用於治療神經退行性疾病的組合物和方法

2023-06-08 17:40:56 2

專利名稱：用於治療神經退行性疾病的組合物和方法
技術領域：
本發明總體上涉及用於基因傳遞的組合物和方法。本發明特別涉及用腺伴隨病毒作為載體的基因傳遞系統傳遞神經膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)來治療由神經退行性疾病引起的預先存在的神經元損傷，如帕金森氏病。
背景技術：
中樞神經系統疾病是主要的公共健康問題。帕金森氏病(PD)僅在美國就影響了一百萬人以上。PD在臨床上表現為自主運動減少、行走困難、姿勢不穩定、僵硬和顫動。PD是一種進行性神經變性疾病，主要影響黑質(SN)中的多巴胺能(DA)神經元。目前，多種中樞神經系統疾病是通過系統給予治療藥物來治療的。但是系統給藥經常是無效的，因為藥物不能通過血腦屏障。即使這些化合物能成功穿過血腦屏障，他們將導致中樞神經系統副作用。因此，許多可能有效的化合物如蛋白質，不能通過系統給藥。
目前可以獲得的治療PD的目標在於替代紋狀體中的多巴胺以恢復運動功能。但是，必須開發阻止或減緩持續進行的退化進程的治療幹涉(Dunnett等，Nature(1999)399A32-39)。神經膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)是目前發現的對多巴胺能(DA)神經元最有效的神經營養因子，並經驗證在體內和體外都可增強多巴胺能(DA)神經元存活(Bjorklund等，Brain Res.(2000)88682-98；Bohn，M.C.，Mol.Ther.(2000)1494-496；Ozawa等，J.Neural Transm.Suppl.(2000)58181-191)。但是，GDNF蛋白給藥到中樞神經系統是成問題的。GDNF僅在很短的時間內保留活性，而且由於GDNF較大，不能穿過血腦屏障，這使直接給藥到腦成為僅有的可行的傳遞方法。這必然要求立體定位注射傳遞GDNF到腦或腦室內(ICV)，該傳遞方式嚴重地限制了它的治療應用。因此，在體內基因直接轉移提供了更有效的傳遞GDNF的方法。
腺伴隨病毒(AAV)曾成功的用於基因治療的基因傳遞。腺伴隨病毒(AAV)基因組是線性的，包含大約4681個核苷的單鏈DNA分子。AAV基因組通常在兩端各有一個反向末端重複區(ITR)，兩端之內為非重複基因組。該ITR的長度大約145bp。該ITR具有多重功能，包括作為DNA複製的起始點，作為病毒基因組的包裝信號。基因組內部非重複部分包括兩個大的可讀框，已知是AAV複製(rep)基因和衣殼(cap)基因。該rep和cap基因編碼可使病毒複製並包裝成病毒體的病毒蛋白。具體地說，由AAV rep區域表達至少4個病毒蛋白，根據它們的表觀分子量命名為Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。AAV cap區域編碼至少3個蛋白，VP1、VP2和VP3。
通過去除AAV基因組內非重複部分(即rep和cap基因)並在ITR中間插入外源基因，將AAV改造成傳遞目的基因。所述外源基因通常功能性連接一個外源啟動子(組成型、細胞特異型、或誘導型)，該啟動子在適合的條件下可在患者的靶細胞中啟動基因表達。還可包括終止信號如多聚腺苷酸化位點。
AAV依賴於輔助病毒，即它需要與一個輔助病毒(例如，腺病毒、皰疹病毒或牛痘)共同感染才能形成AAV病毒體。在沒有輔助病毒共同感染時，AAV是潛伏狀態，病毒基因組插入到宿主細胞染色體中，但是不產生可感染的病毒體。之後通過輔助病毒感染「援助」整合基因組，使它複製並包裝其基因組成為感染AAV病毒體。AAV可感染不同種細胞，而輔助病毒必須是與宿主細胞同種的。例如，人AAV在犬科腺病毒共同感染犬科細胞中可以複製。
在嚙齒類和靈長類PD模型中，研究表明利用AAV、腺病毒(Ad)或慢病毒載體型系統傳遞GDNF基因保護黑質DA神經元，如果在注射神經毒素前或剛剛注射後給藥則還可恢復黑質紋狀體通路(Choi-Lundberg等，Science(1997)275838-841；Mandel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)9414083-14088；Bilang-Bieuel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)948818-8823；Choi-Lundberg等，Exp.Neurol.(1998)154261-275；Mandel等，Exp.Neurol.(1999)160205-214；Kirik等，J.Neurosci.(2000)204686-4700；Bensadoun等，Exp.Neurol.(2000)16415-24；以及Kordower等，Science(2000)290767-773)。然而以前的研究表明當DA神經元損壞後延遲給予GDNF，剩下的DA神經元是少量和大量的恢復功能反應了仍然存活的DA神經元和保持黑質紋狀體的聯繫的數量(Kirik等，J.Neurosci.(2000)204686-4700；Connor等，Gene Therapy(1999)61936-1951；Winkler等，J.Neurosci.(1996)167206-7215；Natsume等，Exp.Neurol.(2001)169231-238)。因此，以前沒有證明在退化進程的晚期長期利用AAV載體系統傳遞GDNF的效力。
PD是特徵為進行性DA退化的疾病，在明顯的症狀出現以前DA神經元數就明顯減少了。因此，臨床上更重要的是弄清楚以延遲的方式傳遞GDNF基因是否能夠挽救在已經存在重度的黑質紋狀體DA退化的動物模型的DA神經元和改善行為。此外，還不清楚載體源性GDNF在黑質中能否由軸突末端向DA神經元細胞體逆向轉運。
發明概述為了治療已經存在的神經元損傷，本領域需要替代方法傳遞GDNF。本發明以下面的發現為基礎AAV載體介導GDNF基因傳遞到重度的黑質紋狀體多巴胺能(DA)去神經的患者，促進黑質(SA)中DA神經元的存活，提高酪氨酸羥化酶(TH)-陽性DA纖維的密度，甚至在退化進程發生以後改善行為和生化缺陷。此外轉基因產生的GDNF在黑質中由紋狀體到DA細胞體逆向轉運，甚至在DA細胞大量喪失之後，保持黑質紋狀體通路的功能聯繫。
因此，在一個實施方案中，本發明涉及治療已經存在的神經元損傷的哺乳動物患者的方法。該方法包括給予患者中樞神經系統重組AAV病毒體，所述重組AAV病毒體包括有效連接包括啟動子的表達控制元件的編碼GDNF多肽的多核苷酸，在體內神經細胞中表達該多核苷酸的條件下提供治療效果。
在某些實施方案中，已經存在的神經元損傷包括中度或重度黑質網狀體多巴胺能(DA)去神經。
在另外的實施方案中，神經細胞在體內轉導，重組AAV病毒體給藥到所述患者的紋狀體內。
在其它實施方案中，利用強力輸送系統(CED)將重組AAV病毒體給藥到紋狀體。
在某些實施方案中患者是人。
在其它實施方案中，本發明涉及治療已經存在的神經元損傷的哺乳動物患者的方法。已經存在的神經元損傷包括中度到重度黑質紋狀體DA去神經，該方法包括將包含重組AAV病毒體的組合物給藥到患者的紋狀體，所述重組AAV病毒體包含有效連接包括啟動子的表達控制元件的編碼GDNF多肽的多核苷酸，在導致體內神經細胞轉導的條件下，通過體內轉導神經細胞來表達多核苷酸以達到治療效果。
此外，所述重組AAV病毒體可以利用CED給藥到所述患者的紋狀體。
在另外的實施方案中，本發明涉及治療已經存在的神經元損傷的哺乳動物患者的方法。已經存在的神經元損傷包括中度到重度黑質紋狀體DA去神經，該方法包括利用CED將包含重組AAV病毒體的組合物給藥到患者的紋狀體，所述重組AAV病毒體包含有效連接包括啟動子的表達控制元件的編碼GDNF多肽的多核苷酸，在導致體內神經細胞轉導的條件下，通過體內神經細胞轉導來表達多核苷酸以達到治療效果。
在任何上述方法中，所述啟動子可以是病毒啟動子，例如，MLP、CMV或RSV LTR啟動子。
如果利用CED，則可以用滲透泵或輸液泵給藥。
在上述任何方法中的多核苷酸還可以包括在5』位置而且符合編碼GDNF多肽的序列的讀框的分泌序列。此外，所述多核苷酸可以編碼人GDNF，例如人pre-pro-GDNF。
本發明還提供了治療哺乳動物患者上述疾病或紊亂的組合物，該組合物包含重組AAV病毒體，所述重組AAV病毒體包含有效連接包括啟動子的表達控制元件的編碼GDNF多肽的多核苷酸，在導致體內神經細胞轉導的條件下達到治療效果。本發明的組合物可以是任選包含藥學上可接受的載體的藥學組合物。
此外，本發明提供1.組合物在治療已經存在的神經元損傷的哺乳動物患者中的應用，將所述組合物給藥到所述患者中樞神經系統，其中所述組合物包含重組腺伴隨病毒(AAV)病毒體，其中所述病毒體包含有效連接包括啟動子的表達控制元件的編碼神經膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)多肽的多核苷酸。
2.第1項的應用，其中所述患者是人。
3.第1項或第2項任一項的應用，其中所述已經存在的神經元損傷包括中度到重度黑質紋狀體多巴胺能(DA)去神經。
4.1-3項任一項的應用，其中所述多核苷酸還包括5』位置分泌序列和可讀框中編碼GDNF多肽的序列。
5.1-4項任一項的應用，其中所述多核苷酸編碼人GDNF。
6.第5項的應用，其中所述多核苷酸編碼人pre-pro-GDNF。
7.1-6項任一項的應用，其中所述組合物給藥到所述患者的紋狀體。
8.上述的任一項的應用，其中所述啟動子是病毒啟動子。
9.第8項的應用，其中所述啟動子是MLP、CMV或RSV LTR啟動子。
10.上述的任一項的應用，其中所述重組AAV病毒體給藥到所述患者的紋狀體。
11.第10項的應用，其中所述重組AAV病毒體通過強力輸送系統(CED)給藥到紋狀體。
12.第11項的應用，其中所述給藥是通過滲透泵進行的。
13.第11項的應用，其中所述給藥是通過輸液泵進行的。
本領域技術人員很容易根據本發明公開內容想到本發明的這些和其它實施方案。
附圖簡述

圖1a和1b為AAV載體示意圖。在圖1a中，LacZ受CMV啟動子的轉錄控制。在圖1b中，小鼠GDNF cDNA在C-末端與FLAG多肽的編碼序列融合併受CMV啟動子的轉錄控制。ITR，反向末端重複區；CMV，巨細胞病毒立即早期啟動子；內含子，人生長素的第一個內含子；多聚A，SV40多腺苷酸化信號序列。
圖2表示用AAV-GDNFflag轉導後從293個細胞中提取出的細胞提取物的蛋白質印記分析。用模擬物(1道)或AAV-LacZ(2道)轉導的293個細胞作為陰性對照。用AAV-GDNFflag轉導(3道)後36個小時，分別用抗-GDNF和抗-FLAG抗體檢測到GDNFflag融合蛋白的表達。
圖3表示用AAV-GDNFflag轉導的培養物中增加的存活的DA神經元。用AAV-GDNFflag、AAV-LacZ或模擬物轉導培養9天後的大鼠E14中腦細胞培養物中計數TH-IR(DA)神經元的數目。培養物中加入rhGDNF(10ng/ml)作為陽性對照。誤差條圖顯示s.em.(*P＜0.01)。
圖4a-4e描述在紋狀體中GDNFflag的表達並逆向轉運到SN。AAV-GDNFflag注入到病變紋狀體4周後，殺死大鼠，為了進行免疫組織化學而處理通過紋狀體和SN的冠狀切片。用抗-FLAG抗體檢測紋狀體中GDNFflag轉基因表達(圖4a和4b)。通過用多克隆抗-TH抗體(4c)和單克隆抗-FLAG抗體(4d)雙免疫螢光染色來確定同側SN中GDNFflag的逆向轉運。4c和4d的覆蓋圖(4e)表明FLAG和TH-陽性神經元共同定位在SN中。在緻密部的廣闊區域檢測雙陽性神經元。該圖表明觀察到TH和FLAG的最明顯的共同定位區域。(a，bar＝100μm；b，bar＝25μm；c-e，bar＝50μm)。
圖5a-5e表明AAV-GDNFflag注射對紋狀體中TH-IR纖維的效果在AAV-LacZ注射動物的損傷側的TH-IR纖維的密度明顯減少(圖5a和5c)。相反，AAV-GDNFflag注射動物證明在處理的紋狀體中TH-IR纖維的密度增加(圖5b和5d)。圖5c和5d分別顯示圖5a和5b的損傷側的箭頭處的高度放大的觀察區域。圖5e表明用圖5b的完整側上的箭頭顯示區域中密集的TH-IR纖維。(圖5a-5b，bar＝1mm；圖5c-5e，bar＝50μm)。
圖6a-6f表明用CTB逆行標記，6-OHDA損傷產生4周後。SN切片用CTB(圖6a和6d)和TH(圖6b和6e)雙重染色。在損傷側(圖6a-6c)和對側(圖6d-6f)兩側的CTB陽性細胞也是TH-IR陽性，代表DA神經元。在損傷側(圖6a-6c)，通過CTB逆行標記TH-陽性神經元表明在損害4周後一些DA神經元保持與紋狀體損傷的聯繫。圖6c是圖6a和6b的覆蓋圖。圖6f是圖6d和6e的覆蓋圖(bar＝50μm)。
