脫氮細菌組合物及其應用的製作方法

2023-06-08 19:48:21 2

專利名稱：脫氮細菌組合物及其應用的製作方法
發明所屬領域本發明屬於微生物領域，具體地說，本發明涉及具有脫氮生物學活性的細菌組合物及該細菌組合物在水體生物脫氮中的應用
背景技術：
氮素是所有生命必須的營養元素，也是全球生態系統物質循環的重要組成部分。使用氮肥已經成為農作物特別是糧食作物高產和增產的主要手段。但氮肥的使用在大幅度提高作物產量的同時也帶來了嚴重的環境問題如飲用水硝酸鹽積累的不斷增長，湖泊等封閉半封閉水域的富營養化，NH4+-NH3進入水體危害魚貝等水產資源；以及溫室氣體N2O不斷排放加劇了大氣溫室效應和對臭氧層的破壞等。提高氮素利用率、降低氮肥損失和對環境的不良影響已經成為目前農業生產和環境保護面臨的一個巨大挑戰。同時，氮素形態轉化又與汙水汙泥脫氮效率、脫氮工藝的改良，水體富營養化的解決密切相關。目前解決水體的氮素富營養化有物理方法、化學方法和生物方法。隨著氮素汙染的不斷加劇和人們對環境問題的日益重視，除氮技術，特別是生物脫氮技術已經成為控制水體汙染的重要方向和手段。
氨氮是造成水體富營養化的主要氮素汙染物之一。目前普遍認為，在生物脫氮過程中，廢水中的氨氮首先被自養硝化菌在好氧條件下氧化為NOx-，然後NOx-在缺氧條件下被反硝化細菌還原為氣態氮如N2等從水中逸出。硝化和反硝化既可在活性汙泥反應器中進行，又可在生物膜反應器中進行，而實際應用最多的還是活性汙泥法，硝化菌和反硝化菌處在同一活性汙泥中。由於目前發現和使用的硝化菌的好氧和自養特性與反硝化菌的缺氧和異養特性明顯不同，脫氮過程通常需在兩個反應器中獨立進行，如Bardenpho工藝、UCT(University ofCapetwon)工藝、雙溝式氧化溝工藝等，或在一個反應器中順次進行如SBR(Sequencing Batch Reactor，序批式反應器)。當混合汙泥進入好氧池或處於好氧狀態時情況則相反，硝化菌工作，反硝化菌處於抑制狀態；當混合汙泥進入缺氧池或處於缺氧狀態時，反硝化菌工作，硝化菌處於抑制狀態。
但是不管傳統的微生物附著型汙水處理構築物，如生物濾池、生物轉盤和淹沒式生物濾池，還是新開發的一些高效生物膜處理系統，如兩相流化床、三相流化床、厭氧流化床，電極-生物膜法，這些方法所採用的硝化菌群多為自養菌，增殖速度慢且難以維持較高生物濃度，需先經曝氣處理以降低有機物濃度，菌株才能生長並表現生物學活性，抗衝擊能力弱；高濃度氨氮和亞硝酸鹽會又抑制硝化菌的生長，使硝化作用不完全，導致總氮去除率很低。
目前，國外有研究者對好氧條件下的生物脫氮過程進行了研究，利用某些微生物種群在好氧條件下具有反硝化的特性來實現同步硝化與反硝化。研究結果表明，泛養硫球菌(Thiosphera pantotroph)、糞產鹼菌(Alcaligenea faecalis)、假單胞菌(Pseadonmonas sp)、叢毛單胞菌(Comamonos sp.)等微生物在好氧條件下可利用NOx-N進行反硝化。將硝化菌和反硝化菌置於同一反應器如曝氣池內混合培養，可達到單個反應器的同步硝化反硝化。但反硝化結果不盡人意，大量氮被轉化成氧化態氮，這種氧化態氮又是大氣溫室氣體效應和臭氧空洞形成的罪魁禍首，容易造成二次汙染。
國內也進行了一些相關的研究工作，利用好氧反硝化菌群和自養硝化菌群組合脫氮(耿金菊，劉登如等，應用與環境生物學報，2002，8(1)78-82)。細菌組合物雖然具有較好的氨氮脫除能力，但抗衝擊能力較弱，氨氮濃度高於0.3克/升的高濃度的氨氮能抑制菌體的生長，並且氨氮濃度高於0.2克/升時，脫氮後氨氮殘餘量較多；同時不耐高的有機碳濃度，並且0.5克/升的有機碳濃度能抑制菌體生長並降低脫氮效果。而且這種組合菌群中的各類細菌培養與生長條件不一致，一方發揮功能時另一方卻被處於抑制狀態，導致彼此不協調，生物脫氮過程時間延長，成本增大，更重要的是，脫氮效率一般，脫氮後的水體離環保要求還有距離。
發明技術內容本發明的一個目的是提供一種細菌組合物，該細菌組合物通過協同作用能有效地脫除水體中的氮素，將有害氮素轉化成對水體無汙染的生物菌體和對大氣環境無汙染的氮氣，而且脫氮時間大為縮短。
本發明的另一個目的是提供細菌組合物在水體生物脫氮中的應用。
一種具有脫氮生物學活性的細菌組合物，其特徵在於它含有(A)異養硝化細菌，
(B)異養好氧反硝化細菌，其中組份(A)與組份(B)可按任意比例混合就可實現水體聯合脫氮的目的。在組份(A)中有微量的組份(B)或在組份(B)中有微量的組份(A)，這種細菌組合物通過協同作用能有效地脫除水體中的氮素，將有害氮素轉化成對水體無汙染的生物菌體和對大氣環境無汙染的氮氣。
在本發明的一個優選方案中，本發明提供的組份(A)異養硝化細菌是是球形節桿菌WR-2，(Arthrobacter globiformis WR-2)，其保藏登記號為CCTCCM202043。在本發明的另一個優選方案中，本發明公開的組份(B)異養反硝化細菌是植物短小桿菌WO-8，(Curtoacterium plantarum WO-8)，其保藏登記號為CCTCC M202044。
一種具有脫氮生物學活性的細菌組合物，其特徵在於它含有下列組份(體積比)(A)異養硝化細菌 1-99％，(B)異養好氧反硝化細菌 99-1％，其中異養硝化細菌是球形節桿菌的一類細菌，異養反硝化細菌是植物短小桿菌的一類細菌。在本發明中，本發明研究者以河南省封丘的華北潮土這種鹼性石灰性土壤為供試土樣，經PM平板分離、純化、活性檢驗，格利斯試劑鑑定，獲得了格利斯反應呈陽性的異養菌株，初步確認它們具有氨氧化能力。在這些菌株中進一步篩選，挑選性能穩定而且硝化活性和單株氨氮脫除能力強的菌株作為目的菌株，我們發現球形節桿菌WR-2具有這種性能。經鑑定為球形節桿菌WR-2，Arthrobacter globiformis WR-2。該菌株具有以下特徵1.菌落形態特徵在營養瓊脂平板(PM平板)上恆溫28℃好氣培養7天後形成很小的菌落，圓形，扁平，全緣；表面不光滑有皺紋、菌苔表面呈土黃色，基質未見明顯的可溶性色素產生。
