炎性疾病和自身免疫疾病的治療和預防的製作方法

2023-06-08 13:29:36 2

專利名稱：：炎性疾病和自身免疫疾病的治療和預防的製作方法
技術領域：
：本發明涉及治療和/或預防炎性疾病,尤其是炎性腸病(IBD),包括克羅恩病、肉芽腫性結腸炎、潰瘍性結腸炎、淋巴細胞結腸炎、膠原性結腸炎和乳糜瀉，以及其它炎性疾病，例如過敏性疾病或狀況,例如特應性皮炎、食物過敏、藥物過敏和哮喘。本發明還涉及治療和/或預防關節炎病(特別是類風溼性關節炎和/或銀屑病關節炎和/或幼年型關節炎)和其它自身免疫疾病,例如動脈粥樣硬化、多發性硬化、或重症肌無力。特別是提供了熱休克蛋白70家族成員的人II類MHC洗脫片段以及它們的延伸序列(例如更長的片段和/或一系列肽)在製備治療或預防IBD和關節炎以及其它自身免疫或炎性疾病的組合物中的用途，以及治療性和/或預防性治療IBD、關節炎和其它自身免疫或炎性疾病的方法。此夕卜,本文還提供了特定的HSP-70蛋白衍生肽。另外,還提供了鑑定和選擇適合於治療和/或預防炎性或自身免疫疾病的熱休克蛋白70(HSP70)家族成員的肽的方法。
背景技術：
：熱休克蛋白(HSP)被證實對於防禦1型糖尿病和類風溼性關節炎是關鍵性的，這兩種疾病為普遍的慢性退行性自身免疫疾病。該關鍵性基於以下的發現1.IISP的肽可用作治療劑來預防或阻止實驗性自身免疫關節炎和實驗性自身免疫糖尿病兩者中的炎性損傷。這類肽治療(首例臨床試驗)以特異的自身免疫T細胞的細胞因子譜(profiles)從促炎Th-I反應向抗炎Th_2反應的轉變為特徵。2.HSP的表位被免疫系統的適應性部分(arm)(Τ細胞和B細胞的抗原受體)所識別。3.HSP的表位在兩種疾病中都為調節性T細胞的靶。在I型糖尿病和關節炎模型中，已觀察到以HSP免疫可預防和遏制疾病。這裡可能的機制為微生物(共生的)HSP反應性T細胞的擴增，其通過黏膜耐受機制而在腸內耐受。HSP反應性T細胞的這種擴增通過口服和胃腸外途徑的IISP給藥是可能的。所擴增的T細胞與在發炎(應激)組織中過表達的同源自身HSP有交叉反應。耐受T細胞的這種交叉反應性導致炎症部位的調節性細胞因子生成。對於I型糖尿病和關節炎,人類中的首例臨床試驗證實了源於HSP60和HSP40的HSP衍生肽將疾病相關T細胞特異性的細胞因子模式轉變為更多調節性細胞因子生成的可能性。W095/25744描述了具有哺乳動物序列相似性的分枝桿菌熱休克蛋白(HSP65)的部分在預防或治療炎性疾病中的用途,所述疾病包括自身免疫疾病,例如糖尿病、關節炎病、動脈粥樣硬化、多發性硬化、重症肌無力、或腫瘤或移植排斥導致的炎性反應。該文獻僅顯示了針對HSP65衍生表位(IISP60家族成員)的數據。US6，007，821描述了全長人熱休克蛋白HSP90和HSP70在治療自身免疫疾病中的用途。僅提供了使用gp96(HSP90成員)治療胰島素依賴糖尿病(IDDM)的數據。僅在IDDM發作後看到效果，並且據說該自身免疫反應(即針對自身抗原的異常免疫反應)被使用全長人gp96的治療所逆轉。用在US6，007，821中的治療性治療中的熱休克蛋白優選從待治療患者、即已出現了該自身免疫疾病的患者獲得(即它們為自體蛋白)。沒有使用非全長HSP70或HSP90蛋白的暗示，並且僅在與全長HSP70蛋白複合的肽情形下提及HSP70肽。該文獻中不包括預防性治療。潰瘍性結腸炎被錯誤地作為自身免疫疾病而提到。Kingston等人(1996，Clin.Exp.Immunology10377)描述了全長重組分枝桿菌HSP70蛋白可用於減少佐劑性關節炎的出現。Tanaka等人(1999，.J.Immunology163，5560-5565)描述了分枝桿菌HSP70的肽234-252抑制佐劑性關節炎的出現並誘導IL-10生成。表位特異T細胞系也具有保護作用。另一肽(胺基酸84-103)是無效的,不抑制佐劑性關節炎的出現。Tanaka等人認為,分枝桿菌肽234-252的大鼠同源物也可能適合於預防關節炎，因為在初步實驗中特異於分枝桿菌肽的T細胞系對保守的大鼠肽(與19個胺基酸長的細菌肽在8個胺基酸有差異)有反應。VanEden(2000,CellStressandChaperones5:452-457)提供了關於自身熱休克蛋白在關節炎免疫方面的保護潛力的綜述。Wendling等人(2000，J.Immunology164:2711_2717)測試了一系列合成的重疊的分枝桿菌HSP70的15聚體肽誘導(全長)重組分枝桿菌HSP70特異T細胞系增殖的能力。採用這種方式，鑑定出4種肽(胺基酸111-125、131-145、397-411和490-504)。這四種肽中，肽111-125誘導與肽111-125的大鼠同源物(由此與自體HSP70)有交叉反應的T細胞，但是以這種分枝桿菌肽胃腸外預免疫不預防關節炎出現。另一方面，鼻內給藥缺導致關節炎顯著減少。Dengjel,Schoor等人(2005,PNASUSA102:7922-2927)描述了這樣的實驗，其顯示當人B細胞在營養缺乏條件下培養時HSP70家族成員的片段被負載進II類主要組織相容性複合物分子(II類MHC分子)中，並且這主要是針對細胞內胞質蛋白而發生,不針對細胞外蛋白。這篇文章未提及使用這種HSP片段來誘導疾病抑制性免疫調節。Crotzer和Blum(2005,PNASUSA102:7779-7780)描述了HSP70上載(upload)II類MHC的分子和細胞生物學基礎，並概述了細胞應激導致自我吞噬機制以及特別是HSP70家族成員片段通過伴侶介導自我吞噬(CMA)被負載進II類MHC分子的證據。沒有提及可能誘導疾病抑制性免疫調節。Paludan等人(2005,Science307:593-595)描述了自我吞噬後的溶酶體加工促進了長壽命內源抗原的II類MHC限制性監視。在增加的補充材料(補充表1)中，描述了HSC70和HSP70為三種最常見的細胞質/核II類MHC天然配體源之中的兩種。Mizushima,Yamamoto等人(2004,Mol.Biol.Cell15:1101_1111)描述，在胸腺上皮網狀細胞中，自我吞噬是組成型活躍的,其發生無需營養缺乏或其它細胞應激誘導事件，並且這種胸腺自我吞噬在新生兒中更活躍。由此,可推斷自我吞噬有助於T細胞庫的產生。Hutszti,Beneetal.(2004,Inflamm.Res.53551-555)描述了旨在支持這樣的觀察結果的實驗，即低水平的針對分枝桿菌hsp65的抗體存在於患有IBD的患者中。Elsaghieretal.(1992,Clin.Exp.Immunology89:305-309)描述了測量患有克羅恩病、潰瘍性結腸炎和肺的非肺結核分枝桿菌疾病的患者中針對分枝桿菌和人熱休克蛋白的抗體水平。他們認為這些數據不足以暗示分枝桿菌在IBD患者中的致敏作用。因此，其它的細菌蛋白可能參與了致敏作用。WO03/072598描述了IISP70肽在診斷和治療自身免疫疾病、尤其是1型糖尿病中的用途。在測試的糖尿病患者中，大多數顯示了對人HSP70的二十肽1-20(pi)、391-410(p27)和511-530(p35)的增殖反應。沒有公開適合於用在免疫介入中的肽。WO2007/054658公開了某些CD40L和分枝桿菌hsp70序列用於控制免疫反應的用途。這些hsp70序列為二卜肽407-426、457-476和477-496。仍需要其它的適合於治療和/或預防IBD和關節炎和/或其它自身免疫疾病的肽和組合物。還需要可用於鑑定或選擇肽的方法，當所述肽以適合量給予人體時可治療或預防關節炎和/或其它自身免疫疾病或其症狀。炎性腸病(IBD)的起因已知依賴於腸道菌群的存在,並認為是對共生生物體的不當的高反應性(BoumaandStrober2003,NatureRev.Immunol.3:521_533)。在手術切除迴腸的克羅恩病患者(無糞流)中，病變似乎消失了。注入腸內容物後誘導了復發的克羅恩病(D'Haensetal.1998，Gastroenterology114:262-267)。此外，在無菌條件下，不能誘導實驗性IBD疾病，除非重建腸菌群(Chandranetal.2003,Surgeon1:125-136,Stroberetal.2002，Ann.Rev.Immunol.20495-549)。因此,據信細菌抗原為導致疾病引發的觸發者。在諸如克羅恩病的IBD中，沒有病因相關的自體抗原已知存在，這與自身免疫疾病不同。因此，IBD不被認為是自身免疫疾病，如類風溼性關節炎。IBD模型已產生了厭氧細菌(梭菌,類桿菌屬)在誘導該疾病中的主要作用的證據(參見Verduetal.2000，Clin.Exp.Immunol.120(1)46-50)。在DSS誘導的結腸炎中口服給予厭氧細菌、需氧革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的粗超聲降解物，只有厭氧細菌的超聲降解物被發現減弱實驗性結腸炎的嚴重程度。發明_既述本發明人發現,--種或多種HSP70衍生肽可用於治療和/或預防關節炎和/或其它自身免疫疾病以及炎性腸病和其它炎性疾病。因此，本發明涉及所述肽及其混合物，涉及包含這些的一種或多種的組合物，以及涉及鑑定能夠激活HSP70特異調節性T細胞的保護性HSP70肽的方法。還提供了HSP70肽特異的T細胞系和雜交瘤,其可在體外或體內用作HSP70肽特異的調節性T細胞的來源,用於研究目的以及在治療和療法中使用這類特異的調節性T細胞。在以全長分枝桿菌IISP70蛋白免疫小鼠和表位作圖分析(測試分枝桿菌IISP70衍生肽(在123種重疊的HSP70肽篩選中，參見Wendlingetal.2000』J.Immunol.1642711-2717)存在下T細胞增殖反應)後,鑑定了13種分枝桿菌15聚體肽,它們被分枝桿菌HSP70啟動的(primed)T細胞識別，並由此認為是參與激活HSP特異的調節T性細胞的候選物。在免疫小鼠中採用13種肽(基於它們與小鼠同源HSP70肽的同源性分為肽池)的混合策略(poolingstrategy),他們發現兩種保守的細菌肽(命名「Bi」和「Cl」)誘導與小鼠同源物HSP70肽(分別為「！！^」和「！^^，「！^讓」)有交叉反應的T細胞，即細菌肽啟動的T細胞與小鼠的同源的「自身」HSP70肽(即小鼠同源肽)有交叉反應。在隨後的實驗中，在小鼠中誘導關節炎之前,給予全長分枝桿菌HSP70蛋白或分枝桿菌和/或小鼠HSP70肽(例如，具有胺基酸VLRIVNEPTAAALAY(SEQIDNO8)並命名「Cl」的分枝桿菌肽和具有胺基酸序列VLRVINEPTAAALAY(SEQIDN0:4)並命名「mCla」的小鼠同源HSP70肽的混合物或給予這些肽的任一種本身；或給予具有胺基酸序列DEVVAVGAALQAGVL(SEQIDNO1)並命名肽「Bi」的分枝桿菌肽本身)，以細菌和哺乳動物同源HSP70肽的混合物鼻內預處理或以這些肽的任一種分別處理,或以分枝桿菌肽Bl處理，能夠顯著減弱關節炎進展和症狀嚴重度，表明保守的HSP70肽可用於治療和/或預防關節炎。因此,細菌HSP70衍生肽能夠誘導特異保護性T細胞的增殖和擴展,這些T細胞可與「自身」HSP70表位(自身HSP肽)交叉反應,例如關節炎關節或關節炎發炎區域局部誘導的HSP70蛋白衍生的那些。除了抗原特異的T細胞增殖，IFN-Y和ILlO的生成顯著地被所述肽和肽混合物刺激，表明IFNy和/或ILlO的生成可能在保護效應方面起作用。另外，在小鼠中誘導結腸炎之前,給予全長分枝桿菌HSP70蛋白或分枝桿菌和/或小鼠HSP70肽(Cl和mCla),導致結腸炎進展和症狀嚴重度的顯著減輕,表明全長HSP70蛋白和/或保守的HSP70肽可用於治療和/或預防炎性腸病，例如結腸炎。因此，細菌HSP70蛋白和/肽能夠誘導特異保護性T細胞的增殖和擴展，這些T細胞可與「自身」IISP70表位(自身HSP肽)交叉反應,例如IBD局部誘導的HSP70蛋白衍生的那些。發現以下的肽和/或其混合物(以及包含這些或由這些組成的組合物)誘導HSP70特異的T細胞反應，可用在治療和/或預防關節炎(尤其是類風溼性關節炎和/或銀屑病關節炎和/或幼年型關節炎)和/或其它自身免疫疾病(例如但不限於1型糖尿病、動脈粥樣硬化、多發性硬化、重症肌無力)或任意這些疾病的症狀的方法中，以及用在治療和！或預防炎性疾病(特別是IBD,例如克羅恩病、肉芽腫性結腸炎、潰瘍性結腸炎、淋巴細胞結腸炎、膠原性結腸炎和乳糜瀉)的方法中1)SEQIDNO1-命名「Bi」並具有胺基酸序列DEVVAVGAALQAGVL的分枝桿菌HSP70肽；及其變體(包含例如至少70%的與該肽的序列一致性)和包含該肽或變體的更長的肽。SEQIDNO1的一變體例如描述在SEQIDNO2和SEQIDNo:83_93的相關部分中，其中SEQIDNO2顯示了命名「mBl」並具有胺基酸序列DEAVAIGAAIQGGVL的小鼠HSP70同源肽。2)SEQIDNO:3-命名「Cl」並具有胺基酸序列VLRIVNEPTAAALAY的分枝桿菌HSP70肽；及其變體(包含例如至少70%的與該肽的序列一致性)和包含該肽或變體的更長的肽。SEQIDNO:3的變體例如描述在以下的兩序列中=SEQIDNO:4，描述命名「mCla」並具有胺基酸序列VLRVINEPTAAALAY的小鼠IISP70同源肽；以及SEQIDNO:5，描述命名「mClb，，並具有胺基酸序列VLRIINEPTAAAIAY的小鼠HSP70同源肽，以及在SEQIDNo:57-71的相關部分中。