圖7a-7f表明在SN中AAV-GDNFflag對TH-和CTB-陽性細胞數目的影響。通過中腦的冠狀切片顯示AAV載體給藥20周後TH-IR(圖7a-7c)和CTB-陽性(圖7d-7f)黑質神經元。在殺死動物前3天向紋狀體兩側注射CTB。分別來自AAV-LacZ注射動物的損傷側(圖7a和7d)和AAV-GDNFflag注射動物的損傷側(圖7b和7e)和完整半球(圖7c和7f)的SN實例。(圖7a-7c，bar＝200μm；圖7d-7f，bar＝100μm)。
圖8表明接受AAV-GDNFflag注射的大鼠損傷SN中TH-陽性和CTE-陽性神經元的百分率與用AAV-LacZ注射的動物比較明顯增加(n＝8)。用陽性細胞的百分率來表示數據(損傷/未損傷半球，*P＜0.01)。
圖9a-9b表明GDNFflag對行為恢復的影響。經脫水嗎啡誘導旋轉和圓筒實驗檢查紋狀體內注射AAV-GDNFflag(n＝20)、AAV-LacZ(n＝16)或載體(n＝8)的大鼠。接受AAV-GDNFflag的大鼠中觀察到脫水嗎啡誘導旋轉明顯減少。相反，用AAV-LacZ注射組或載體注射組的大鼠表現出穩定的旋轉。旋轉以每60分的轉數表示。(圖9a)。通過圓筒實驗評價6-OHDA損害後的自發前肢使用。在AAV處理前，通過對側肢使用頻率的減少說明大鼠明顯地表現為偏向同側(總接觸的23-25％)。20周時AAV-GDNFflag處理的大鼠逐漸地改善達到接近正常(總的47％)。相反，接受AAV-LacZ或載體的大鼠的對側肢使用頻率的減少持續存在。用總數的百分率表示對側(右)前腳接觸(*P＜0.01)。(圖9b)。
圖10a和10b表明AAV-GDNFflag(n＝8)或AAV-LacZ(n＝8)注射20周後6-OHDA-病變中含有的多巴胺(圖10a)和DOPAC和HVA(多巴胺代謝物)(圖10b)。數據表示完整紋狀體的百分率(P＜0.01)。
圖11(SEQ ID NOS1和2)表示人pre-pro-GDNF的核苷酸序列和胺基酸序列。成熟的GDNF分子為胺基酸位置78-211。
圖12(SEQ ID NOS3和4)表示大鼠pre-pro-GDNF的核苷酸序列和胺基酸序列。成熟的GDNF分子為胺基酸位置78-211。
圖13(SEQ ID NOS6和7)表示小鼠pre-pro-GDNF的核苷酸序列和胺基酸序列。成熟的GDNF分子為胺基酸位置107-240。
發明詳述除非另有說明，實施本發明應用本領域技術範圍內病毒學、微生物學、分子生物學和重組DNA技術的常規方法來進行。所述技術在文獻中有充分地解釋。參見，例如Sambrook等Molecular CloningALaboratory Manual(最近版本)；DNA CloningA Practical Approach，第III卷(D.Glover，編輯)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait，編輯，最近版本)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames S.Higgins，編輯，最近版本)；Transcription and Translation(B.Hames S.Higgins，編輯，最近版本)；CRC Handbook of Parvoviruses，第III卷(P.Tijssen，編輯)；Fundamental Virology，第2版，第III卷(B.N.Fields and D.M.Knipe，編輯)；Freshney Culture of Animal Cells，A Manual of BasicTechnique(Wiley-Liss，第3版)；以及Ausubel等(1991)Current Protocolsin Moleular Biology(Wiley Interscience，NY)。
除非本文另有清楚的說明，在本說明書和附件權利要求中所使用的單數形式「一個」「一種」和「其(該，所述)」包括複數含義。
A.定義在本發明的描述中，將使用下列術語，特此簡要說明定義如下本文使用的術語「神經膠質細胞源性神經營養因子多肽」或「GDNF多肽」是指任何來源的神經營養因子，是與任何多種已知GDNF基本同源和功能相當。三種哺乳動物有代表性的GDNF示於圖11、12和13。大鼠(圖12，SEQ ID NO4)和人(圖11，SEQ ID NO2)蛋白質之間的同源度是大約93％，所有哺乳動物GDNF具有相似高度同源性。所述GDNF以單體、二聚體或其他多聚體的生物活性形式存在。因此，本文使用的術語「GDNF多肽」包括活性單體GDNF以及活性多聚體GDNF、活性糖基化和非糖基化形式的GDNF和活性截短形式的分子。
本文使用的「功能相當」是指GDNF多肽保留部分或全部神經營養的特性，但是與天然的GDNF分子的程度不一定相同。
「同源」是指兩個多核苷酸或兩個多肽部分之間相似的百分數。當兩個多核苷酸或兩個多肽序列至少大約50％相似，優選至少75％，更優選至少80-85％，優選至少90％，更優選至少95-99％或在規定的分子長度內更多序列相似或序列相同，則所述序列彼此「基本同源」。本文使用的基本同源還指與特定的多核苷酸或多肽序列完全相同的序列。
「同一性」通常是指兩個多核苷酸或多肽序列分別準確的核苷酸與核苷酸或胺基酸與胺基酸的對應。同一性百分率可通過兩個分子之間序列信息的直接對比來測定，通過排列序列，計算兩列序列之間匹配的準確數，除以最短序列，結果乘以100。
可以應用容易買到的電腦程式幫助分析相似性和同一性，例如ALIGN、Dayhoff，M.O(Atlas of Protein Sequence and Structure，M.O.Dayhoff編輯，5增刊3353-358，國家生物醫學研究基金，華盛頓，其修改Smith和Waterman Advances in Appl.Math.2482-489，1981的用於肽分析的局部同源運算法則)。在Wisconsin序列分析包(WisconsinSequence Analysis Package)第8版本中可以獲得測定核苷酸序列相似性和同一性的程序(由Genetics Computer Group，Madison，WI獲得)，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，這些程序也依賴於Smith和Waterman運算法則。通過製造商推薦和前面提到Wisconsin序列分析包中所述的默認參數容易使用這些程序。例如，特定核苷酸序列與參考序列的相似性百分比可以利用默認打分表和6個核苷酸位點的空位罰分的Smith和Waterman的同源運算法則來測定。
本

發明內容
中另一個建立相似性百分比的方法是利用愛丁堡大學擁有版權，由John F.Collins和Shane S.Sturrok開發，由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)發行的MPSRCH軟體包。這套軟體包在默認參數用於記分表中使用Smith和Waterman運算法則(例如，空位開放罰分為12、空位延長罰分為1、一個空位為6)。由該數據產生「匹配」值反應「序列相似性」。本領域通常已知其他計算序列間同一性或相似性百分比的合適的程序，例如，另一種對比程序是BLAST，使用默認參數。例如，BLASTN和BLASTP可應用下列默認參數來使用遺傳密碼＝標準；過濾器＝無；鏈＝兩條；截止值＝60；預期值＝10；矩陣＝BLOSUM62；種類＝50個序列；按...排序＝HIGH SCORE；資料庫＝非豐餘，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank+CDS翻譯+Swiss蛋白質+Spupdate+PIP。這些程序的詳細內容可在下列網址中找到http//www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
此外，同源性可通過多核苷酸在下列條件下雜交來測定，所述條件是在同源的區域形成穩定的雙鏈，然後用單鏈特異性核酸酶消化，消化片段的大小測定。在例如針對特殊系統定義的的嚴格條件下通過DNA印跡雜交實驗來確定DNA序列是基本同源的。定義的適合雜交條件是本領域的技術。參見，例如，Sambrook等，同上；DNA Cloning，同上；Nucleic Acid Hybridization，同上。
「GDNF變體」是指參照GDNF分子有生物活性的衍生物，或所述衍生物保留想要的活性的片段，例如本文所述實驗中的神經營養活性。一般地說，術語「變體」指具有天然多肽序列和結構、而相對於天然分子一個或多個胺基酸插入、取代(通常是保守的)和/或缺失的化合物，只要所述改變不破壞神經營養活性。優選所述變體具有至少與天然分子相同的神經營養活性。用於製造編碼GDNF變體的多核苷酸的方法是本領域已知的並在下面進一步描述。
對於GDNF缺失變體，通常缺失範圍是大約1-30個殘基，更通常為大約1-10個殘基，典型的是大約1-5個臨近的殘基，或在所述範圍內的任何整數。設想存在N-末端、C-末端和內部缺失。為了保持最大的生物活性，通常將缺失導入到與其它TGF-β超家族成員低同源的區域。通常選擇缺失以保持GDNF蛋白產物在受影響的區域的三級結構，例如，半胱氨酸交聯。缺失變體的非限制性實施例包括缺失GDNF1-40 N-末端胺基酸的截短的GDNF蛋白質產物，或缺失GDNF C-末端殘基的變體或其結合物。
對於GDNF插入變體，胺基酸序列插入通常包括N-和/或C-末端融合，融合範圍從一個殘基到包含一百個或更多殘基的多肽的長度，以及內部加入單個或多個胺基酸殘基。內部插入通常範圍是大約1-10個殘基，更通常為大約1-5個殘基，常常是1-3個胺基酸殘基，或在所述範圍內的任何整數。N-末端插入變體的實例包括異源N-末端信號序列與GDNF N-末端的融合，以及其它神經營養因子序列衍生的胺基酸序列的融合。
GDNF取代變體有至少一個GDNF氫基酸序列的胺基酸殘基除去，由一個不同的殘基插入到它的位置。所述取代變體包括等位基因的變體，其特徵在於在單種種群中自然發生的核苷酸序列的改變，它可能導致或不導致胺基酸改變。特別優選的取代是保守的，即這些取代是在與它們的側鏈相關的胺基酸家族內的取代。具體地說，胺基酸通常分為4種(1)酸性的—天冬氨酸、穀氨酸；(2)鹼性的—賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性的—丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；以及(4)不帶電的極性的—甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時分類為芳香族胺基酸。例如，可以預見的是用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、用穀氨酸取代天冬氨酸、用絲氨酸取代蘇氨酸、或用結構相關的胺基酸取代相似的保守的胺基酸，這些取代不會對生物活性有大的影響。
例如，該GDNF分子可以包括直至大約5-10個保守的或非保守的胺基酸取代，或甚至大約15-25個保守的或非保守的胺基酸取代，或5-25之間任何整數，只要保持想要的分子功能完整。本領域技術人員應用本領域眾所周知的技術可以很容易地測定目的分子允許改變的區域。
GDNF胺基酸序列的特定突變可以包括糖基化位點的修飾(例如，絲氨酸、蘇氨酸、或天冬醯胺)。在任何天冬醯胺-連接的糖基化識別位點或通過插入O-聯糖類修飾的分子的任何位點的胺基酸取代或缺失導致失去糖基化或部分糖基化。天冬醯胺-連接的糖基化識別位點包括適當的細胞糖基化酶特異性識別的三肽序列。這些三肽序列是Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser，其中Xaa可以是除了Pro外的任何胺基酸。在糖基化識別位點的第一或第三個胺基酸位置的一個或兩個位點上的胺基酸取代或缺失的改變(和/或在第二位置上胺基酸缺失)導致在修飾的三肽序列非糖基化。因此適當改變的核苷酸序列的表達產生不在該位點糖基化的變體。或者，GDNF胺基酸序列可以修飾以加上糖基化位點。
識別突變GDNF胺基酸殘基或區域的方法是本領域眾所周知的。一種已知所述方法是「丙氨酸掃描突變」。參見例如，Cunningham和Wells，Science(1989)2441081-1085。在這個方法中，鑑別胺基酸殘基或目標殘基組(例如，帶電的殘基如Arg、Asp、His、Lys以及Glu)並用中性或帶負電胺基酸(最優選丙氨酸和多聚丙氨酸)替代，以影響胺基酸與細胞內外周圍水環境之間的相互作用。通過在取代的位點引入另外的或替代的殘基精確定位對取代敏感的功能的結構域。因此，測定引入胺基酸序列變異的靶位點，在相應的靶密碼子或DNA序列的區域上進行丙氨酸掃描或隨機誘變，篩選表達的GDNF變體以對需要的活性和活性程度進行最優組合。
誘變最關鍵的位點包括在側鏈體積、電荷、和/或疏水性的方面不同物種GDNF蛋白的胺基酸明顯不同的位點。其它的目標位點是那些來自不同物種的在GDNF-樣蛋白的特定殘基上是同樣的位點。所述位置通常對蛋白質的生物活性是重要的。這些位點起初是以相關的保守方式取代的。如果所述取代導致生物活性的改變，那麼引入更大改變(典型取代)，和/或製造其它插入或缺失，並篩選所得產物的活性。