2.菌體形態特徵革蘭氏陽性；培養早期，細胞呈不規則的杆狀，延長培養時間則出現球形，老化的細胞幾乎全為球狀；多以鏈狀形式排列；不運動，不形成內生孢子。
3.主要生理生化特性見表1最適培養溫度為28-32℃，pH7.0-7.2，好氧。
4.氨氧化活性在90-100r/min搖床培養14天積累的亞硝酸鹽濃度均高於60.0mg NO2-NL-1，個別單株可高達95mg NO2-NL-1以上。
5.脫氮活性以濃度為0.075mol L-1乙酸鈉為碳源時，C/N為5∶1，培養28
表1 WR-2菌株的生理生化特性檢測項目 結果檢測項目 結果生長需生物素 + 液化明膠 +硫胺素 - 水解澱粉 +NO3→NO2+ D-木糖 -/+尿酸 + 松三糖 +m-羥基苯甲酸 + D-葡萄糖醛酸鹽 -/+α-酮基-戊二酸 + 環己六醇 -棉子糖 - D-甘露糖 -D-甘氨酸 + 蔗糖 -/+乳糖 -注+表示陽性反應或能利用-表示陰性反應或不能利用。天，氨氮脫除率為65％，全氮去除率為62％；丙酮酸為碳源時，濃度為0.050molL-1時，C/N為5∶1，培養28天，氨氮脫除率為90％，全氮去除率為68％。所殘餘的全氮幾乎為菌體細胞。
參照伯傑氏細菌鑑定手冊第九版的分類鑑定，該菌株為球形節桿菌(Arthrobacter globiformis)。因此將其命名為球形節桿菌WR-2。球形節桿菌WR-2已於2002年11月5日在中國專利局指定的保藏單位-中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏登記號CCTCC M202043。
在本發明中，本發明人還從河南省封丘的華北潮土中分離到的一株植物短小桿菌屬細菌，進一步反覆篩選檢測比較，結果這株細菌具有異養好氧反硝化性能，經鑑定為植物短小桿菌WO-8，Curtoacterium plantarum WO-8。該菌株具有以下特徵1.菌落形態特徵在PM營養瓊脂平板上恆溫28℃好氣培養2天後，形成的菌落為圓形、扁平、全緣，表面光滑；菌苔表面呈桔黃色，基質未見明顯的可溶性色素產生。
2.菌體形態特徵革蘭氏染色為陽性反應；短杆狀、粗狀、菌體兩端鈍圓，多以單個排列形式出現；未見內生孢子形成；運動。
3.主要生理生化特性見表2，最適培養溫度為28-32℃，pH7.0-7.2，好氧。
4.菌株的反硝化活性具有強反硝化活性，具有硝酸鹽、亞硝酸鹽還原能力，實驗測得在7天內將200mg N L-1NO2-脫除99％；10天內將280mg N L-1
表2 WO-8菌株的生理生化特性檢測項目 結果檢測項目 結果α-環狀糊精 - 土溫40+糊精+ 土溫80+糖原+ N-乙醯-D-葡糖胺 -苦杏仁苷- N-乙醯-D-甘露糖胺 -L-阿拉伯糖 - 對苯二酚葡糖苷-D-阿拉伯糖 + 纖維二糖 -果糖+ 墨角藻糖 -D-半乳糖- 龍膽二糖 -α-D-葡萄糖 + α-D-乳糖 -m-肌醇 - 乳糖 -麥芽糖 -/+D-甘露醇 +D-甘露糖-/+D-蜜二糖 -α-甲基-D-半乳糖苷 - α-甲基-D-葡萄糖苷-β-甲基-D-半乳糖苷 - β-甲基-D-葡萄糖苷-β-甲基葡萄糖 - D-阿洛酮糖-D-棉子糖- L-鼠李糖 -D-核糖 + 蔗糖 -D-塔格糖- 海藻糖-松二糖 - 木糖醇-D-木糖 -/+醋酸 +α-羥基-丁酸+ β-羥基-丁酸 +α-酮基-戊二酸 + 甲基丙酮酸+單-甲基琥珀酸 + 丙酸 +丙酮酸 + 檸檬酸-琥珀酸 + N-乙酸-L-穀氨酸 +丙醯胺 + D-丙氨酸 +L-丙氨酸+ L-丙氨醯-甘氨酸 +L-天冬醯胺 + L-穀氨酸 +甘氨酸-L-穀氨酸 + L-焦穀氨酸-L-絲氨酸- 2，3-丁二醇 -甘油+ 肌苷 -胸腺嘧啶核苷- 尿苷 -/+1-磷酸葡萄糖- 2-磷酸葡萄糖 -D-L-α-甘油磷酸 -注表中+表示結果呈陽性反應，-表示表示結果呈陰性反應。NO3-脫除97％，並以氣態氮的形式逸失。以銨鹽為氮源時，培養過程中沒有亞硝酸鹽的生成，無異養硝化活性。
參照伯傑氏細菌鑑定手冊第九版的分類鑑定，該菌株為植物短小桿菌(Curtobacterium plantarum)。因此將其命名為植物短小桿菌WO-8。植物短小桿菌WO-8已於2002年11月5日在中國專利局指定的保藏單位-中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏登記號CCTCC M202044。
在本發明中，通過液體搖床分別培養球形節桿菌WR-2和植物短小桿菌WO-8，並分別測菌液OD600值，調相同菌體OD600值，按體積百分比量取細菌混合，獲得本發明所提供的細菌組合物。在本發明中，在組份(A)中有微量的組份(B)或在組份(B)中有微量的組份(A)，由這兩株菌組成的細菌組合物通過協同作用能有效地脫除水體中的氮素，將有害氮素轉化成對水體無汙染的生物菌體和對大氣環境無汙染的氮氣，這種生物脫氮過程是在有氧條件和異養狀態下進行的，細菌以有機碳作為能源，將氨態氮轉化成雙氮的氣體，而且這種生物轉化過程不需要物理與化學的曝氣處理，與傳統的方法相比，生物反應的時間大為縮短。
本發明的組合物中除含有球形節桿菌WR-2和植物短小桿菌WO-8這兩種組份外，本發明的細菌組合物還可含有(體積比)(C)水體脫氮工藝中可接收的載體0-10％；其中水體脫氮工藝中可接收的載體是指聚乙烯醇，硝化和反硝化細菌。在本發明中，聚乙烯醇是指重量比為20％的聚乙烯醇，20％的聚乙烯醇溶液配製時取20克聚乙烯醇常規溶解即得，然後根據需要量取適量的體積，形成組合物。在本發明中，硝化和反硝化細菌是指蠟狀芽孢桿菌NBB-135，(CGMCC No.0560)；短小芽孢桿菌NBB-112，(CGMCC No.0561)；環狀芽孢桿菌NBB-295，(CGMCCNo.0557)；地衣芽孢桿菌NBB-072，(CGMCC No.0562)；糞產鹼菌，(CGMCCNo.1.1799)；螢光假單胞菌，(CGMCC No1.1802)等。這些菌株在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行專利程序保藏或可向該菌種保藏機構索取。常用的硝化細菌與反硝化細菌在測菌液OD600值後，調相同菌體OD600值，按體積百分比量取細菌後混合。