出乎意料地，發明人在表位作圖實驗(見實施例)中鑑定的具有與肽mClb相同胺基酸序列的肽已在文獻中描述為從保持在應激(營養缺乏)條件以增強自我吞噬的人B細胞系的人II類MHC分子洗脫(Dengjeletal.2005,PNAS102:7922-7927，參見表1，人肽VLRIINEPTAAAIAY),並且重疊肽也已由其它描述為存在於人II類MH中(參見實施例)。不被任何理論所束縛，本發明人認為，其它的從II類MHC分子洗脫的HSP70衍生肽(和/或它們的細菌同源物)也適合於治療和/或預防關節炎(特別是類風溼性關節炎和/或銀屑病關節炎和/或幼年型關節炎)和/或其它自身免疫疾病,例如但不限於動脈粥樣硬化、多發性硬化、重症肌無力，或任意這些疾病的症狀，以及一種或多種IBD,例如克羅恩病、肉芽腫性結腸炎、潰瘍性結腸炎、淋巴細胞結腸炎、膠原性結腸炎和/或乳糜瀉。因此，提供了可用於本發明的其它組的肽3)HSP70蛋白衍生肽,其結合待治療個體的細胞上的II類MHC並且誘導與該個體的同源「自身」HSP70肽可交叉反應的T細胞。從文獻篩選存在於(結合)II類MHC分子上(即容納在II類MHC裂隙中且可從中洗脫)的HSP70衍生肽,鑑定了約30種肽(參見實施例和SEQIDNO1.7-47),它們都作為適合於治療或預防自身免疫疾病和IBD而包括在本文中。因此,在本發明的一個實施方案中，提供了包含一種或多種HSP70衍生肽的組合物(以及包含這些或由這些組成的組合物)(其能夠結合哺乳動物、尤其是人II類MIIC分子)，用於激活IISP70特異的調節性T細胞,並由此用於治療和/或預防關節炎,特別是類風溼性關節炎和/或銀屑病關節炎和/或幼年型關節炎，和/或其它自身免疫疾病,例如但不限於動脈粥樣硬化、多發性硬化、重症肌無力或任意這些疾病的症狀，以及IBD。另外，還提供了使用IISP70家族成員的一種或多種II類MHC洗脫肽來(製備藥物來)治療或預防關節炎和/或其它自身免疫疾病(例如但不限於動脈粥樣硬化，多發性硬化、重症肌無力或任意這些疾病的症狀)的方法。此外,本文提供了使用一種或多種更長的包含這些洗脫肽的HSP70肽的方法。在另一實施方案中，本文排除使用全長HSP70蛋白或複合的HSP70衍生肽(例如US6，007，821中描述的HSP70肽複合物)。因此,本文使用的肽優選自由的、非複合肽,它們不結合至其它蛋白或肽。所述肽的使用具有優點，因為它們可合成製備,這是廉價的並且避免了例如從天然或重組來源純化的蛋白的汙染。特異性、穩定性和均一性也高。類似地，提供了包含一種或多種HSP70肽的藥物、營養或食品增補組合物，其可用於免疫或預免疫哺乳動物、特別是人來預防關節炎和/或其它自身免疫疾病，和/或在症狀出現後治療關節炎和/或其它自身免疫疾病。另外,還提供了使用HSP70家族成員的一種或多種II類MHC洗脫肽來治療或預防一種或多種IBD的方法。在另一實施方案中，本文提供了使用全長HSP70蛋白來(製備藥物來)治療或預防一種或多種炎性腸病(IBD)的方法。類似地,上文提及的藥物、營養或食品增補組合物可用於免疫或預免疫哺乳動物、特別是人來防禦181)，和/或在症狀出現後治療IBD。在另一實施方案中，提供了鑑定適合於治療和/或預防關節炎和/或其它自身免疫疾病的HSP70衍生肽的方法，包括(a)提供優選來自細菌或哺乳動物HSP70蛋白的一種或多種HSP70衍生肽；以及(b)任選地確定HSP70衍生肽是否能夠結合II類MHC分子，即結合II類MHC裂隙，或者可從II類MHC分子洗脫；(c)任選地在交叉反應測定法中測試所述肽誘導與哺乳動物(尤其是人或動物模型或細胞系)的同源自身肽可交叉反應的肽特異T細胞的能力，並選擇顯示交叉反應性的那些肽；以及(d)向關節炎動物模型(例如佐劑性關節炎、蛋白聚糖誘導關節炎)和/或其它自身免疫疾病動物模型或炎性疾病動物模型給予包含一種或多種所述肽或由其組成的組合物以確定體內保護活性，並且比較治療和對照動物之間的發病和/或症狀，由此確認所述一種或多種肽適合於治療和！或預防疾病；以及(e)採用所述一種或多種肽來製備用於治療和/或預防人或動物的關節炎和/或其它自身免疫疾病和/或IBD的藥物，以及在治療和/或預防個體的關節炎和/或其它自身免疫疾病和/或炎性疾病的方法中使用所述一種或多種肽，其中所述個體特別是人或馴養動物，例如家畜或寵物(例如狗)。因此，在一個實施方案中，所述肽源於IISP70蛋白且包含T細胞表位，其在動物模型如小鼠中預防實驗性誘導的關節炎和/或其它自身免疫疾病(見步驟d)。在另一實施方案中，所述肽包含全長HSP70蛋白的--部分，或全長HSP70蛋白的--系列肽,或兩種或多種HSP70衍生肽的混合物，或者由其組成，且在給予小鼠時預防實驗性關節炎和/或其它自身免疫疾病和/或炎性疾病(見步驟d)。還提供了治療或預防人或動物個體的關節炎和/或一種或多種其它自身免疫疾病和/或一種或多種炎性疾病的方法,包括向有需要的個體給予治療或預防有效量的--種或多種HSP70衍生肽(或其變體，或包含該較短肽的更長肽)(步驟(e))。一般性定義「關節炎」在本文中指選自類風溼性關節炎、銀屑病關節炎和幼年型慢性關節炎的炎性自身免疫疾病。「自身免疫疾病」指諸如關節炎、胰島素依賴糖尿病(1型糖尿病)、動脈粥樣硬化、重症肌無力、實驗性自身免疫腦脊髓炎、多發性硬化等的疾病，其中主要的疾病開始和維持性免疫反應是針對個體的自體抗原(自身抗原；即正常細胞組分的抗原)。產生了特異於這類自體抗原的自體抗體和T細胞。特別地,根據本發明,待治療或預防的自身免疫疾病為炎性T細胞即II類MHC限制性CD4T細胞引起的那些疾病。這些疾病包括動脈粥樣硬化、關節炎、重症肌無力、多發性硬化等。這些疾病可被認為不用於細胞毒性T淋巴細胞(I類MHC限制性CD8T細胞)引起的自身免疫疾病,如糖尿病。「非自身免疫疾病」在本文指這樣的疾病,其中主要的疾病開始和維持性免疫反應不是針對個體的自體抗原(自身抗原)，而是針對非自身抗原(外來抗原)。例如，IBD(炎性腸病)為非自身免疫疾病。在這種/後一情形下，自身免疫反應不是開始和/或維持炎症的原因。對於克羅恩病,該疾病的非自身免疫性質在手術構建的盲袢中得到證實，其中除去糞便內含物導致疾病消退，而重新注入糞便內容物導致疾病復發(Rutgeertsetal.1991,Lancet338771~774)。「炎性疾病，，指任何這樣的疾病，其中組織或細胞損傷或細胞功能障礙是通過血漿體液介導物或淋巴(白血)細胞形式的免疫系統活性引起。這包括炎性腸病(IBD)和其它炎性疾病。這類其它炎性疾病包括過敏性疾病或狀況,例如特應性皮炎、食物過敏、藥物過敏和哮喘。「IBD」在本文指炎性腸病，一種胃腸道慢性炎症，包括以下疾病或由其組成克羅恩病、肉芽腫性結腸炎、漬瘍性結腸炎、淋巴細胞結腸炎、膠原性結腸炎和乳糜瀉。「個體」在本文為哺乳動物,特別是人和/或馴養動物,特別是家畜(牛、馬、豬等)或寵物(狗、貓、兔等)。術語「模型動物」在本文中通常指非人動物，特別是非人哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔等。術語「抗原」(或免疫原)包括提及能夠引起適應性免疫反應的物質，即能夠誘導產生對該抗原有特異免疫反應性的抗原識別分子(特別是抗原特異或交叉反應T細胞)的物質。抗原內的特異免疫反應位點稱為「表位」(或抗原決定族)。本文提供了由一種或多種細菌和/或哺乳動物HSP蛋白的表位組成或包含它們的蛋白片段(肽)，所述表位能夠預防和/或治療關節炎和/或--種或多種其它自身免疫疾病。這些表位也稱為「保護性表位，，。「T細胞表位」指由T細胞受體識別的表位。結合表位後,個體中免疫反應被固定。「腸的」在本文中指直接輸送進個體的胃腸道(例如，口服或通過軟管、導管或人造口)。「鼻的」指通過鼻給藥。「百分比」或「均值」一般指重均百分比，除非另有說明或除非明確指另一基準。「序列一致性」和「序列相似性，，可通過採用整體或局部比對算法比對兩胺基酸序列或兩核苷酸序列來確定。然後，當它們(當通過例如採用默認參數的程序GAP或BESTFIT最佳比對時)共有至少某種最低百分比的序列一致性時,序列可歸為「基本上一致的」或「實質上相似的」，或「變體」(如以F所定義的)。GAP採用Needleman和Wunsch整體比對算法在總長度上來比對兩序列,最大化匹配數量並最小化空位數量。其最適合比對類似長度的序列。一般地,採用GAP默認參數，空位生成罰分高於延伸罰分(例如，空位開放罰分=10,空位延伸罰分=0.5)。對於核苷酸,所使用的默認計分矩陣為rwsgapdna,對於蛋白，默認計分矩陣為Blosum62(Henikoff&Henikoff,1992,PNAS89,915-919)可以採用電腦程式,例如GCGWisconsin軟體包,版本10.3，來確定序列比對和序列一致性百分比計分，該軟體包可從AccelrysInc.,9685ScrantonRoad,SanDiego,CA921.21-3752USA獲得。另外，可使用Embossffin版本2.10.O,採用程序「needle」(其對應GAP),參數與以上GAP所用的相同。對於不同長度的序列，優選使用局部比對算法如SmithWaterman算法，例如通過例如Embossffin版本2.10.O的程序「water」所提供的，採用默認參數(空位開放罰分1.0.O和空位延伸罰分0.5),或採用諸如BLAST或FASTA的程序。術語「蛋白」或「多肽」或「肽」可互換使用，指由胺基酸鏈組成的分子,不考慮特異作用方式、大小、三維結構或來源。蛋白的「片段」或「部分」或包含天然蛋白的片段的肽因此仍可稱為「蛋白」或「肽」。「分離的蛋白」用來指不再處於其天然環境中的蛋白，例如在體外或在重組細菌宿主細胞中。根據上下文,術語「同源物」或「同源的」指從共同祖先序列傳下來的序列。如果需要，該術語可通過直系同源(ortholog)和旁系同源(paralog)來說明；參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov/'Education/BLASTinfo/Orthology.html)。直系同源一般在不同物種中保留了相同功能。與此相反,旁系同源進化出不同(可能相關)的功能。HSP70家族的細菌熱休克蛋白和哺乳動物熱休克蛋白因此在本文中認為是同源物,不同種類細菌的HSP70蛋白或不同種類的哺乳動物的HSP70蛋白(例如小鼠和人HSP70蛋白)也是如此。因此，採用局部比對算法(例如SmithWaterman)成對比對時，細菌IISP70衍生肽的「哺乳動物同源物」在胺基酸序列上與該細菌肽有至少70%、優選至少80%,90%或更高的一致性。術語「同源的」和「異源的」也可以用於指核酸或胺基酸序列與其宿主細胞或生物體的關係，尤其在轉基因細胞/生物體情況F。同源序列因此在宿主物種中天然存在，而異源序列不天然存在於宿主細胞中。「嚴緊雜交條件」可用於鑑定核苷酸序列，其基本上與給定的核苷酸序列相同。嚴緊條件是序列依賴的,不同情況下可以不同。通常,對特異序列而言,在確定的離子強度和PH下嚴緊條件選擇為低於熱力學熔點(Tm)約5°C。Tm為50%的靶序列雜交至完全匹配的探針時的溫度(確定的離子強度和Pli值下)。典型地，可以選擇這樣的嚴緊條件，其中鹽濃度約0.02摩爾，pH7,且溫度至少60。降低鹽濃度和/或升高溫度增強嚴緊性。用於RNA-DNA雜交(採用例如IOOnt探針的Northern印跡)的嚴緊條件例如包括至少一次在0.2XSSC中於63°C洗滌20min,或等同條件。用於DM-DNA雜交(採用例如IOOnt探針的Southern印跡)的嚴緊條件例如包括至少一次(一般兩次)在0.2XSSC中於至少50°C(—般約55°C)洗滌20min,或等同條件。還參見Sambrook等人(1989,MolecularCloningalaboratorymanual(分子克隆實驗室手冊)·第二版·N.Y.，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989.1659p.ISBN0-87969-309-6)以及Sambrook禾ΠRussell(2001,MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實驗室手冊)，第—三版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY)。在本文及其權利要求書中，動詞「包含」及其詞形變化以其非限制性意義使用，指該詞語之後的項目包括在內，但是並不排除未明確提及的項目。另外,通過不定冠詞「a」或「an」指出的元素不排除存在一個以上該元素的可能性，除非上下文明確要求該元素中的一個並僅有--個。因此不定冠詞「a」或「an」一般指「至少--個」,例如「acell」也指細胞培養物、組織、整個生物體等形式的多個細胞。還應理解的是，當本文提及「序列」時，一般指具有某種亞單元(例如胺基酸)序列的實際物理分子。詳細說明本發明涉及一種或多種從II類MHC分子洗脫和/或能夠與其結合的熱休克蛋白70(HSP70)衍生肽在治療和/或預防關節炎、特別是類風溼性關節炎和/或銀屑病關節炎和/或幼年型關節炎和/或其它自身免疫疾病、例如但不限於動脈粥樣硬化、多發性硬化、重症肌無力或任意這些疾病的症狀中的用途。本發明還涉及包含一種或多種這類肽或由其組成的組合物。本發明還涉及HSP70衍生肽和！或--種或多種全長HSP70蛋白在治療和！或預防炎性疾病、特別是IBD、尤其是各種形式的結腸炎、例如選自克羅恩病、肉芽腫性結腸炎、潰瘍性結腸炎、淋巴細胞結腸炎、膠原性結腸炎和乳糜瀉的那些疾病中的用途。用於本發明的肽和蛋白熱休克蛋白為普遍的蛋白，其在原核和真核細胞中發揮重要的看家功能。它們作為伴侶蛋白在蛋白摺疊和從應激條件拯救細胞方面起重要作用。基於它們的單體分子量將它們分為不同的家族。