酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖月桂酸酯的方法
2023-04-26 10:27:41 1
專利名稱：酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖月桂酸酯的方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖月桂酸酯的方法。
背景技術：
糖酯是由碳水化合物作為親水基團，脂肪酸作為疏水基團的非離子表面活性劑， 具有無毒、易生物降解、HLB值範圍廣(1-16)及良好的表面活性等優點，並且具有分散潤滑、去汙、起泡、調節粘度、防止老化、防止結晶、抑菌性等作用，因此被廣泛用於食品、醫藥和化妝品等行業，是聯合國糧農組織(FAO)和世界衛生組織(WHO)推薦使用的食品添加劑。目前市售的糖酯產品基本上是化學合成的，產物為複雜的混合物，要得到高純度的產品需進行繁雜的分離工作。脂肪酶是目前糖酯合成中使用最廣泛的酶，但是生產成本高、固定化過程繁雜費時大大局限了其商業化應用。
發明內容
本發明提供了一種酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖月桂酸酯的方法，可顯著降低葡萄糖月桂酸酯生產成本，同時達到較高的酯化反應效率和產率。一種酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖月桂酸酯的方法，包括將葡萄糖和月桂酸溶於有機溶劑中，加入酵母展示脂肪酶，於50 60°C反應10 14小時，分離、純化製得葡萄糖月桂酸酯。優選的，所述的有機溶劑為丙酮。優選的，每升有機溶劑中葡萄糖、月桂酸和酵母展示脂肪酶的加入量分別為20 100g、50 100g、l 2g。所述反應置於水浴搖床中進行，水浴搖床轉速為150 200轉/分鐘。優選的，在分離純化前加入分子篩，繼續攪拌反應10 12h，鎖住水分，促進酯化
反應進一步進行。所述的分離、純化為離心取上清液，旋轉蒸發除去有機溶劑，水洗後溶於正己烷，
重結晶。所述的酵母展示脂肪酶通過如下方法製備將經線性化處理的重組質粒轉入畢赤酵母(Pichia paStoriS)GS115，將所得轉化子接種於BMMY培養基中，誘導培養72 144小時後離心收集菌體，菌體經衝洗、生物印跡和冷凍乾燥製得酵母展示脂肪酶；所述的重組質粒由原始載體pPIC9K和依次插入原始載體PPIC9K中MF α 1信號肽下遊的脂肪酶基因和畢赤酵母GS115的細胞壁α凝集素基因組成。所述的脂肪酶基因可選用Genbank號為AF229435的序列，畢赤酵母(Pichia paStoriS)GS115為商業化產品，可從^witrogen公司購得。它的細胞壁α凝集素基因序列的 Genbank 號為]\C8164。
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載體PPIC9K為商業化產品(如hvitrogen公司)，它存在MF α 1信號肽序列(Genbank號Μ17301)，同時該載體內信號肽序列上遊存在AOXl啟動子(Genbank號 Ζ46233)。重組質粒線性化處理的目的是為了與胞內基因組發生同源重組，提高表達穩定性。優選的，所述生物印跡所用配體為油酸，它可以誘導酶結構改變，提高轉化率。本發明通過將脂肪酶基因和細胞壁α凝集素基因導入畢赤酵母細胞GS115，畢赤酵母細胞誘導培養後，脂肪酶表達並分泌到胞外，同時利用細胞壁α凝集素將該脂肪酶固定在細胞表面。利用該酵母展示脂肪酶對酯化反應進行催化，可有效提高操作穩定性、耐熱性以及重複性，由於酶反應的特異性該酶能大幅度抑制副反應的發生，酯化轉化率在80% 以上。
具體實施例方式實施例1製備酵母展示脂肪酶通過人工合成的方法，合成米根黴(lihizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank 號AF229435)和畢赤酵母GS115的細胞壁α凝集素基因(Genbank號為Μ28164)，同時在脂肪酶基因C端加上連接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS (linker)，連接後得到核苷酸序列 pro-ROL-linker-α -agglutinin,同時在序列兩端添加EcoR I和Not I酶切位點，其中 pro-ROL為脂肪酶基因，α-agglutinin為細胞壁α凝集素基因。以上述人工合成序列為模板，利用下述引物對，進行PCR擴增，上遊引物5，-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3，；下遊引物5，-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3，PCR反應體系為模板DNA為1 μ 1，高保真DNA聚合酶0. 5 μ 1，dNTP (50mM) 0. 4 μ 1， 上下遊引物各0. 5 μ 1，10XPCR緩衝液5 μ 1，加水至50 μ 1。PCR運行條件為94°C 3分鐘，；35個循環(94°C 30秒，60°C 1分鐘，72°C 30秒)， 72 V 10分鐘。用EocR I和Not I同時酶切PCR產物和pPIC9K質粒，並在T4連接酶的作用下過夜連接形成PPIC9K-R0L質粒，通過電泳檢驗並回收質粒。為使目的基因與畢赤酵母GS115 發生His 4單位點置換重組，用Ml I對pPIC9K-R0L質粒進行酶切線性化處理。