在本發明的一個優選方案中，該細菌組合物含有下列組份(體積比)(A)異養硝化細菌30-70％，(B)異養反硝化細菌 70-30％。
在本發明的一個更優選方案中該細菌組合物含有下列組份(體積比)(A)異養硝化細菌40％，(B)異養反硝化細菌 60％。
本發明提供的異養硝化細菌主要是指在有氧狀態下將水體中的NH4+通過硝化作用轉化成NO2-和NO3-，或氧化態N以及將水體中的NH4+轉化為氮氣或氧化態氮。本發明提供的異養反硝化細菌主要是在有氧狀態下將水體中的將氧化態氮如NO2-和NO3-轉化為氮氣排出，異養硝化細菌和異養反硝化細菌二者聯合作用水體，可有效地將水體中的氮素汙染轉化對大氣也無二次汙染的氮氣逸出並且縮短汙水處理時間。一般地採用本發明的細菌組合比單株水體脫氮時間縮短7天，本發明的優選細菌組合比WR-2單株在水體脫氮時間縮短17天。比傳統的自養的硝化與反硝化工藝過程脫氮速率提高19-30％。
在本發明中的銨態氮或氨態氮是指可溶性的銨根離子NH4+-NH3；氮氧化物是指NO和N2O。
在本發明中硝化作用是指微生物將NH4+氧化為NO2-，繼而NO2-再氧化為NO3-的過程，或者由於微生物作用導致氧化態氮增多的過程。它是自然界氮素循環的重要環節，也是農田氮素損失的關鍵途徑之一。生物硝化作用可以分為三大類型化能自養型硝化作用、異養型硝化作用和甲烷營養型硝化作用。
在本發明中異養硝化廣義上是指有機和無機氮化合物從還原態經生物氧化為多種氧化態的過程，狹義上的是指異養微生物在好氧條件下將氧化態-3的銨氮或有機態氮氧化為羥胺、亞硝酸鹽和硝酸鹽的過程。
在本發明中反硝化是指微生物將NO3-還原為NO2-，繼而NO2-再還原為N2O、NO或N2的過程。
在本發明中碳/氮比，又稱C/N比是指碳元素的摩爾濃度與氮元素的摩爾濃度之比，如C/N＝1相當於硫酸銨0.015mol L-1乙酸鈉0.015mol L-1。
在本發明中脫氮是指水體中可溶性氮的去除，可溶性氮是指NH4+，NO2-和NO3-。
在本發明中水體脫氮工藝中可接收的載體包括吸附劑，硝化和反硝化細菌等。在本發明中使用的各種單位，有國家標準的一律採用國家標準，無國家標準的採用行業標準，亞硝酸鹽濃度為60.0mg NO2-N L-1，表示每升溶液中含60毫克亞硝態氮，硝酸鹽含量為0.18mg N L-1表示每升溶液中含0.18毫克硝態氮，


附圖1球形節桿菌WR-2的菌體顯微照片附圖2植物短小桿菌WO-8的菌體顯微照片附圖3細菌組合物的不同時間的脫氮效果圖。其中NH4，TN，NO2分別表示體系中氨氮殘留濃度，全氮殘留濃度和亞硝酸鹽的積累濃度。
下面結合具體實施例。進一步闡述本發明，應當理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明要求保護的範圍，下列實施例中未註明具體實驗條件和方法，通常按照常規條件如土壤微生物研究會〖日〗編，葉維青等譯，科學出版社，1983，土壤微生物實驗法；許光輝等編，北京農業出版社，1986，土壤微生物分析方法手冊；以及中國科學院南京土壤研究所微生物室編，科學出版社，1985，土壤微生物研究法等書中所述的條件，或接照製造廠商所建議的條件。
實施例實施例1.培養基和試劑的配製1.1PM液體培養基(牛肉膏蛋白腖培養基)配製稱3克牛肉浸膏，5克蛋白腖，溶解於1000毫升蒸餾水中形成PM液體培養基，在上述未滅菌的液體PM培養基中加入20克瓊脂，形成PM固體培養基。
用1N氫氧化鈉調培養基pH至7.1。分裝在三角瓶中，滅菌，培養基冷卻至50℃時倒平板。PM液體培養基經高壓液相色譜分析，結果是亞硝酸鹽和硝酸鹽含量均為跡量亞硝酸鹽未檢出，硝酸鹽含量為0.18mg N L-1。
1.2格利斯試劑的配製1.2.1對氨基苯磺酸試劑(A液)0.5克對氨基苯磺酸(Sulfanilic acid)溶於150毫升20％的稀醋酸溶液中，貯於棕色瓶，冷藏備用。
1.2.2α-萘胺試劑(B液)0.5克α-萘胺(α-naphthylamine)加到20毫升蒸餾水和150毫升20％的稀醋酸溶液中，貯於棕色瓶，冷藏備用。
1.2.3格利斯試劑的使用液取等比例的A液與B液混合即可使用。
1.3 NB液體培養基的配製1.3.1無機鹽溶液的配製稱取(NH4)2SO42.1克，NaH2PO40.25克，K2HPO40.75克，MgSO4·7H2O 0.03克，MnSO4·H2O 0.01克，FeSO4·7H2O 0.01克，溶解於1000毫升蒸餾水中，用1M NaOH調培養基的pH值為7.0，分裝在三角瓶中，滅菌。
1.3.2有機碳溶液的配製
1.3.2.1乙酸鈉溶液的配製稱取27.2克三水乙酸鈉溶解於1000毫升蒸餾水中形成0.20M的乙酸鈉溶液，滅菌。
1.3.2.2甲酸鈉溶液的配製稱取20.8克二水甲酸鈉溶解於1000毫升蒸餾水中形成0.20M的甲酸鈉溶液，滅菌。
1.3.2.3丙酮酸溶液的配製吸取14.0毫升丙酮酸溶解於1000毫升蒸餾水中形成0.20M的丙酮酸溶液，滅菌。
使用時取無機鹽溶液90份(體積比)與有機碳溶液10份混合，形成NB培養基。
1.4硝酸細菌培養基的配製稱取NaNO21.0克，MgSO4·7H2O 0.03克，K2HPO40.75克，NaH2PO40.25克，MnSO4·H2O 0.01克，NaCO31.0克，溶解於1000毫升蒸餾水中，用1M NaOH調培養基的pH值為7.2，分裝在三角瓶中，滅菌。
1.5二苯胺試劑的配製二苯胺0.5克，濃硫酸 100毫升，蒸餾水 20毫升；先將二苯胺0.5克溶於蒸餾水20毫升中，再徐徐加入濃硫酸100毫升，保存於棕色瓶中備用1.6反硝化培養基的配製1.6.1無機鹽溶液的配製稱取KNO32.0克，KH2PO41.0克，K2HPO41.0克，MgSO4·7H2O 0.2克，溶解於1000毫升蒸餾水，用1M NaOH調培養基的pH值為7.2，分裝在三角瓶中，滅菌。