因此，家族HSP70的蛋白具有約70kDa的分子量。主要家族為HSP10、40、60、70、90和1.00。很多哺乳動物HSP家族成員具有高度保守的微生物同源物。本發明人發現,分枝桿菌HSP70和哺乳動物HSP70蛋白的肽片段可用於治療哺乳動物中的炎性疾病和/或自身免疫疾病。他們發現所鑑定的小鼠肽之一(命名mClb)的人同源物由於在II類MIIC分子上被呈遞而已在Dengjel等人的文章(PNAS2005，上文)有描述。該文章中顯示並認為，特別在細胞應激條件下,胞質蛋白通過自我吞噬而進入抗原呈遞的II類MHC途徑中。在自我吞噬中，三種不同的機制起作用，其中伴侶蛋白介導的自我吞噬(CMA)是一種機制。在CMA中，HSC70為轉運分子，其協助有功能的Lamp-2將胞質蛋白轉移進溶酶體，用於II類MHC呈遞。由於CMA的這種機制，HSC70(HSP70家族蛋白)片段優先與II類MHC負載區室相交叉,並被捕獲在II類MHC結合裂隙中。在Dengjel等人的文章中，發現HSP70肽主導從II類MHC獲取的胞質肽庫並在增強自我吞噬的條件下上調(營養缺乏)。這篇文章中沒有地方有對這對於HSP特異CD4+T細胞識別可能意味著什麼的解釋，而是已發現類似的肽(本文命名mCla和Cl)適合於治療和/或預防自身免疫疾病，例如關節炎或IBD,本發明人斷定能夠結合II類MHC分子並誘導與同源的「自身」HSP70肽可交叉反應的CD4+T細胞的HSP70衍生肽可用於治療和/或預防哺乳動物(特別是人)中的關節炎和/或其它自身免疫疾病和/或IBD。術語「治療」在本文中指，在給予適合量的一種或多種HSP70衍生肽後,疾病症狀和/或進展的任何減弱或緩解，由此在診斷出關節炎或IBD後進行一次或多次給藥。該術語因此包括經治療個體中疾病症狀和/或進展的減弱，以及該個體的痊癒。術語「預防」指向個體預防性給予本發明的化合物或組合物，該個體還未被診斷有關節炎或IBD，但是其例如可能有發病的風險。本發明人還得到Mizushima等人的文章(MolecularBiologyoftheCell,2004,Vol.151101-1111)的指導，其顯示自我吞噬以高基礎水平在胸腺的胸腺上皮細胞中發生。年幼哺乳動物和晚期胚胎在胸腺中顯示甚至更高的自我吞噬活性(同上，相同文章)。本發明人認為，胸腺上皮細胞參與了T細胞庫的陽性選擇。這使得HSP70有可能在組織T細胞庫的陽性選擇的位置和時間上載進II類MHC。換言之，由此本發明人推斷，胸腺選擇的HSP70衍生肽將可能導致對HSP70肽有特異性的調節性T細胞的T細胞庫的形成。本發明人將這些零碎的信息與他們自己的實驗數據(見實施例)組合，得出結論增強的自我吞噬條件(例如應激和營養缺乏)下的細胞系的II類MHC分子結合裂隙中的HSP70家族成員衍生肽有誘導調節性T細胞反應的性質,並適合於治療和/或預防關節炎(特別是類風溼性關節炎和/或銀屑病關節炎和！或幼年型關節炎)和！或其它自身免疫疾病，例如但不限於1型糖尿病、動脈粥樣硬化、多發性硬化、重症肌無力或任何這些疾病的症狀或IBD。本發明人在蛋白聚糖誘導的關節炎的Ba:[b/c小鼠模型中測試了命名Cl(SEQIDNO3)的分枝桿菌HSP70衍生肽和其交叉反應性哺乳動物(小鼠)同源物(命名mCla的HSP70同源肽，SEQIDNO4)誘導調節性T細胞反應(針對同源的小鼠HSP70肽)的能力(將它們分別測試或混合在一起測試)。這些實驗顯示，在誘導疾病之前給藥，兩種肽單獨(或作為二者的混合物)的鼻內給藥抑制了關節炎(見實施例)。對於肽「Bi」也發現了類似的結果。他們還在TNBS誘導的Balb/c小鼠結腸炎模型中測試了Cl誘導調節性T細胞反應(針對同源的小鼠HSP70肽)的能力。該實驗顯示，當在TNBS皮膚致敏之後且在通過直腸TNBS給藥誘導疾病之前給藥時,這種肽(肽混合物)的鼻內給藥抑制了TNBS誘導的結腸炎病(參見實施例)。本發明人還在實驗性IBD模型中測試了完整分枝桿菌HSP70分子。這種情況下測試了SEQIDNO55的分枝桿菌HSP70。為此，使用了TNBS誘導的IBD模型和DSS誘導的IBD模型。在兩種模型中，當口服和/或鼻內給藥時，全長分枝桿菌HSP70都抑制了發病。因此,本發明人發現HSP70衍生肽和/或完整HSP70蛋白的鼻內給藥和/或口服給藥在嚙齒類的TNBS和DSS結腸炎模型中為高度抑制疾病的(參見實施例)。觀察到預防效果和治療效果。肽(鼻內給藥)預防關節炎的效果可與全長分枝桿菌HSP70蛋白(SEQII)NO55)的保護效果相較。因此,本發明人發現嚙齒類關節炎模型中HSP70衍生肽的鼻內給藥高度抑制疾病的(參見實施例)。因此,在一個實施方案中，提供了保護性表位或由保護性表位組成或包含保護性表位的蛋白片段(肽)，以及包含它們的一種或多種的組合物。特別是在--個實施方案中，提供了用於製備治療和/或預防關節炎和/或其它自身免疫疾病和/或IBD的組合物(例如藥物或疫苗)的一種或多種HSP70肽或包含這種肽的更長的多肽。還提供了一系列HSP70肽,其中一系列包括重疊肽,它們合起來覆蓋全長HSP70蛋白。這一系列的子部分(subpart)或全部也可以用於製備本發明的組合物。術語「HSP70蛋白」在本文指全長蛋白，例如人、動物(例如哺乳動物)、細菌、酵母、植物或其它來源的且分類為屬於HSP70家族蛋白的全長HSP70蛋白。該術語該包括這些蛋白的「變體」，例如相對於天然蛋白有一個或多個胺基酸缺失、替換或插入的蛋白。當優選採用整體比對算法全長比對時,變體可以包括與天然蛋白(即生物體中天然發現的HSP70蛋白)至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%或99%或更高的胺基酸一致性。IISP70蛋白的實例包括SEQIDNO:55中描述的分枝桿菌HSP70蛋白及其變體，SEQIDNO48-54中描述的人HSP70蛋白及其變體,例如包括與SEQIDNO55和/或48-54的至少以上百分比的胺基酸序列一致性的蛋白。其它來源的HSP70蛋白在本領域中是已知的,它們的胺基酸序列可容易地獲得，例如通過http://www.expasy.org。實例包括(帶UniProtKB/Swiss-Prot條目):牛HSP70蛋白8(P19120；HSP7CJ30VIN)；鼠IiSP蛋白5(P20029；GRP78—MOUSE)；大鼠HSP蛋白9(P48721；GRP75—RAT)；雞(P08106；HSP7O—CHICK)；果蠅(黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster))(HSP72_DR0ME)；S^F(Arabidopsis_thaliana)(P22953,HSP71_ARATH；P22954,HSP72_ARATH；095719，HSP73_ARATH；Q39043,BIP2_ARATH)；普通菸草(Nicotiana—tabacum)(Q40511—TOBAC；Q67BD0—TOBAC；Q67BD1—TOBAC；Q67BD2—TOBAC；Q03685，BIP5JOBAC)；釀酒酵母(Saccharoraycescerevisiae)SSQl(Q05931，HSP7Q—YEAST)，SSB2QMO150，HSP76_YEAST),SSA3(P09435,HSP73_YEAST)和SSA4(P22202,HSP74_YEAST)；嗜酸性乳酸菌(Lactobacillusacidophilus)(Q84BU4,DNAK_LACAC)；絲狀黴漿菌(Mycoplasmamycoides)(Q6MT06；DNAK—MYCMS)；以及麻風分枝桿菌(Mycobacteriumleprae)(DMAK—MYCLE,P19993),禽結核分枝桿菌(M.avium)(A0QLZ6,DNAKmMYCA1),副結核分枝桿菌(M.paratuberculasis)(Q00488,DNAK_MYCPA),和淺黃分枝桿菌(M.gilvum)(DNAK_MYCGI,A4T112)；等等。術語「HSP70衍生肽」或「HSP70肽」或「HSP70片段」在本文指以上描述的IISP70蛋白和/或蛋白變體的片段,例如包含上述HSP70蛋白或變體的至少5、6、7、8、9、10、優選至少11、12、13、14、15、任選地至少16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70或更多連續胺基酸的或由其組成的片段。因此，當採用局部比對算法與全長HSP70蛋白或變體(如上所定義)比對時，所述肽的至少5、6、7、8、9、10、11等連續胺基酸100%匹配該全長蛋白或變體。HSP70衍生肽還可以例如在一端或兩端包含其它的胺基酸,或在胺基酸之間插入其它的胺基酸。這些另外的胺基酸不必與天然HSP70胺基酸序列互補。長度變化反映了這樣的事實，即不同的長度變體可結合II類MHC分子。本發明HSP70衍生肽的非限制性實例由SEQIDN0:1-5或其變體組成或包含SEQIDNO1-5或其變體,例如這樣的肽，其相對於SEQIDNO包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10胺基酸插入或添加、置換或刪除並在體內仍為保護性的。其它優選的肽由SEQIDN0:17-47或其變體組成或包含SEQIDN0:17_47或其變體，例如這樣的肽，其相對於SEQIDNO17-47包含1、2、3、4、5、或更多胺基酸插入或添加、置換或刪除並在體內仍為保護性的。特別優選的肽為SEQIDNO:56-132的那些，即其相同部分或與該部分有至少70%、優選至少80%、更優選至少90%胺基酸一致性的等同物。顯然，本發明的HSP70肽在治療和/或預防關節炎方面在體內是有功能的，並且如下文所闡述的，可測試或確定功能。在一個實施方案中，所述肽包含HSP70蛋白或變體的不超過30、25、20、19、1.8、17、16、15、1.4、13、12、11或10個連續胺基酸或由其組成。優選地,用在本發明中的肽具有至少10、11、12、13或14胺基酸,多至19、18、17或16連續胺基酸。最優選地,所述肽具有至少11至30胺基酸，更優選至少12胺基酸，多至少於25胺基酸，最優選15至少於19胺基酸。「一系列」HSP70肽指至少兩種、三種、四種、五種等，多至至少50、100、120、130、150、200、300或更多種肽的集合,這些肽重疊一個或多個胺基酸(優選至少3、5、8、9、10、11胺基酸或更多)，這樣整個HSP70蛋白被該集合所覆蓋，即重疊區域的排列可重構成整個HSP70蛋白或蛋白變體。例如，重疊10胺基酸的一系列15聚體肽產生123種肽的系列。該系列肽可以在不同的肽長度和/或重疊方面更小或更大。子系列可覆蓋少於整個HSP70蛋白，例如至多80%、60%、50%、30%、20%或更少。原則....匕可以使用任何HSP70蛋白，例如任何微生物(例如細菌，例如來自分枝桿菌屬的,等等)或哺乳動物(例如，大鼠、小鼠、人等)來源的HSP70蛋白片段。各種各樣生物體的HSP70蛋白都已被克隆和測序，如以上所描述的，因此蛋白和/或肽可通過例如重組DNA技術、化學合成而產生,或採用本領域熟知的方法從天然來源純化。HSP70衍生肽可以為任何來源的HSP70蛋白的片段，例如細菌的、酵母的、植物的、合成的、人工的、哺乳動物(大鼠、小鼠、牛等)或人的。當採用全長HSP70蛋白(或一系列肽,例如覆蓋全長蛋白)時,一個實施方案是該全長蛋白不是人源的,特別是當其用於治療和/或預防潰瘍性結腸炎時。因此,該實施方案包括使用全長非人HSP70蛋白來治療或預防潰瘍性結腸炎。優選地，該HSP70蛋白系列和/或HSP70肽包含在體內有功能的表位或由其組成，即當它們以適合濃度和通過適合途徑(例如鼻內)給藥時，預防或治療關節炎和/或其它自身免疫疾病。這類肽優選能夠a)結合個體(例如人)的II:類MHC分子，和任選地(b)它們能夠激活與該個體(例如人或動物)或哺乳動物模型動物如小鼠的同源「自身」HSP70肽有交叉反應的調節性T細胞(CD4+細胞)，以及(c)當給予動物或人個體時，該肽能夠治療和/或預防關節炎和/或一種或多種其它自身免疫疾病，或症狀嚴重性和/或任何這些疾病的發病(進展)。如本文其它地方所詳細描述的,可對肽的上述能力進行測試，但基本上，能力a)可通過從科學文獻(其被描述具有這種能力)鑑定肽和/或通過體外或體內的II類MHC結合測定來確定；能力b)可通過體外啟動測試，能力c)可通過使用例如動物模型和/或人體試驗來測試。在動物模型中也可使用人源化MHC轉基因動物。因此,在一個實施方案中，具有特定胺基酸序列的肽就此使用，例如組合物包含SEQIDNO1-5和10、或SEQIDNO17-47和/或56-132、或其它的各HSP70衍生肽之一的多個分子，或由其組成。在另一實施方案中，提供了兩種或多種不同IISP70衍生肽的混合物。這些不同的肽可以來自相同HSP70蛋白(例如源自細菌HSP70,例如源自分枝桿菌HSP70,例如SEQIDNO55)或來自不同HSP70蛋白，例如來自不同物種的同源物,例如一種肽來自小鼠或人HSP70，一種肽來自細菌HSP70。「不同」意味著肽的胺基酸序列有至少一個胺基酸差異(相對於其它肽通過添加、置換或刪除)。還可以使用--種或多種HSP70肽和/或HSP70系列的混合物。在優選的實施方案中，用於治療和/或預防關節炎和/或其它自身免疫疾病的組合物包含至少一種微生物和至少一種哺乳動物HSP70肽或由其組成，其中細菌和哺乳動物肽優選彼此為同源物，即它們在胺基酸序列上非常相似(它們為如上所述的「變體」)且可交叉反應。