GDNF活性的測定是本領域已知的，包括增強中腦神經元培養物中多巴胺的吸收的能力和增強交感神經節神經元的存活的能力。參見例如，美國專利號6,362,319。
「帕金森氏病樣症狀」包括肌肉顫抖、肌肉無力、僵硬、運動徐緩、姿勢和平衡的改變、痴呆和相似症狀，通常是帕金森氏病或其它神經變性的疾病伴有的。
「載體」是指任何遺傳元件，例如質粒、噬菌體、轉座子、粘粒、染色體、病毒、病毒粒體等，當與適當的控制因子連接時它們能夠複製並能在細胞之間轉運基因序列。因此，該術語包括克隆和表達載體，以及病毒載體。
「AAV載體」是指由腺伴隨病毒血清型衍生的載體，非限制性包括AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7和AAV-8。AAV載體可以具有全部或部分缺失一個或多個AAV野生型基因，優選rep和/或cap基因，但是保留功能性側接ITR序列。功能性ITR序列對AAV病毒體的拯救、複製和包裝是必須的。因此，本文定義的AAV載體包括至少病毒複製和包裝順式需要的那些序列(例如，功能性ITR)。所述ITR不必是野生型核苷酸序列，可以是經改變的，例如，經過核苷酸的插入、缺失或取代，只要該序列提供功能性拯救、複製和包裝。
「AAV輔助功能」是指可以表達提供AAV基因產物的AAV衍生的編碼序列，所述產物再對生產性AAV複製反式起作用。因此，AAV輔助功能包括兩個主要AAV可讀框(ORF)，即rep和cap。所述Rep表達產物經證實具有多種功能，其中包括AAV DNA複製起點的識別、結合和產生切口；DNA解旋酶活性；以及由AAV(或其它異源的)啟動子轉錄的調節。所述Cap表達產物提供必要的包裝功能。本文使用AAV輔助功能來補充AAV載體失去的反式AAV功能。
術語「AAV輔助構建物」通常是指包括提供AAV載體缺失的AAV功能的核苷酸序列的核酸分子，它用於產生轉導載體來傳遞目標核苷酸序列。AAV輔助構建物通常用於提供AAV rep和/或cap基因的瞬時表達來補充失去的細胞裂解性AAV複製必須的AAV功能；但是輔助構建物缺少AAV ITR並且不能自我複製和自我包裝。AAV輔助構建物可以是質粒、噬菌體、轉座子、粘粒、病毒或病毒粒體。描述了許多AAV輔助構建物，例如常用的編碼Rep和Cap表達產物的質粒pAAV/Ad和pIM29+45。參見例如，Samulski等(1989)J.Virol.633822-3828；以及McCarty等(1991)J.Virol.652936-2945。已有許多其它編碼Rep和Cap表達產物的載體的介紹。參見例如，美國專利號5,139,941和6,376,237。
術語「附屬功能」是指非AAV衍生的病毒和/或細胞的功能(AAV依賴其進行複製)。因此，該術語包括在AAV複製中需要的蛋白和RNA包括那些涉及AAV基因轉錄活化、時期專一的AAV mRNA剪接、AAVDNA複製、Cap表達產物的合成和AAV衣殼裝配的部分。基於病毒的附屬功能可由任何已知的輔助病毒如腺病毒、皰疹病毒(除了1型單純皰疹病毒)和牛痘病毒衍生。
術語「附屬功能載體」通常是指包含提供附屬功能的核苷酸的核酸分子。附屬功能載體可以轉染適合的宿主細胞，然後所述載體在宿主細胞中能夠支持AAV病毒體產生。從該術語中特別排除在外的是自然存在的傳染性病毒體，例如腺病毒、皰疹病毒或牛痘病毒體。因此，附屬功能載體可以是質粒、噬菌體、轉座子或粘粒的形式。
特別證明了完全補充的腺病毒基因不需要附屬的輔助功能。具體地說，不能DNA複製和晚期基因合成的腺病毒突變體表明是AAV複製許可的。Ito等，(1970)J.Gen.Virol.9243；Ishibashi等，(1971)Virology45317。同樣地，E2B和E3區域內的突變體顯示出支持AAV複製，說明E2B和E3區域可能不參與提供附屬的功能。Carter等，(1983)Virology126505。但是，E1區域缺陷或缺失E4區域的腺病毒不能支持AAV複製。因此，E1A和E4區域可能是AAV複製直接或間接需要的。Laughlin等，(1982)J.Virol.41868；Janik等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA781925；Carter等，(1983)Virology126505。其它特徵性Ad突變體包括E1B(Laughlin等，(1982)，同上；Janik等，(1981)，同上；Ostrove等，(1980)Virology104502)；E2A(Handa等，(1975)J.Gen.Virol.29239；Strauss等，(1976)J.Virol.17140；Myers等，(1980)J.Virol.35665；Jay等，(1981)Proc.Aatl.Acad.Sci.USA782927；Myers等，(1981)J.Biol.Chem.256567)；E2B(Carter，腺伴隨病毒輔助功能，I CRC Handbook of Parvoviruses(P.Tijssen編輯，1990))；E3(Carter等，(1983)，同上)；以及E4(Carter等，(1983)，同上；Carter(1995))。儘管通過具有E1B編碼區域突變的腺病毒提供的附屬功能的研究產生不一致的結果，但是Samulski等，(1988)J.Virol.62206-210，最近報導E1B55k是AAV病毒體產生所需要的，而E1B19k不是。此外，國際公開WO97/17458和Matshushita等，(1998)GeneTherapy5938-945描述了編碼多種Ad基因的附屬功能載體。
特別優選附屬功能載體包括腺病毒VARNA編碼區域、腺病毒E4 ORF6編碼區域、腺病毒E2A 72 kD編碼區域、腺病毒E1A編碼區域、和缺少完整E1B55k區域的腺病毒E1B編碼區域。在國際公開號WO01/83797中描述了所述載體。
「能夠支持有效的rAAV病毒體產生」是指附屬功能載體或系統在特定的宿主細胞中，能夠提供與腺病毒輔助病毒感染該宿主細胞能獲得的大體相當的或更高水平的rAAV病毒體產生的輔助功能。因此，附屬功能載體或系統支持有效的rAAV病毒體產生的能力可以通過比較應用附加載體或系統獲得的rAAV病毒體滴度與應用傳染性腺病毒感染獲得的滴度來確定。更具體地說，如果相同數量的宿主細胞獲得的病毒體量少於用腺病毒感染的量的不大於200倍，更優選不大於100倍，最優選相等或高於用腺病毒感染獲得的量，則附屬功能載體或系統支持有效的rAAV病毒體產生與用傳染性腺病毒獲得的大致相當或更高。
「重組病毒」是指經過遺傳改變的病毒，例如，通過添加或插入異源核酸構建物到粒子中。
「AAV病毒體」是指完整病毒體，如野生型(wt)AAV病毒體(包括與AAV衣殼蛋白外殼結合的線性單鏈AAV核酸基因組)。在這點上，任何互補單鏈AAV核酸分子，例如有意義鏈或無意義鏈，都可以包裝到任何AAV病毒體中，並且兩條鏈同樣地具有傳染性。
「重組AAV病毒體」或「rAAV病毒體」本文定義為有傳染性的複製缺陷病毒，包括AAV蛋白衣殼，封裝著側接AAV ITR的目的異源核苷酸序列。rAAV病毒體是在具有AAV載體的、AAV輔助功能和引入其中的附屬功能合適的宿主細胞中產生的。如此，所述宿主細胞具有編碼AAV多肽的能力，為了以後的基因傳遞，這就需要將AAV載體(包括目的重組核苷酸序列)包裝到傳染性重組病毒體中。
術語「轉染」是用於指細胞吸收外源DNA，當外源DNA導入到細胞膜內時即轉染了該細胞。許多轉染技術通常是本領域已知的。參見例如，Graham等，(1973)Virology52456，Sambrook等，(1989)Molecular Cloning，a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，Davis等，(1986)Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier，和Chu等，(1981)Gene13197。所述技術可以用於將一個或多個外源DNA部分(如核苷酸整合載體和其它核酸分子)引入到合適的宿主細胞中。
術語「宿主細胞」表示例如微生物、酵母細胞、昆蟲細胞、和哺乳動物細胞，它們能夠或已經用於接受AAV輔助構建物、AAV載體質粒、附屬功能載體、或其它轉運DNA。術語包括轉染的原始細胞的子代。因此，本文使用的「宿主細胞」通常是指用外源DNA序列轉染的細胞。可以理解由於自然、偶然或有目的的突變，單一親代細胞的子代在形態學或遺傳或總DNA互補上與原始的親代不需要完全一致。
本文使用的術語「細胞系」是指在體外能夠繼續或延長生長和分裂的細胞群體。通常，細胞系是由單一的祖代細胞衍生的無性(繁殖)系的群體。本領域深知在所述無性(繁殖)系的群體的保存或轉運中染色體組型可能發生自發的或誘導的改變。因此，細胞系衍生的細胞是指可以不與祖代細胞或培養物準確一致，所述細胞系包括所述變體。
術語「異源的」涉及核酸序列如編碼序列和控制序列，表示通常不連接在一起的序列，和/或通常不是特定的細胞具有的序列。因此，核酸構建物或載體的「異源」區域是在另一個核酸分子中或與另一個核酸分子相連的核酸節段，而在自然中與所述另外的分子無關。例如，核酸構建物的異源區域可以包括編碼序列和非天然的編碼序列側翼序列。異源編碼序列的另一個例子是編碼序列本身是自然中不存在的構建物(例如，具有與天然基因不同的密碼子的合成序列)。同樣地，本發明的目的認為用不是細胞中正常存在的構建物轉化的細胞是異源的。等位基因的變異或自然發生的突變事件不會產生本文使用的異源DNA。
「編碼序列」或「編碼」特定蛋白的序列是，當處於合適的調節序列的控制下在體外或體內轉錄(在DNA的情況)和翻譯(在mRNA的情況)成多肽的核酸序列。編碼序列的邊界是由5』末端(氨基)的起始密碼子和3』末端(羧基)的終止密碼子決定的。編碼序列可以包括，但不限於，來自原核的或真核的mRNA的cDNA、來自原核的或真核的DNA的基因組DNA序列、甚至合成的DNA序列。轉錄終止序列通常是位於編碼序列的3』端。
「核酸」序列是指DNA或RNA序列。該術語包括含任何已知DNA和RNA鹼基類似物的序列，例如，但不限於4-乙醯胞嘧啶、8-羥基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨甲基-2-硫代尿嘧啶、5-羧基甲基-氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2.2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基烏嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基烏嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基-甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖Q核苷、5』-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶以及2，6-二氨基嘌呤。
術語DNA「控制序列」是指啟動子序列、多聚腺苷酸信號、轉錄終止序列、上遊調節區域、複製起點、內部核糖體進入位點(「IRES」)、增強子等的集合，它們共同提供在受體細胞中編碼序列的複製、轉錄和翻譯。不是所有的這些控制序列都需要存在，只要選定的編碼序列在合適的宿主細胞中能夠複製、轉錄並翻譯。
本文使用的術語「啟動子」通常意義是指包括DNA調節序列的核苷酸區域，其中所述調節序列是由能夠結合RNA聚合酶和啟動子下遊(3』-方向)編碼序列的轉錄的基因衍生來的。轉錄啟動子包括「誘導型啟動子」(有效連接啟動子的多核苷酸序列表達是通過分析物、輔因子、調節蛋白等誘導的)和「組成型啟動子」。
「有效連接」是指元件的排列，其中所描述的成分配置成得以執行它們通常的功能。因此，控制序列可操作地連接到編碼序列能影響編碼序列的表達。控制序列不需要與編碼序列鄰近，只要它們能控制編碼序列的表達。因此例如，間插不可翻譯但可轉錄的序列可以存在於啟動子序列和編碼序列之間，仍然可以認為啟動子序列是「有效連接」到編碼序列。
「分離(的)」當就核苷酸序列而言，是指所述分子在基本上沒有其它同型的生物學大分子的情況下存在。因此，「編碼特定的多肽的分離的核酸分子」是指基本沒有其它不編碼所述多肽的核酸分子的核酸分子；但是所述分子可以包括一些對所述組分基本特徵沒有有害影響的其它鹼基或部分。
在整個申請中描述特定核酸分子中核苷酸序列的相應位置時，例如，當特定核苷酸序列描述成位於相對於另一序列的「上遊」、「下遊」、「3』」或「5』」時，可以理解成所述序列在DNA分子的「有義鏈」或「編碼」鏈中的位置，這是本領域通用的。
特定AAV多肽的「功能同系物」或「功能等同物」包括由天然多肽序列衍生的分子，以及以與參考AAV分子相似的方式發揮作用以達到需要結果的重組產生或化學合成的多肽。因此，AAV Rep 68或Rep 78功能同系物包括那些多肽的衍生物和類似物—包含內部或其氨基或羰基末端的單一或多個氫基酸添加、取代和/或缺失，只要保留完整的活性。