1.6.2有機碳溶液的配製碳源為檸檬酸鈉、乙酸鈉或葡萄糖1.6.2.1葡萄糖溶液的配製稱取20克葡萄糖溶解於1000毫升蒸餾水中形成2％的葡萄糖溶液，滅菌。
1.6.2.2乙酸鈉溶液的配製稱取20克三水乙酸鈉溶解於1000毫升蒸餾水中形成2％的乙酸鈉溶液，滅菌。
使用時按體積比取無機鹽溶液90份與有機碳溶液10份混合，形成反硝化細菌培養基。
實施例2、分離鑑定具有硝化活性的異養細菌菌株2.1土壤樣品採樣地點河南省封丘縣趙崗鄉；分類名稱中壤質黃潮土；來源耕層土壤，淤土；土樣處理風乾、研磨過20目篩；2.2稱取1.0克風乾土於含有50毫升無菌蒸餾水的250毫升三角瓶中，90r/min搖床振蕩4小時。
2.3土懸液按10倍法稀釋後塗布於PM平板，每個稀釋度三個重複。28℃培養7天後，挑取單菌落到PM平板，劃線純化。鏡檢，證明純度。
2.4初篩(活性菌的鑑別)將獲得的經分離純化後的異養菌株接種於PM平板，28℃培養10天，格利斯試劑直接點滴到平板，進行硝化活性確認，並以不接菌的平板作空白對照。1分鐘內，格利斯試劑顯色呈紅色，表明有亞硝酸鹽生成。重複驗證，顯色反應仍呈陽性，初步確認為硝化活性菌。(見表3)。PM培養基經高壓液相色譜分析，表明其中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量均為跡量其中亞硝酸鹽未檢出，硝酸鹽含量低於0.2mg N L-1，不會對結果構成正幹擾。
2.5復篩選取初篩時活性較強的代表性菌株進行。刮取生長於PM平板的純菌菌苔入30毫升無菌水，使其充分分散均勻製成菌懸液。分別接種1毫升菌懸液入含不同有機物為碳源的50毫升NB培養基的250毫升錐形瓶中，每組三個重複。並以不接種的培養基作空白對照。28℃靜止培養42天後，培養液4℃下5000g離心15min，格利斯試劑法比色測定上清液中的亞硝酸鹽濃度。菌種樣品培養上清比色值減空白對照上清比色值的差值大於0.3mg N L-1時判為異養硝化活性菌(表4)。WR-2菌株硝化活性最高，確立為模式株。
2.6活性菌株的生理學鑑定參照伯傑氏細菌鑑定手冊第九版。細菌的形態和生理特徵見表5，表6。
2.7球形節桿菌WR-2菌株具有以下特徵2.7.1菌落形態特徵在營養瓊脂PM平板上恆溫28℃好氣培養7天後形成很小的菌落，圓形，扁平，全緣；表面不光滑有皺紋、菌苔表面呈土黃色，基質未見明顯的可溶性色素產生，見圖1。
2.7.2菌體形態特徵革蘭氏陽性；培養早期，細胞呈不規則的杆狀，延長培養時間則出現球形，老化的細胞幾乎全為球狀；多以鏈狀形式排列；不運動，不形成內生孢子。
表3部分活性菌株的分類種(屬)名 代表菌株節桿菌屬(Arthrobacter)WY-1，WR-2球形節桿菌(Arthrobacter globiformis) WR-2歐文氏菌屬(Erwinia) WT-1，XY-3棒狀桿菌屬(Corynebacterium) WY-19小單孢菌屬(Micromonospora)WH-1芽孢桿菌屬(Bacillus)短小芽孢桿菌(Bacillus brevis) WY-2，WY-21地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) WX-2環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans) WR-8堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus) WR-9表4各菌株的比色值(以亞硝酸鹽表示，NO2--N mg L-1)菌株號 碳源檸檬酸鈉 乙酸鈉XY-3 0.4 1.0WY-2 0.0 1.7WY-19 0.7 0.3WY-20 0.0 0.4WY-21 0.7 0.8WR-2 0.6 8.2WT-1 0.3 1.9WH-1 0.0 0.4CK0.0 0.1表5 節桿菌屬細菌的生理生化特性菌株號 厭氧生長 接觸酶 澱粉水解 葡萄糖發酵 分解纖維素 吲哚實驗 硝酸鹽還原B173 + + - +- - +B256 + + + +- - +B459 - + + +- - +B464 - + + +- - +B602 - + + +- - +B605 - + + +- - +WY-1 - + + +- - +WR-2 - + + +- - +注表中+表示結果呈陽性反應，-表示表示結果呈陰性反應。
表6 節桿菌屬細菌的個體形態特徵菌株號B173 PM平板上菌落圓形，淺黃色，微凸起；革蘭氏染色陽性，無內生芽孢，12小時為長短不一的桿菌，7天時為球狀細胞，有特定排列B256 PM平板上菌落圓形，黃色，微凸起；革蘭氏染色陽性，無內生芽孢，12小時為直或彎曲的小桿菌，有的有分支，7天時為球桿狀細胞B459 PM平板上菌落圓形，淺黃色，微凸起；革蘭氏染色陽性，無內生芽孢，12小時為桿菌，有二分支，形狀不規則，7天時為球菌、球桿菌B464 PM平板上菌落圓形，淺黃色，微凸起；革蘭氏染色陽性，無內生芽孢，12小時為桿菌，有分支，7天時為球菌、球桿菌B602 PM平板上菌落圓形，蛋黃色，不透明，凸起，光滑；革蘭氏染色陽性，無內生芽孢，12小時為桿菌，7天時為球菌，球形或橢球形B605 PM平板上菌落圓形，蛋黃色，凸起，光滑；革蘭氏染色陽性，無內生芽孢，12小時為桿菌，細長彎曲，7天時為球菌、球桿菌WY-1 PM平板上菌落圓形，黃色，凸起，光滑；革蘭氏染色陽性，無內生芽孢，12小時為桿菌，有的有分支，7天時為球菌、球桿菌WR-2 可以在PM平板上形成很小的菌落，圓形，扁平，全緣；表面不光滑有皺紋、菌苔表面呈土黃色；革蘭氏陽性；培養早期，細胞呈不規則的杆狀，延長培養時間則出現球形，老化的細胞幾乎全為球狀；多以鏈狀形式排列；不運動，不形成內生孢子2.7.3主要生理生化特性見表1最適培養溫度為28-32℃，pH7.0-7.2，好氧。
2.7.4氨氧化活性在90-100r/min搖床培養14天積累的亞硝酸鹽濃度均高於60.0mg NO2-N L-1，個別單株可高達95mg NO2-N L-1以上。