例如,優選的組合物包含SEQIDNO3的肽(細菌「Cl」)和一種或多種小鼠同源物(SEQIDNO:4和/或5或其其它變體，例如來自其它物種的，參見SEQIDNO47-54和56-132)。當提及「熱休克蛋白」時，可理解的是該蛋白天然存在於細菌、酵母、植物或哺乳動物細胞中，但是可以通過各種手段生成或分離。例如，其可以通過重組DNA技術產生，由此編碼蛋白(或蛋白片段)的核苷酸序列被用於轉化或轉染宿主細胞，然後其產生蛋白或蛋白片段。編碼HSP的核酸序列(cDNA、RNA和基因組DNA)在本領域中是已知的，可以通過化學合成製備，並且用於重組產生蛋白或蛋白片段(肽)的方法是常規的。類似地，核酸雜交技術(例如採用嚴緊雜交條件)可用於分離編碼HSP的基因。或者,蛋白或蛋白片段可以從天然來源(例如哺乳動物細胞、細菌或植物)純化或部分純化，或者可以化學合成。例如，肽可通過公知的Merrifield固相合成方法來合成，其中胺基酸順序地添加至生長鏈。參見Merrifield(1963)，J.Am.Chem.Soc.85:2149-2156JPAthertonetal.,「SolidPhasePeptideSynthesis(固相肽合成),」IRLPress,London,(1989)。自動I太合成儀可從許多供應商獲得，例如AppliedBiosvstems,FosterCity,California,,在最廣義上，提供了具有結合個體II類MHC分子的能力的任何HSP70肽序列。這種能力可採用本領域已知的各種方法測試。例如，可在II類MHC結合測定法中測試覆蓋整個HSP70蛋白的例如15聚體肽的整個重疊組，參見PeptideelectrophoreticinobiIityshiftassay(Ii^IlJ^'),MittelmanΑ.etal.,DegeneratebindingoftyrosinasepeptidestoMHCIIAd/Edmolecules(酪氨酸酶肽與MHCIIAd/Ed分子的簡併結合).J.Exp.Ther.Oncol.(2007)6:231-9。還參見Joosten，I.等人(1994)描述的基於競爭的結合測定法，DirectbindingofautoimmunediseaserelatedTcellepitopestopurifiedLewisratMHCclassIImolecules(自身免疫疾病相關T細胞表位與純化的Lewis大鼠II類MHC分子的直接結合).Int.Immunol.6:751。還參見US2004/224009。優選地，這類方法可用於測試一種或多種肽是否能夠結合II類MIIC分子。「片段」在本文指包含任何HSP70蛋白的至少6或7、更優選至少8或9、更優選10、11、12、13、14、15、任選地16、17、18或更多連續(鄰近)胺基酸的肽。如已經提到的,這是適當的，特別是因為II類MHC結合肽具有可變長度且多種長度的變體可結合類似的II類MHC分子。在一個實施方案中，片段不超過40、30，優選25、20、19、18、17、16或15胺基酸長。本發明的HSP70片段(和混合物)優選是「有功能的」,即它們由一種或多種肽序列組成或包含一種或多種肽序列，當體內給藥時,這些肽序列有治療和/或預防關節炎和/或一種或多種其它自身免疫疾病和或IBD的能力。因此，最後，如實施例中所描述以及本領域已知的，將關節炎和/或其它自身免疫疾病的體內動物模型應該用於測試功能性。所述肽優選能夠結合個體的I:I類MHC分子(見上文)。儘管不是所有能夠結合11類MHC分子的HSP70衍生肽都能誘導保護性T細胞反應,但是可通過選擇發現存在於II類MHC分子裂隙中的HSP70序列來預選擇潛在有功能的HSP70衍生肽(T細胞表位)，已知大約50%的MIIC結合序列將通過免疫庫(immunerepertoire)而用作T細胞表位。在這種基於II類MHC結合能力的預選擇之後,可通過測試肽誘導T細胞的能力來進一步測試功能性(類似採用體外人T細胞致敏測定法，例如參見第3239頁RH欄"CellularAssay(細胞測定法)，，和第3243頁LIi欄，HaiderT，etal.，IsolationofnovelIILA-DRrestrictedpotentialtumor-associatedantigensfromthemelanomacelllineFM3(從黑素瘤細胞系FM3分離新的HLA-DR限制性的潛在腫瘤相關抗原).,CancerRes.,1997，573238-44)，並且通過在體外致敏測定法中分析它們和/或在動物模型中測試體內功能，其可與同源「自身」肽交叉反應，由此以潛在的保護性肽對測試動物給藥並選擇那些顯著降低或預防(與適合的對照相比)動物中自身免疫疾病的肽。為了測試交叉反應性，即所選擇的肽誘導與同源自身蛋白交叉反應的T細胞的能力，可使用以下方法(還參見實施例)在體外以確定的(例如微生物)HSP70表位激活的T細胞接著可用同源的自身肽(在小鼠模型中小鼠HSP)再次激活，該自身肽或者為重組蛋白或從應激細胞或組織純化,或作為應激的抗原呈遞細胞上升高水平的MHC肽複合物,或者是合成製備的。任何激活跡象(見上文)都可認為是測試(例如微生物)表位與自身蛋白/肽的交叉反應性的指示。最初的測試可基於自身蛋白/肽的序列以合成肽進行，但是最終證實與該蛋白/肽自身(分離形式或細胞上表達的)的交叉反應性優選以(過)表達並呈遞該自身HSP肽的(應激的)抗原呈遞細胞在T細胞激活試驗中獲得，以便排除隱蔽表位(crypticepitope)。一種簡單的確定最適合片段的方式是生成全長細菌HSP蛋白或哺乳動物/人HSP蛋白的重疊肽(例如重疊五聚體、六聚體、七聚體或十聚體；即短的連續胺基酸)並從它們的保護效果方面篩選這些重疊肽。例如,通過在自身免疫疾病如關節炎的嚙齒類模型中給藥,如實施例中所描述的。在一個實施方案中，使用如上所述的覆蓋完整HSP70蛋白的一系列肽，或子系列。例如，分枝桿菌HSP70(SEQIDNO:55)在長度上由625胺基酸組成。可使用其片段或其變體的片段。在另一優選的實施方案中，使用包含SEQID州)55或其變體的至少約6、7、8或更多連續胺基酸的或由其組成的片段。另外,可以使用完整的、優選非人HSP70,例如用於預防或治療潰瘍性結腸炎。在本發明的另一實施方案中，用於本發明的HSP蛋白的片段(或系列)包含衍生自如下蛋白的所有功能片段,所述如下蛋白與SEQIDNO:55或48-54(也稱為SEQIDN055的變體,或48-54)的任一種有至少35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或更高(100%)的胺基酸序列一致性(就蛋白的全長而言)，不考慮蛋白的來源且不考慮其是否天然存在。在這些實施方案中，不要求該蛋白在細菌或哺乳動物(如人)中天然存在，由於在本文中使用了天然產生的HSP蛋白的變體。這類變體當然也可以天然存在於細菌或哺乳動物中。這些變體(及其片段)可以通過本領域已知的方法來產生，例如定向誘變，從頭幵始的化學合成,包含一個或多個核苷酸缺失、置換或添加的核酸序列的重組表達，基因混排技術，等等。例如，上文所述的DNA序列的小修飾可常規地完成，即通過PCR介導的誘變(Hoetal.,1989,Gene77,51—59.,Whiteetal.,1989,TrendsinGenet.5,185—189)。對DNA序列的更深刻的修飾可通過採用可獲得的技術進行的對所需編碼區域的從頭幵始DNA合成來常規完成。細菌HSP70(如SEQIDNO:55中所描述的)的優選片段由以下氨基組成或包含以下胺基酸-SEQIDNO55的胺基酸141-155(其也描述為SEQIDNO3)及其變體；-SEQIDNO55的胺基酸342-356(其也描述為SEQIDNO1)及其變體；-SEQIDNO17-47(哺乳動物HSP70片段)的細菌同源物,或其變體；這些細菌序列的實例在SEQIDNO56-132中給出；-SEQIDNO:55或其變體的任何其它的至少6、7、8、9、10、優選至少11、12、13、14、15、任選地至少16、17、18、20、30、40、50或更多連續胺基酸的片段。最優選的為在HSP70蛋白之間高度保守的片段；「變體」包括具有至少70或至少80%序列同源性的同源物；變體還包括具有SEQIDNO:3或1的序列的肽，其中一個或多個、優選多至五個或更優選一、二或三個胺基酸分別與SEQIDNO56-71或SEQIDNO:8』3-93的對應胺基酸交換。例如小鼠、大鼠、兔、牛、人等來源的哺乳動物同源HSP70蛋白(例如SEQIDNO48-54中為人HSP70蛋白所描述的)的優選片段由以下胺基酸組成或包含以下胺基酸-SEQIDNO:1的哺乳動物同源物，例如SEQIDN0:2(小鼠同源物)；或SEQIDNO48(人同源物hspala)的胺基酸366-380，或SEQIDNO49(人同源物hspall)的胺基酸368-382；SEQIDNO:50(人同源物hspa2)的胺基酸369-383；SEQIDNO51(人同源物hspa5)的胺基酸391-405;SEQIDNO:52(人同源物hspa6)的胺基酸368-382;SEQIDNO:53(人同源物hspa8)的胺基酸366-380;SEQIDNO:54(人同源物hspa9)的胺基酸414-428,或其它哺乳動物HSP70蛋白的同源物或變體,例如與SEQIDNO:1有至少70%胺基酸一致性或更高(如上所定義)的序列。-SEQIDNO3的哺乳動物同源物,例如SEQIDNO4或5(小鼠同源物)；或SEQIDNO:48(人同源物hspala)的胺基酸168-183，或SEQIDNO:49(人同源物hspall)的胺基酸171-185；SEQIDNO:50(人同源物hspa2)的胺基酸170-184；SEQIDNO51(人同源物hspa5)的胺基酸195-209；SEQIDNO:52(人同源物hspa6)的胺基酸171-185；SEQIDNO:53(人同源物hspa8)的胺基酸169-183;SEQIDNO:54(人同源物hspa9)的胺基酸216-230，或其它哺乳動物HSP70蛋白的同源物或變體，例如與SEQIDNO3有至少70%胺基酸一致性或更高(如上所定義)的序列。-SEQIDNO:48-54或其變體(例如來自其它哺乳動物的同源物)的任一種的胺基酸或任何其它的至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、30、40、50或更多連續胺基酸的片段。最優選的為在HSP70蛋白之間高度保守的片段。-SEQIDNO:17-47和56-132,或其變體，例如來自其它哺乳動物物種的其同源物或其它哺乳動物HSP70蛋白「變體」包括具有至少70或至少80%序列同源性的同源物；變體還包括具有SEQIDNO4或5；或2的序列的肽，其中一個或多個、優選多至五個或更優選一、二或三個胺基酸分別與SEQIDNO56-72或SEQIDNO:83-93的對應胺基酸交換。在一個實施方案中，優選僅使用一種蛋白片段，而在另一實施方案中,可以使用不同胺基酸序列的蛋白片段混合物。另外，全部HSP70系列或子系列可以與一種或多種HSP70蛋白的片段混合或組合。或者，可以混合不同HSP70蛋白的片段。例如，來自細菌的HSP70肽可以與一種或多種具體的哺乳動物HSP70衍生肽混合/組合或共給藥。因此，也可以混合細菌和哺乳動物的其功能性片段。同樣地，可以混合相同或不同HSP70蛋白的HSP70衍生肽的混合物。混合物包括包含兩種或更多種蛋白和/或肽的單一組合物，或者共給藥(一起，或一種緊接另一種)的分開組合物(稱為試劑盒)，這樣僅在給藥後兩種或多種蛋白和/或片段在一個個體的體內組合。該混合物或試劑盒也可以包含--系列的HSP70肽,或這種系列的一部分(子系列)。例如，每種長度例如10、12、15、16或更多胺基酸的至少3、4、5或更多種重疊肽(它們合起來可重建HSP70蛋白的至少一部分或甚至全長)可在一種組合物內一起使用，或者共給藥,這樣它們在體內組合。對於該系列僅包含HSP70蛋白的一部分的情形,優選重疊肽構成全長HSP70蛋白的至少10%、20%、25%、優選至少30%、40%或50%。此外，優選地,這些肽優選重疊以僅形成一個或兩個重疊群(contig)。因此，它們可以來自全長蛋白的兩個區域，例如來自包括SEQIDNO:55的胺基酸150和包括SEQIDNO:55的胺基酸350的區域。這些肽優選重疊至少一個胺基酸,更優選重疊至少2、3、4或5胺基酸。在本發明的另一實施方案中,提供了保護性表位或由保護性表位組成或包含保護性表位的蛋白片段，由此哺乳動物如小鼠或人HSP70衍生肽被用於製備治療和/或預防人或動物(如家畜或寵物)中關節炎和/或其它自身免疫疾病的組合物(或藥物)。「人熱休克70蛋白」指智人(Homosapiens)的天然存在的蛋白，例如SEQIDNO48-54中描述的。非人、哺乳動物熱休克70蛋白為人熱休克70蛋白的變體,包括與人蛋白的至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或更高的一致性(參見本文其它地方的定義)。在整個說明書中，為細菌HSP70衍生片段描述的實施方案可同樣應用到哺乳動物、特別是小鼠和人IISP70衍生片段,反之亦然。因此,在一個實施方案中，全長人HSP70蛋白(或其變體或肽系列)也可以用於治療人(或動物)個體，尤其是治療或預防一種或多種選自克羅恩病、肉芽腫性結腸炎、潰瘍性結腸炎、淋巴細胞結腸炎、膠原性結腸炎和乳糜瀉的IBD。在另一實施方案中，全長人HSP70優選不用於人個體中治療或預防IBD潰瘍性結腸炎，由於對此目的非人HSP70蛋白是優選的。在不同的實施方案中，優選全長、非人HSP70(或變體或肽系列)可以被用於治療人或動物個體，例如非人哺乳動物HSP70蛋白(例如小鼠、大鼠、牛、等)。