特定腺病毒核苷酸區域「功能同系物」或「功能等同物」包括由異源腺病毒血清型衍生的相似的區域、由另一個病毒或細胞來源的核苷酸區域、以及以與參考核苷酸區域相似方式發揮作用以達到預期結果的重組產生或化學合成的多核苷酸。因此，腺病毒VA RNA基因區域或腺病毒E2a基因區域的功能同系物包含所述基因區域的衍生物和類似物—包括在該區域內單一的或多個核苷酸鹼基的添加、取代和/或缺失，只要同系物保留以背景以上可檢測到的水平提供其固有的支持AAV病毒體產生的附屬功能。
「強力輸送系統」是指藥物的任何非手動傳遞。本發明中，AAV的強力輸送系統(CED)的實例可以通過輸液泵或滲透泵來實現。下面有CED的更詳細的描述。
術語「中樞神經系統」或「CNS」包括脊椎動物的大腦和脊髓的所有細胞和組織。因此，該術語包括但不限於神經元細胞、神經膠質細胞、星形膠質細胞、腦脊髓液(CSF)、胞間隙、骨、軟骨等。CNS的各區域與不同行為和/或功能相關。例如，大腦的基底神經節與運動功能，尤其是自主運動有關。基底神經節是由6對神經核組成尾狀核、殼核、蒼白球、伏隔核、丘腦底部的核、以及黑質。儘管被內囊分開，但尾狀核和殼核共有細胞結構學、化學和生理學特性，通常是稱為紋狀體。在帕金森氏患者中退化的黑質提供主要的多巴胺能的輸入基底神經節。
本文可交換的使用術語「對象」、「個體」或「患者」是指脊椎動物，優選哺乳動物。哺乳動物包括，但不限於鼠科動物、猿、人、畜牧動物、運動動物和寵物。
「有效量」是足夠起到有益的或需要作用的劑量。有效量可以一次或多次給藥、應用或劑量。
B.常規方法本發明的基礎是意外發現AAV載體介導的GDNF基因傳遞以延遲方式逆轉多巴胺能(DA)神經元的進行性退化，同時保存功能性黑質紋狀體的通路。如在實施例中特別描述，帕金森氏病的可接受的動物模型接受表達FLAG肽標記的GDNF(AAV-GDNFflag)或β-半乳糖苷酶(AAV-LacZ)的AAV載體注射到病變紋狀體中。FLAG免疫染色證明GDNFflag的逆向轉運到黑質(SN)。在AAV-GDNFflag組中，紋狀體中酪氨酸羥化酶(TH)-陽性DA纖維的密度和SN中的TH-陽性或霍亂毒素B亞單位(CTB，神經元示蹤物)-標記的神經元的數量比AAV-LacZ組明顯的增加。與對照組相比，AAV-GDNFflag組紋狀體中多巴胺水平及其代謝物顯著高於對照組。AAV-GDNFflag注射後觀察到一致的解剖學的和生物化學的改變，顯著的行為恢復。這些數據出乎意料地顯示應用以AAV為基礎的傳遞系統延遲傳遞的GDNF基因即使是在進行性退化開始以後也是有效的。
因此，本發明提供治療神經退行性疾病和其它神經損傷已經發生後的神經疾病的方法。在優選實施方案中，神經損傷是由於帕金森氏病或損害或非正常功能的多巴胺能的神經細胞。
因此，本發明可以用於將編碼GDNF多肽的多核苷酸傳遞給患有任何嚴重神經退行性疾病的患者，包括但不限於，帕金森氏病(PD)、肌萎縮性(脊髓)側索硬化(ALS)、癲癇症、阿爾茨海默氏病等。此外，本發明可以用於將GDNF傳遞給以下疾病患者由於暫時的或永久的血流向部分神經系統的停止引起的神經損傷，如中風；或由於接觸神經毒素引起的神經損傷，如癌症的化療劑紫杉醇、順式鉑氨或長春花新鹼和AIDS化療劑ddI或ddC，以及慢性代謝性疾病引起的神經損傷，如糖尿病或腎功能疾病。
如上解釋，GDNF是可以由神經膠質細胞鑑別出或獲得的蛋白質並具有神經營養的活性。更詳細地說，GDNF是多巴胺能的神經營養蛋白質，其特徵部分在於它能增加黑質多巴胺能神經元的胚胎前體吸收多巴胺，此外它能促進副交感神經和交感神經細胞的存活。
GDNF是大約39kD糖基化蛋白質，天然形式以同型二聚體存在。GDNF最初翻譯成pre-pro-GDNF多肽、蛋白水解處理的信號序列，分子的「前」部分導致產生GDNF的成熟形式。人和嚙齒類動物中，單一基因產生可變剪接的形式。參見例如，美國專利號6,362,319。兩種形式包含一致的信號肽序列和一致的蛋白水解處理序列。蛋白水解裂解產生相同成熟的134胺基酸殘基形式。因此，用於本發明AAV載體的GDNF多核苷酸可以編碼任一或兩種形式，可以編碼完整的pre-pro-分子、pre-分子、pro-分子、成熟的GDNF多肽、或這些形式如上定義的生物學活性變體。
已知許多GDNF多核苷酸和胺基酸序列。三種有代表性的哺乳動物GDNF序列描述於本文的圖11、12和13。人GDNF核苷酸和胺基酸序列特別表示於圖11(SEQ ID NO1和2)。大鼠GDNF核苷酸和胺基酸序列表示於圖12(SEQ ID NO3和4)，小鼠GDNF核苷酸和胺基酸序列表示於圖13(SEQ ID NO6和7)。大鼠和人蛋白質之間的同源度是大約93％，所有哺乳動物GDNF具有相似的高度同源度。本領域已知另外的GDNF核苷酸和胺基酸序列。參見例如，美國專利號6,221,376和6,363,319，和Lin等，Science(1993)2601130-1132(大鼠和人的序列)，以及NCBI登錄號AY052832、AJ001896、AF053748、AF063586和L19063(人序列)；NCBI登錄號AF184922、AF497634、X92495、NM019139(大鼠序列)；NCBI登錄號AF516767(大熊貓序列)；NCBI登錄號XM122804、NM010275、D88351S1、D49921、U36449、U37459、U66195(小鼠序列)；NCBI登錄號AF469665(日本(NipponiaNippon)序列)；NCBI登錄號AF106678(Macaca mulatta序列)；以及NCBI登錄號NM131732和AF329853(斑馬魚(zebrafish)序列)。如上解釋，任何這些序列及其變體(如和這些序列基本同源的和功能相當的序列)可用於本發明方法。
AAV-傳遞GDNF多核苷酸的功效可以用任何本領域已知的多種上述疾病的動物模型測試。例如，帕金森氏病的最廣泛應用的動物模型通常通過給予毒素來複製多巴胺能神經元的神經退行性病變。單側注射6-羥基多巴胺(6-OHDA)到小鼠或大鼠的黑質中導致同側紋狀體和黑質緻密部神經元損失，對側半球很少改變。同樣地，脫氧麻黃鹼誘導的神經毒素導致多巴胺能神經元和5-羥色胺能神經元的神經退行性病變，本領域技術人員認為它與人類疾病緊密相連。治療藥物的功效可以通過應用脫水嗎啡誘導旋轉行為的行為結果來評價。
另一個帕金森氏病模型是用神經毒素N-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)來構建。MPTP給予哺乳動物，如小鼠、大鼠和猴。將MPTP給予猴的結果是不僅損失黑質緻密部和紋狀體中的多巴胺能神經元和5-羥色胺能神經元，還在行為上與人帕金森氏病患者表現相似，如運動不能和姿勢僵硬。參見例如，美國專利號6,362,319。
對比上述帕金森氏病的動物模型，許多近交品系小鼠的獲得證明多巴胺能細胞數量是逐步下降的。例如，D2受體缺陷小鼠可以通過同源重組產生，其行為特徵類似其患有帕金森氏病患者。Fitzgerald等，(1993)Brain Res.608247-258。第二個實施例是振動(weaver)突變小鼠中腦的多巴胺能神經元的數量隨時間逐步下降直到40％。Verina等，(1997)Exp.Brain Res.1135-12；Adelbrecht等，(1996)Mol.Brain Res.43291-300；Mitsumoto等，(1994)Science2651107-1110。
本實施例應用了Sauer和Oertel部分PD模型(Sauer和Oertel，Neuroscience(1994)59401-415)。在這個模型中，層內注射6-OHDA誘導開始於損害後1-2周的DA神經元進行性逆行性變性並持續8-16周。這種正在進行的DA神經元的損耗與PD的病程更相似，並且作為用於治療的研究的動物模型比完全模型更適合，其構建破壞中前腦內側束，因此引起DA神經元的迅速退化。在下面詳細的實驗中，在載體注射前大鼠表現出一致的行為缺陷。脫水嗎啡誘導旋轉的外觀通常是在紋狀體多巴胺量消耗≥90％才表現出來(Hudson等，Brain Res.(1993)626167-174)。但是，對PD患者和動物模型的研究表明可能存在比多巴胺暗示的水平更多的存活的DA神經元(Javoy-Agid等，Neuroscience(1990)38245-253；Fearnley和Lees，Brain(1991)1142283-2301；Schulzer等，Brain(1994)117509-516)。在本文使用的模型中，CTB-陽性神經元在SN損傷側的數量在損傷4周後是對側值的28.9％。這與以前用螢光金(FG)-逆行標記證明的28.8％(損傷35天後)(Kozlowski等，Exp.Neurol.(2000)1661-15)或34％(損傷4周後)(Sauer和Oertel，Neuroscience(1994)59401-415)的損傷的SN中FG-陽性細胞的研究是一致的。此外，大部分CTB-標記的神經元是TH-陽性，表明黑質紋狀體投射的部分在AAV載體注射時保持完整的。儘管不希望受特定理論的限制，還是認為完整的黑質紋狀體投射和DA神經元的殘餘部分可以作為GDNF基因傳遞後再生和功能恢復的基礎。
描述了其它神經退行性疾病的動物模型，其可用於在除了PD外的神經退行性疾病的治療中評價AAV傳遞GDNF多核苷酸的治療功效。例如，Martin等，(1995)Brain Res.683172-178描述了癲癇症的動物模型，Matheson等，(1997)NeuroReport81739-1742和Oppenheim等，(1995)Nature373344-346描述了由物理性損傷導致的神經退行性病變的模型，以及Sagot等，(1996)J.Neurosci.162335-2341描述了運動神經元退化的動物模型。
包含GDNF編碼序列的重組AAV病毒體可以應用以下充分描述的本領域公認的技術產生。野生型AAV和輔助病毒可以用於提供產生rAAV病毒體的必要的複製功能(參見例如，美國專利號5,139,941)。或者，包含輔助功能基因的質粒結合一個眾所周知的輔助病毒感染可用作複製功能來源(參見例如，美國專利號5,622,856和美國專利號5,139,941)。同樣地，包含附屬功能基因的質粒可以結合野生型AAV感染使用，以提供必要的複製功能。當與rAAV病毒體聯合應用時，這三種方法都足以產生rAAV病毒體。本領域眾所周知的其它方法也可以由技術人員用來產生rAAV病毒體。
在本發明的優選實施方案中，三重轉染方法(詳細描述於美國專利號6,001,650)用於產生rAAV病毒體，因為該方法不需要應用傳染性輔助病毒，在沒有任何可檢測的輔助病毒存在下，啟動rAAV病毒體產生。這是通過三種載體用於rAAV病毒體的產生來實現AAV輔助功能載體、附屬功能載體、以及rAAV表達載體。但是本領域的技術人員意識到，這些載體編碼的核酸序列可以以不同結合的兩個或多個載體提供。
如本文解釋，AAV輔助功能載體編碼「AAV輔助功能」序列(即rep和cap)，其反式作用用於生產性AAV複製和包衣殼。優選AAV輔助功能載體支持有效的AAV載體產生，不產生任何可檢測的wtAAV病毒體(即，AAV病毒體包括功能性rep和cap基因)。所述載體的一個實例pHLP19描述於美國專利號6,001,650。AAV輔助功能載體的rep和cap基因可以由任何已知AAV血清型衍生，如上述解釋。例如，AAV輔助功能載體可以具有由AAV-2衍生的rep基因和由AAV-6衍生的cap基因；本領域的技術人員可以意識到可能有其它rep和cap基因組合，限定特徵是有能力支持rAAV病毒體產生。
附屬功能載體編碼核苷酸序列用於AAV賴以複製的非AAV衍生病毒和/或細胞功能(即「附屬功能」)。附屬功能包括AAV複製需要的功能，包括但不限於與AAV基因轉錄活化有關的部分、時期專一的AAV mRNA剪接、AAV DNA複製、cap表達產物的合成、以及AAV衣殼的組裝。以病毒為基礎的附屬功能可由任何眾所周知的輔助病毒如腺病毒、皰疹病毒(除了單純皰疹病毒1型)和牛痘病毒衍生。在優選實施方案中，使用附屬功能質粒pLadeno5(關於pLadeno5詳述於美國專利號6,004,797)。該質粒提供用於AAV載體產生的全套腺病毒附屬功能，但是缺少形成能複製的腺病毒必須的成分。
為了更進一步理解本發明，下面提供了關於重組AAV表達載體、AAV輔助和附屬功能、包含AAV病毒體的組合物、以及病毒體的傳遞的更詳細的討論。
重組AAV表達載體重組AAV(rAAV)表達載體應用已知技術構建，以便至少提供在轉錄方向上有效連接成分、控制元件(包括轉錄起始區域)、目的GDNF多核苷酸以及轉錄終止區域。控制元件選擇在哺乳動物肌肉細胞中有功能的。包含有效連接成分的最終構建物以功能性AAV ITR序列為邊界(5』和3』)。