2.7.5脫氮活性以乙酸鈉為碳源時，濃度為0.075mol L-1時，C/N為5∶1，培養28天，氨氮脫除率為65％，全氮去除率為62％；丙酮酸為碳源時，濃度為0.050mol L-1時，C/N為5∶1，培養28天，氨氮脫除率為90％，全氮去除率為68％。所殘餘的全氮幾乎為菌體細胞。
參照伯傑氏細菌鑑定手冊第九版的分類鑑定，該菌株為球形節桿菌(Arthrobacter globiformis)。因此將其命名為球形節桿菌WR-2。球形節桿菌WR-2已於2002年11月5日在中國專利局指定的保藏單位——中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCC M202043。
實施例3 WO-8的分離與鑑定3.1稱取1.0克風乾土於50毫升已滅菌的，含有硝酸細菌加富培養基的250毫升三角瓶中，28℃，靜止培養。培養7天後每隔三天取樣，格利斯試劑點滴確定亞硝酸鹽的消失，等顯色反應呈粉紅色或無紅色，顯陰性或弱陽性後，以二苯胺試劑點滴確認硝酸鹽的生成，若顯色反應呈深藍或藍黑色；等顯色反應呈淺藍色或無色，顯陰性或弱陽性後即取2毫升培養液接種到新鮮培養基中。等格利斯試劑點滴顯色反應、二苯胺試劑顯色反應都再次呈陰性後，取樣進行菌株分離。3.2加富培養液按10倍法稀釋後塗布於PM平板，每個稀釋度三個重複。28℃培養7天後，挑取單菌落到PM平板，劃線純化。鏡檢，證明純度。
3.3反硝化活性菌的篩選確認刮取生長於PM斜面的純菌菌苔入9毫升無菌水，使其充分分散均勻製成菌懸液。分別接種1毫升菌懸液入含50毫升以葡萄糖為碳源硝酸細菌培養基的250毫升三角燒瓶和含50毫升反硝化培養基的250毫升三角燒瓶。並以不接種的培養基作空白對照。28℃靜止培養，隔3天取樣，格利斯試劑點滴確認亞硝酸鹽的存在和消失，通過硝酸鹽還原和亞硝酸鹽氧化，證明其反硝化活性，結果見表7。
通過對各活性菌株進一步的比較，發現WO-8菌株可在7天內將200mg NL-1NO2-脫除99％；10天內將280mg N L-1NO3-脫除97％。確認WO-8菌株亞硝酸鹽還原能力和硝酸鹽還原能力最強。
3.4 WO-8菌株經鑑定為植物短小桿菌WO-8，(Curtoacterium plantarum WO-8)。該菌株具有以下特徵3.4.1菌落形態特徵在PM營養瓊脂平板上恆溫28℃好氣培養2天後，形成的菌落為圓形、扁平、全緣，表面光滑；菌苔表面呈桔黃色，基質未見明顯的可溶性色素產生。
3.4.2菌體形態特徵革蘭氏染色為陽性反應；短杆狀、粗狀、菌體兩端鈍圓，多以單個排列形式出現；未見內生孢子形成；運動，見圖2。
3.4.3主要生理生化特性見表2最適培養溫度為28-32℃，pH7.0-7.2，好氧。
3.4.4菌株的反硝化活性 具有強反硝化活性，具有硝酸鹽、亞硝酸鹽還原能力，實驗測得可在7天內將200mg N L-1NO2-脫除99％；10天內將280mg NL-1NO3-脫除97％，並以氣態氮的形式逸失。以銨鹽為氮源時，培養過程中沒有亞硝酸鹽的生成，無異養硝化活性。
表7 各菌株的反硝化活性表現(28℃，靜止培養)亞硝酸鹽還原 硝酸鹽還原菌株號葡萄糖 檸檬酸鈉葡萄糖 檸檬酸鈉WO-1++ ++WO-2-- --WO-3-- --WO-4-- --WO-5-- ++WO-4-- --WO-7-- ++WO-8++ ++WO-9++ ++WO-10 ++ --WO-11 -- ++WO-12 -- ++WO-12 -- ++注-表示陰性，+表示陽性參照伯傑氏細菌鑑定手冊第九版的分類鑑定，該菌株為植物短小桿菌(Curtobacterium plantarum)。因此將其命名為植物短小桿菌WO-8。植物短小桿菌WO-8已於2002年11月5日在中國專利局指定的保藏單位-中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏登記號CCTCC M202044。
實施例4球形節桿菌WR-2的脫氮效果4.1培養基為NB培養基。以乙酸鈉為碳源，濃度分別為0.015mol L-1、0.0225mol L-1、0.030mol L-1、0.045mol L-1、0.075mol L-1、0.15mol L-1。
4.2預培養從PM斜面接-環菌苔入裝有50毫升以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養基的250毫升錐形瓶中，在29±1℃，120-130r/min搖床振蕩培養24小時。
4.3按2％接種量，將預培養之菌液1毫升接至裝有50毫升NB培養基(不同濃度乙酸鈉為碳源)的250毫升錐形瓶中。設不接種對照，3次重複。30℃，靜止培養。
4.4結果見表8。
表8 不同濃度乙酸鈉為碳源時的培養狀況(30℃，靜止培養)乙酸鈉濃度 0.015mol L-10.045mol L-10.075mol L-128天 42天 28天 48天 28天 38天NO2-1.19±0.29 4.15±1.33 0.074±0.021 0.41±0.190.094±0.010 0.090±0.016NH4+％ -42.08±6.16％ 37.4±1.90％ - 34.5±1.84％ 9.38±0.78％TN％ 70.9±1.24％ 54.7±3.03％ 45.0±2.97％ 23.6±1.85％ 37.7±1.20％ 22.3±1.82％注NO2-以毫克N L-1表示。
銨態氮殘留百分比(NH4+％)＝接菌培養物的銨態氮濃度/不接菌對照的銨態氮濃度全氮殘留百分比(TN％)＝接菌培養物的全氮/不接菌對照的全氮數據表示平均值±標準誤n＝3。
表明WR-2培養物具有單株脫氮能力，能夠脫除體系中的銨氮和全氮，但脫氮產物主要為雙氮氣體(85％)，含少量氮氧化物(15％)，存在二次汙染的可能性，且時間較長。
實施例5 WR-2與WO-8的聯合脫氮效果5.1-般組合條件下，WR-2與WO-8的聯合脫氮效果5.1.1培養基為以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養基，配方同1.3。