在另一實施方案中，僅使用細菌HSP70衍生肽，即在方法和組合物中不使用哺乳動物肽。在另一實施方案中，僅使用哺乳動物HSP70衍生肽，即在方法和組合物中不使用細菌肽。在另一實施方案中，所述方法和組合物涉及治療或預防一種或多種IBD的用途，其中該IBD為非自身免疫疾病；在一個實施方案中，該IBD不是潰瘍性結腸炎。如所提到的,所用的片段優選「有功能的」,即它們由一種或多種保護性表位組成或包含--種或多種保護性表位並且當給藥至個體時能夠誘導產生交叉反應的T細胞,並且尤其是減弱或預防關節炎或一種或多種與關節炎相關的症狀。因此，為了試驗片段的功能，可以如上所述或如實施例中測量交叉反應T細胞的激活，和/或體內功能可以在自身免疫疾病動物模型中評估，如所描述的,例如在關節炎或另一自身免疫疾病模型中評估。應理解,本發明還考慮了肽類似物或包含肽類似物的蛋白片段,其展示出上述肽的免疫學性能，但是其含有一個或多個化學修飾。這類肽類似物，也稱為肽模擬物，可例如由對應於上述肽的胺基酸殘基的單元組成，其中基本上相同的側基是存在的，但是骨架含有修飾，例如另一諸如CH=CH、C0-0、CO-CH2或CH2-CH2的基團替換醯胺基團(CO-NH)。也可想像其它的修飾，例如通過類似的天然或非天然胺基酸替換胺基酸。在這方面，「類似的」指具有大致相同的大小、電荷和極性；因此脂肪族胺基酸丙氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸和甲硫氨酸可認為是相似的；同樣地，出於本目的,鹼性至中性極性胺基酸如賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸、天冬醯胺和穀氨醯胺是類似的；這同樣適合於酸性至中性極性胺基酸，例如天冬醯胺、天冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、絲氨酸、高絲氨酸和蘇氨酸。上述肽可以就此使用，或者可以連接至增強它們的抗原性或免疫原性的序列。這種序列可以包括類毒素類或免疫球蛋白類的部分。所述肽也可以用作與MHC分子的複合物和/或被納入溶酶體中。所述肽也可以共價連接至作為免疫刺激載體的其它分子或整個細胞。所述肽可以為單體、二聚體或多聚體的形式。本發明還提供了自體T細胞或其它表達來自這類T細胞的T細胞受體或其部分的細胞，採用上述蛋白或肽通過免疫剌激將它們激活。本發明還考慮了抗體，尤其是針對上述肽的單克隆抗體。這些抗體可採用已知方法來產生,例如通過雜交瘤技術。這些抗體可以用作被動疫苗或用作診斷工具。鑑定HSP70表位和肽的方法在另一實施方案中,提供了鑑定適合於治療和/或預防關節炎(特別是類風溼性關節炎和/或銀屑病關節炎和/或幼年型關節炎)和/或其它自身免疫疾病(例如但不限於動脈粥樣硬化、多發性硬化、重症肌無力)或任意這些疾病中的任一種的症狀的方法，包括提供優選來自細菌和/或哺乳動物HSP70蛋白的一種或多種HSP70衍生肽(「試驗」肽)；並且a)任選地確定該HSP70衍生肽是否能夠結合II類MHC分子，即結合II類MHC裂隙,或者可從II類MHC分子洗脫；b)任選地在交叉反應測定法中測試該「試驗」肽誘導與哺乳動物(尤其是人或動物模型或細胞系)的同源自身肽可交叉反應的肽特異T細胞的能力，並選擇顯示交叉反應性的那些肽；以及c)任選地向自身免疫疾病或IBD動物模型給予包含一種或多種「試驗」肽或由其組成的組合物以確定體內保護活性，並且比較治療和對照動物之間的發病和/或症狀，由此確認所述一種或多種肽適合於治療和/或預防自身免疫疾病或IBD(和/或其症狀)，以及d)採用所述一種或多種「試驗」肽來製備用於治療和/或預防人或動物自身免疫疾病或IBD的藥物，以及在治療和/或預防個體(特別是人或動物個體,例如家畜或寵物)自身免疫疾病的方法中使用所述一種或多種「試驗」肽。在步驟(a)中，可以使用細菌或哺乳動物IISP70蛋白(包括人IISP70蛋白)的任何片段。可獲得很多HSP70胺基酸序列，並且可採用標準肽合成方法合成由片段組成或包含片段的肽。優選地,將例如不同細菌和/或哺乳動物來源的HSP70蛋白進行比對,並選擇保守胺基酸。所述肽在下文中稱為「試驗」肽。在步驟(b)中，優選確定「試驗」肽是否可結合人II類MIIC分子。結合能力可採用各種方法分析，例如採用II類MHC-肽結合測定法。步驟(a)和(b)也可互換，這樣最初的測試肽例如通過文獻分析鑑定為結合II類MHC分子,然後合成試驗肽來進一步用於步驟(c)、(d)和(e)。由於步驟(b)是任選的，其也可被刪除。任選的步驟(C)涉及分析試驗肽是否能夠激活與同源自身肽或包含同源自身胺基酸的蛋白可交叉反應的調節性τ細胞。這可以通過以F方式來完成提供同源自身肽或蛋白(例如，通過比對步驟(a)的「試驗」肽和生物體或細胞系的天然HSP70蛋白)，然後狽ij試「自身，，肽或蛋白向經「試驗」肽啟動的T細胞的給藥是否導致T細胞激活反應,例如增殖,呈遞激活標誌物和產生細胞因子。這可例如在體內(動物模型)以及在體外(採用體外T細胞致敏測定法，參見HaiderΤ.etal,IsolationofnovelHLA-DRrestrictedpotentialtumor-associatedantigensfromthemelanomacelllineFM』3(從黑素瘤細胞系FM3分離新的HLA-DR限制性的潛在腫瘤相關抗原).,CancerRes.，1997,57:3238-44)進行。選擇顯示交叉反應的試驗肽來進一步使用，而摒棄不顯示交叉反應的肽。在步驟(d)中，與適當的對照一起，使用自身免疫疾病(例如關節炎模型)或IBD(例如TNBS誘導的結腸炎)的動物模型來確定一或多量的肽在一個或多個時間點(疾病誘導之前或疾病誘導之後)的給藥是否對疾病嚴重性或發病有影響。這類各種自身免疫疾病的動物模型在本領域是可獲得的，參見例如，實施例中描述的蛋白聚糖誘導的關節炎模型。其它關節炎模型例如包括II型膠原誘導的關節炎、蛋白聚糖誘導的關節炎、姥鮫烷誘導的關節炎和鏈球菌細胞壁誘導的關節炎(參見PIiWooley,Animalmodelsofrheumatoidarthritis(類風溼性關節炎的動物模型)，Curr.Opin.Rheumatol.1991Nr.3(3):407_20.)。其它IBD模型包括例如化學誘導、免疫學、遺傳學禾口自發模型(參見PizarroΤ.Τ.,etal.,MousemodelsforthestudyofCrohn'sdisease(用於克羅恩病研究的小鼠模型).TrendsMol.Med.20039(5)-.218-22.綜述)。動物模型也可用於確定有效濃度和最佳給藥方式以及給藥方案。也可能通過採用轉基因齧齒動物如小鼠來試驗一種或多種HSP70衍生肽的功能和/或有效量，該轉基因齧齒動物經人II類MHC基因轉化，參見例如KoehmS.etal.,HLA-DRBlallelescontrolallergicbroncho-pulmonaryaspergillosis—likepulmonaryresponsesinhumanizedtransgenicmice(人源化車專基因小鼠中HL.A-DRBl等位基因控制過敏性支氣管肺麴黴病樣肺反應)，!.AllergyClin.Immunol.2007,June8th印刷之前的電子出片反物；ChenΖ.,etal..，HumanizedtransgenicmiceexpressingHLADR4-DQ3haplotype:reconstitutionofphenotypeandHLA—restrictedT-ce1!responses(表達HLADR4-DQ3單元型的人源化轉基因小鼠重建表型和HLA限制性T細胞反應)，TissueAntigens2006No.68(3):210_9；BrintnellW.etal.，TheinfluenceofMHCclassIImoleculescontainingtherheumatoidarthritissharedepitopeontheimmuneresponsetoaggrecanGlanditspeptides(含有類風溼性關節炎共有表位的II類MHC分子對針對聚集蛋白聚糖Gl及其肽的免疫反應的影響)』Scand.J.Immunol.2007Nr.65(5)444-52；以及MangalamA.etal.，RoleofMHCclassIIexpressingCD4+Tcellsinproteolipidprotein(91-110)-inducedEAEinHLA-DR3transgenicmice(HLA-DR3轉基因小鼠內表達II類MHC的CD4+T細胞在蛋白脂質蛋白(91-110)誘導的EAE中的作用),Eur.J.Immunol.2006Nr.36(12):3356_70。在步驟(e)中，步驟(d)中在治療和/或預防疾病症狀或進展方面顯示出積極效果的那些肽或肽混合物被用於製備用於臨床或動物試驗以及用於商業用途的組合物。該方法也可以用於覆蓋全長HSP70蛋白的一序列肽或子系列，或肽混合物。在以上的方法中，步驟(c)也可以任選地用全長HSP70蛋白進行,這樣在體外致敏測定後接著測量與純化的人hsp70或應激的抗原呈遞細胞或與人hsp70衍生肽的交叉反應。其也可在動物模型中進行。然後針對交叉反應性T細胞反應分析調節活性的誘導(例如細胞因子如IL-10的產生,在共培養測定法中的hsp特異T細胞的抑制活性)。本發日月的紹合#1禾Π用塗本發明的蛋白和/或肽用於製備包含它們的藥物組合物，由此該藥物組合物可用於向哺乳動物(尤其是人和/或動物，特別是家畜和寵物)給藥,來治療和/或預防關節炎，特別是類風溼性關節炎和/或銀屑病關節炎和/或幼年型關節炎,和/或其它自身免疫疾病,例如但不限於動脈粥樣硬化、多發性硬化、重症肌無力，或任意這些疾病中的任何的一種或多種(優選全部)症狀，或者來治療和/或預防IBD(特別是克羅恩病、肉芽腫性結腸炎、潰瘍性結腸炎、淋巴細胞結腸炎、膠原性結腸炎和/或乳糜瀉)，或其一個或多個(優選全部)症狀,或者來治療或預防其它炎性疾病，尤其是特應性皮炎、食物過敏、藥物過敏和哮喘或其--個或多個症狀。所用的蛋白或肽的量可以變化，這取決於該組合物是用於治療還是用於預防，以及取決於劑型和給藥頻率。適合的製劑可在Remington『sPharmaceuticalSciences(Remington藥物禾4學)，MackPublishingCompany,Philadelphia,Pa.，18thed.(1990)或Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(Remington藥物禾鬥學與實踐)，2005，LippincottWilliams&ffilkins,US；21stRevEdedition中找到。在一個實施方案中，本發明的免疫原性肽(或包含它們的組合物)為預防性地給藥(預防)或給予已經患有自身免疫疾病或炎性疾病的個體(治療)。該組合物以足以引起有效免疫反應的量給予個體(例如患者)。足以實現該目的的量定義為「治療有效量」或「免疫有效量」。對此用途有效的量將取決於例如肽組合物、給藥方式、治療的疾病的階段和嚴重性、個體體重和總體健康狀況、以及處方醫師的判斷，但是一般在每個個體約0.1μg至約150μg每千克(kg)體重、或約1μg至約200μg每kg體重的範圍，更通常是每劑約1μg至約50μg每kg體重。劑量的給予可以每周一次,或兩天或每天--次,或甚至每天幾次。可以在短期(例如數周至數月)或更長時間段(數月至數年)給予劑量單元。組合物可以製備成各種劑量單元，例如包含例如7μg、7.5μg、8μg、9μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、100μg、200μg、1000μg、2500μg、5000μg或更多的每一HSP70衍生肽(以及任選地還有HSP70系列或子系列)的劑量。任選地，藥物組合物為黏膜給藥，最優選口服或鼻內給藥。但是，在另一實施方案中，包括了其它的給藥形式,例如經皮給藥、吸入和胃腸外給藥。由其優選的為口服和鼻內製劑。本發明的蛋白和/或肽可以例如溶解或懸浮在可接受的載體中，優選水性載體。可以使用多種水性載體，例如水、緩衝水、0.4%鹽水、0.3%甘氨酸、透明質酸等。這些組合物可以通過常規的、公知的滅菌技術滅菌，或者可以無菌過濾。所得到的水溶液可以就此包裝使用，或者凍幹,該凍幹製劑在給藥前與無菌溶液組合。如接近生理條件所需，該組合物可以含有藥物可接受的輔助物質，例如緩衝劑、張力調節劑、潤溼劑等，例如醋酸鈉、乳酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、去水山梨糖醇月桂酸酯和油酸三乙醇胺。對於固體組合物,可以使用常規的無毒固體載體,包括例如藥物級的甘露醇、？L糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。對於口服給藥，通過將任何常用的賦形劑如之前列出的那些載體以及約0.1%至5%或10%、更優選0.1-2%的(優選每種)活性成分併入而形成藥學上可接受的無毒組合物。如上所述,組合物旨在誘導對肽的免疫反應。因此,適合於最大化免疫反應的組合物和給藥方法是優選的。例如,肽可以被弓I入宿主，包括人，其連接至載體或作為活性肽單元的均聚物或雜聚物。或者，可使用肽的「雞尾酒(cocktail)」。一種以上肽的混合物具有增加免疫反應的優點。該組合物,特別是口服劑型,還可以包含一種或多種蛋白酶抑制劑。