AAV ITR區域的核苷酸序列是已知的。參見例如，Kotin，R.M(1994)Human Gene Therapy5793-801；K.I.「細小病毒及其複製」Fundamental Virology，第2版，(B.N.Fields和D.M.Knipe編輯)(AAV-2序列)。用於本發明載體的AAV ITR不需要有野生型核苷酸序列，並且是可以改變的，例如，核苷酸的插入、缺失或取代。此外，AAV ITR可由任何多種AAV血清型衍生，包括但不限於AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7和AAV-8等。此外，AAV表達載體側接選擇核苷酸序列的5』和3』ITR的不必一致或由相同的AAV血清型分離株衍生，只要它們功能是想要的，即允許由宿主細胞基因組或載體切除和挽救在目的序列，並且當AAV Rep基因產物存在於細胞中時允許整合DNA分子進入到受體細胞基因組。
用於AAV載體的合適的GDNF多核苷酸分子的大小是小於大約5kb。選定的多核苷酸序列與指導在患者體內轉錄或其表達的控制元件有效連接。所述控制元件可以包括通常與選擇基因連接的控制序列。或者，可以使用異源控制序列。可用的異源控制序列通常包括那些由哺乳動物或病毒基因的編碼序列衍生的。實例包括，但不限於，神經元-特異性烯醇化酶啟動子、GFAP啟動子、SV40早期啟動子、小鼠乳腺瘤病毒LTR啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)；單純皰疹病毒(HSV)啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子如CMV立即早期啟動子區域(CMVIE)、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、合成啟動子、雜合啟動子等。此外，本文也使用由非病毒基因衍生的序列，如鼠科的金屬硫蛋白基因。所述啟動子序列可由例如Stratagene市售獲得(San Diego，CA)。
具有以AAV ITR為邊界的目的GDNF多核苷酸分子的AAV表達載體可以通過直接插入選定的序列到從其切除AAV主要可讀框(ORF)處的AAV基因組中。AAV基因組的其它部分也可以缺失，只要保留足夠部分ITR以允許複製和包裝功能。所述構建物可以應用本領域眾所周知的技術來設計。參見例如，美國專利號5,173,414和5,139,941；國際公開號WO92/01070(1992年1月23日公開)和WO93/03769(1993年3月4日公開)；Lebkowski等，(1988)Molec.Cell.Biol.83988-3996；Vincent等，(1990)Vaccines 90(Cold Spring HarborLaboratory Press)；Carter(1992)Current Opinion in Biotechnology3533-539；Muzyczka(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol15897-129；Kotin(1994)Human Gene Therapy5793-801；Shelling和Smith(1994)Gene Therapy1165-169；以及Zhou等，(1994)J.Exp.Med.1791867-1875。
或者，AAV ITR可以由病毒基因組或由包含它的AAV載體切出獲得，所述AAV載體包含相同的和應用標準連接技術將其與存在於另一個載體的選定核酸構建物的5』和3』端融合，例如那些描述於Sambrook等，同上的技術。例如，可在20mM Tris-Cl pH7.5、10mMMgCl2、10mM DDT、33μg/ml BSA、10mM-50mM NaCl，和40μMATP、0.01-0.02(Weiss)單位T4 DNA連接酶在0℃(用於「粘性末端」連接)或1μM ATP、0.3-0.6(Weiss)單位T4 DNA連接酶在14℃(用於「平端」連接)下完成連接。分子間的「粘性末端」連接通常是在30-100μg/ml總DNA濃度(5-100nM總的終濃度)下進行。包含ITR的AAV載體描述於例如，美國專利號5,139,941。其中特別介紹了幾種AAV載體，其可從美國典型培養物保藏中心(「ATCC」)中可獲得，保藏號為53222、53223、53224、53225和53226。
此外，嵌合基因可以合成產生，包括安排一個或多個選定的核酸序列5』和3』端的AAV ITR序列。可以使用哺乳動物肌肉細胞中用於表達嵌合基因序列的優選密碼子。完全嵌合序列由通過標準方法製備的重疊寡聚核苷酸裝配。參見例如，Edge(1981)Nature292756；Nambair等，(1984)Science2231299；Jay等，(1984)J.Biol.Chem(1984)2596311。
關於本發明的目的，用於從AAV表達載體產生rAAV病毒體的合適的宿主細胞包括微生物、酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞，它們可以是或已經是用作異源DNA分子的受體並能夠在懸浮培養生長。該術語包括已經轉染的原始細胞的子代。因此，本文使用的「宿主細胞」通常是指經外源DNA序列轉染的細胞。穩定的人細胞系的細胞293(通過例如美國典型培養物保藏中心保藏號ATCC CRL1573容易獲得)是本發明的實踐中優選的。詳細地說，人細胞系293是用腺病毒5型DNA片段(Graham等，(1977)J.Gen.Virol.3659)轉化的人胚腎細胞系，並表達腺病毒E1a和E1b基因(Aiello等，(1979)Virology94460)。所述293細胞系是容易轉染的，並提供特別方便的產生rAAV病毒體的平臺。
AAV輔助功能包含上述AAV表達載體的宿主細胞必須有能力提供AAV輔助功能，為了複製和使側接AAV ITR的核苷酸序列包衣殼以產生rAAV病毒體。AAV輔助功能通常是可以表達產生AAV基因產物的AAV-衍生的編碼序列，AAV基因產物再反式作用用於生產性AAV複製。本文使用AAV輔助功能以補充AAV表達載體失去的必要的AAV功能。因此，AAV輔助功能包括一個或兩個AAV主要ORF，稱作rep和cap編碼區域，或其功能性同系物。
「AAV rep編碼區域」是指本領域公認的編碼複製蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40的AAV基因組的區域。這些Rep表達產物擁有多種功能，包括識別、結合併切斷AAV DNA複製的起始點、DNA解旋酶活性和調節AAV(或其它異源的)啟動子轉錄。Rep表達產物共同需要用於複製AAV基因組。AAV rep編碼區域的描述參見例如，Muzyczka，N.(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol.15897-129；和Kotin，R.M.(1994)Human Gene Therapy5793-801。AAV rep編碼區域的合適同系物包括也是已知的介導AAV-2DNA複製的人皰疹病毒6(HHV-6)rep基因(Thomson等，(1994)Virology204304-311)。
「AAV cap編碼區域」是指本領域意公認的編碼衣殼蛋白VP1、VP2和VP3或其功能性同系物的AAV基因組的區域。這些Cap表達產物提供用於包裝病毒基因組共同需要的包裝功能。關於AAV cap編碼區域的描述參見例如，Muzyczka，N.和Kotin，R.M.(同上)。
AAV輔助功能通過用AAV輔助構建物在用AAV表達載體轉染宿主細胞之前或同時導入宿主細胞。因此，AAV輔助構建物提供至少瞬時表達AAV rep和/或cap基因以補充失去的生產性AAV感染必須的AAV功能。AAV輔助構建物缺少AAV ITR並且不能自我複製和包裝。
這些構建物可以是質粒、噬菌體、轉座子、粘粒、病毒或病毒粒體的形式。參見例如，Samulski等，(1989)J.Virol.633822-3828；以及McCarty等，(1991)J.Virol.652936-2945中，描述了許多AAV輔助構建物，例如通常使用的編碼Rep和Cap表達產物的質粒pAAV/Ad和pIM29+45。參見例如，美國專利號5,139,941中描述了編碼Rep和Cap表達產物的許多其它載體。
AAV表達載體和AAV輔助構建物可以構建成包含一個或多個可隨意選擇的標記。合適的標記包括當細胞培養在合適的選擇性培養基中，使用包含可選擇標記的核酸構建物轉染的細胞賦予抗生素抗性或敏感性、賦予顏色或改變其抗原特性的基因。在本發明的實踐中可用的多種可選擇的標記基因包括潮黴素B抗性基因(編碼氨基糖苷磷酸轉移酶(APH))，通過賦予抗G418抗性可以篩選哺乳動物細胞(可由Sigma獲得，St.Louis，Mo.)。本領域的技術人員知道其它合適的標記。
AAV附屬功能宿主細胞(或包裝細胞)必須也是具有提供非AAV-衍生功能或「附屬功能」的能力，生產rAAV病毒體。附屬功能是非AAV-衍生的病毒和/或細胞的功能，依靠該功能AAV可以複製。因此，附屬功能至少包括那些AAV複製需要的非AAV蛋白質和RNA，包括那些涉及AAV基因轉錄的活化、時期專一的AAV mRNA剪接、AAV DNA複製、Cap表達產物的合成和AAV衣殼裝配。以病毒為基礎的附屬功能可以由任何已知的輔助病毒衍生的。
具體地說，附屬功能可以通過本領域技術人員已知的方法導入並繼而在宿主細胞中表達。通常，附屬功能通過用無關的輔助病毒感染宿主細胞來提供。已知許多合適的輔助病毒，包括腺病毒；皰疹病毒如單純皰疹病毒1和2型；和牛痘病毒。本文還使用非病毒附屬功能，例如通過應用任何不同的已知因子使細胞同步提供的那些。參見例如，Buller等，(1981)J. Virol.40241-247；McPherson等，(1985)Virology147217-222；Schlehofer等，(1986)Virology152110-117。
或者，附屬功能可以應用以上定義的附屬功能載體提供。參見例如，美國專利號6,004,797和國際公開號WO01/83797。提供附屬功能的核酸序列可以由天然來源獲得，如由腺病毒體的基因組獲得，或應用本領域已知的重組或合成方法來構建。如上解釋，證明附屬輔助功能不需要完全補充腺病毒基因。具體地說，沒有DNA複製和晚期基因合成能力的腺病毒突變體證明允許AAV複製。Ito等，(1970)J.Gen.Virol.9243；Ishibashi等，(1971)Virology45317。同樣，在E2B和E3區域內的突變證明支持AAV複製，表明E2B和E3區域可能不涉及提供附屬功能。Carter等，(1983)Virology126505。但是，E1區域缺陷或E4區域缺失的腺病毒不能支持AAV複製。因此，E1A和E4區域可能是AAV複製直接或間接需要的。Laughlin等，(1982)J.Virol.41868；Janik等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA781925；Carter等，(1983)Virology126505。其它特徵性Ad突變體包括E1B(Laughlin等，(1982)，同上；Janik等，(1981)，同上；Ostrove等，(1980)Virology104502)；E2A(Handa等，(1975)J.Gen.Virol.29239；Strauss等，(1976)J.Virol.17140；Myers等，(1980)J.Virol.35665；Jay等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA782927；Myers等，(1981)J.Biol.Chem.256567)；E2B(Carter，腺病毒相關病毒輔助功能，I CRC Handbook ofParvoviruses(P.Tijssen編輯，1990))；E3(Carter等，(1983)，同上)；以及E4(Carter等，(1983)，同上；Carter(1995))。儘管通過具有E1B編碼區域突變的腺病毒提供的附屬功能的研究產生不一致的結果，但是Samulski等，(1988)J.Virol.62206-210最近報導E1B55k是AAV病毒體產生所需要的，而E1B19k不是。此外，國際公開WO97/17458和Matshushita等，(1998)Gene Therapy5938-945描述了編碼不同Ad基因的附屬功能載體。
特別優選的附屬功能載體包括腺病毒VARNA編碼區域、腺病毒E4 ORF6編碼區域、腺病毒E2A 72 kD編碼區域、腺病毒E1A編碼區域、缺少完整的E1B55k編碼區域的腺病毒E1B區域。所述載體描述於國際公開號WO01/83797。
作為用輔助病毒感染宿主細胞或用附屬功能載體轉染宿主細胞的結果，附屬功能表達反式激活AAV輔助構建物以產生AAV Rep或Cap蛋白。Rep表達產物從AAV表達載體中除去重組DNA(包括目的DNA)。Rep蛋白還用於複製AAV基因組。表達的Cap蛋白組裝成衣殼，並將重組AAV基因組包裝到所述衣殼中。因此，接著生產性AAV複製，並將DNA包裝成rAAV病毒體。
