCTCGAAGGCGGCGTCGAGCCGAACAAGCCGGTGCGCTACAGCTACACGCGCCAGGCGCGCGGCAGTTGGTCGCTGAACTGGCTGGTACCGATCGGCCACGAGAAGCCCTCGAACATCAAGGTGTTCATCCACGAACTGAACGCCGGTAACCAGCTCAGCCACATGTCGCCGATCTACACCATCGAGATGGGCGACGAGTTGCTGGCGAAGCTGGCGCGCGATGCCACCTTCTTCGTCAGGGCGCACGAGAGCAACGAGATGCAGCCGACGCTCGCCATCAGcCATGCCGGGGTCAGCGTGGTCATGGCCCAGGCCCAGCCGCGCCGGGAAAAGCGCTGGAGCGAATGGGCCAGCGGCAAGGTGTTGTGCCTGCTCGACCCGCTGGACGGGGTCTACAACTACCTCGCCCAGCAGCGCTGCAACCTCGACGATACCTGGGAAGGCAAGATCTACCGGGTGCTCGCCGGCAACCCGGCGAAGCATGACCTGGACATCAAGCCCACGGTCATCAGTCATCGCCTGCACTTCCCCGAGGGCGGCAGCCTGGCCGCGCTGACCGCGCACCAGGCTTGCCACCTGCCGCTGGAGACTTTCACCCGTCATCGCCAGCCGCGCGGCTGGGAACAACTGGAGCAGTGCGGCTATCCGGTGCAGCGGCTGGTCGCCCTCTACCTGGCGGCGCGGCTGTCGTGGAACCAGGTCGACCAGGTGATCGGCAACGCCCTGGCCAGCCCCGGCAGCGGCGGCGACCTGGGCGAAGCGATCCGCGAGCAGCCGGAGCAGGCCCGTCTGGCCCTGACCCTGGCCGCCGCCGAGAGCGAGCGCTTCGTCCGGCAGGGCACCGGCAACGACGAGGCCGGCGCGGCCAGCGCCGACGTGGTGAGCCTGACCTGCCCGGTCGCCGCCGGTGAATGCGCGGGCCCGGCGGACAGCGGCGACGCCCTGCTGGAGCGCAACTATCCCACTGGCGCGGAGTTCCTCGGCGACGGCGGCGACATCAGCTTCAGCACCCGCGGCACGCAGAACTGGACGGTGGAGCGGCTGCTCCAGGCGCACCGCCAACTGGAGGAGCGCGGCTATGTGTTCGTCGGCTACCACGGCACCTTCCTCGAAGCGGCGCAAAGCATCGTCTTCGGCGGGGTGCGCGCGCGCAGCCAGGACCTCGACGCGATCTGGCGCGGTTTCTATATCGCCGGCGATCCGGCGCTGGCCTACGGCTACGCCCAGGACCAGGAACCCGACGCGCGCGGCCGGATCCGCAACGGTGCCCTGCTGCGGGTCTATGTGCCGCGCTCGAGCCTGCCGGGCTTCTACCGCACCGGCCTGACCCTGGCCGCGCCGGAGGCGGCGGGCGAGGTCGAACGGCTGATCGGCCATCCGCTGCCGCTGCGCCTGGACGCCATCACCGGCCCCGAGGAGGAAGGCGGGCGCGTGACCATTCTCGGCTGGCCGCTGGCCGAGCGCACCGTGGTGATTCCCTCGGCGATCCCCACCGACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACCCGTCCAGCATCCCCGACAAGGAACAGGCGATCAGCGCCCTGCCGGACTACGCCAGCCAGCCCGGCAAACCGCCGCGCGAGGACCTGAAGGGAGGTGGACACCACCACCACCACCACTAA。
將pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SAP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASAG aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SA aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SGP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SMP aa、 pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SSP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SQP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SFP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SVP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SLP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SIP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SPP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SNP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA STP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SCP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SWP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SYP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SDP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SEP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SKP AA、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SRP aa、pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SHP aa和pET28tacrEPA5763AAA SAP aa分別導入步驟一得到的宿主菌S.flexneri 2a 301ΔpCPΔwaaI中，分別得到含有相應目的載體的重組菌，即301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SAP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASAG aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASA aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SGP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SMP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASSP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SQP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SFP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASVP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SLP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SIP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASPP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SNP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA STP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASCP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SWP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SYP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASDP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SEP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SKP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASRP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SHP aa和301ΔpCPΔwaaI/pET28tacrEPA5763AAA SAP aa。
6.2將步驟5的5766AAA aa中S位點後的AGV突變後得到的多肽的O-糖基化檢測
6.2.1定性檢測