蛋白酶抑制劑分為四類絲氨酸蛋白酶抑制劑(包括胰蛋白酶抑制劑)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、天冬氨酸蛋白酶抑制劑和金屬蛋白酶抑制劑。適合的蛋白酶抑制劑在本領域中是可獲得的(例如從Sigma-Aldrich)。優選的抑制劑為胰蛋白酶抑制劑，例如植物來源的胰蛋白酶抑制劑(大豆胰蛋白酶抑制劑、利馬豆胰蛋白酶抑制劑、穀物胰蛋白酶抑制劑等)或動物來源的胰蛋白酶抑制劑(來自雞或火雞蛋清、來自牛胰腺等的胰蛋白酶抑制劑)。該組合物還可以包含佐劑。很多佐劑在本領域都是公知的。適合的佐劑包括不完全弗氏佐劑、明礬、磷酸鋁、氫氧化鋁、N乙醯基-胞壁醯蘇氨醯異穀氨醯胺(thr-MDP)、N-乙醯基-nor-胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺(CGP11637，稱為nor-MDP)、N-乙醯基胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺醯基-L-丙氨酸-2-(1『,2'-二棕櫚醯-sn-甘油基-3-羥基磷醯基氧基)-乙胺(CGP19835A,稱為MTP-PE)，以及RIBI，其在2%的角鯊烯/吐溫80乳液中含有三種從細菌提取的組分單磷醯脂A、海藻糖二黴菌酸酯和細胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。本發明免疫原性肽在藥物製劑中的濃度可以廣泛變化,即從少於約0.1%(例如，0.01%wt/vol)到約2%或更高重量比，並且將根據所選的特定給藥模式主要通過液體體積、粘度等進行選擇。適合於各種給藥類型的製劑的進一步指導可在Remington『sPharmaceutica!Sciences(Remington藥物禾鬥學)，MacePublishingCompany,Philadelphia,PA,18thed.(1990，上文)中找到。對於藥物遞送的方法的概述，參見Langer,Science2491527-1533(1990)。這些參考文獻都通過引用其整體併入本文。經皮遞送系統包括貼劑、凝膠、膠帶和軟膏，並且可含有賦形劑如增溶劑、滲透增強劑(例如脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和胺基酸)、親水聚合物(例如聚卡波非和聚乙烯吡咯烷以及粘合劑和增粘劑(例如聚異丁烯、基於矽酮的粘合劑、丙烯酸酯和聚丁烯)。經黏膜遞送系統包括貼劑、片劑、栓劑、陰道栓劑、凝膠和軟膏，並且可含有賦形劑，例如增溶劑和增強劑(例如丙二醇、膽汁鹽和胺基酸)，以及其它載體(例如聚乙二醇、脂肪酸酯和衍生物，以及親水聚合物如羥丙甲基纖維素和透明質酸)。可注射遞送系統包括溶液、混懸液、凝膠、微球和聚合物可注射劑，並且可包含賦形劑如溶解性改變劑(例如乙醇、丙二醇和蔗糖)和聚合物(例如聚癸醯基內酯和PLGA's)。可植入系統包括幫狀物和盤狀物，並且可包含賦形劑如PLGA和聚癸醯基內酯。其它的可用於本發明藥物組合物給藥的遞送系統包括鼻內遞送系統如噴霧劑和粉末劑、舌下遞送系統和通過吸入遞送的系統。對於通過吸入給藥,本發明的藥物組合物方便地以氣溶膠噴霧劑包裝的形式從壓縮包或霧化器遞送,其使用適合的推進劑,例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、一氧化碳或其它適合的氣體。對於壓縮的氣溶膠的情況，劑量單元可以通過提供閥遞送計量的量來確定。用在吸入器或吹藥器中的例如明膠膠囊和藥盒可以配製為容納有本發明肽的粉末混合物和適合的粉末基料如乳糖或澱粉。本發明的藥物組合物還可以配製為通過例如美國專利6，358，530中描述的吸入劑給藥。也可以使用其它的疫苗或給藥方法,例如顆粒轟擊(微彈轟擊)，由此編碼表位即本發明的肽和/或蛋白的DNA或RNA被包被在金顆粒上，這些金顆粒被用於轟擊個體組織，參見例如vanDrunenetal.MethodsMolMed.2006；12791~105；Gaffalettil.Eur.J.Cell.Biol.2006,Availableonline22August2006),或脂質體遞送。因此,在一個實施方案中,提供了編碼本發明蛋白和/或肽的DNA或RNA(例如,包含所述DNA或RNA的質粒)，以及包含它們的組合物。在另一方面，本發明涉及產生包含本發明的肽或蛋白的藥物組合物的方法。該方法至少包括將本發明的肽或蛋白與藥物可接受的載體和其它如上文描述的組分如佐劑混合的步驟。還提供了被本發明的一種或多種肽和/或蛋白包被的金顆粒,其用於微彈轟擊應用。還提供了治療或預防關節炎(特別是類風溼性關節炎和/或銀屑病關節炎和/或幼年型關節炎)和/或其它自身免疫疾病如動脈粥樣硬化、多發性硬化、重症肌無力或人個體中任意這些疾病的一種或多種(優選全部)症狀或炎性腸病(IBD)的方法,包括給予有需要的人治療或預防有效量的一種或多種上述肽。在優選的實施方案中，該給藥為定期黏膜給藥，優選口服和/或鼻內給藥。應注意到,本文描述的治療和預防性(保護性)治療不限於完全消除或完全防止疾病，而是在一實施方案中還指,相對於對照組，顯著降低治療個體組中一種或多種關節炎症狀和/或一種或多種其它自身免疫疾病的症狀的嚴重性，如關節炎的實施例所描述的。例如，一種或多種與關節炎和/或其它自身免疫疾病和/或IBD相關的症狀，例如體重減輕(臨床狀態)、結腸縮短和/或組織形態學變化等,在治療組中可以顯著降低。顯著降低應該是統計學上顯著的，技術人員可容易地確定是否如此。例如，與對照組相比，一種或多種症狀降低至少約1%、2%、5%、10%、20%或更多可以是顯著的。關節炎症狀包括例如動物爪子的發紅和腫脹或體重減輕。在人，可以評估普遍接受的疾病活性標準/接受的反應標準，例如HealthTechnologyAssessment2002,Vol.6，No.21,p83中描述的關節炎反應標準,其包括例如「疼痛關節數」、「腫脹關節數」、「疼痛的患者評估」以及其它用於評估疾病症狀和嚴重性的標準。對於其它自身免疫疾病，類似的用於評估症狀和疾病嚴重性的標準在本領域是已知的。應注意到,本文描述的治療和預防性(保護性)治療不限於完全消除或完全防止疾病，而是在一實施方案中還指,相對於對照組，顯著降低治療個體組中一種或多種IBD症狀的嚴重性，如實施例中所描述的。例如，一種或多種與IBD相關的症狀，例如體重減輕(臨床狀態)、結腸縮短和/或組織形態學變化等，在治療組中可以顯著降低。顯著降低應該是統計學上顯著的,技術人員可容易地確定是否如此。例如，與對照組相比，一種或多種症狀降低至少約1%、2%、5%、10%、20%或更多可以是顯著的。以下的表1顯示了II類MHC結合/洗脫的哺乳動物HSP70衍生肽的文獻研究結果。這些肽可用於治療或預防人或其它動物的關節炎或IBD。根據本發明使用的肽優選與表的序列具有至少70%的胺基酸--致性。另外,可有利地使用來自其它物種、尤其是細菌物種的同源肽。表1:從II類MHC分子洗脫的衍生自哺乳動物IISP70家族成員的肽tableseeoriginaldocumentpage25tableseeoriginaldocumentpage26tableseeoriginaldocumentpage27tableseeoriginaldocumentpage28tableseeoriginaldocumentpage29tableseeoriginaldocumentpage30tableseeoriginaldocumentpage31tableseeoriginaldocumentpage32tableseeoriginaldocumentpage33tableseeoriginaldocumentpage34$HSP70蛋白的來源物種:m=小鼠；h=人；r=大鼠用於選擇本發明肽的適合HSP70序列列在表2中。這些序列基於表1中具有中或高度保守性的肽。指出了來源物種「mamm」指哺乳動物，包括人，「酵母」指釀酒酵母(SSA3和SSB2蛋白)，「Mycob」指分枝桿菌屬，包括結核分枝桿菌(在對應的區域內麻風分枝桿菌(leprae)和淺黃分枝桿菌(gilvum)是相同的)。來自其它物種和其它HSP70蛋白的對應序列可通過與這些其它物種或蛋白的可獲得序列進行比較來容易地鑑定。優選的肽具有至少12、更優選至少13、最優選至少14或甚至15胺基酸、多至至多19、更優選至多18、最優選至多17或甚至16個的來自表2的序列的胺基酸。除了表2的特定序列，本發明還包括這樣的肽，其中1、2、3或多至4胺基酸被高度保守的胺基酸替換,或被來自相同組56-72、73-82,83-94,95-105,106-119或120-132的肽的對應胺基酸替換。例如，也包括這樣的基於SEQIDNO:72的肽，其中第二亮氨酸被甲硫氨酸(SEQ57)、丙氨酸(來自SEQ62)、穀氨酸(來自SEQ66、69或71)、或賴氨酸(來自SEQ80)替換,或者第三亮氨酸被異亮氨酸(來自例如SEQ56)替換。高度保守的氨基組為例如V、L、I和M；R和K；D和E；K和Q；D和K；E禾口Q;S禾ΠT；G和A；F、W和Y；等等。最優選的肽為表2的序列喪失最先的兩個胺基酸和/或最後的兩個或三個胺基酸的那些。特別優選的為分枝桿菌肽，其具有至多三個、更優選兩個或一個如上所述高度保守的置換或替換，或者具有相同(部分的)序列。在基於Cl的分枝桿菌肽中，優選至少位置145(V-1.45)的V和L-153之一是保留的；類似地,對於Bl，至少V-344、G-354和V-355之一是保留的；以及對於B2,至少E_31、T_35和V-39(或I或T)是保留的。表2:基於從II類MHC分子洗脫的HSP70家族成員的保守肽。tableseeoriginaldocumentpage36tableseeoriginaldocumentpage37tableseeoriginaldocumentpage38DIDANGIVHVTAKDKGTGKE1321451-470(C4)jMycob._序列SEQIDNO1分枝桿菌HSP70肽「Bi」SEQIDNO2小鼠HSP70同源肽「mBl，，SEQIDNO3分枝桿菌HSP70肽「Cl」SEQIDNO4和5小鼠HSP70同源肽「mCla，，和"mClb」SEQIDNO6_16:用在實施例中的分枝桿菌HSP70肽SEQIDNO17-47:11類MHC呈遞的哺乳動物HSP70肽的列表SEQIDKO48-54人HSP70蛋白SEQIDNO55分枝桿菌HSP70蛋白SEQIDNO56-132保守HSP70區域的優選序列JMMai-實施例1的T細胞增殖(HSP70表位作圖)Ml-實施例1的細胞因子生成(HSP70表位作圖)圖3-a)和b)鼠DSS結腸炎實驗時間表圖4至圖7-全長分枝桿菌IISP70蛋白對DSS結腸炎的抑制作用(實施例3)；圖4(結腸長度—口服組)，圖5(重量變化-口服組)，圖6(臨床狀態-口服組)，圖7(組織學等級-口服組)。圖8至圖11-全長分枝桿菌HSP70蛋白對DSS結腸炎的抑制作用(實施例4)；圖8(結腸長度-口服組)，圖9(重量變化-口服組)，圖10(臨床狀態-口服組)，圖11(組織學等級-口服組)。圖12-鼠科動物DSS結腸炎實驗時間表圖13-實施例5的疾病發作圖14-實施例5的最大體重減輕圖15-實施例5的結腸長度數據圖16-實施例5的末端結腸樣品的ILlO釋放圖17-鼠科動物TNBS結腸炎實驗時間表圖18-實施例6中對體重的影響圖19-對引流淋巴結細胞(CLN)ILlO生成的影響(CD3/CD28再刺激)。圖20-A)、B)和C)實驗時間表(3A全長分枝桿菌HSP70的給藥時間表)(3B肽或肽混合物的給藥時間表)(3C肽混合物的給藥時間表)圖21-全長分枝桿菌HSP70蛋白給藥後的關節炎評分ρ<0.05(Marm-WhitneyU檢驗)。圖22-肽Cl和mCla的混合物(稱為「Clmix」)給藥後的關節炎評分肽「Bi」給藥後的關節炎評分M24"抗原特異的T細胞增殖測定結果。處死小鼠後,分離脾細胞並在體外用抗原再剌激72小時，隨後與3H孵育18小時。計算刺激指數(CPM抗原/CPM培養基刺激細胞)，並按每個體內治療組描述。CPM=每分鐘的放射性氚記數。圖25-抗原特異的IFN-γ生成除了抗原特異增殖之外,通過ELISA測量IFNy生成。培養72小時後獲取體外再刺激的脾細胞的上清液。圖26-抗原特異的IL-10生成除了抗原特異增殖之外，通過ELISA測量IL-10生成。培養72小時後獲取體外再刺激的脾細胞的上清液。圖27-肽Cl和mCla的混合物(稱為「Clmix」)給藥後的關節炎評分圖28-實驗時間表S29肽Cl或mCla治療後的關節炎評分；*p<0.05(Marm-WhitneyU檢驗)**p86%胺基酸一致性的高度保守肽,見下文)，並且用這些肽池以2周的間隔期免疫10-12周齡ba:[b/c小鼠兩次(腹膜內和皮下給藥)。在第二次免疫後10天,在體外用所有13種單獨肽再剌激啟動的脾和引流淋巴結細胞，之後我們測量了T細胞增殖(氚摻入)、IFNy、IL10、IL4和IL5產生(細胞因子產生)。我們(在卜三種中)鑑定了三種誘導明顯反應的肽(參見圖1)三種肽誘導了增加的增殖性T細胞反應和IFNγ(肽Al、Bi、Cl),兩種肽誘導了增強的IL-IO生成(肽Al,Cl)。沒有肽誘導了可檢測的IL4或IL5。以相應的小鼠同源肽確定交叉反應性。肽Bl和Cl被發現誘導了針對它們對應的小鼠同源肽的交叉反應性t細胞反應(就增殖和細胞因子生成而言,參見對小鼠同源肽mBl、mCla、mClb的反應)。含有T細胞表位的肽被用於產生肽特異的T細胞系和雜交瘤。這些T細胞系在體外和體內用作Hsp特異調節性T細胞的來源。