重組AAV複製後，rAAV病毒體可用多種常規的純化方法從宿主細胞中純化，例如，柱層析、CsCl梯度等。例如，可以使用多個柱純化步驟，如通過陰離子交換柱、親合柱和/或陽離子交換柱純化。參見例如，國際公開號WO02/12455。此外，如果用感染來表達附屬功能，那麼殘餘的輔助病毒可用已知方法滅活。例如，腺病毒可通過加熱到大約60℃如20分鐘或更長時間來滅活。由於AAV是對熱非常穩定的，而輔助腺病毒是熱不穩定的，所以這樣的處理僅對輔助病毒有效的滅活。
所得的包括目的GDNF核苷酸序列的rAAV病毒體之後可以利用下述技術用於基因傳遞。
組合物組合物包括足夠的遺傳物質以生產治療有效量的目的GDNF，即足夠減少或改善所述疾病的症狀的量或足夠獲得想要的益處的量。該組合物也包含藥學上可接受的賦形劑。所述賦形劑包括任何其本身對接受所述組合物的個體不產生有害抗體的藥用物質，並且使用時可以沒有不適當的毒性。藥學上可接受的賦形劑包括，但不限於，山梨糖醇、任何不同TWEEN化合物、液體例如水、鹽水、甘油和乙醇。藥學上可接受的鹽可以包括，例如無機酸鹽如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等；有機酸鹽如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等。此外，輔助物質如潤溼劑或乳化劑、pH緩衝物等，可以存在於所述介質中。藥學上可接受的賦形劑徹底的討論可在REMINGTON』SPHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中獲得。
一個特別有用的製劑包括重組AAV病毒體和一個或多個二羥基的或多羥基的醇，以及任選去汙劑如山梨聚糖酯。參見例如，國際公開號WO00/32233。
根據本說明書的教導，本領域技術人員是顯而易見的是，可以經驗性確定必須加入的病毒載體的有效量。有代表性的劑量在下面詳述。在治療過程中可以一劑性、連續或間斷地給藥。測定最有效的平均值和給藥劑量的方法是本領域技術人員眾所周知的，並隨病毒載體、治療的組合物、靶細胞、以及患者而改變。可以用治療醫師選擇的劑量水平和模式來完成單次或多次給藥。
可以理解通過傳遞重組病毒體表達一個以上轉基因。或者，如本文描述也可以將分別表達一個或多個不同轉基因的載體傳遞到CNS。此外，還企圖通過本發明的方法傳遞所述病毒載體聯合其它合適的組合物和療法。例如，可以通過共同給予表達GDNF到CNS(例如，到紋狀體尾狀核或殼核)中的重組AAV病毒體和其它藥物如AADC、多巴胺前體(例如，左旋多巴)、多巴胺合成抑制劑(例如，卡比多巴)、多巴胺代謝抑制劑(例如，MaOB抑制劑)、多巴胺興奮劑或拮抗劑可以先於或接著或同時與編碼GDNF的重組病毒體給藥來治療帕金森氏病。例如，編碼AADC的基因可以與編碼GDNF的基因一起給藥到CNS。同樣，左旋多巴和任選的卡比多巴可系統給藥。這樣，顯然通過能將左旋多巴轉換成多巴胺的AADC可恢復PD患者中自然失去的多巴胺。轉基因在誘導啟動子的控制下，為了調節所述轉基因的表達可以給予某些系統傳遞的化合物如幕黎甾酮、松甾酮、四環素或aufin。
AAV病毒體的傳遞應用體內或體外(也稱活體外)轉導技術可以將重組AAV病毒體導入CNS細胞以治療已經存在的神經元損傷。如果在體外轉導，想要的受體細胞可以從患者中取出，用rAAV病毒體轉導並再引入到患者。或者，可以使用同系或異種細胞，那些細胞在患者中不會產生不適當的免疫反應。此外，神經祖細胞可以在體外轉導並隨後傳遞到CNS。
描述了合適的轉導細胞傳遞和導入到患者的方法。例如，通過混合重組AAV病毒體與細胞以在合適的介質中轉導，細胞可在體外轉導，包含目的DNA的那些細胞可以應用常規技術如DNA印跡和/或PCR，或應用可檢測的標記來篩選。然後可以將轉導細胞配製到藥用組合物中，如上所述，通過如下所述的多種技術將所述組合物以一個劑量或多劑量導入到患者中。
對於體內傳遞，可將rAAV病毒體配製到藥用組合物中，並且可以直接以規定方式給予一個劑量或多個劑量。治療有效量可包括大約從106到1015的rAAV病毒體，更優選107到1012，甚至更優選大約108到1010的rAAV病毒體(或病毒基因組，也稱「vg」)，或在這些範圍內的任何值。通常，可傳遞0.01-1ml的組合物，優選0.01-約.5ml，優選大約0.05-0.3ml，如0.08、0.09、0.1、0.2等，在這些範圍內的任何整數的組合物都可傳遞。
體外轉導的重組AAV病毒體或細胞可通過應用本領域已知的神經外科學的技術如立體定位注射(參見例如，Stein等，J.Virol 733424-3429，1999；Davidson等，PNAS 973428-3432，2000；Davidson等，Nat.Genet.3219-223，1993；以及Alisky和Davidson，Hum.GeneTher.112315-2329)，用針、導管或相關的裝置注射直接傳遞到CNS或大腦，例如腦室區，以及紋狀體(例如，紋狀體的尾狀核或殼核)，脊髓和神經肌肉連接，或小腦小葉。由於事實上立體定位坐標不能正好對準注射位點，所以小腦注射是複雜的；在小腦小葉的大小以及它們的完全三維方向上存在著動物與動物的變異。因此，霍亂毒素亞單位b(CTb)可以用於確定注射的精確位置，並揭示注射位點可轉導的神經元的集合體。可注射到分子層，浦肯野細胞層，顆粒細胞層和小腦活樹的白質，但是不延伸到深層小腦核。
給藥到CNS的一種模式使用強力輸送系統(CED)。這樣，可將重組病毒體傳遞到大腦大區域的許多細胞。此外，傳遞的載體有效地在CNS細胞(例如，神經元或神經膠質細胞)中表達轉基因。任何強力輸送裝置可適用於病毒載體的傳遞。在優選實施方案中，該裝置是滲透泵或輸液泵。滲透泵和輸液泵可由多個供應商處市售獲得，(例如Alzet公司、Hamilton公司、Alza，Inc.、Palo Alto、California)。病毒載體通常通過下面的CED裝置傳遞。將導管、套管或其它注射裝置插入到選定患者的CNS組織中。本領域的技術人員可以容易地測定適合作為靶的CNS的常規區域。例如，當傳遞AAV-GDNF來治療PD時，紋狀體是大腦的靶合適區域。例如從ASI Instruments，Warren，MI可獲得立體定位圖和定位裝置。也可用由患者大腦的CT和/或MRI成像獲得的解剖圖來完成定位，以幫助操縱注射裝置到選定的靶位點。此外，因為本文描述的方法可以實施使得相關的較大大腦區域接受病毒載體，需要較少的灌輸套管。因此外科的併發症與穿入次數有關，這個模式的傳遞系統比常規傳遞技術所見的副作用減少。關於CED傳遞的詳細描述參見美國專利號6,309,634。
在PD的情況下，傳遞給證明存在黑質紋狀體多巴胺能(DA)去神經的患者，例如中度到重度去神經。通常當患者表現出可見的PD症狀時，就發生了中度到重度去神經，至少大約60％-70％到超過90％的現有的神經元已經失去。因此，「中度」去神經是指失去至少大約60％-70％的神經元，而「重度」去神經是指失去至少大約90％的神經元。
一種神經元失去的測量是通過CNS中多巴胺活性的水平。因此，「中度」去神經是指一個或兩個紋狀體半球中失去至少大約60％-70％的多巴胺含量，而「重度」去神經的反應是一個或兩個紋狀體半球中至少失去大約90％。為了測量多巴胺量，給予患者標記的示蹤物。標記的探測說明多巴胺的活性。標記的示蹤物優選可在整體動物的大腦中體內觀察到的，例如，正電子放射X光斷層(PET)掃描或其它CNS成像技術。用於選擇示蹤物的合適的標記包括任何可由光譜、光化學、免疫化學、電、光學或化學方法檢測的組分。本發明有用的標記包括放射標記(例如，18F、3H、125I、35S、32p等)、酶、比色標記、螢光染色等。在優選實施方案中，標記18F和DOPA用於多巴胺活性的量化。因此，在這個實施方案中，神經元丟失程度用[18F]-氟-DOPA作為示蹤物來測量。另一個多巴胺活性的測量應用標記示蹤物6-[18F]-氟-L-m-酪氨酸(18F-FMT)。FMT與利用多巴胺的細胞結合。參見例如，美國專利號6,309,634測量體內多巴胺含量的方法。
神經元的再生和由此疾病的治療也可以通過如上所述測量多巴胺的水平來監測。本文使用的疾病的治療是指減輕或消除所述疾病的症狀，以及神經元的再生。因此，可以由比較治療前後的多巴胺的水平來衡量神經元再生。或者，用可以看到的疾病症狀作為治療的測量指標。
神經組織分析和生化分析組織可由治療的患者獲得，並用常規的程序來處理評價神經元退化、再生和分化。在本發明中，它可用於評價例如，多種紋狀體和黑質(SN)的細胞，例如檢測紋狀體和SN的冠狀切片。隨著時間的過去進行測量可以表明遠離載體給藥位點的細胞改正的增加。
多巴胺及其代謝物HVA和DOPAC的水平可以應用以前描述的高壓液相層析法(HPLC)來測定(Shen，Y.，Hum.Gene Ther.(2000)111509-1519)。尤其是如果載體編碼可分泌型GDNF，也可收集CSF並用於評價蛋白質水平或酶活性。
也可通過腹膜內注射脫水嗎啡-HCl測試患者的周期性轉動行為。
C.實驗下面是實施本發明的具體實施方案的實施例。該實施例僅提供例證性說明目的，並不是企圖以任何方式來限制本發明的範圍。
努力確保使用的有關數據(例如，量、溫度等)的精確，但是當然允許一些實驗誤差和偏差。
材料和方法動物和外科準備成年雄性Wistar大鼠(重200-250g)以12h光照/黑暗循環養在隨意使用食物和水的籠子內。實驗依照Jichi Medical School的動物實驗指導進行。按照Sauer和Oertel，Neuroscience(1994)59401-415中的描述來製備大鼠局部PD模型。簡要地說，大鼠接受在左側紋狀體中立體定位注射溶於4μl的抗壞血酸鹽(0.05％)中的20μg6-羥基多巴胺(6-OHDA；以游離鹼計算；Sigma，St.Louis MO)，以下列坐標前後(AP)+1.0mm，中間-側面(ML)3.0mm，背腹(DV)-4.5mm。相對於前囪和硬腦膜表面計算該立體定位坐標。4周後，動物進行脫水嗎啡誘導的旋轉的測試(0.1mg/kg腹膜內給藥)，並且在進一步的研究中僅包括在60分鐘內表現7次/分鐘或更多對側旋轉的那些動物。為了評定黑質紋狀體的退化程度，死前3天將神經示蹤物CTB(1％蒸餾水溶液，1μl；List Bidogical Laboratories，Campbell，CA，USA)注射到紋狀體兩側(n＝5，AP＝+1mm，ML＝3.0mm，DV＝-4.5mm)。這可進行反向標記6-OHDA損害後4周的SN中保持功能性投射紋狀體的DA神經元亞群。PD動物模型隨意接受AAV-GDNFflag(n＝32)，AAV-LacZ(n＝2)，或介質(0.1M PBS；n＝8)在三個不同位點(每個位點2μl，1013載體基因拷貝/ml)注射到左側紋狀體，應用下列坐標(AP＝+1.5mm，+1.0mm和+0.5mm；ML＝2.6mm，3.0mm和3.2mm；DV＝-4.5mm)。注射速度設定在1μl/分，在緩慢抽出前將針多停留在該處7分鐘。為了評價逆向轉運的GDNFflag蛋白，將一些大鼠(在每個時間點AAV-GDNFflag注射組，n＝4；AAV-LacZ注射組，n＝2)分別在AAV注射後2、4和8周處死用於組織學。載體注射後20周，大鼠隨意分組並處死用於生化分析或免疫組織化學分析。在8隻大鼠中，死前3天兩側注射CTB到紋狀體。
行為測試AAV載體注射後，每2周通過腹膜內注射脫水嗎啡-HCl(0.1mg/kg)來測定大鼠旋轉行為。如以前所述(Shen，Y.，Hum.Gene Ther.(2000)111509-1519)，在觀察期≥60分鐘期間計算完全身體轉動的總數。自發的肢體使用每4周應用圓筒實驗方法評價(Kirik等，J.Neurosci.(2000)204686-4700)。將大鼠置於一個足夠自由運動的大的透明玻璃筒內。當它們用後腿站起10次以後，期間至少一隻爪子在圓筒壁上，計算兩隻前爪接觸圓筒壁的數目至少20次。對側的前爪接觸的數據用總數的百分比表示。
生化分析在戊巴比妥鈉麻醉下殺死大鼠，立即將腦解剖並置於乾冰上。用鋒利的不鏽鋼管在紋狀體兩側打孔。溼的組織樣品稱重並貯藏於-80℃直到後面分析使用。用如以前所述(Shen，Y.，Hum.Gene Ther.(2000)111509-1519)的高壓液相層析(HPLC)來評價多巴胺及其代謝物HVA和DOPAC的水平。
免疫組織化學在深度麻醉下用PBS灌輸大鼠接著用冰冷的4％PEA。解剖大腦，然後在4％PEA中後-固定4小時。紋狀體和SN的冠狀切片(30μm)在0.3％H2O2的PBS中處理30分鐘，並用3％胎牛血清(FBS)的PBS/0.1％Triton X-100封閉1小時。然後將切片用TH(1∶1000，小鼠抗-TH單克隆抗體；Chemicon，Temecula，CA，USA)，CTB(1∶10000，山羊抗CTB抗血清；List Biologic，Campbell，CA，USA)或FLAG(1∶1000，抗-FLAGM2抗體，Sigma，St.Louis，MO)的第一抗體在4℃孵育過夜。接著用生物素醯化的第二抗體(抗第一抗體)在室溫下孵育1小時(1∶400，SantaCruz，CA)。用抗生物素蛋白-生物素醯化的過氧(化)物酶複合物方法(Vectastain ABC試劑盒；Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)以3，3-二氨基聯苯胺(DAB)作為色素原來顯色切片。