5.1.2培養5.1.2.1從PM斜面接-環植物短小桿菌WO-8的菌苔入裝有50毫升以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養24小時，將菌液調OD值調至OD600＝0.45。
5.1.2.2從PM斜面接-環球形節桿菌WR-2的菌苔入裝有50毫升以0.015molL-1乙酸鈉為碳源NB培養基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養24小時，將菌液調OD值調至OD600＝0.45。
5.1.2.3 WO-8(5.1.2.1之培養物)和WR-2菌(5.1.2.2之培養物)分別以以①1∶99(體積比)，②7∶3(體積比)，③6∶4(體積比)的比例混合，再取混合菌液以2％的量接種，即取混合菌液1毫升接入以0.075mol L-1乙酸鹽為碳源的NB培養基(配方同1.3)在28±1℃，靜止培養21天。同時以單接WR-2菌(5.1.2.2之培養物)的培養作為對照。以靛酚藍比色法測氨態氮，格利斯試劑比色法測定亞硝態氮，開氏法測定總氮。
5.1.3結果如表9.1，9.2所示表9.1不同混合比例下混合菌群的脫氮效果(靜止培養21天)WO-8WR-2 1∶997∶36∶4銨氮脫除率 70.8％ 82.7％ 90.1％全氮去除率 64.3％ 68.2％ 74.2％亞硝酸鹽濃度0.36 0.320.24注表中亞硝酸鹽濃度以mg N L-1表示表9.2 WR-2菌株的脫氮效果(靜止培養)培養天數 21天 28天銨氮脫除率 47.8％66.3％全氮去除率 43.3％62.8％亞硝酸鹽濃度 0.66 0.74注表中亞硝酸鹽濃度以mg N L-1表示結果表明WO-8菌株和WR-2菌株以不同比例混合的混合培養物中，以WO-8菌株和WR-2菌株以6∶4比例混合的混合培養物脫氮效果最佳。且相同條件下不同比例的混合菌群氨氮和全氮的脫除效果都優於WR-2菌株的單株脫氮效果，至少可以提前7天獲得相近的脫氮效果。
5.2最優化條件下混合菌群的脫氮5.2.1從PM斜面接-環植物短小桿菌WO-8的菌苔入裝有50毫升的以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養基(配方同1.3)的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養24小時，將菌液調OD值調至OD600＝0.45。5.2.2從PM斜面接-環球形節桿菌WR-2的菌苔入裝有50毫升以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養基(配方同1.3)的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養24小時，將菌液調OD值調至OD600＝0.45。5.2.3 WO-8(5.2.1之培養物)和WR-2菌(5.2.2之培養物)以6∶4(體積比)的比例混合，將混合菌液1毫升接至裝有50毫升新鮮NB培養基的250毫升錐形瓶中，作脫氮動力學曲線。設不接種對照，3次重複。同時以單接WR-2菌(5.2.2之培養物)的培養作為對照。28±1℃，靜止培養。
5.2.2結果如圖3所示。
在WR-2菌和WO-8菌聯合脫氮的條件下，混合菌群在21天內，可脫去體系全氮的81％，銨氮去除率為98％，培養過程中亞硝酸鹽最高濃度僅為0.29毫克N L-1，幾乎無亞硝酸鹽的積累。證明混合菌群具有很好的全氮和銨氮去除能力。WR-2菌單株脫氮38天時可脫去體系全氮的78％，銨氮去除率為90％，細菌組合物較WR-2菌單株脫氮效率提高45％，得到相近的脫氮效果時間縮短了17天。
5.3分批補料時混合菌群的脫氮效果5.3.1 WR-2菌和WO-8菌以等體積比接入以0.075mol L-1乙酸鹽為碳源的NB培養基(配方同1.3)。每天取樣分析銨氮。
5.3.2等銨氮濃度降低到＜10mg N L-1時，加入新鮮的NB培養基至銨氮濃度為440mg N L-1。
5.3.3等銨氮濃度再次降低到＜10mg N L-1時，重複4.3.2的操作。
5.3.4結果見表10。
表10 分批補料時混合菌群的脫氮效果第一次 第二次 第三次 第四次 第五次 第六次 第七次培養天數17 14 10 8 7 5 5銨氮濃度9.5 9.2 8.1 9.7 7.6 5.8 8.3注培養天數以銨氮濃度降低到＜10mg N L-1的培養天數計算5.4固定化混合菌群的脫氮5.4.1混合菌群的固定化膜的製備5.4.1.1混合菌群濃縮菌體的製備5.4.1.1.1從PM斜面接一環植物短小桿菌WO-8的菌苔入裝有50毫升以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養基(配方同1.3)的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養48小時，將菌液調OD值調至OD600＝0.50。
5.4.1.1.2從PM斜面接一環球形節桿菌WR-2的菌苔入裝有50毫升以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養基(配方同1.3)的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養48小時，將菌液調OD值調至OD600＝0.50。
5.4.1.1.3 WO-8(5.4.1.1.1之培養物)和WR-2菌(5.4.1.1.2之培養物)以64(體積比)的比例混合，將混合菌液在5000r/min，4℃下離心15分鐘，用生理鹽水洗滌離心兩次。
5.4.1.2混合菌群的固定將步驟5.4.1.1.3製得的濃縮菌體(相當於混合菌液300毫升)加入到50毫升20％聚乙烯醇和1.0mol L-1的CaCl2的混合溶液中，以原始混合菌液計，聚乙烯醇濃度為2.5％(體積比)。攪勻後平鋪於有機玻璃板上，置於冰箱中，-20℃冷凍過夜，再在室溫下解凍。重複冷凍解凍3-4次，有蒸餾水充分洗滌表明，即得平板狀固定化細胞膜。