將酶切線性化處理好的目的基因約15 μ 1加入到事先準備好的畢赤酵母GS115感受態細胞中，轉入電轉杯中，冰浴15min，然後在1500V，400Q，25uF條件下電擊10ms，並加入約Iml預冷的山梨醇。將上述混勻的電轉產物約400μ 1塗於MD平板上，篩選陽性轉化子，然後將陽性轉化子塗於不同濃度的G418平板上，根據陽性轉化子對G418的抗性篩選出Mut表型的多拷貝陽性重組菌株。將多拷貝陽性重組菌株接種在BMGY培養基中發酵培養30h，離心收集細胞；再將細胞置於含有0.5% (體積百分比)甲醇的BMMY培養基中誘導培養144h，離心收集細胞， 用水衝洗後，接種至YGC培養基中30°C培養120h，然後3000g離心分鐘收集菌體，蒸餾水洗滌後再用50mM pH7. 0磷酸緩衝液洗滌，然後與2倍體積油酸混合，-80°C下預凍後再經德國 Christ真空冷凍乾燥機乾燥Mh，用己烷洗滌除去油酸，再進行再真空乾燥去除己烷，即得到經生物印跡處理的酵母展示脂肪酶。
實施例2酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖月桂酸酯實例1取葡萄糖0. 2g、月桂酸0. 5g，加入含有IOmL丙酮的具塞三角瓶，混合、預熱 IOmin,然後加入酵母展示脂肪酶0. Olg，置於水浴搖床開始反應，轉速為200轉/分鐘，反應溫度保持在50°c，反應1 後加入0. 5g分子篩(孔徑小於2nm)，繼續反應1 後，離心沉澱除去酵母展示脂肪酶及分子篩，取上清液進行旋轉蒸發除去有機溶劑，水洗3次後加入正己烷於4°C結晶得葡萄糖月桂酸酯產品，烘乾、粉碎即可。實例2取葡萄糖lg、月桂酸lg，加入含有IOmL丙酮的具塞三角瓶，混合、預熱 IOmin,然後加入酵母展示脂肪酶0. 02g,置於水浴搖床開始反應，轉速為180轉/分鐘，反應溫度保持在，反應1 後加入0. 5g分子篩(孔徑小於2nm)，繼續反應1 後，離心沉澱除去酵母展示脂肪酶及分子篩，取上清液進行旋轉蒸發除去有機溶劑，水洗3次後加入正己烷於4°C結晶得葡萄糖月桂酸酯產品，烘乾、粉碎即可。實施例3採用傳統化學法合成葡萄糖月桂酸酯取葡萄糖0. 2g、月桂酸0. 5g，加入含有IOmL丙酮的具塞三角瓶，混合、預熱lOmin， 置於水浴搖床開始反應，轉速為200轉/分鐘，反應溫度保持在50°C，反應1 後加入0. 5g 分子篩(孔徑小於2nm)，繼續反應1 後，離心沉澱除去分子篩，取上清液進行旋轉蒸發除去有機溶劑，水洗3次後加入正己烷於4°C結晶得葡萄糖月桂酸酯產品，烘乾、粉碎即可。實施例3測定反應轉化率將反應液離心，取上清液，真空旋轉蒸發除去有機溶劑，用甲醇(色譜純)溶解，經 0. 45 μ m濾膜過濾，上樣測定。液相色譜(HPLC)檢測條件色譜柱SunfireTM C18 (5 μ m, 4. 6mm X 150mm)；流動相為V (甲醇)V(水)=95 5 ；流速lmL/min，柱溫，蒸發光檢測器，進樣量2 μ L。平行測定三次，取平均值。酯化轉化率計算公式如下轉化率(％ )=(單酯摩爾數/糖摩爾數)X 100%通過上述方法檢測計算，實施例2中，實例1合成葡萄糖月桂酸酯的轉化率達 80.9%,實例2合成葡萄糖月桂酸酯的轉化率達82. 4%。而實施例3採用傳統化學法合成葡萄糖月桂酸酯的轉化率僅為50%左右。
權利要求
1.一種酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖月桂酸酯的方法，包括將葡萄糖和月桂酸溶於有機溶劑中，加入酵母展示脂肪酶，於50 60°C反應10 14 小時，分離、純化製得葡萄糖月桂酸酯；所述的酵母展示脂肪酶通過如下方法製備將經線性化處理的重組質粒轉入畢赤酵母(Pichia paSt0riS)GS115，將所得轉化子接種於BMMY培養基中，誘導培養72 144小時後離心收集菌體，菌體經衝洗、生物印跡和冷凍乾燥製得酵母展示脂肪酶；所述的重組質粒由原始載體PPIC9K和依次插入原始載體PPIC9K中MF α 1信號肽下遊的脂肪酶基因和畢赤酵母GS115的細胞壁α凝集素基因組成。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，以每升有機溶劑計，葡萄糖、月桂酸和酵母展示脂肪酶的加入量分別為20 100g、50 100g、l 2g。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的有機溶劑為丙酮。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述生物印跡中採用的配體為油酸。
全文摘要
本發明公開了一種酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖月桂酸酯的方法，包括將葡萄糖和月桂酸溶於有機溶劑中，加入酵母展示脂肪酶，於50～60℃反應10～14小時，分離、純化製得葡萄糖月桂酸酯；將經線性化處理的重組質粒轉入畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115，將所得轉化子接種於BMMY培養基中，誘導培養72～144小時後離心收集菌體，菌體經衝洗、生物印跡和冷凍乾燥製得酵母展示脂肪酶；本發明通過將脂肪酶展示在細胞外，利用該酶製劑催化合成葡萄糖月桂酸酯，不僅提高了轉化效率，而且縮短了反應時間，降低了生產成本。
文檔編號C12N15/63GK102212580SQ20111011078
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月28日 優先權日2011年4月28日
發明者何國慶, 周陳偉, 徐娟, 林吉恆, 王睿之, 迪拉熱木, 阮暉 申請人:浙江大學