另外，細胞系和雜交瘤的激活被用於研究抗原呈遞細胞的Hsp加工對Hsp肽特異的T細胞激活的影響。肽Cl和mCla用在TNBS結腸炎研究中。肽池a(不保守的)肽池b(保守的)肽池c(高度保守的)ai=kpfqsviadtgisvsβι=devvavgaalqagvlcι=vlrivneptaaalay(seqidno:6，seqidno:(seqidno:1，seqidno:(seqidno:3，seqidno:55,291-305)55』342-356)55』141-155)A2=YTAPEISARILMKLKB2=EGSRTTPSIVAFARNC2=ILVFDLGGGTFDVSL(seqidno:7，seqidno:(seqidno:10,seqidno:(seqidno:14,seqidno:55，86-100)55，31-45)55，166-180)A3=AEGGSKVPEDTLNKVB3=MQRLREAAEKAKIELC3=RGIPQIEVTFDIDAN(seqidno:8，seqidno:(seqidno:11，seqidno:(seqidno:15，seqidno:55，530-544)55,231-245)55,441-455)A4=AQAASQATGAAHPGGB4=GGKEPNKGVNPDEWC4=QIEVTFDIDANGIVH(seqidno:9,seqidno:(seqidno:12’seqidno:(seqidno:16，seqidno:55，585-599)55，331-345)55，445-459)b5=ldvtplslgietkgg(seqidno:13,seqidno:_55，366-380)_結果顯示在圖1和圖2中，並總結如下表3:總結Hsp70表位作圖tableseeoriginaldocumentpage41分枝桿菌肽Al=分枝桿菌hsp70肽(KPFQSVIADTGISVS)-SEQIDNO6Bl=分枝桿菌hsp70肽(DEWAVGAALQAGVL)-SEQIDNO1Cl=分枝桿菌hsp70(VLRIVNEPTAAALAY)-SEQIDNO3小鼠同源物mBl=小鼠Grp75肽(hspa9a)(DEAVAIGAAIQGGVL)-SEQIDNO2mCla=小鼠Grp75(hspa9a)肽(VLRVINEPTAAALAY)-SEQIDNO4mClb=小鼠hsp70(hspala/hspa8)肽(VLRIΙΝΡΤΑΑΑΙΑΥ)-SEQIDNO5碰以上結果顯示，保守的HSP70肽，例如Bl和Cl以及它們的哺乳動物同源物，誘導T細胞反應，並且細菌肽啟動的T細胞與哺乳動物(小鼠)中的自身IISP70肽/蛋白交叉反應。還通過對應的小鼠同源肽也誘導了細胞因子生成(IFNy和IL-10生成)。實施例2-結腸炎的DSS樽型和TNBS樽型結腸炎的DSSIt型至少部分地涉及上皮細胞屏障功能變化的結腸炎模型為通過物理因子硫酸葡聚糖鈉(DSS)誘導的結腸炎。該模型經常用於研究潛在治療劑的效果，因為其容易通過在飲用水中給予DSS而誘導以及因為DSS誘導具有明確起始的持續水平的結腸炎。這種形式結腸炎中的炎症機制至少幵始時是激活諸如巨噬細胞的非淋巴細胞並釋放促炎細胞因子。上皮屏障功能的變化可在早期(明顯炎症之前幾天)發現，由此可以為巨噬細胞激活創造條件。在DSS結腸炎的急性階段,T細胞反應由極化的Thl反應組成,但是在隨後和炎症的更慢性階段，發生混合的Thl/Th2反應。在後一情況下，DSS引起大量的TNF-α和IL-6的分泌，這是造成疾病中組織破壞的主要原因。所使用的方法改編自VerdiiEFetal,Clin.Exp.Immunol.2000，120:46-50。結腸炎的TNBS樽型可以多種方式實現結腸炎的TNBS模型。用於研究IBD中適應性免疫反應的作用的最佳和最有代表性的變體之一為這裡所使用的，其為皮膚致敏，接著以TNBS結腸內灌注的方法(TeVeldeAA.etal.,Inflamm.BowelDis.2006,12:995-999。我們的方法為對AritaM等人描述的方法(ProcNatl.Acad.Sci.USA.2005，102:7671_6)的修改。實施例3-全長分枝桿菌HSP70蛋白給藥對BALB/c小鼠DSS^ΜΜΜΜΜ(Prague研究-第一部分)這是一個實驗的第一部分。由於動物數量限制,該實驗分為兩個部分。每一部分中每組五隻小鼠。旌15隻常規的雌性Balb/c雌性小鼠(7至9周齡)隨機分為4組(每組5隻)。為了評估口服治療的效果,將抗原(全長分枝桿菌HSP70蛋白)與溶解在50μ10.15Μ碳酸氫鈉中的Img大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTLSigma)—起給藥，以一周的間隔期填餵4次。一周後，小鼠在它們的飲用水中接受3%硫酸葡聚糖鈉(DSS),持續多達7天。在35天時,通過臨床活動性評分、結腸長度和組織學評分評估結腸炎。關於實驗時間表，參見圖3(時間表Α)。組AKPBS+DSS)治療方式100μ1的無菌PBS/SBTI,胃內給藥(對照組)組Bl(HSP60+DSS)治療方式:100μ1無菌PBS/SBTI(11)中HSP6030μg/小鼠，胃內給藥組Cl(HSP70+DSS)治療方式100μ1無菌PBS/SBTI(11)中HSP7030μg/小鼠，胃內給藥MM結果顯示在下表和圖4(結腸長度)、圖5(重量變化)、圖6(臨床狀態)和圖7(組織學級別)中。結腸長度統計學總結tableseeoriginaldocumentpage42多重範圍檢驗tableseeoriginaldocumentpage42tableseeoriginaldocumentpage43*表示統計學顯著差異。(ρ<0，05)重量變化統計學總結tableseeoriginaldocumentpage43多重範圍檢驗tableseeoriginaldocumentpage43*表示統計學顯著差異。(ρ<0，05)臨床狀態:tableseeoriginaldocumentpage43tableseeoriginaldocumentpage44總評分通過每--參數的評分相加後除以3來計算。*Cooperetal.:C1inicopathologicstudyofdextransulfatesodiumexperimentalmurinecolitis(硫酸葡聚糖鈉實驗性鼠結腸炎的臨床病理性研究).LabInvest69:238-249,1993，和Hermannetal.SpecificTypeIVPhosphodiesteraseInhibitorRolipramMitigatesExperimentalColitisinMice(特異的IV型磷酸二酯酶抑制劑Ro1ipram緩解小鼠中實驗性結腸炎)JPET29222-30,2000統計學總結tableseeoriginaldocumentpage44*表示統計學顯著差異。(P<0.05)組織學級別統計學總結tableseeoriginaldocumentpage45多重範圍檢驗tableseeoriginaldocumentpage45*表示統計學顯著差異。(P<0,05)結論以上結果顯示，當預防性地(疾病誘導之前)口服給藥時,全長HSP70蛋白對結腸炎具有抑制作用。實施例4-全長分枝桿菌HSP70對BALB/c小鼠DSS結腸炎的抑制作用(Prague研究_第二部分)這些結果僅涉及實驗的第二部分(第一部分參見實施例3)。這部分每組有5隻小鼠°旌15隻常規的雌性Balb/c雌性小鼠(7至9周齡)隨機分為4組(每組5隻)。為了評估口服治療的效果,將抗原(全長分枝桿菌HSP70蛋白)與溶解在50μ10.15Μ碳酸氫鈉中的Img大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTLSigma)—起給藥，以一周的間隔期填餵4次。一周後,小鼠在它們的飲用水中接受3%硫酸葡聚糖鈉(DSS),持續多達8天。在36天時通過臨床活動性評分、結腸長度和組織學評分評估結腸炎。對於實驗時間表，參見圖3，時間表B。組鉬Α2(PBS+DSS)治療方式100μ1的無菌PBS/SBTI，胃內給藥(對照)組Β2(HSP60+DSS)治療方式100μ1無菌PBS/SBTI(11)中HSP6080μg/小鼠，胃內給藥組Cl(HSP70+DSS)治療方式100μ1無菌PBS/SBTI(11)中HSP7030μg/小鼠，胃內給藥MM結果顯示如下，以及顯示在圖8(結腸長度)、圖9(重量變化)、圖10(臨床狀態)和圖11(組織學級別)中。結腸長度與PBS相比，當口服給藥時HSP70防止了結腸縮短。統計總結tableseeoriginaldocumentpage46多重範圍實驗tableseeoriginaldocumentpage46*表示統計學顯著差異。(ρ<0，05)重量變化統計總結tableseeoriginaldocumentpage46數S均值方差標準差最小值最大值範圍總計15-1.8614.02263.74467-9.93^913.8tableseeoriginaldocumentpage47與PBS相比，分枝桿菌HSP70蛋白的給藥顯著減輕結腸炎的症狀(對於結腸長度、重量減輕和臨床狀態分別為P=O.0057,0.0387和0.0831)。結果類似於在實驗的第一部分期間獲得的結果(見實施例3)。實施例3和4合起來在口服治療的BALB/c小鼠中評估急性硫酸葡聚糖鈉(DSS)誘導的結腸炎。值表示為均值士標準差。tableseeoriginaldocumentpage48a大豆胰蛋白酶抑制劑(Sigma-Aldrich),Img/每劑，溶解在50μ1的0.15摩爾/升碳酸氫鈉緩衝液中(ρΗ8.0)。*與對照組的值有顯著差異(P<0.05)，通過Student’st檢驗計算。**與對照組的值有顯著差異(P<0.01),通過Student’st檢驗計算。實施例5全長分枝桿菌HSP70蛋白對在BALB/c小鼠中誘導DSS結腸炎的抑制作用(Utrecht研究)圖12顯示了研究設計。載體指PBS。治療組A100μ1PBS(對照)組B:100μ1PBS中的30μg分枝桿菌HSP70蛋白[SEQIDNO55]實驗開始時，以7周齡的雌性BALB/c小鼠進行這項研究。小鼠組(η=10)以100μ1PBS中的30μgHSP70(Mthsp70；批號031205；2.1內毒素單位/mg)或載體(100μ1PBS)處理4次(第7、9、11、14天)，通過口腔飼餵給藥。飼餵前10分鐘,動物接受含有2mg大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI)的0.15M碳酸氫鈉，ρΗ8.0。通過在7天內給予補加了3%DSS的飲用水來誘導結腸炎。通過確定體重和糞便粘稠度來跟蹤疾病發作，得到如下表中闡釋的臨床狀態。解剖時記錄結腸長度縱向切割結腸，分為幾個部分來確定-福馬林固定的石蠟切片上的組織學-勻漿液中的MPO活性(指示中性白細胞滲入)-來自末端結腸樣品的離體細胞因子釋放(TNFa,IL10)。通過將每個參數的評分相加後除以3來計算總評分。圖13顯示了疾病進展。以IISP70蛋白預處理導致降低的疾病嚴重性。疾病發作基於按上文描述計算的臨床評分。臨床評分的確定tableseeoriginaldocumentpage49圖14顯示了體重減輕。HSP70處理導致結腸炎誘導造成的體重減輕顯著減小。最大體重減輕在36天時確定。圖15顯示結腸長度。在以HSP70蛋白預處理時結腸長度較少減小。結腸炎症通常導致減小的結腸長度。圖16顯示HSP70處理增加了(白介素10)ILlO的釋放。將遠端結腸樣品孵育24小時，並採用特異ELISA測量上清液中的ILlO含量。健康BALB/c小鼠中從遠端結腸樣品釋放的ILlO為450士328pg/g結腸。結果總結tableseeoriginaldocumentpage49,戶ILlO(pg/g結腸)IP值1均值st.devfeEM(η)與載體比較載體318710081TSP7012742937329640.0445統計學非參數KruskalWallis檢驗，接著是Mann-Whitney事後檢驗(單尾)。實施例6-全長分枝杆茼HSP70蛋白、或分枝杆茼和小鼠HSP70肽同源物在BALB/c小鼠TNBS結腸炎中的抑制作用目的研究HSP70蛋白或肽預處理是否導致減弱的TNBS誘導結腸炎。研究概述在疾病誘導之前，以全長HSP70[SEQIDNO55]或HSP70肽(顯示在SEQIDNO3中的分枝桿菌HSP70衍生肽「Cl」和SEQIDNO:4的小鼠同源肽「mCla」)胃內或鼻內給藥治療雌性BALB/c小鼠(CharlesRiver-Germany)(實驗幵始時10-12周齡)。在4周期間，小鼠接受4X30μgHSP70胃內給藥。通過在口服HSP70給藥前10分鐘給予大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI)來中和胃內容物。鼻內治療以4X30μgHSP70或4X(與33μg肽mCla(=小鼠Grp75(hspa9)肽216-230,VLRVINEPTAAALAY)混合的67μg肽Cl(結核分枝桿菌HSP70肽141-155，VLRIVNEPTAAALAY))在一周內進行。然後，通過以下方式致敏小鼠以含有ImgTNBS的ΙΟΟμΙ50%乙醇塗抹去毛的腹部連續兩天,在6天後以含有ImgTNBSKlOOyl40%乙醇直腸攻毒(challenge)。3天後解剖小鼠，基於結腸長度、重量和形態學確定直腸炎症。另外，還確定直腸和引流的尾部淋巴結(CLN)的細胞因子生成。治療組(η=10)Α.