對於FLAG/TH雙重免疫螢光染色，切片繼續在包含5％正常山羊血清的PBS封閉溶液中在室溫下孵育1小時，單克隆小鼠抗-FLAG抗體(1∶250，Sigma)和多克隆兔抗-TH抗體(1∶500)在4℃過夜，羅丹明-偶聯的山羊抗-小鼠IgG(1∶200；Santa Cruz，Santa Cruz，CA)和FITC-偶聯的山羊抗-兔IgG(1∶200；Santa Cruz，Santa Cruz，CA)在室溫下2小時。檢測切片並在聚焦掃描雷射顯微鏡下觀察(TCS NT；Leica，Heidelberg，Germany)。對於CTB/TH雙重免疫螢光染色，使用抗-CTB(1∶5000，抗CTB山羊抗血清)和小鼠抗-TH(1∶500)抗體。
用於TH-陽性神經元和CTB-標記神經元的定量分析，計算300-μm間隔貫穿SN兩側的切片。用NIH Image 1.59軟體來測量在每隔300μm貫穿紋狀體的嘴尾切片上TH-IR纖維的光密度(Kozlowski等，Exp.Neurol.(2000)1661-15)。
統計學分析結果表示為平均值±s.e.m.。應用重複-測量方差分析(ANOVA)接著Tukey真實差異顯著性(HSD)測驗(StatView 5.0軟體)進行數據的統計學分析。
實施例1重組AAV載體的構建表達FLAG-標記的GDNF(AAV-GDNFflag，圖1a)或β-半乳糖苷酶(AAV-LacZ，圖1b)的重組AAV載體如下構建。6-OHDA病變或注射脫水嗎啡引起內源表達GDNF(Ohta等，Biochem.Biophys.Res.Commun.(2000)27218-22；Zhou等，Neuroreport(2000)113289-3293)，區別轉基因衍生的GDNF和內源GDNF對評價基因傳遞的作用是必要的。因此，構建了表達FLAG-標記的GDNF的AAV載體。
AAV載體質粒pAAV-GDNFflag是由以前描述的pAAV-GDNF質粒衍生的(Fan等，Neurosci.Lett.(1998)24861-64)。這個質粒包含FLAG序列(DYKDDDDK(SEQ ID NO5))羧基末端標記的小鼠GDNFcDNA(Matsushita等，Gene(1997)203149-157)，在人巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子下，在AAV-2基因組的反向末端重複區(ITR)之間的人促生長素的第一個內含子和猿病毒40(SV40)多腺苷酸化信號序列。
以前描述了(Fan等，Neurosci.Lett.(1998)24861-64)AAV載體質粒pAAV-LacZ，輔助質粒pHLP19和pladenol。Pladeno5描述於美國專利號6,004,797。應用磷酸鈣共沉澱法將載體質粒和輔助質粒瞬時轉染接近融合的人293細胞。轉染72小時後，收穫細胞並通過三次冷凍和解凍循環使細胞溶解。用如以前所述的(Masushita等，GeneTherapy(1998)5938-945)兩次CsCl順序連續梯度來提純AAV載體(AAV-GDNFflag和AAV-LacZ)。通過定量DNA斑點雜交分析來評價，AAV-GDNFflag的最終粒子滴度是1.6×1013載體基因組拷貝數/ml，AAV-LacZ的最終粒子滴度是2.1×1013載體基因組拷貝數/ml。
實施例2
體外表達AAV-GDNFflag為了檢測體外表達的GDNFflag融合蛋白，將293細胞用AAV-GDNFflag或AAV-LacZ轉導(5000載體基因組拷貝數/細胞)。轉導後36小時，通過15％聚丙烯醯胺凝膠電泳分離細胞溶解產物並轉移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore，Bedford，MA，USA)。剩餘的蛋白質-結合位點用5％脫脂奶粉TBS在室溫下封閉1小時。將膜用小鼠抗-FLAG M2抗體(1∶1000，Sigma，St Louis，MO)或兔抗-GDNF抗體(1∶2000，SantaCruz，Santa Cruz，CA)在4℃孵育過夜，接著用綴合辣根過氧化物酶的第二抗-小鼠或抗-兔抗體(1∶2500，Amersham，Arliongton Heights，IL)在室溫下孵育2小時。用ECL系統來檢測化學發光的信號(Amersham)。
在蛋白質印跡分析上，通過抗-GDNF和抗-FLAG抗體在AAV-GDNFflag-轉導的293細胞的溶解產物中檢測GDNFflag融合蛋白。在AAV-LacZ轉導的細胞的溶解產物中沒有檢測到信號(圖2)。
為了鑑定AAV-載體衍生的GDNFflag融合蛋白的生物活性，製備了大鼠胎兒DA神經元的原代培養物。簡單地說，從14天Wistar大鼠胚胎中解剖出腹側中腦，切碎並用0.25％胰酶的PBS孵育15分鐘。將分離的細胞以初始密度為105個細胞/皿鋪到35mm多聚-L-賴氨酸預包被的平皿中，並用補充B27(Gibco BRL)、100單位/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、25mM KCl和2mM穀氨醯胺的神經基本-SFM培養基(Gibco BRL)在37℃孵育。在AAV載體處理平皿中，用AAV-GDNFflag或AAV-LacZ(5000載體基因組拷貝數/細胞)感染培養物。陽性對照皿或陰性對照皿中，向培養物加入終濃度為10ng/ml的重組人GDNF(rhGDNF，Santa Cruz)或BSA。培養基每隔3天更換一半新鮮的培養基，rhGDNF或BSA保持相同濃度。9天後，用4％多聚甲醛(PFA)固定細胞30分鐘，並進行免疫細胞化學染色以檢測GDNFflag和TH的表達。如描述(Sawada等，J.Neurochem.(2000)741175-1184)計算TH-IR細胞存在的數目。
酪氨酸羥化酶(TH)免疫染色顯示在AAV-GDNFflag轉導的培養物中存活的TH-免疫反應性(TH-IR)的細胞比在AAV-LacZ轉導的培養物中多兩倍(圖3)。這些結果證實AAV-GDNFflag能推動生物活性GDNFflag融合蛋白體外產生，FLAG肽的添加不能改變GDNF對DA神經元的神經營養性效應，允許通過抗-FLAG抗體鑑定外源表達GDNFflag融合蛋白。
實施例3在紋狀體中表達GDNFflag並逆向轉運到SN用抗-FLAG抗體在AAV-GDNFflag注射2、4、8和20周後檢測紋狀體中GDNFflag轉基因的表達。在貫穿紋狀體的注射位點周圍檢測FLAG免疫反應性(FLAG-IR)細胞。這些細胞顯示出典型形態學的中等刺狀神經元(圖4a和4b)。此外，在紋狀體內注射AAV-GDNFflag 4周和8周後在同側SN的緻密部用抗-TH和抗-FLAG抗體雙重免疫螢光染色檢測雙重陽性細胞(圖4c-4e)。注射AAV載體8周後，13.1±2.4％(n＝4)的TH-IR細胞重疊分散在SN的FLAG-IR細胞，表明有些轉基因GDNFflag得以進入到DA神經元。在紋狀體或SN的對側沒有觀察到FLAG-IR細胞，在AAV-LacZ或載體注射的大鼠中的這些區域也沒有。在AAV-LacZ注射的大鼠中，儘管在注射後2-20周在紋狀體中檢測到X-gal陽性細胞，但是沒能在SN中發現β-半乳糖苷酶信號。
這些結果表明AAV-GDNFflag能夠促進GDNFflag融合蛋白在紋狀體中的表達，並且GDNFflag融合蛋白而不是AAV載體本身能從紋狀體末端逆向轉運到SN中的DA神經元。
實施例4恢復紋狀體中DA神經支配為了測定AAV-GDNFflag能否恢復病變紋狀體中DA神經元支配，注射20周後在300-μm間隔貫穿紋狀體切片上檢查TH-IR纖維末端的程度。在AAV-LacZ注射的大鼠中，病變紋狀體中TH-IR纖維的密度顯著減少至僅僅13.5±3.0％的完整側(圖5a和5c)。相反，注射AAV-GDNFflag的大鼠中，TH-IR纖維的密度顯著增加，達到接近48.7±7.3％的完整側(圖5b、5d和5e)。保持的TH-IR纖維分布在注射位點周圍，說明TH-IR纖維的神經支配通過GDNFflag在紋狀體中表達而恢復。
CTB反向-標記在評價黑質紋狀體的功能上比單獨用抗-TH免疫染色更精確，因為只有CTB標記的SN神經元保持功能性黑質紋狀體投射，而抗-TH免疫染色只證明在神經元體中存在TH酶。在AAV-GDNFflag組，比SN中存在更多的CTB標記的DA神經元，說明在紋狀體中表達的GDNFflag能夠恢復DA神經元並促進紋狀體的功能性投射。此外，紋狀體中高水平的多巴胺及其代謝物支持通過紋狀體內注射AAV-GDNFflag成功的恢復黑質紋狀體系統，說明在黑質紋狀體系統中長期保持多巴胺的活性。
實施例5黑質紋狀體投射的保持霍亂毒素亞單位B(CTB，神經元示蹤物)(Leman等，Brain Res.Brain Res.Protoc.(2000)5298-304)注射到紋狀體的兩側以評價剩餘的黑質紋狀體通路的程度。死前3天注射同樣坐標的6-OHDA，逆向標記DA神經元亞群保持紋狀體投射。在AAV載體處理的時間點，即6-OHDA注射後4周，受損SN中CTB-陽性神經元的數目是28.9±3.7％的完整的對側(n＝5)。用抗-CTB和抗-TH抗體雙重免疫螢光染色說明SN中大部分CTB-陽性神經元也是TH-陽性(圖6)。受損側上TH-IR神經元的百分比是34.9±2.6％(n＝4)的完整側。這些結果說明一些部分黑質紋狀體連接在受損後4周仍然保持。AAV載體注射後20周，在注射AAV-LacZ的大鼠中觀察到廣泛地失去TH-IR細胞(19.5±2.0％的完整側)和CTB-陽性細胞(17.9±1.6％的完整側)。相反，注射AAV-GDNFflag導致TH-IR神經元和CTB-陽性細胞顯著增加，分別達到57.3±6.2％和50.8±8.5％的對側(圖7和8，P＜0.01)。
這些結果證明在損傷後4周紋狀體內注射AAV-GDNFflag使SN中DA神經元恢復存活並促進保持黑質紋狀體投射。
實施例6紋狀體內注射AAV-GDNFflag後行為的恢復6-OHDA給藥後4周，三組所有大鼠(AAV-GDNFflag，n＝20；AAV-lacZ，n＝16；載體；n＝8)證明在脫水嗎啡誘導旋轉實驗和圓筒實驗中相同的損害程度，說明DA損耗的水平相當。
在接受AAV-GDNFflag的大鼠中觀察到脫水嗎啡誘導的旋轉在載體注射後4周開始減少(圖9a)。該減少是逐漸進行並持續整個實驗(20周)。相反，AAV-LacZ或載體注射組的大鼠在相同時期表現出相當穩定的旋轉速度。
圓筒實驗用於測定受損大鼠的自發的前肢使用(圖9b)。AAV處理前，6-OHDA損傷後每組大鼠表現出相同顯著的偏向同側，在這個實驗根據減少對側肢的使用頻率(23％-25％的總接觸數)。從注射後4周觀察到接受AAV-GDNFflag的大鼠顯著的改進，逐漸地進步並在20周達到接近正常的水平(47％的總接觸數)。相反，在接受AAV-LacZ或載體的大鼠在20周內保持相同水平的對側肢使用。AAV-GDNFflag注射的大鼠與AAV-LacZ或載體注射的大鼠在脫水嗎啡誘導旋轉實驗和圓筒實驗上的統計學分析顯示出顯著的差異(P＜0.01)。
實施例7病變紋狀體的多巴胺含量的保存為了檢測AAV-GDNFflag注射後行為的恢復與黑質紋狀體多巴胺產生是否相關，在注射後20周測定紋狀體中多巴胺及其代謝物的水平，高香草酸(HVA)和3，4-二羥基苯乙酸(DOPAC)。在AAV-GDNFflag注射組(n＝8)中，紋狀體受損側的多巴胺水平是50.9±7.7％的對側完整側，而在AAV-LacZ注射組(n＝8)保持在11.5±4.8％的對側(圖10，P＜0.01)。此外，在AAV-GDNFflag注射組中HVA和DOPAC的水平更高。在兩組之間的紋狀體完整側上沒有觀察到多巴胺或其代謝物的水平有顯著差異。
上述實施例表明AAV載體介導的GDNF基因傳遞到可接受PD動物模型的紋狀體中保護更晚期退化的SN神經元，並保持它們與紋狀體的連接。
在本研究中，從注射後4-8周檢測與AAV-GDNFflag注射側同側的SN細胞中的GDNFflag。應用抗-FLAG和抗-TH抗體雙重免疫螢光染色確定這些SN細胞是DA細胞。AAV載體處理後8周在緻密部的廣泛區域觀察到FLAG-IR細胞，儘管FLAG-IR細胞的百分比似乎是低的(13.1％TH-IR細胞)。GDNF表現為對DA神經元在皮摩爾範圍內非常有效的作用，所以小量的GDNFflag蛋白質瞬時轉運並且在死的時候通過免疫組織化學檢測不到，可以保護對毒素-誘導的細胞死亡的黑質DA神經元。相反，紋狀體中注射AAV-LacZ的大鼠證明在SN中沒有β-半乳糖苷酶信號。與以前研究一致(Chamberlin等，Brain Res.(1998)793169-175)，AAV載體本身在中樞神經系統中不是逆向轉運的，但是GDNFflag蛋白是從紋狀體到在SN中DA神經元逆向轉運的。GDNFflag蛋白在紋狀體中的顯著表達也在注射後20周檢測到。GDNFflag產生的持續提供了在單獨AAV載體注射後黑質紋狀體系統的長期恢復。AAV-GDNFflag注射後病變紋狀體中保持TH-IR的密度。