5.4.1.3固定化膜反應器及脫氮實驗將所得的固定化細胞膜用法蘭固定並組裝成生物脫氮反應器。反應器盛液量為1800毫升的以0.015mol L-1乙酸鹽為碳源的NB培養基(配方同1.3，其中銨態氮濃度減為120mg N L-1)，膜的有效面積為100cm2。置於30℃恆溫培養箱中進行活化，待細胞活性穩定後，進行脫氮實驗。實驗過程中，控制溶解氧濃度為5-8mg L-1。每隔一定時間取少量樣品分析其中的銨態氮、亞硝態氮和硝態氮濃度。結果在培養108小時後，銨氮去除率為95.2％，亞硝酸鹽濃度僅為0.26mgN L-1，脫氮速率為0.19g·m-2·h-1。較傳統的自養硝化-厭氧反硝化細菌在同樣採用固定化膜技術(脫氮速率0.146-0.16g·m-2·h-1)(曹國民等，環境科學學報，2001，21(2)189-193)，脫氮速率提高19-30％。
實施例6 WR-2和WO-8的混合菌群加硝化菌短小芽孢桿菌NBB-112(CGMCC No.0561)的混合培養6.1培養基為以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養基，配製方法同1.3。
6.2預培養6.2.1從PM斜面接一環短小芽孢桿菌NBB-112的菌苔入裝有以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的50毫升NB培養基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養24小時，將菌液調OD值為OD600＝0.45。
6.2.2從PM斜面接一環植物短小桿菌WO-8的菌苔入裝有50毫升以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養24小時，將菌液調OD值為OD600＝0.45。
6.2.3從PM斜面接一環球形節桿菌WR-2的菌苔入裝有50毫升以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養24小時，將菌液調OD值為OD600＝0.45。
6.3培養WO-8(6.2.2之培養物)和WR-2菌(6.2.3之培養物)和NBB-112(6.2.1之培養物)以體積比10∶10∶1混合，再以2％量的接種混合菌液1毫升接入以0.075mol L-1乙酸鹽為碳源的NB培養基(配方同1.3)。在30℃，靜止培養21天。以靛酚藍比色法測氨態氮，格利斯試劑比色法測定亞硝態氮，開氏法測定總氮。
6.4結果混合培養物在培養21天後，脫除了體系全氮的64.5％，銨氮去除率為82.7％，亞硝酸鹽濃度僅為0.45mg N L-1。
實施例7 WR-2和WO-8的混合菌群加硝化菌蠟狀芽孢桿菌NBB-135(CGMCC No.0560)的混合培養7.1培養基為以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養基，配製方法同1.3。
7.2預培養7.2.1從PM斜面接一環蠟狀芽孢桿菌NBB-135的菌苔入裝有以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的50毫升NB培養基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養24小時，將菌液調OD值為OD600＝0.45。
7.2.2從PM斜面接一環植物短小桿菌WO-8的菌苔入裝有50毫升以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養24小時，將菌液調OD值為OD600＝0.45。
7.2.3從PM斜面接一環球形節桿菌WR-2的菌苔入裝有50毫升以0.015molL-1乙酸鈉為碳源的NB培養基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養24小時，將菌液調OD值為OD600＝0.45。
7.3培養WO-8(7.2.2之培養物)和WR-2菌(7.2.3之培養物)和NBB-135(7.2.1之培養物)按3∶7∶0.5(體積比)混合，再以2％量的接種混合菌液1毫升接入以0.075mol L-1乙酸鹽為碳源的NB培養基(配方同1.3)。在30℃，靜止培養21天。以靛酚藍比色法測氨態氮，格利斯試劑比色法測定亞硝態氮，開氏法測定總氮。
7.4結果混合培養物在培養21天後，脫除了體系全氮的62.3％，銨氮去除率為78.1％，亞硝酸鹽濃度僅為0.52mg N L-1。
實施例8 WR-2和WO-8的混合菌群加反硝化菌，螢光假單胞菌(CGMCCNo1.1802)的混合培養8.1培養基為以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養基，配製方法同1.3。
8.1.1螢光假單胞菌(CGMCC No1.1802)從中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心索取。
8.2預培養8.2.1從PM斜面接-環螢光假單胞菌的菌苔入裝有PM液體培養基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養24小時，將菌液調OD值為菌體OD600＝0.45。
8.2.2從PM斜面接一環植物短小桿菌WO-8的菌苔入裝有50毫升以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養24小時，將菌液調OD值為OD600＝0.45。
8.2.3從PM斜面接一環球形節桿菌WR-2的菌苔入裝有50毫升以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養24小時，將菌液調OD值為OD600＝0.45。