口服PBS，致敏TNBS,攻毒TNBS(對照組)B.口服(全長)HSP70，致敏TNBS，攻毒TNBS(口服組)C.鼻內(全長)HSP70，致敏TNBS，攻毒TNBS(鼻內組)D.鼻內肽，致敏TNBS,攻毒TNBS(肽組，C1和mC1a)實驗設計顯示在圖17中。MM體重的結果顯示在圖18中，ILlO生成顯示在圖19中。_]碰以上結果顯示,全長HSP70蛋白(無論是口服還是鼻內給予)以及HSP70肽的組合(鼻內給予)均對TNBS誘導的結腸炎有預防性地(疾病誘導之前)抑制作用。口服給予全長IISP70的抑制作用與尾部淋巴結內升高的IL-10反應相關。實施例-蛋白聚糖誘導的關節炎模型蛋白聚糖誘導的關節炎模型(PGIA)為類風溼性關節炎的鼠科動物模型，並描述為T細胞依賴的和抗體介導的模型。在該模型中，通過兩次注射位於合成的佐劑二甲基二十八烷基銨(DDA)中的人蛋白聚糖(hPG)而誘導關節炎，參見HanyeczA.etaL，AchievementofasynergisticadjuvanteffectonarthritisinductionbyactivationofinnateimmunityandforcingtheimmuneresponsetowardtheThlphenotype(通過激活先天免疫並迫使免疫反應朝向Thl表型而實現對關節炎誘導的協同佐劑效應).ArthritisRheum.200450(5)1665~760因為是通過合成的佐劑而不是完全弗氏佐劑(CFA)進行免疫來誘導關節炎,所以可排除存在於CFA中的微生物Hsp誘導的幹擾免疫反應的影響。由於人和小鼠(自身)PG之間的交叉反應，出現了慢性和復發的關節炎。發病後，關節炎嚴重性通過臨床評估關節的粗細、發紅和變形來評分,每隻爪1-4分。實施例8-分枝杆茼全長HSP70蛋白對蛋白聚糖誘導的關節炎的抑制作用方案將10隻雌性BalbA^jnIl(從CharlesRiver獲得的退出種鼠(retiredbreeder))隨機分為兩組。為了評估分枝桿菌HSP70(SEQIDNO55)鼻內治療對PGIA的影響，在疾病誘導之前的第-7、-5和-3天時,給予含有30μgHsp70的10μ1PBS。通過兩次i.p.注射含有400μghPG和2mgDDA的200μ1PBS來誘導PGIA0通過如實施例7中所述的臨床評估來評價隨後出現的關節炎的評分。實驗時間表顯示在圖20Α中。組A(PBS)以10μ1PBS鼻內治療(3X)組B(Hsp70)以含有30μgHspTO的10μ1PBS鼻內治療(3X)結果顯示在圖21中。結果證實了之前的研究,顯示全長HSP70可抑制關節炎發病。實施例9-HSP70衍生肽對蛋白聚糖誘導的關節炎的抑制作用(第一實驗)趙將15隻雌性Balb/c小鼠(從CharlesRiver獲得的退出種鼠)隨機分為8組(每組5隻小鼠)。為了評估以Hsp70衍生肽「Bi」(SEQIDNO1)和Cl(SEQIDNO3)與mCla(SEQIDNO4)的混合物(本文稱為「Clmix」)進行的鼻內治療對PGIA的影響，在疾病誘導之前的第-7、-5和-3天時,給予含有100μg肽的10μ1PBS。將卵清蛋白肽323-339(pOva)用作對照肽。通過兩次i.p.注射含有400μghPG和2ragDDA的200μ1PBS來誘導PGIA。通過臨床評估來評價隨後出現的關節炎的評分。實驗時間表顯示在圖20Β中。組A(pOva)以含有100μgpOva的10μ1PBS鼻內治療(3X)組B(Bi)以含有100PgBl的10μ1PBS鼻內治療(3Χ)組C(Cl)以含有100μg的Clraix混合物的10μ1PBS鼻內治療(3X)關節炎評分結果顯示在圖22,圖23中。處死小鼠後，分離出脾細胞，在體外用抗原再刺激72小時，接著與3Η—起孵育18小時。計算刺激指數(CPM抗原/CPM培養基刺激細胞)，並按每一體內治療組描述(參見圖24)。除了抗原特異增殖，IFN-γ和ILlO生成通過ELISA測量。培養72小時後獲取體外再刺激的脾細胞的上清液(參見圖25和圖26)。結果顯示,Clmix和Bl肽的治療都導致疾病嚴重性的降低。肽的鼻內給藥也誘導了針對這些肽的特異和交叉反應性T細胞反應(增殖、IFN-γ和ILlO生成)。實旆例10-HSP70衍牛tt對蛋白fg糖誘導的關節炎的抑制作用(Il二實3合)將12隻雌性Balb/c小鼠(從CharlesRiver獲得的退出種鼠)隨機分為2組(每組6隻小鼠)。為了評估以Hsp70衍生的mCla進行的鼻內治療對PGIA的影響,在疾病誘導之前的第-14、-11、-7和-4天時,給予含有IOOug肽的10μ1PBS。將卵清蛋白肽(pOva)用作對照肽。通過兩次i.p.注射含有400μghPG和2mgDDA的200μ1PBS來誘導PGIA0通過臨床評估來評價隨後出現的關節炎的評分。實驗時間表顯示在圖20C中。組A(pOva)以含有100μgpOva的10μ1PBS鼻內治療(4Χ)組B(mCla)以含有100μgmCla的10μ1PBS鼻內治療(4Χ)結果顯示在圖27。結果顯示，肽mCla的給藥抑制了疾病活性。實施例11-HSP70衍牛fit對蛋白秀導的關節炎(PGIA)的抑制作用將18隻雌性Ba:[b/c小鼠(從CharlesRiver獲得的退出種鼠)隨機分為3組(每組6隻小鼠)。為了評估以Hsp70衍生肽Cl和其小鼠同源物mCla進行的鼻內(i.η.)治療對PGIA的影響，在疾病誘導前的第_7、-5和-3天時，給予含有100μg肽的10μ1PBS(見圖28)。將卵清蛋白肽(pOva)用作對照肽。通過兩次i.p.注射含有300μghPG和2mgDDA的200μ1PBS來誘導PGIA。通過臨床評估來評價隨後出現的關節炎的評分。組A(pOva)以含有100μgpOva的10μ1PBS鼻內治療組B(Cl)以含有100μgCl的10μ1PBS鼻內治療組C(mCla)以含有100μgmCl的10μ1PBS鼻內治療結果顯示在圖29中。結果顯示單獨的肽Cl和mCla的鼻內給藥導致疾病活性的顯著降低。實施例12-人PBMC和SFMC中的肽特異反應。在從健康對照的血液或JIA和M患者的滑液獲得的單核細胞中研究肽特異反應。患者在烏得勒支大學醫學中心的風溼病學和臨床免疫學以及兒科學的門診部(Utrecht,TheNetherlands)就診。RA患者滿足美國風溼病學協會RA標準的診斷標準(參考文獻)。通過肝素化血液或滑液的ficoll(Pharmacia,Uppsala,Sweden)密度梯度離心分離細胞，並在圓底96孔板的補加了2mmol/L穀氨醯胺、100U/ml青黴素和鏈黴素(GibcoBRL，Gaithersburg,MDUSA)以及10%AB陽性熱滅活人血清(SanquinBloodBank,Utrecht,theNetherlands)的RPMI1640中培養，每孔200μ1,含2*IO5細胞。以20μg/ml的肽在37°C,5%CO2和100%相對溼度下刺激培養物96小時，一式三份。為了確定PBMC的肽特異增殖，在最後16小時』向每孔添加1μCl(37kBq)[31!]-胸苷，並測量摻入。數據表示為刺激指數,通過與肽一起培養的細胞的平均CPM除以沒有肽時培養的細胞的平均CPM來計算。SFMC的肽特異反應通過細胞內染色和FACS分析來測量。因此，如同為PBMC所描述的，細胞在肽存在下培養。96小時後，100μ1的培養基以新鮮培養基替換，並加入40IU/mlIL-2。第8天時，離心沉澱細胞,吸取培養基,並添加含有相同供體的新近經射線處理的APC(7.5*105,以3500rad射線處理)的200μ1新培養基。在存在或不存在肽並添加共刺激mAbCD28和CD49(各0.5μg/ml)情況下於37°C培養細胞6小時。在最後4小時，添加Golgistop(BDBiosciences)。洗滌收集的細胞,按以前的描述(參考文獻),以抗CD3-多甲藻葉綠素蛋白複合物(PerCP)、抗CD4-別藻藍蛋白(APC)和抗CD69異硫氰酸螢光素(FITC)對其表面染色並隨後在Cytofix/cytoperm溶液(BDBiosciences)中固定,接著以針對IL-IO、IFNγ或TNFα的藻紅蛋白(PE)偶聯mAb細胞內染色。所有抗體都從BectonDickinson獲得。數據表示為CD3+⑶4'群的陽性細胞百分比。結果人PBMC和SFMC中(m)Cl肽特異反應人體內，HSP特異T細胞反應被報導與惡性疾病形式相關。另外，識別Hsp60的CD4+T細胞出現在發炎的關節內。Hsp特異T細胞向炎症部位的遷移很可能對於它們恰當發揮功能是重要的。在Cl區域，mCla和mClb肽基本上與人肽相同。出於這個原因，研究了人體內的(m)Cl特異T細胞反應。首先，從健康對照分離PBMC,並通過[3H]胸苷摻入來測量肽特異增殖。與A5對照肽相比，以mClb肽刺激顯著增加增殖,證實該肽存在於人HLA上且可被人T細胞識別。其次，為了測試(m)Cl肽是否可在炎性條件下在關節內被局部識另ij，分離了滑液單核細胞(SFMC)並如材料和方法中所述，用肽刺激。第8天時，添加含有肽和新近射線處理的APC的培養基再刺激6小時,接著通過細胞內染色和FACS分析來分析肽誘導的IL_10、IFNy和TNFa生成。與在健康對照中獲得的增殖數據--致,mClb剌激增加了IL-10、IFNy和TNFa的生成以及CD69在⑶3+CD4+群中的表面表達。另外，Cl肽剌激增加了CD69和細胞因子表達。與此相反，如所預料的，對照A5不誘導肽特異反應。總體而言,這證實Cl且特別是mClb肽在健康對照和在發炎關節內都可被人T細胞所識別，由此支持了在人體內使用所述肽的可能性。結果顯示在圖30中。權利要求衍生自熱休克家族70蛋白(HSP70蛋白)的肽，所述肽包含與SEQIDNo.3-5、1-2、10和17-47或其細菌、植物、酵母或動物同源物之一有至少70％序列一致性的胺基酸序列片段，其用於治療和/或預防炎性疾病或自身免疫疾病。2.如權利要求1所述的肽，其中所述肽的胺基酸序列與SEQIDNo.56-132的至少12個連續胺基酸有至少70%的序列一致性。3.如權利要求1或2所述的肽,其中所述序列一致性為至少80%。4.如權利要求1至3中任一項所述的肽，其具有11-30個胺基酸、優選12至少於25個胺基酸、最優選15至少於19個胺基酸的長度。5.如權利要求3所述的肽,其包含SEQIDNo.24-30和56-72中任一種的至少12、優選至少15個連續胺基酸。6.如權利要求1至5中任一項所述的肽，包含SEQIDNo.3-5的胺基酸序列之一、或SEQIDNo.57，59-62，65-69的對應的15胺基酸序列之一、或其中多至3個胺基酸被SEQIDNo.56-71的對應胺基酸所替換的SEQIDNo.3的胺基酸序列，或者由SEQIDNo.3-5的胺基酸序列之--、或SEQIDNo.57,59-62,65-69的對應的15胺基酸序列之一、或其中多至3個胺基酸被SEQIDNo.56-71的對應胺基酸所替換的SEQIDNo.3的胺基酸序列組成。7.如權利要求1至6中任一項所述的肽,其中所述IISP70為細菌IISP70，優選分枝桿菌HSP70。8.包含至少一種前述權利要求中任一項所述的哺乳動物HSP70肽和至少一種權利要求1至7中任一項所述的細菌HSP70肽的組合物。9.如權利要求8所述的組合物，其中所述哺乳動物肽和細菌肽具有至少70%的胺基酸序列一致性。10.如權利要求1至7中任一項所述的肽,或如權利要求8或9所述的組合物,其用於治療和/或預防炎性腸病(IBD)，其中所述IBD選自克羅恩病、肉芽腫性結腸炎、淋巴細胞結腸炎、膠原性結腸炎、潰瘍性結腸炎和乳糜瀉。11.如權利要求1至7中任一項所述的肽,或如權利要求8或9所述的組合物，其用於治療和/'或預防哺乳動物中的自身免疫疾病,其中所述自身免疫疾病選自關節炎、動脈粥樣硬化、多發性硬化和重症肌無力。12.如權利要求11所述的肽或組合物,其中所述自身免疫疾病選自類風溼性關節炎、銀屑病關節炎和幼年型關節炎。13.治療或預防IBD或自身免疫疾病的藥物組合物,包含權利要求1至5中任一項所述的肽或權利要求6或7所述的組合物。14.鑑定適合於治療和/或預防炎性疾病或自身免疫疾病的治療和/或預防的IISP70蛋白的片段的方法,包括以下步驟(a)提供優選來自細菌、植物、酵母和！或哺乳動物HSP70蛋白的一種或多種HSP70衍生肽；以及(b)任選地確定所述IISP70衍生肽是否能夠結合II類MHC分子；(c)任選地在交叉反應測定法中測試所述肽誘導與哺乳動物的同源自身肽交叉反應的肽特異T細胞的能力，並選擇顯示交叉反應性的那些肽；以及(d)向IBD或自身免疫疾病動物模型給予包含一種或多種所述肽或由一種或多種所述肽組成的組合物以確定體內保護性活性，並且比較受治動物和對照動物之間的發病和/或症狀，以及(e)採用在步驟(d)中顯示出體內活性的一種或多種肽來製備治療和/或預防人或馴養動物如家畜或寵物的IBD或自身免疫疾病的藥物。15.全長熱休克家族70蛋白(HSP70蛋白)和/或其片段,其用於治療和！或預防炎性腸病(IBD)，所述HSP70蛋白包含與SEQIDNO:55至少50%的胺基酸序列一致性。16.如權利要求15所述的蛋白，其中所述IBD為潰瘍性結腸炎且其中所述全長IISP70蛋白為非人HSP70蛋白。全文摘要本發明涉及熱休克蛋白的片段在治療和/或預防自身免疫疾病如關節炎或炎性疾病如炎性腸病中的用途。優選使用屬於HSP70家族的細菌和/或哺乳動物的熱休克蛋白。文檔編號A61P37/00GK101801402SQ200880106035公開日2010年8月11日申請日期2008年7月7日優先權日2007年7月6日發明者維拉姆·萬艾登,魯爾登·萬德爾茲申請人:烏得勒支大學控股有限公司