因此，紋狀體中AAV-介導的GDNF基因傳遞作為PD和其它CNS退化疾病的神經保護的基因治療是有效的。
因此，提供治療神經退化疾病的新方法。儘管已經在某種程度上詳細的描述了本發明的優選實施方案，但是應該理解可以進行不背離本發明權利要求定義的精神和範圍的明顯改變。
工業適用性本發明公開了治療已經存在神經元損傷的患者的組合物和方法。所述組合物和方法使用以腺伴隨病毒為基礎的基因傳遞系統來傳遞神經膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)到患有神經退行性疾病如帕金森氏病患者。
序列表1100ZAWA，KeiyaMURAMATSU，Shin-ichi120用於治療神經變性疾病的組合物和方法1300800-0028.40140未給定1412002-08-2815060/315,8381512001-08-291607170PatentIn Ver.2.02101211633212DNA213人工序列220
221CDS222(1)..(633)220
223人工序列的描述人GDNF4001atg aag tta tgg gat gtc gtg gct gtc tgc ctg gtg ctg ctc cac acc 48Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr1 5 10 15gcg tcc gcc ttc ccg ctg ccc gcc ggt aag agg cct ccc gag gcg ccc 96
Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Pro Pro Glu Ala Pro20 25 30gcc gaa gac cgc tcc ctc ggc cgc cgc cgc gcg ccc ttc gcg ctg agc144Ala Glu Asp Arg Ser Leu Gly Arg Arg Arg Ala Pro Phe Ala Leu Ser35 40 45agt gac tca aat atg cca gag gat tat cct gat cag ttc gat gat gtc192Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val50 55 60atg gat ttt att caa gcc acc att aaa aga ctg aaa agg tca cca gat240Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser Pro Asp65 70 75 80aaa caa atg gca gtg ctt cct aga aga gag cgg aat cgg cag gct gca288Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala85 90 95gct gcc aac cca gag aat tcc aga gga aaa ggt cgg aga ggc cag agg336Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg100 105 110ggc aaa aac cgg ggt tgt gtc tta act gca ata cat tta aat gtc act384Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr115 120 125gac ttg ggt ctg ggc tat gaa acc aag gag gaa ctg att ttt agg tac432Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr130 135 140tgc agc ggc tct tgc gat gca gct gag aca acg tac gac aaa ata ttg480Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu145 150 155 160aaa aac tta tcc aga aat aga agg ctg gtg agt gac aaa gta ggg cag528Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gln165 170 175
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223人工序列的描述人GDNF4002Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr1 5 10 15Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Pro Pro Glu Ala Pro20 25 30Ala Glu Asp Arg Ser Leu Gly Arg Arg Arg Ala Pro Phe Ala Leu Ser35 40 45Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val50 55 60Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser Pro Asp65 70 75 80
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223人工序列的描述大鼠GDNF4003atg aag tta tgg gat gtc gtg gct gtc tgc ctg gtg ttg ctc cac acc 48Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr1 5 10 15gcg tct gcc ttc ccg ctg ccc gcc ggt aag agg ctt ctc gaa gcg ccc 96Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Leu Leu Glu Ala Pro20 25 30gcc gaa gac cac tcc ctc ggc cac cgc cgc gtg ccc ttc gcg ctg acc 144Ala Glu Asp His Ser Leu Gly His Arg Arg Val Pro Phe Ala Leu Thr35 40 45agt gac tcc aat atg ccc gaa gat tat cct gac cag ttt gat gac gtc 192Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val50 55 60atg gat ttt att caa gcc acc atc aaa aga ctg aaa agg tca cca gat 240Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser Pro Asp65 70 75 80aaa caa gcg gcg gca ctt cct cga aga gag agg aac cgg caa gct gca 288Lys Gln Ala Ala Ala Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala85 90 95gct gcc agc cca gag aat tcc aga ggg aaa ggt cgc aga ggc cag agg 336Ala Ala Scr Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg100 105 110ggc aaa aat cgg ggg tgc gtc tta act gca ata cac tta aat gtc act384Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr115 120 125gac ttg ggt ttg ggc tac gaa acc aag gag gaa ctg atc ttt cga tat 432Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr130 135 140
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223人工序列的描述大鼠GDNF4004Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr1 5 10 15Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Leu Leu Glu Ala Pro20 25 30Ala Glu Asp His Ser Leu Gly His Arg Arg Val Pro Phe Ala Leu Thr
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221CDS222(1)..(720)220
223人工序列的描述小鼠GDNF4006atg gga ttc ggg cca ctt gga gtt aat gtc caa ctg ggg gtc tac gga 48Met Gly Phe Gly Pro Leu Gly Val Asn Val Gln Leu Gly Val Tyr Gly1 5 10 15gac cgg atc cga ggt gcc gcc gcc gga cgg gac tct aag atg aag tta 96Asp Arg Ile Arg Gly Ala Ala Ala Gly Arg Asp Ser Lys Met Lys Leu20 25 30tgg gat gtc gtg gct gtc tgc ctg gtg ttg ctc cac acc gcg tct gcc 144Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr Ala Ser Ala35 40 45ttc ccg ctg ccc gcc ggt aag agg ctt ctc gaa gcg ccc gct gaa gac 192Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Leu Leu Glu Ala Pro Ala Glu Asp
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權利要求
1.一種組合物在治療已經存在神經元損傷的哺乳動物患者中的應用，該應用將所述組合物給予到所述患者的中樞神經系統，其中所述組合物包含重組腺伴隨病毒(AAV)病毒體，其中所述病毒體包含編碼神經膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)多肽的多核苷酸，該多核苷酸與包括啟動子的表達控制元件有效連接。
2.權利要求1的應用，其中所述患者是人。
3.權利要求1或2的應用，其中所述已經存在的神經元損傷包括中度到重度黑質紋狀體多巴胺能(DA)去神經。
4.權利要求1-3任一項的應用，其中所述多核苷酸還包括位於5』位而且符合編碼GDNF多肽的序列的讀框的分泌序列。
5.權利要求1-4任一項的應用，其中所述多核苷酸編碼人GDNF。
6.權利要求5的應用，其中所述多核苷酸編碼人pre-pro-GDNF。
7.權利要求1-6任一項的應用，其中所述組合物給到所述患者的紋狀體中。
8.任一項前述權利要求的應用，其中所述啟動子是病毒啟動子。
9.權利要求8的應用，其中所述啟動子是MLP、CMV或RSV LTR啟動子。
10.任一項前述權利要求的應用，其中所述重組AAV病毒體給藥到所述患者的紋狀體中。
11.權利要求10的應用，其中所述重組AAV病毒體利用強力輸送系統(CED)給藥到紋狀體。
12.權利要求11的應用，其中所述給藥用滲透泵完成。
13.權利要求11的應用，其中所述給藥用輸液泵完成。
全文摘要
本發明公開了用於治療已經存在神經元損傷的患者的組合物和方法。所述組合物和方法使用以腺伴隨病毒(AAV)為基礎的基因傳遞系統來傳遞神經膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)到患有神經退行性病症(例如帕金森氏病)的患者。
文檔編號C07K14/475GK1575340SQ0282132
公開日2005年2月2日 申請日期2002年8月29日 優先權日2001年8月29日
發明者小澤敬也, 村松慎一, 池口邦彥, 中野今治 申請人:田邊製藥株式會社