將步驟6.1得到的重組菌301ΔpCPΔwaaI/pET28tacrEPA5763AAA SAP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SAP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASAG aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SA aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASGP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SMP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SSP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASQP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SFP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SVP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASLP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SIP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SPP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASNP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA STP aa、301ΔpCPΔ waaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SCP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASWP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SYP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SDP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASEP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SKP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SRP aa和301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SHP aa分別按照步驟1.2的方法，將「用HRP標記的Anti-His抗體檢測多肽的O-糖基化情況」替換為「用兔源Anti-EPA抗體和作為二抗的HRP標記的山羊抗兔檢測多肽的O-糖基化情況」，其他步驟均不變，檢測重組菌表達蛋白的O-糖基化情況，實驗重複三次，用301ΔpCPΔwaaI/pET28tacrEPA5763AAA SAP aa作為陰性對照，部分結果如圖8所示。
結果顯示，將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)突變後得到的部分多肽仍可被O-糖基化，且糖基化水平較高，這類多肽有5763AAA SAP aa、5763AAA SAG aa、5763AAA SA aa、5763AAA SGP aa、5763AAA SMP aa、5763AAA SSP aa、5763AAASFP aa、5763AAA SNP aa、5763AAA SLP aa、5763AAA SVP aa、、5763AAA SQP aa、5763AAA STP aa、5763AAA SIP aa、和5763AAA SPP aa；而將步驟5的5766AAA aa(SEQ ID No.5所示的多肽)的第16-19位胺基酸(即S-A-G-V)突變後得到的其餘多肽被O-糖基化的能力稍弱。
6.2.2定量檢測
定量檢測步驟6.1得到的重組菌301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SAP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SGP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SMP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASSP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SQP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SFP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASVP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SLP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SIP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASPP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SNP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA STP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASCP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SWP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SYP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASDP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SEP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SKP aa、301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAASRP aa和301ΔpCPΔwaaI/pET28tacpglL-tacrEPA5763AAA SHP aa中蛋白的糖基化水平，實驗重複三次，每次重複實驗的具體步驟如下：
挑取上述重組菌菌株的單克隆，接於終濃度50μg/mL氨苄青黴素的LB液體培養基中，225r/min 37℃培養至OD約0.6，加入IPTG，使其在培養液中的濃度為1mM，轉至30℃培養10小時，得到蛋白誘導培養液。離心蛋白誘導培養液，收集重組菌菌體沉澱，PBS洗兩次後按照文獻(參考文獻Ihssen J,Kowarik M,Wiesl i L,Reiss R,Wacker M,L.Structural insights from random mutagenesis of Campylobacter jejunioligosacchary ltransferase PglB[J].Bmc Biotechnol.2012；12:67.)的方法提取重組菌菌體的周間質蛋白，具體操作步驟如下：將5mL蛋白誘導培養液得到的重組菌菌體重懸於130μL裂解液(該裂解液由水和溶質組成，溶質及其濃度分別為pH值為8的30mM Tris –HCl、20％(質量百分比濃度)蔗糖、1mM EDTA和1mg/ml溶菌酶)中，冰浴30min後離心，得到上清液。取20μL上清液加入20μL 2×SDS上樣Buffer中後於沸水中孵育10分鐘，得到蛋白待測液。
將上清液25倍稀釋後包被96孔板，每孔100μL，每個重組菌三個平行實驗，包被兩組，將包被的96孔板4℃孵育過夜後PBST洗3次，每次3min。甩幹96孔板，用將脫脂奶粉溶於PBST中得到的5％(質量百分比濃度)脫脂奶粉溶液封閉，每孔200μL，37℃孵育2h。甩幹96孔板，向一組的每孔中加入用保溫液(該保溫液為將脫脂奶粉溶於PBST中得到的0.5％(質量百分比濃度)脫脂奶粉溶液)稀釋40倍得到的稀釋的兔源福氏II型血清100μL，向另一組的每孔中加入用保溫液稀釋20000倍得到的稀釋的兔源Anti-EPA抗體100μL，而後將這兩組均於37℃下孵育1h。之後PBST洗3次，甩幹後向這兩組的96孔板的每孔中加入用保溫液稀釋5000倍得到的稀釋的HRP標記的山羊抗兔100μL，37℃孵育1h，PBST洗5次後甩幹，每孔加入100μL OPD-H2O2顯色液顯色，避光反應15min後再加入50μL終止液(2mol/L H2SO4)終止反應。於492nm下測量吸光度(OD492)，用步驟6.1的301ΔpCPΔwaaI/pET28tacrEPA5763AAA SAP aa作為陰性對照，結果如圖9和表1所示。
表1、5766AAA aa中S位點後的AGV突變後得到的多肽的O-糖基化檢測結果
表1中，表達效率是指單位EPA蛋白所能夠糖基化的量，表達效率＝一抗為兔源福氏II型血清的OD492/一抗為兔源Anti-EPA抗體的OD492；「——」表示無該數據。
結果表明，將S之後第二個胺基酸定為P後，將S與P之間突變為全部20種胺基酸，相應肽段可糖基化，且糖基化效率較高，其中糖基化效率由高到低依次為5763AAA SGP aa、5763AAA SMP aa、5763AAA SAP aa、5763AAA SSP aa、5763AAA SQP aa、5763AAA SIP aa、5763AAA SWP aa、5763AAA SNP aa、、5763AAA SVP aa、5763AAA SYP aa、5763AAA SLP aa、、5763AAA SRP aa、5763AAA SHP aa、5763AAA SFP aa、5763AAA SEP aa、5763AAA SDP aa、5763AAA STP aa、5763AAA SPP aa、5763AAA SKP aa和5763AAA SCP aa。
實驗證明，本實施例提供的多肽可被O-糖基化。