8.3培養WO-8(8.2.2之培養物)和WR-2菌(8.2.3之培養物)和螢光假單胞菌(8.2.1之培養物)按70∶30∶8(體積比)混合，再以2％量的接種混合菌液1毫升接入以0.075mol L-1乙酸鹽為碳源的NB培養基(配方同1.3)。在30℃，靜止培養21天。以靛酚藍比色法測氨態氮，格利斯試劑比色法測定亞硝態氮，開氏法測定總氮。
8.4結果混合培養物在培養21天後，脫除了體系全氮的71.6％，銨氮去除率為84.2％，亞硝酸鹽濃度僅為0.13mg N L-1。
實施例9細菌組合物與普通硝化與反硝化聯合脫氮效果WR-2和WO-8的混合菌群加蠟狀芽孢桿菌NBB-135(CGMCC No.0560)、短小芽孢桿菌NBB-112(CGMCC No.0561)、環狀芽孢桿菌NBB-295(CGMCCNo.0557)、地衣芽孢桿菌NBB-072(CGMCC No.0562)、糞產鹼菌(CGMCCNo.1.1799)、螢光假單胞菌(CGMCC No1.1802)的混合培養9.1培養基為以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養基，配製方法同1.3。
9.1.1螢光假單胞菌(CGMCC No1.1802)和糞產鹼菌(CGMCC No.1.1799)、從中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心索取。
9.2預培養9.2.1從PM斜面各接一環蠟狀芽孢桿菌NBB-135(CGMCC No.0560)、短小芽孢桿菌NBB-112(CGMCC No.0561)、環狀芽孢桿菌NBB-295(CGMCC No.0557)、地衣芽孢桿菌NBB-072(CGMCC No.0562)、糞產鹼菌(CGMCC No.1.1799)、螢光假單胞菌(CGMCC No1.1802)的菌苔入裝有70毫升PM液體培養基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養28小時，將菌液調OD值為菌體OD600＝0.45。
9.2.2從PM斜面接一環植物短小桿菌WO-8的菌苔入裝有50毫升以0.015molL-1乙酸鈉為碳源的NB培養基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養24小時，將菌液調OD值為OD600＝0.45。
9.2.3從PM斜面接一環球形節桿菌WR-2的菌苔入裝有50毫升以0.015molL-1乙酸鈉為碳源的NB培養基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養24小時，將菌液調OD值為OD600＝0.45。
9.3培養WO-8(9.2.2之培養物)和WR-2菌(9.2.3之培養物)和螢光假單胞菌等混合培養(8.2.1之培養物)按10∶10∶1(體積比)混合，接1毫升混合菌液入以0.075mol L-1乙酸鹽為碳源的NB培養基(配方同1.3)。在30℃，靜止培養21天。以靛酚藍比色法測氨態氮，格利斯試劑比色法測定亞硝態氮，開氏法測定總氮。
9.4結果混合培養物在培養21天後，脫除了體系全氮的76.3％，銨氮去除率為87.9％，亞硝酸鹽濃度僅為0.10mg N L-1。
權利要求
1.一種具有脫氮生物學活性的細菌組合物，其特徵在於它含有(A)異養硝化細菌，(B)異養好氧反硝化細菌，其中組份(A)與組份(B)可按任意比例混合。
2.根據權利要求1中所述的細菌組合物，其特徵在於組份(A)異養硝化細菌是球形節桿菌WR-2，(Arthrobacter globiformis WR-2)，其保藏登記號為CCTCC M202043。
3.根據權利要求1中所述的細菌組合物，其特徵在於組份(B)異養反硝化細菌是植物短小桿菌WO-8，(Curtoacterium plantarum WO-8)，其保藏登記號為CCTCC M202044。
4.根據權利要求1至3中所述的任何一種細菌組合物，其特徵在於它含有下列組份(體積比)(A)異養硝化細菌 1-99％，(B)異養好氧反硝化細菌 99-1％，其中異養硝化細菌是球形節桿菌WR-2(Arthrobacter globiformis WR-2)，其保藏登記號為CCTCC M202043，異養反硝化細菌是植物短小桿菌WO-8(Curtoacterium plantarum WO-8)，其保藏登記號為CCTCC M202044。
5.根據權利要求4中所述的細菌組合物，其特徵在於該細菌組合物含有下列組份(體積比)(A)異養硝化細菌 30-70％，(B)異養好氧反硝化細菌 70-30％。
6.根據權利要求5中所述的細菌組合物，其特徵該細菌組合物含有下列組份(體積比)(A)異養硝化細菌 40％，(B)異養好氧反硝化細菌 60％。
7.根據權利要求4至6中所述的任何一種細菌組合物，其特徵該細菌組合物還含有(體積比)(C)水體脫氮工藝中可接收的載體 0-10％，其中水體脫氮工藝中可接收的載體是指聚乙烯醇，硝化和反硝化細菌。
8.根據權利要求7中所述的細菌組合物，其特徵是聚乙烯醇為重量百分比為20％的聚乙烯醇。
9.根據權利要求7中所述的細菌組合物，其特徵是硝化和反硝化細菌是指蠟狀芽孢桿菌NBB-135，(CGMCC No.0560)；短小芽孢桿菌NBB-112，(CGMCC No.0561)；環狀芽孢桿菌NBB-295，(CGMCC No.0557)；地衣芽孢桿菌NBB-072，(CGMCC No.0562)；糞產鹼菌，(CGMCCNo.1.1799)；螢光假單胞菌，(CGMCC No1.1802)。
10.權利要求1至9中所述的任何一種細菌組合物在水體脫氮中的應用。
全文摘要
本發明涉及具有脫氮生物學活性的，能將水體中的氮素轉化成無汙染氮氣的細菌組合物。該組合物含有異養硝化細菌和異養好氧反硝化細菌。該類細菌組合物能有效脫除氨態氮，保護環境。
文檔編號C02F3/34GK1590532SQ03118599
公開日2005年3月9日 申請日期2003年2月14日 優先權日2003年2月14日
發明者王一明, 彭光浩 申請人:中國科學院南京土壤研究所